DE1618506A1 - Verfahren zur Herstellung von substituierten Cyclopent-2-enonen - Google Patents

Description

161B506

RAH 4480/14

F. HofFmann-La Roche & Co. Akticftgcsellschaft, Basel/Schweiz .

Verfahren zur Herstellung von substituierten Cyelopent-2-enonen

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von substituierten Cyelopent-2-enonen der allgemeinen Formel

Tl CD

^HC

woj?in R eine Alkyl-, Alkenyl- oder Alkadienylgruppe mit 3 ■- 5 Kohlenstoffatomen bedeutet.

10 β 811 /21

Diese Verbindungen sind wichtige Zwischenprodukte in der Synthese von Pyrethrin und Pyrethrinanalogen, einer bekannten Klasse von Verbindungen-mit Insektiziden Eigenschaften.

Zu den Verbindungen, welche man üblicherweise zu den Pyrethrinen zählt, gehören die vier Hauptbestandteile von Pyrethrum, nämlich Pyrethrin I, Cinerin I, Pyrethrin-II und Cinerin II. Pyrethrum ist der Extrakt von Chrysanthemum W ■cinerariaefolium und eine wichtige Quelle natürlicher Insektizide. Die Pyrethrine, welche _s wie oben erwähnt, die wichtigsten insektiziden Bestandteile des Pyrethrum und speziell die beiden Komponenten Pyrethrin-I und Cinerin I einschliessen, sind besonders brauchbare Insektizide wegen ihrer erhöhten insektiziden Wirkung, welche sie entfalten, wenn sie zusammen mit synergistischen Substanzen, wie z.B. Piperonylbutoxid, verwendet werden, sowie wegen ihrer geringen Toxizität gegenüber Säugetieren, und der Vermeidung einer möglichen Resitenz bei Anwendung sublethaler Dosen.

Gemäss der Bedeutung der Pyrethrine war deren Herstellung Gegenstand umfangreicher Untersuchungen. Trotzdem ist bisher ^; keine kommerziell annehmbare Synthese gelungen und der gesamte Bedarf an Pyrethrinen ist durch.Extraktion aus Pyrethrumblumen gedeckt worden. Da hierbei/ infolge der erforderlichen grossen Lösungsmittelmengeh, viele inaktive und !unerwünschte Nebenprodukte anfallen, sind kostspielige und umständliche Reinigungsmethoden untrlässXIsfeo ·

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Das erfindungsgemässe Verfahren bietet demgegenüber die Möglichkeit der synthetischen Herstellung der Bestandteile des Pyrethrins und von Pyrethrinanalogen über leicht zugängliche Ausgangsstoffe. Gegenstand der Erfindung ist die Umwandlung von 2-R-3-methyl-cyclöpent-2-enonen gemäss Formel II zu 2-R-3-methyl-4-hydroxy-cyclopent-2-enonen gemäss Formel I mittels eines mikrobiellen Enzymsystemes.

Dies kann durch folgendes Formelschema dargestellt werden:

CEnzymsystem]

worin R eine Alkyl-, Alkenyl- oder Alkadienylgruppe mit 3-5 Kohlenstoffatomen darstellt.

Die Ausgangsprodukte gemäss Formel II sind bekannt und können leicht durch herkömmliche Methoden erhalten werden.

Von den Cyclopent-2-enonen gemäss Formel II, welche als Ausgangsmaterialien des erfindungsgemässen Verfahrens verwendbar sind, selen beispielsweise folgende genannt:

j 2-Butyl-3-methyl-109811/2109

cyolopent-2-enon; 2-Pentyl-3-methyl~cyclopent-2-enon; 2-Ally1-3-methyl-cyclopent-2-enon(Allethron); 2-(But-2-enyl)-3-methylcyclopent-2-enon(Cineron); 2-(But-3-enyl)-3-methyl~cyclopent-2~ enori; 2-(Pent-2-enyl)-3-methyl-eyclopent-2~enon-{ Jasrnon); 2-(Pent-3-enyl)-3~methyl-cyclopent-2-enon; 2~(Pent-4-enyl)-3-methylcyclopent~2-enonj 2-(Pent-2,4-dienyl)-3-methyl-cyclopent-2-enon (Pyrethron)j woraus, nach dem erfindungsgemässen Verfahren die entsprechenden hydroxylhaltigen Verbindungen gemäss Formel I erhalten werden, wie z.B. 2-Propyl-3-methy 1-ij.-hydroxy-eyelopent-2-enon; 2-Butyl-3-Inethyl-4-hydroxy-cyclopent-2-enon; 2-Pentyl-3-methyl-4-hydroxy-cyclopent-2-enon; 2-Allyl-3-methyl~4~hydroxycyclopent-2-enon(Allethrolon); 2- (But-2-enyl)-3-methyl-ⁱf-hydroxycyclopent-2-enon(Cinerolon); 2-{But-3~enyl)-3-methyl-^l -hydroxycyclopent-2-enon; 2-(Pent-2-enyl)-3-methyl-^-hydroxy-cyelopent-2-enon(Jasmolon); 2-(Pent-3-enyl)-3-^fnethyl-4-hydroxy-eyclopent-2-enon; 2-(Pent-4-enyl)-3-methyl-4-hydroxy-cyclopent-2-enon; 2-(Pent-2,4-dienyl)-3-methyl-ⁱl—hydroxy-cyclopent-2-enon(Pyrethrolon)

Die Ueberführung der nach dem erfindungsgemässen Verfahren hergestellten 2-R-3-methyl-4-hydroxy-cyclopent-2-enone gemäss Formel I in als Insektizide wirksame Pyrethrine und Analoge kann durch Veresterung mit einer geeigneten Cyclopropancarbonsäure beispielsweise mit Chrysanthemummonocarbonsäure (Chrysanthemsäure), Pyrethrumsäure und dergleichen erfolgen. Die Darstellung von Pyrethrinen und Analogen durch Veresterung von substituierten 3-Methyl-4-hydroxy-cyclopent-2-enonen mit Cyclopropancarbonsäuren

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wurde bereits unter anderem von folgenden Autoren beschriebenί L.Crombie et al., JCS p. 3963 (I956), L-Cromble et al. JCSp. II52 (1950) und Schechter et al. JACS Vol. 71, p. 3165 (19^9).

Wie bereits oben erwähnt, kann das erfindungsgemässe Verfahren ausser auf die Synthese von in der Natur vorkbmmenden Pyrethrinen auch auf di'e Darstellung von synthetischen Analogen, wie z.B. Allethrin, angewandt werden, welches durch Veresterung von nach dem erfindungsgemässen Verfahrendargestellten Allethrolon erhalten wird. Die enzymatisehe Hydroxylierung von Verbindungen gemäss Formel Il worin R einen Alkenyl-, oder Alkadienylrest bedeutet, und besonders die UeberfÜhrung von Allethron in Allethrolon, von Cineron in Ginerolpn und Pyrethron in Pyrethrolon, stellt einen bevorzugten Aspekt der Erfindung dar. " ".."■" ^: -■"■'" -.-.-■■ .-". _■:■" .""'■ ■:' ' . "■='"" .,".

Die 2-R-3-methyl-4-hydroxy-cyclopent-2-eiione gemäss Formel I können als Stereoisomere vorkommen* Das erfindungsgemässe Ver-' fahren sehliesst die Herstellung aller möglichen ^teöeöisomeren ein, sowohl in Form ihrer racemisehen Gemische^ als axiclx ini Form ihrer getrennten optisch aktiven Antipoden, Wenn"..das Produkt als raeemlsches Gemisch anfällt, kann dieses nach bekannten Methoden getrennt werden. Da die zur Veresterung verwendeten Cyclopropancarbonsäuren bekanntlich ebenfalls als Stereoisomere vorkommen, ist es möglich durch die Wahl der entsprechenden Stereoisomeren der 2-R-3-methyl~4-hydroxy-cyclopent72-enone und der Cyclopropancarbonsäuren, jedes gewünschte Isomere der·

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Pyrethrine oder der Pyrethrinanalogen herzustellen.

Die mikrobiologische Umwandlung von Verbindungen der allgemeinen Formel II zu Verbindungen der allgemeinen Formel I gemäss der vorliegenden Erfindung wird vorzugsweise mittels eines Enzymsystems eines Mikroorganismus der Abteilung (des Phylum) Eumycophyta oder der Abteilung (des Phylum) Schizomycophyte durchgeführt, insbesondere mittels eines Mikroorganismus aus einer der folgenden Klassens Phycomycetes, Ascomycetes, ;. Deuteromycetes, Basidiomycetes, Schizomycetes und Sehizophyceae. Mikroorganismen nach obiger Beschreibung, welche für das erfindungsgemässe Verfahren besonders geeignet sind; werden aus folgenden Ordnungen gewählt! Mucorales, Plectascineae, Sphaeriales, Moniliales, Daorymycetales, Actinomycetales, Eubacteriales und Pseudomonodales, und zwar insbesondere Glieder der Familien: Mucoraceae, Thamnidaceae, Aspergillaceae, Chaetomiaceae, Moniliaceae, Dematiaceae, Tuberculariaceae, Dacrymycetaceae, Streptomyöetaceae, Bacilläceae, Mikrocoqcaceae, Enterobacteri- . aceae und Spirillaceae. Aus den Gattungen der .Mikroprganismen ; innerhalb der obigen Klassifizierungen, aus welchen ein spezi^ll«4 Stamm geeigneter Mikroorganismen zur Produktion von Snzymsysteinen für das erfinduhgsgemässe Verfahren ausgewählt wurde, kö^en I speziell folgende Exemplare angeführt werden? Mucor, Ehi»opus_t Helicostylum, Aspergillus, Penicillium, Ch*©tomiiam, Beäuviüriat* j Trichotheclum, Trichoderma, Cijrvularia, Cylindrooarpon, Füsarium, Dacrymyces, Dacryopinax, Streptomyces, Bacillus, Staphylococcus,

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Serratia und Cellvibrio. Die zahlreichen Stämme von Mikroorganismen der Spezies, welche unter die oben genannten Klassifizierungen fallen und welche für die erfindungsgemässe Umwandlung ge- " eignet sind, können durch folgende Spezies exemplifiziert werdenj Mucor hiemalis, Mucor parasiticus, Rhizopus ärrhizus, Rhizopus nigricans, Helicostylum pyriforme, Aspergillus chevalieri, Aspergillus clavatus, Aspergi-llus fasciculatus, Aspergillus flayus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Aspergillus tamarii, Penieillium cyclopium, Penicillium Javanicum, Penicillium lilacinum, Chaetomium globosum, Beauvaria bassiana, Trichothecium lignorum^ Curvularia lunata, Curvularia pallescens, Cylindrocarpon radicicola, Füsarium culmorum, Dacrymyces deliquescens, Dacryopinax spathularia, Streptomyces aureofaciens, Streptomyces fradiae, Streptomyces griseus, Bacillus alvei, Bacillus pumilus, Serratia marcescens, Cellvibrio vulgaris; und die Stämme Staphylococcus sp. QMB 821, Streptomycete sp., NRRL 3232, thermophile streptomycete sp. 3232, thermophile streptomycete sp. 3233»

Die Klassifizierung und Nomenklatur der Mikroorganismen, welche in dieser Beschreibung verwendet werden, stammen aus "Bergey's Manual of Determinative Bacteriology* 7th Edition (1957).

Spezielle Stämme der nach dem erfindungsgemässen Verfahren benützten Mikroorganismen können von bekannten

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-⁸ - 1b185üß

bezogen werden, wie z.B.: American Type Culture Collection (ATCC), 123OI Parklawn Drive, Rookville, Maryland 20852. Centraalbureau voor Schimmelcultures (CBS), Baarn, Holland. Northern Utilization Research and Development Division (NRRL), United States Department of Agriculture, 18I5 North University Street, Peoria, Illinois 6l604, USA. Quartermaster Research and Development Center -(0,M), United States Army, Natiok, Massachusetts, USA.

Das erfindungsgemasse Verfahren wird zweckmässig wie folgt' durchgeführts Ein geeigneter Mikroorganismus wird in einem geeigneten Nährmedium gezüchtet. Hierauf werden, die Kultur, Sporen oder Zellen, oder von der Kultur gewonnene Flüssigkeit oder Enzympräparate, einschliesslich zellfreier Enzympräparate, die nach in der Enzymologie üblichen Methoden erhalten werden, mit einem Cyclopentenon gemäss Formel II in Kontakt gebracht, wobei eine Verbindung gemäss Formel I entsteht.

Die Verwendung von mikrobiologischen Agentien zur Durchführung der erfindungsgemassen Umwandlung kann auch in der Weise erfolgen, dass man den Mikroorganismus in Gegenwart einer Verbindung der Formel II als Substrat, unter ähnlichen Bedingungen wie oben erwähnt, züchtet. Die Wirkungsweise von einem der oben aufgezählten Mikroorganismen auf eine als Substrat dienende Verbindung der Formel II kann als enzymatische Hydroxylierung be·» zeichnet werden, und diese enzymatische Hydroxylierung kann, wenn

10 9 8 11/2109 b^ad original

sie in Gegenwart der Enzyme produzierenden Organismen durchgeführt wird, als eine Fermentation bezeichnet werden.

Der Permentationsprozess des erfindungsgemässen, Verfahrens bewirkt eine selektive Substitution eines Wasserstoffatoms durch eine Hydroxylgruppe in der 4-Stellung der als Substrat verwendeten Cyclopentenone. Man kann auch die Umwandlung nach dem erfindungsgemässen Verfahren so durchführen, dass man das die Hydroxylierung bewirkende Enzymsystem von dem Mikroorganismus abtrennt und das zellfreie Enzymsystem·mit einer Verbindung gemäss Formel II in Kontakt bringt. ·

Die Zusammensetzung der für die Kultur der Mikroorganismen sowie der für die Fermentation verwendeten Nährlösung kann weitgehend variieren. Die in dem erfindungsgemässen Verfahren verwendeten Mikroorganismen werden am besten in einer für die Vermehrung der das hydroxyIierende Enzym produzierenden Zellen günstigen Nährlösung gezüchtet. Eine solche Nährlösung sollte alle von dem Mikroorganismus benötigten Nährstoff enthalten,wie Stickstoff, Kohlenstoff, Phosphor, Schwefel und Kalium sowie die Spurenelemente. Als Stickstoffquellen wurden folgende als zufriedenstellend gefunden: rohe oder gereinigte Proteine, Peptone, Proteinhydrolysate, Aminosäuren*, Harnstoff, sowie andere assimilierbare Stickstoffquellen oder Mischungen hiervon. Als Kohlenstoffquellen kommen in Frage assimilierbare Zucker, Dextrine, Stärke, Lipide, Bohnen- oder Kornmehl, sowie verschiedene Kombi-

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nationen hiervon. Der pH der Kultur und des Fermentationssystems kann von 2 bis 9 variieren, vorzugsweise jedoch liegt er zwischen K und 8, je nach dem verwendeten Mikroorganismus. Die Temperatur kann etwa 20 - 50 C betragen, vorzugsweise jedoch 28 C bis 48 C, wiederum abhängig vom verwendeten Mikroorganismus. Die Wachstumszeit der Kultur variiert natürlich mit dem jeweiligen Mikroorganismus und der Nährlösung. Normalerweise erhält man eine befriedigende Kultur nach 1-6 Tagen und die Umwandlung erfolgt gewöhnlich während einer 1-bis 10-tägigen Fermentationsperiode. Die Fermentation ist aerob, sodass Rühren und Belüftung für optimale Resultate wünschenswert sind. Am zweckmässigsten wird die Fermentation in wässrigem Mödium in einem belüfteten Fermentator durchgeführt. Die Konzentration des Substrats kann weitgehend variieren, bis zu 5 g pro Liter der verwendeten Kultur und mehr. Bevorzugt wird jedoch bei Konzentrationen zwischen 0,5-2 g pro Liter Kultur gearbeitet.

Das Substrat kann mit dem Organismus und dessen Enzymen in Kontakt gebracht werden, ohne diese von dem Nährboden zu entfernen, oder man kann die Zellen und Enzyme zuerst von dem Nährboden entfernen und sie dann in einem wässrigen Medium mit dem Substrat in Kontakt bringen. Das Substrat kann auf einmal zu der Kultur oder dem Enzyrnsystem gegeben werden oder man gibt es kontinuierlich hinzu während das Wachstum und die Reaktion fortschreiten. Das Substrat kann ferner in unverdünnter Form oder verdünnt in einem entsprechenden Lösungsmittel zugesetzt werden.

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Vorzugsweise wird es als 5-10^ige Lösung in einem organischen Lösungsmittel, wie z.B. Benzol, zugesetzt.

Die Endprodukte der mikrobiologischen Umwandlung, d.h. die Verbindungen der allgemeinen Formel I, können mittels bekannten Verfahren wie Verteilung, Lösen, Adsorption usw. von dem Reaktionsgemisch und etwaigen Verunreinigungen getrennt werden» Die erhaltenen Verbindungen der Formel Γ können nach der Abtrennung wenn erwünscht noch weiter gereinigt werden» Hierbei " können ebenfalls herkömmliche Methoden, wie Destillation und Chromatographie benützt werden. Die Reaktionsprodukte können aber auch direkt der Veresterung mit den entsprechenden Cyclopropancarbonsäuren unterworfen werden, um die gewünsaiten Pyrethrine und Analoge direkt zu erhalten. Die Zweckniässigkeit hiervon hängt selbstverständlich von der Natur und der Menge der anwesenden Verunreinigungen ab, was wiederum abhängig ist von der Art der verwendeten Mikroorganismen.

Beispiel 1 ~

Eine Schrägagarkultur wurde mit Sporen von Aspergillus • niger ATCC 91^2 beimpft und bei 2Ö°C bebrütet. Das Schrägagarmedium bestand aus 5# fein gemahlenem Hafermehl;2% Glueösej 2% Agar und 91# destilliertem wasser. Vor der Sterilisierung betrug der pH des Mediums 7. Nach 5 Tagen war der Nährboden mit Sporen bedeckt. Hierauf wurden 10 ml,eines Sporenyerdüiinungsmit

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-4Z-

tels zugesetzt, welches 1 g Agar und 0,1 g Aerosol OT pro Liter destillierten Wassers enthielt. Die Sporen wurden von der Agarfläche gespült und in dem wässrigem Verdünnungsmittel suspendiert

Je 1/2 ml dieser Sporensuspension wurde aseptisch in je einen von drei 5OO ml Erlenmeyerkolben gegeben, von welchen jeder 100 ml eines sterilen Fermentationsrnediums mit folgender Zusammensetzung {in Gramm pro Liter destillierten V/assers)ent- ) hielt: -

Technische Glucose 20; KH PO₁₊ 1,5; MgSO^ Ί\0 1,5; NfLNO-. 1; enzymatisch hydrolisiertes Laktalbumin 1; ZnSO^^HpO 10 mg; 1-Glutaminsäure 0,5; Rückstand von Maisquellwasser 1; .lösliche Komponente von autolysierter Hefe 0,5. '

Der pH wurde vor der Sterilisation auf 7 eingestellt und die ' Kolben wurden mit Wattepfropfen verschlossen. Die Sterilisierung wurde iri einem Autoklaven bei 120⁰C während 30 Minuten durchgeführt.

Die Kolben wurden auf eine mechanische Schüttelmaschine gestellt, welche ihnen eine rotierende Bewegung mit etwa 280-320 ■ Umdrehungen pro Minute verlieh. Die Temperatur wurde dabei konstant auf 28⁰C gehalten.

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Nach zwei Tagen Inkubationszeit hatte sich in jedem Kolben ein dichtes Myzelwachstum ausgebildet und der pH war auf etwa 3*2-3,5 gesunken.

Zu jedem Kolben wurden nun, unter aseptischen Bedingungen 2 ml einer sterilen Lösung von 50 mg Cineron in Aethanol gegeben. Die Inkubation wurde fortgesetzt und in Intervallen von 2, 3 und K Tagen nach der Zugabe des Cineron wurde je ein Kolben von der' Schüttelmaschine genommen und wie folgt analysierte 10 Gramm unfiltrierte Brühe wurden bei Zimmertemperatur mit 25 ml Chlor o-' form extrahiert. Die Lösungsmittelphase wurde in ein trockenes Gefäss gebracht, die wässrige Phase und die Emulsion wurden nochmals mit 15 ml Chloroform extrahiert. Die Lösungsmittelphase wurde abgetrennt und mit dem ersten Extrakt vereinigt.

Der Chloroformauszug wurde bei Raumtemperatur zur Trockene eingedampft, indem man einen von Sauerstoff freien Stickstoffstrom darüber leitete. Der trockene Rückstand wurde sodann in 1 ml Methanol aufgenommen.

Drei Mikroliter der methanolischen Lösung wurden in einen, mit einem Wasserstofflamm-Ionlsationsdetektor ausgerüsteten, GasChromatographen gegeben. Der Durchgang der Probe durch die Absorptionskolonne wurde mit einem 0-1 Millivolt-Schreiber mit Plattenintegrator registriert. Das Instrument wurde vorher mit Proben von r@in@m Cineron und¹ Cinerolon geeicht«

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Bei der Analyse der A. niger ATCC 9142 Fermentationsproben wurde in den Kolben 301 mg Cinerolon pro Liter gefunden

[Sdp. 124 -125 C/0,02 mm; nl'«1,5091; Λ „7l^s~2,76 2,9 5,85 und 6,06μ ;> ^⁵°^H 230(12,30O)J .

Vier Tage nach der Zugabe des Cineron zu der Fermentationsmasse blieben 84 mg restliches Cineron pro Liter zurück.

Der Fermentationsprozess ist in. folgender Tabelle dargestellt.

Umwandlung von Cineron in Cinerolon durch Aspergillus niger ATCC 9142

Tage nach Zugabe 0 2 .3 4

mg/Liter

Cinerolon 0 132 167 301

Cineron 500 32? 220 84

Umwandlung von

Cineron in Cinerolon, ■'..-. 26 33 60

in % (bezogen auf die ·

Ausgangskonzentration

an Cineron) .

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- ' Seispiel 2

Sporen von Aspergillus niger ATCC 9142 wurden nach. Beispiel 1 auf Schrägagar gezüchte ν und die von dem Nährboden erhaltenen 10 ml Sporensuspension wurden unter Rühren in einen 14 Liter Gärbottich mit 8,5 Liter Nährlösung gegeben.· Diese Nährlösung hatte dieselbe Zusammensetzung wie in Beispiel 1, nur enthielt sie noch. 5 ml einer Trimethylsilan-Emulsion um Schaumbildung zu verhindern. Der Gärbottich wurde zur Temperaturkonstanthaltung in ein Wasserbad von 28 C gestellt.

Die Rührgeschwindigkeit in dem Bottich.betrug 350 Umdrehungen pro Minute während ein konstanter Luftstrom von 2 Liter pro Minute hindurchgeblasen wurde* Nach etwa zwölf Stunden Inkubation wurde der Luftstrom auf drei Liter pro Minute und die Rührgeschwindigkeit auf 500 Umdrehungen pro Minute erhöht.

Die Inkubation wurde insgesamt 40 Stunden auf diese Art fortgesetzt, nach welcher Zeit sich ein dichtes feinkugeliges Gewächs gebildet hatte und der pH auf 2 abgesunken war.

Der pH wurde durch Zugabe einer sterilen 5-n Natriumhydroxydlösung auf 6,3 eingestellt und hierauf wurden unter aseptischen Bedingungen 4 g Cineron,, gelöst in 15 ml Aethanol^ in den Bottich gegeben» Die Inkubation wurde unter Erhöhung des Luftstroms auf vier Liter pro Minute und der Rührgesehwi^dlgksifc auf 550 Umdrehtragen pro Minute fortgesetzt» Die Temperatur wurde

BADORIGINAL' , ."·."■ 109811/2100

" ^1β ~

konstant bei 28⁰C gehalten. . '

Während der Inkubation wurden des öfteren Proben entnommen, welche folgenden Verlauf der Fermentation anzeigten:

	ine;	pro Liter	DH
Stunden nach Zugabe	Cinerolon	Cineron	6,3
0	0	^90	3,8
23	116 ■	253	3,7
29	127	210	3,6
35	135	111

' Der Versuch wurde 35 Stunden nach der Zugabe von Cineron abgebrochen» Das Myzel wurde abfiltriert, mit etwa 200 ml destilliertem Wasser gewaschen und dann weggeworfen. Die 200 ml Waschwasser wurden zu dem Piltrat gegeben.

Das Piltrat wurde dreimal mit je 2.000 ml Methylenchlorid extrahiert. Die Methylenchloridauszüge "wurden vereint und nacheinander; einmal mit 1,5 Liter 1-n Salzsäure und zweirr.al mit 1,5 Liter einer 5#igen wässrigen Natriumbicarbonatlösung gewaschen, und dann über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet. Nach dem Trocknen wurden die Methylenchloridauszüge im Vakuum eingedampft<>

Der so konzentrierte Extrakt(3,10 .g) wurde einer Vakuum-

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destillation unterworfen, wobei Cineron (58°-11Ο°θ/θ,Ο95 mm y 0,812 g.) und eine zusätzliche Fraktion (110^O-130°G/0,09 ^mm ; 0*855 g) erhalten wurden. Diese zusätzliche Fraktion würde auf 15 g Silikagel chromatographiert. Durch Eluieren mit 6$ Aethylacetat in Benzol erhielt man weitere 0,1.21 g Cineron sowie '■■0,108 g Cinerolon. Die Identifizierung wurde bestätigt durch Vergleich der Infrarot-, UV-, Kernresonanz-, und Massenspektren, sowie mit Hilfe der Retentionszeit in der Gaschromatographie und dem Rp-Wert der Dünnschichtchromatographie, mit den entsprechenden Werten von natürlich gewonnenem Cinerolon.

Beispiel 5

Es wurden Sporen von Aspergillus niger NRRL 3228 auf Schrägagar in Analogie zu den Angaben in Beispiel 1 gezüchtet. Eine Impfoese Sporen eines solchen Nährbodens wurde in einen 500 ml Erlenmeyerkolben gegeben, welcher 100 ml Nährlösung folgender Zusammensetzung, in Gramm pro Liter destillierten Wassers enthält:

Technische Glucose k0 ; Maisstärke 20 ; Trypsinhydrolysat von Casein 20 ; Malzextrakt 10 ■; Natriumnitrat 3 I Monokali umphosphat 1 j Magnesiumsulfatheptahydrat 0,5 ; Kaliumchlorid 0,5. ; Ferrosulfatheptahydrat 20 mg.

Die Inkubation des beimpften Kolbens wurde bei 28°C auf

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I b 1 B b O 6

einer rotierenden Schüttelmaschine wie in Beispiel 1 durchgeführt. Nach 48-stündiger Inkubation wurden 50 ml der gebildeten Kultur in einen l4-Liter Gärbottich mit 8,5 Liter der oben beschriebenen Nährlösung gegeben. Die Inkubation in dem Bottich wurde bei 32⁰C, einem Luftstrom, von 3 Li.ter pro Minute und einer Rührgeschwindigkeit von 700 Umdrehungen pro Minute durchgeführt. Ein Silikon-Demulgator wurde zugesetzt, um die Schaumbildung zu verhindern.

Nachdem die Kultur 55 Stunden in dem Bottich war, wurde der pH mittels einer entsprechenden Menge steriler Natriumhydroxidlösung auf 5,7 eingestellt und auf + 0^2 pH-*Einheiten für die Dauer der Fermentation gehalten. Nachdem der pH eingestellt war, wurden 3*5 g Cineron, gelöst in 35 ml Aethanol, zugegeben und die Fermentation während 88 Stunden fortgesetzt. Danach wurde filtriert und das klare Filtrat wie in Beispiel 2 weiterbehandelt. Das Destillat wurde an 10 g Silikagel chromatographiert und mit 8$ Aethylacetat in Benzol eluiert, wobei Cinerolon erhalten wurde.

Beispiel 4

Die Fermentation wurde mit Aspergillus niger NRRL 3228 wie in Beispiel 3 durchgeführt, mit der Einschränkung, dass vor der Zugabe des Cineron der pH auf 4,5 eingestellt wurde und für die Dauer der Fermentation mittels automatischer Kontrolle auf

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■ - 19 -■ ■ 161BbÜ6

diesen Wert + 0,2 Einheiten gehalten wurde« Die nach der Fermentatiönsperiode verbleibenden 5*3 Liter Brühe wurden wie in Beispiel 2 verarbeitet. Das Destillat wurde an 10 g Silikagel chromatographiert und mit 6$ Aeth^dcetat in Benzol eluiert, wobei Cinerolon erhalten wurde.

Beispiel 5 .

Dieses Beispiel illustriert die Skala an Fungi, welche fähig sind Gineron in Gineroion überzuführen _o

Es wurden Sporenkulturen einer Vielzahl von speziellen Organismen wie in Beispiel 1 hergestellt» 500 ml Erlenmeyerkolben, welche 100 ml einer für jeden Organismus passenden Nährlösung enthielten, wyrden" dann mit einer genügenden Menge frischer Sporen beimpft.. Alle Kolben wurden inkubiert, mit Gineron versetzt und dann nach Beispiel 1 analysiert. Die Leistungen der verschiedenen Mikroorganismen sind in der folgenden Tabelle zusammengestellt: .

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Organismus

Mucor hiemalis Wehmer CBS Mucor parasiticus ATCC 6476 Penicillium cyclopium ATCC 11,145 Penicillium javanicum QM I876M Penicillium lilacinum QM 1O34M Rhizopus arrhizus NRRL 2286 Rhizopus nigricans NRRL 1477 Serratia marcescens QMB 1466 Staphylococcus sp. QMB 821 Streptomyces aureofaciens ATCC 10,762 Streptomyces fradiae (Waksman et Curtis) CBS

Streptomyces griseus NRRL 3231 Thermophile streptomycete NRRL 3233 Thermophile streptomycete NRRL 3232 Trichoderma lignorum QM 216m Trichothecium roseum ATCC 12,543

mg/l Cinerolon aus 500 mg/l Cineron	% Umwandlung von Cineron. in Cinerolon
^ 30	6
31	6
r^ 25	5
30	6
68	14
111	21
62	12
^9 .	10
62	12
762 212	42
19	4
33	6
233 178 *	9*
232 104*	5*
95 ■	19
.55	11

Ausgangskonzentration an Cineron =* 2 g/Liter.

1 χ= Bezeichnung gemäss Katalog des Centraalbureau voor Schimmel-

cultures

2 = Nummernmässige Bezeichnung in der Sammlung des Quartermaster

Research and Development Center

3 = Nummernmässige Bezeichnung in der Sammlung der American Type

Culture Collection

4 β Nummernmässige Bezeichnung in der Sammlung der Northern

Utilization Research and Development Division

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φι

-•afc-

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Beispiel 6 "

Ein Schrägagar wurde mit Bacillus pumilus ATCC 6631 beimpft und der Inkubation bei 28°C überlassen. Der Sehrägagarnährboden bestand aus: Trypsinhydrolysat von Casein 1,7$; Enaymhydrolysat von Sojamehl 0,3$; Natriumchlorid 0,3^; Dikaliumphosphat 0,25$; Dextrose 0,25$; Agar2$; der Rest war destilliertes Wasser. Nach 48 Stunden wurde die gebildete Kultur in 20 ml sterilem Wasser suspendiert, und 2 ml dieser Suspension in einen ■ 500 ml Erlenmeyerkolben übertragen, in welche.m sich 100 ml steriles Permentationsmedium befanden. Die Zusammensetzung dieses Fermentationsrnediums war dieselbe wie oben angegeben, jedoch unter Weglassung des Agar. Die Inkubation des beimpften Kolbens wurde bei 28⁰C auf einer rotierenden Schüttelmaschine vorgenommen. Innerhalb 48 Stunden war der pH des Mediums von 7,2 auf 6,4 abgesunken. Zu diesem Zeitpunkt wurden 50 mg Cineron, gelöst in 2 ml Aethanol, zugegeben und die Inkubation unter Schütteln fortgesetzt. Drei Tage nach Zugabe des Cineron wurde eine Probe der Fermentationslösung wie folgt untersucht:

Es wurden 5 ^ffll Brühe entnommen und mit 1,0ml chromatographisch reinem Methylisobuty!keton extrahiert, 50 Mikroliter des klaren Extrakts wurden auf einer Dünnschiohtchromatographieplatte auf fluoreszierendes Silikagel aufgetragen und trocknen gelassen. Die Platte wurde mit Äethylacetat/Benzoi' (6Ö:4O) entwickelt, dann getrocknet und die auftretenden Flecken unter

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UV-Licht sichtbar gemacht. Der das Cinerolon darstellende Fleck wurde mit 5 ml Aethanol von der Platte eluiert. Nach Entfernung des Adsorbens wurde die aethanolische Lösung mit frischem Aethanol verdünnt und der Brechungsindex der Lösung bei 230 πιμ bestimmt. So wurde die Anwesenheit von Cinerolon durch Vergleich mit dem Wert für reines Cinerolon aufgezeigt.

Beispiel 7

'■■·...

Ein Schrägagar wurde mit einer Kultur von therrnophilen Streptomycete sp. NRRL 3232 bestrichen und bei einer konstanten Temperatur von 48 C zur Inkubation gegeben. Der Nährboden hatte folgende Zusammensetzung in Gramm pro Liter destillierten Wassers:

Enzymhydrolysat von Sojamehl 2; Rückstand aus wässrigem Hefeextrakt 2; Trypsinhydrolysat von Casein 5i lösliche Stärke 10; Mannit.5; Magnesiumsulfatheptahydrat 0,2; ' Ammoniumferrosulfat 10 mg; Zinkchlorid 2,1 mg; Mangan II

Chlorid.4H₂O :1,8 mg; Kupfersulf at. 5H₂O 0,3 mg; Kobaltnitrat 0,5 mg; Borsäure 0,6 mg; Agar 20 g.

Binnen 24 Stunden hatte sich eine ausgiebige Kultur entwickelt. _; Diese Kultur wurde in 10 ml sterilem Wasser suspendiert und 1 ml dieser Suspension in einen 5OO ml Kolben überführt, welcher 100 ml • .Nährlösung enthielt, deren Zusammensetzung die gleiche war wie oben, mit dem Unterschied., dass kein Agar zugegen war. Der be-

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impfte Kolben wurde bei"48°C auf einer rotierenden Schüttelmaschine geschüttelt. Nach 2k Stunden hatte sich eine starke Kultur entwickelt und der pH des Mediums war von 7/0 auf 8,4 angestiegen. Nun wurden 200 mg Cineron, gelöst in 2 ml Aethanol, zugesetzt und die Inkubation fortgeführt. 5 Tage nach Zugabe des Cineron konnte in einer nach Beispiel 1 untersuchten·Probe Cinerolon nachgewiesen werden. -. . .

Beispiel 8

Der Vorgang war derselbe wie in Beispiel 7 beschrieben, mit dem Unterschied, dass hier ein Fermentationsmedium folgender Zusammensetzung, in Gramm pro Liter destillierten Wassers, verwendet wurde: ] . ■

Enzymhydrolysat von Milchprotein 20; getrocknete Brauerei-' hefe 3; Maisstärke 10; Ammoniumferr©sulfat 10·mg; Zink-Chlorid 2,1 mg; Mangan{II}chlorid.4H₂0 1,8 mg; Kupfersulf at.5H₂O 0,3 mg; Kobaltnitrat 0,5 mg; Borsäure 0,6 mg.

Das Fermentationsmedium wurde vier Tage nach Zugabe des Cineron untersucht und es wurde gefunden, dass der Kolben Cinerolon enthielt. -

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Beispiel 9

Eine.Kultur von zwei mit Sporen von A.niger ATCC 9142 beimpften Agarflachen wurde in 20 ml sterilem Wasser suspendiert. Die Agarflächen hatten folgende Zusammensetzung in Gramm pro Liter destillierten Wassers:

Honig 50; Pepton 10; Agar 20.

Je 10 ml dieser Suspension wurden in je einen von zwei gerührten 14 Liter Gärbottiche überführt, welche jeweils 8,5 Liter Fermentationsmedium folgender Zusammensetzung, in Gramm pro Liter destillierten Wassers enthielten:

Technische Glucose 20; Magnesiumsulfat.7H₂O 1,5; Monokali umphosphat 1,5J Ammoniumnitrat 1,0; Eindampfrückstand von Maisquellwasser 1,0; enzymhydrolysiertes Laktalbumin 1,0; 1-Glutaminsäure 0,5; autolysierte Hefe 0,5; Zinksulf at.7H₂O 10 mg. .

Der pH wurde vor der Sterilisierung mit Kaliumhydroxyd auf 6,8 eingestellt, und 5 ml 5$iges Trimethylsilan als Demulgator zugesetzt. Die Permentatoren wurden in Autoklaven bei 12Q°C 30 Minuten sterilisiert und dann rasch abgekühlt.

Nach dem Beimpfen wurden die Fermentatoren bei 2ö°C, bei

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einer Rührgeschwindigkeit von 550 Umdrehungen -pro Minute und · einem Luft strom von k !Liter pro Minute inkubiert* Innerhalb 3 Tagen enstand in jedem Bottich eine dichte Kuitur und der pH. war auf 2,2-2,3 abgesunken. Der pH.wurde dann mit steriler 5n Natronlauge wieder auf ^O^elnges-tellt. Aus "jedem Bottich entnahm man 20,100 ml Kulturanteile, welche aseptisch in sterile 500 ml Erlenmeyerkolben gefüllt wurden.

In jeden dieserart gefüllten KQ Kolben wurden 50 ^mS* 3-Methyl-2-propyl-cyclopent-2-enon, gelöst irT 1 ml trockenem Aethanol, zugesetzt. Die Kolben wurden dann unter Schütteln bei '28⁰C inkubiert. STach- 9Tagen wurde der Inhalt dieser Kolben zusammengeschüttet und mit Diäthyläther extrahiert. Man erhielt 4-Hydroxy-3-methyl-2-propyl-'Cyclopent-2-enon, (breit), 5,88μ und 6,05Mi )v^G!i!^90H 232(10,90Oh Molelculargewicht

durch Massenspektroskopie = 154.

- . ^; Beispiel 10 V ■■.-..

Ein aliquoter Teil einer 2.Tage alten,_; schweren Myzel-

erhalten nach: Beispiel 1, wurde filtriert um das Myzel· von, dem Fitltrat zu; trennen» Ein Schleifmittel iTonerde) wurde z^ii dam My^gI gegeben un<i das Gemison solange zerrieben bis die

Myzeifädert ^um gross ten Teil zerrissen waren. 30^ des klaren Fllfcrates wurdsii zu dem zerriebene» Teig gegeben und das Ganze gut v#i?misöhfc« Bas Gemiseli wuräe auf ein. Filter gegossen, dessen

Porengrösse durchschnittlich 0,2 Mikron betrug. Ss wurde durch einen mikrobiologischen Standardtest gezeigt, dass die durch das Filtrat hindurchgehende Flüssigkeit (zellfreies Filtrat) frei war von. jeglichen lebenden Asperglllus niger, sowie von ^:glichen anderen Mikroorganismen. Dem zellfreien Filtrat wurde Cine'ron (50 mg/ml- 95$ Aethanol) bis zu einer Endkonzentration von 500 Mikrogramm pro ml zugesetzt. Der Kolben mit dieser Mischung wurde auf einer Schüttelmaschine geschüttelt. Nach.einem Tag wurde eine 2 ml Probe der Mischung mit Methylenchlorid extrahiert und mittels Dünnschichtchromatographie nach Beispiel 6 untersucht, wobei die Anwesenheit von Cinerolon festgestellt wurde.

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Claims (1)

1. If18506

   - -, - Patentansprüche ~

   1» Verfahren zur^ Herstellung von substituierten CyclojJent-2-enonen der allgemeinen Formel ^h-: <

   worin Reine Alkyl-,* Alkenyl- oder Alkadienylgruppe mit 3-5 kohlenstoffatomenbedeutet,

   dadurch gekemizeichnet/dass man eine Verbindung der allgemeinen .Formel""- .; ". ^;; > ^ -:■-^;"-■■;".- - -' -·ν -.""-. - - . .

   worin R die obige Bedeutung hat, r «nzymätiiSch hyärpxyliert«

   2V Erfahren nach Anspruch 1, dadurch gelcennzieiGtiriet, dass man die enzymätische HydroxyIierung mit einem Enzymsystem von Mikroorganismen der Abteilung JSumycophytä oder Schizomycophyta durchführiiv■"■ -: / : ; " ; ^v; ■ " ".'

   -; J» .Verfahren nach Ansprach 1 oder>._.2_f dadurah gekeimzeich-

   : 10s a 11/^2109 ■■".-■■ ■^::ν,:^Λ"::^:---": ■"/

   net, dass man die enzymatische Hydroxylierung mit einem Enzymsystem von Mikroorganismen der Klasse Phycomycetes, Ascomycetes, Deuteromycetes, Basidiomycetes, Schizomyeetes oder Schizophyceae durchführt.

   4. Verfahren nach Anspruch 1, 2 oder 3* dadurch gekennzeichnet, dass man die enzymatische·Hydroxylierung mit einem Enzymsystem von Mikroorganismen der Ordnung Mucorales, Plectascineae, Sphaeriales, Moniliales, Dacrymycetales, Actinomycetales, Eubacteriale.s .oder Pseudomonodales durchführt.

   5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-k, dadurch gekennzeichnet, dass man die enzymatische Hydroxylierung mit einem Enzymsystem von Mikroorganismen der Familie Mucoraceae^Tliamnidaceae, Aspergillaceae, Chaetomiaceae, Moniliaceae, Dematiaceae, Tuberculariaceae, Dacrymycetaceae, Streptomycetaceae, Bacillaceae, Mikrococcaceae, Enterobacteriaceae oder Spirillaceae durchführt.

   6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-5, dadurch gekennzeichnet, dass man die enzymatische Hydroxylierung mit einem Enzymsystem von Mikroorganismen der Gattung Mucor, Rhizopus, He Ii c os ty Ium,· Aspergillüs, Penicillium, Chaetomium,· Beauvaria, Trichothecium, Trichoderma, Curvularia, Cylindrocarpon, Fusarium, Dacrymyces, Dacryopinax, Streptomyces, Bacillus, Staphylococcus,

   Serratia oder Cellvibrio durchführt.

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   7. Verfahren nach einem der Ansprüche·1-6, dadurch gekennzeichnet, dass man die enzymatische Hydroxylierung mit einem Enzymsystem von Mikroorganismen der Spezies Mucor hiemalis, Mucor parasiticus, Rhizopus arrhizus, Rhizopus nigri.cans, Helicostylum pyriforme, Aspergillus ehevalieri, Aspergillus clavatus, Aspergillus fasciGulatuSj Aspergillus flavus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Aspergillus tamarii, Penioillium cyclopium JPenicillium javanicum, Penicillium lilacinum, Chaetomium globosum, Beauvaria bassiana, Trichothecium roseuni,, Triohoderma lignorum, Gurvularia lunata, Curvularia pallesoens, Cylindrocarpon radioieola, Fusarium culmorum, Dacrymyces delisuescens, Dacryopinax spathularia, Streptomyoes auredfaciens, Steptoraybes fradiae, Streptomyces griseus, Baoillus alvei. Bacillus pumilus, Serratia mareescens, oder Cellvibrio vulgaris durchführt.

   S* Verfahren nach einem der Ansprüeite "b*7_f daiäurch ge- kenn^etchnet, dass man. als Ausg^ngsmätsriai der Pommel ti eine Verfclad"usg verweiidet, worin it eine ASkenylgjpuppe jjiii 3*5 Kohlen-

   l§fiff/f fit

   kennzeichnet, dass man als Ausgangsmaterial der Formel II eine Verbindung verwendet, worin R eine Alkylgruppe mit 3-5 Kohlenstoffatomen bedeutet.

   11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-7>und 10, dadurch gekennzeichnet, dass man als Ausgangsmaterial der Formel II eine Verbindung verwendet, worin R eine n-Propylgruppe ist.

   12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-11, dadurch
   gekennzeichnet, dass man zur Durchführung der Hydroxylierung
   ein zellfreies Enzymsystem verwendet.