DE2215509B2

DE2215509B2 - Vernetzte Copolymerisate

Info

Publication number: DE2215509B2
Application number: DE2215509A
Authority: DE
Inventors: Herbert Dr. 5074 Odental Bartl; Bruno Dr. 5090 Leverkusen Boemer; Fritz Dr. Hueper; Erich Dr. Rauenbusch; Guenter Dr. Schmidt-Kastner
Original assignee: Bayer AG
Current assignee: Bayer AG
Priority date: 1972-03-30
Filing date: 1972-03-30
Publication date: 1979-10-04
Also published as: DE2215509C3; DE2215509A1

Description

Die covalente Bindung von Substanzen an unlösliche polymere Träger hat in den letzten Jahren zunehmend an Bedeutung gewonnen. Besondere Vorteile bietet die Fixierung von katalytisch wirksamen Verbindungen, z. B. Enzymen, da sie in dieser Form nach beendeter Umsetzung leicht abgetrennt und mehrfach wiederverwendet werden können.

Als Träger mit reaktiven Gruppen wurden bereits mehrfach Copolymerisate aus Maleinsäureanhydrid und Vinylverbindungen vorgeschlagen. Copolymere des Maleinsäureanhydrids mit Äthylen und Monovinylverbindungen werden jedoch bei der Umsetzung mit wäßrigen Enzymlösungen mehr oder weniger wasserlöslich, so daß vor oder während der Umsetzung zweckmäßig ein zusätzlicher Vernetzer z. B. ein Diamin zugesetzt wird. So erhaltene Enzympräparate sind !relativ schlecht filtrierbar und besitzen lösliche Anteile, was zu Verlusten an gebundenem Enzym führt(vergl.E. Katchalski, Biochemistry 3, [1964], Seiten 1905-1919).

Ferner wurden Copolymerisate aus Acrylamid und Maleinsäure beschrieben, die durch nachträgliches Erhitzen in die Anhydridform überführt werden. Diese Produkte sind relativ schwach vernetzt, quellen sehr stark in Wasser und besitzen eine nur mäßige mechanische Stabilität, was zu Abriebsverlusten bei der Anwendung dieser Harze führt (vergl. DE-OS 1908290).

Außerdem wurden stark vernetzte Trägerpolymere durch Copolymerisation von Maleinssureanhydrid mit Divinyläthern hergestellt. Aufgrund der alternierenden Copolymerisationsart der Monomeren enthalten diese Polymeren einen sehr hohen Anteil an Anhydridgruppen - in den angegebenen Beispielen jeweils über 50 Gew.-% Maleinsäureanhydrid —, der durch das Molekulargewicht des Vinyläthermonomeren bestimmt wird und daher nur in relativ engen Grenzen dem jeweiligen Verwendungszweck angepaßt werden kann (vergl. DE-OS 2008996).

Aufgabe der Erfindung war es, neue, stark vernetzte, in Wasser quellfähige Copolymerisate mit stark variierbarem Gehalt an cyclischen Dicarbonsäureanhydridgruppen und ein Verfahren zu ihrer Herstellung aufzufinden. Bezüglich ihrer Verwendung zur Fixierung von Substanzen, die mit Anhydridgruppen reagieren können, sollten sie die Nachteile der bisher bekannten Trägermaterialien nicht bzw. in geringerem Maße aufweisen.

Die Aufgabe wurde dadurch gelöst, daß nach den Methoden der Perl- oder Fällungspolymerisation Anhydride a, ^-monoolefinisch ungesättigter Dicarbonsäuren und Di- oder Poly-(Meth)Acrylate von Dioder Polyolen zu statistisch aufgebauten Copolymerisaten polymerisiert wurden.

Gegenstand der Erfindung sind somit vernetzte Copolymerisate bestehend aus copolymerisierten Einheiten von

A) 0,1 bis 50 Gew.-%, vorzugsweise 2 bis 20 Gew.-% a, /3-monoolefinisch ungesättigten Dicarbonsäureanhydriden mit 4 bis 9 Kohlenstoffatomen und

B) 99,9 bis 50Gew.-%, vorzugsweise 80 bis 98 Gew.-% Di- und/oder Poly-(Meth)Acrylaten von Di- und/oder Polyolen,

wobei die vernetzten Copolymerisate Schüttvolumina von 1,4 bis 30, vorzugsweise von 2 bis 20 ml/g und spezifische Oberflächen von 0,1 bis 500, vorzugsweise von 1 bis 400 mVg besitzen und nach der Verseifung der Anhydridgruppen 0,02 bis 10, vorzugsweise 0,4 bis 4 Milliäquivalente Säure pro Gramm enthalten.

Die spezifischen Oberflächen werden nach der BET-Methode (DIN 66131 und 66132) bestimmt. Zur Bestimmung des Säuregehaltes nach Verseifung der Anhydridgruppen werden 1 g Polymerisat mit einem Überschuß von 0,1 η NaOH versetzt und im geschlossenen Gefäß unter gelegentlichem Umschütteln 16-24 Stunden bei Raumtemperatur belassen. Anschließend wird die nicht verbrauchte Lauge mit 0,1 η HCl gegen Phenolphthalein zurücktitriert, bis die Lösung 30 Sekunden farblos bleibt. 1 ml verbrauchte 0,1 η NaOH entspricht 0,1 m Äquiv/g.

Gegenstand der Erfindung ist weiter ein Verfahren zur Herstellung dieser Copolymerisate, dadurch gekennzeichnet, daß man - bezogen auf Gesamtmonomere -

A) 0,1 bis 70Gew.-%, vorzugsweise 2 bis 35 Gew.-% α, /3-monoolefinisch ungesättigte Dicarbonsäureanhydride mit 4 bis 9 Kohlenstoffatome, und

B) 99,9 bis 30 Gew.-%, vorzugsweise 98 bis

65 Gew.-% Di- und/oder Poly-(Meth)Acrylate von Di- und/oder Polyolen

nach der Methode der Fällungspolymerisation oder der Perlpolymerisation in Lösungsmitteln oder Lösungsmittelgemischen, die gegen Anhydridgruppen inert sind, bei Temperaturen von 20 bis 200° C in Gegenwart Radikale bildender Verbindungen polymerisiert.

Gegenstand der Erfindung ist auch die Verwendung der erfindungsgemäß erhaltenen Copolymerisate zur Fixierung von Substanzen, die mit den Anhydridgruppen der Copolymerisate reagieren können.

Als a, /3-monoolefinisch ungesättigte Dicarbonsäureanhydride mit 4 bis 9, vorzugsweise 4 bis 5 Kohlenstoffatomen seien namentlich genannt: Maleinsäure-, Itaconsäure- oder Citraconsäureanhydrid, insbesondere Maleinsäureanhydrid. Für die Copolymerisation können auch Mischungen dieser Anhydride eingesetzt werden.

Die erfindungsgemäß zu verwendenden Di- und/ oder Polymethacrylate bzw. Di- und/oder Polyacrylate von Di- und/oder Polyolen leiten sich von Verbindungen mit mindestens 2 alkoholischen oder phenolischen, vorzugsweise alkoholischen OH-Gruppen bzw. deren Umsetzungsprodukten mit Alkylenoxiden mit 2 bis 8 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise 2 bis 4 Kohlenstoffatomen oder Gemischen dieser Alkylenoxide ab, wobei an 1 Mol der Hydroxylgruppen tragenden Verbindung 1 bis 10⁴, vorzugsweise 1 bis 20 Alkylenoxidbausteine anpolymerisiert sind. Beispielhaft seien Alkylenoxide, Äthylenoxid, Propylenoxid, Butylenoxid, Trimethylenoxid, Tetramethylenoxid, vorzugsweise Äthylenoxid und Propylenoxid genannt.

Die erfindungsgemäß einzusetzenden Di- und Poiy-(Meth)Acrylate von Di- und Polyolen werden nach bekannten Methoden., beispielsweise durch Umsetzung der Di- und/oder Polyole mit (Meth)-Acrylsäurechlorid in Gegenwart von in etwa äquimolaren Mengen, bezogen auf Säurechlorid, an tert. Aminen wie Triäthylamin, bei Temperaturen unter 20° C, in Anwesenheit von Benzol gewonnen (vergl. DE-OS 1907666).

Als Di- bzw. Polyole mit mindestens 2 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise 2 bis 12 Kohlenstoffatomen kommen z. B. in Frage: Äthylenglykol, Propandiol-1,2, Propandiol-1,3, Butandiole insbesondere Butandiol-1,4, Hexandiole, Dekandiole, Glyzerin, Trimethylolpropan, Pentaerythrit, Sorbit, Sucrose und deren Umsetzungsprodukte mit Alkylenoxiden, wie vorstehend angegeben. Es können auch Gemische aus Di- und Polyolen eingesetzt werden.

Vorzugsweise werden Diacrylate bzw. Dimethacrylate von Diolen mit 2 bis 4 Kohlenstoffatomen und/oder Umsetzungsprodukten von einem Mol dieser Diole mit 1 bis 20 Molen Alkylenoxid mit 2 bis 4 Kohlenstoffatomen bzw. Trimethylolpropantrimethacrylat verwendet.

Besonders vorteilhaft sind die Dimethacrylate von Äthylenglykol, Diäthylenglykol, Triäthylenglykol, Tetraäthylenglykol oder höheren Polyalkylglykolen mit Molgewichten bis 1000 oder deren Gemische.

Falls gewünscht, können neben den erfindungsgemäß zu verwendenden Di- und/oder PoIy-(Meth)Acrylaten auch üblicherweise verwendete Vernetzungsmittel mit mindestens 2 nichtkonjugierten Doppelbindungen, etwa Divinyladipat, Methylenbisacrylamid, Triacrylformal oder Triallylcyanurat in

Mengen von etwa 0,01 bis 30 Gew.-% der Monomerenmischung zugesetzt werden.

Aufgrund der möglichen Variationsbreite in der Zusammensetzung der Monomerenmischungen können innerhalb eines sehr weiten Bereiches Hydrophi-He, Vernetzungsdichte, Quellbarkeit und Anhydridgruppengehalt der erfindungsgemäßen Copolymerisate dem jeweiligen Verwendungszweck angepaßt werden.

Die Polymerisation kann z. B. in einem organischen Lösungsmittel als Fällungspolymerisation durchgeführt werden, wobei die Polymeren bereits kurz nach dem Einsetzen der Polymerisation auszufallen beginnen. An sich sind alle gegen Anhydridgruppen inerten Lösungsmittel geeignet. Besonders günstige Lösungsmittel sind aliphatische, cycloaliphatische und aromatische Kohlenwasserstoffe sowie halogensubstituierte Kohlenwasserstoffe, Aikylaromaten und Carbonsäureester.

Beispielhaft seien genannt: Heptan, Octan, Isooctan, Benzinfraktionen mit Siedpunkten von etwa 60 bis 200° C, Cyclohexan, Benzol, Toluol, Xylole, Chlorbenzol, Dichlorbenzole, Äthylacetat, Butylacetat.

Die Lösungsmittel sollen vorzugsweise einen Siedepunkt von mindestens 6O⁰C besitzen und im Vakuum gut aus dem Fällungspolymerisat entfernbar sein. Für 1 Teil der Monomerenmischung verwendet man etwa 2 bis 50, bevorzugt 5 bis 20 Gew.-Teile, des Lösungsmittels. Die Eigenschaften der Copolymerisate, besonders das Schüttgewicht und die spezifische Oberfläche werden durch Art und Menge des Lösungsmittels wesentlich beeinflußt.

In vielen Fällen ist es vorteilhaft, Gemische der obengenannten Lösungsmittel zu verwenden, oder die Polymerisation in einem Lösungsmittel für das Polymere zu beginnen und im Verlauf der Polymerisation kontinuierlich ein Fällungsmittel für das Polymere zuzugeben. Das Fällungsmittel kann auch zu bestimmten Zeitpunkten in einer oder mehreren Portionen zugegeben werden. Außerdem kann die Monomerenmischung zusammen mit einem geeigneten Initiator als Lösung oder ohne Lösungsmittel in eine vorgelegte Lösungsmittelmenge eingespeist werden, so daß während der Polymerisation eine gleichmäßige, geringe Monomerkonzentration aufrecht erhalten wird. Durch Verwendung von (Meth)-Acrylmonomeren unterschiedlicher Hydrophilie und Variation der Polymerisationsbedingungen lassen sich innerhalb eines sehr weiten Bereiches Produkte mit dem jeweiligen Verwendungszweck angepaßter Quellbarkeit, Dichte und spezifischer Oberfläche bei guter mechanischer Stabilität herstellen.

Die erfindungsgemäßen Copolymerisate können auch durch Suspensionspolymerisation hergestellt werden. Die Suspensionspolymerisation wird zweckmäßig in organischem Medium durchgeführt. Die Monomeren und der Initiator werden in einem mit Paraffinen nicht mischbaren, gegen Anhydridgruppen inerten Lösungsmittel wie Acetonitril, Dimethylformamid, Dimethylsulfoxid oder Hexamethylphosphorsäuretriamid gelöst und meistens unter Zusatz von Dispergatoren in der zusammenhängenden Phase verteilt. Als zusammenhänge Phase eignen sich besonders Paraffinkohlenwasserstoffe, wie Hexan, Heptan, Octan und höhere Homologe, Cycloaliphaten wie Cyclohexan sowie Paraffingemische wie Benzinfraktionen oder Paraffinöl. Das Volumenverhältnis, zu-

sammenhängende Phase: Monomerphase beträgt 1:1 bis 10:1, vorzugsweise 2:1 bis 5:1.

Zur Stabilisierung der Suspension können beispielsweise Glycerin-mono- und dioleate sowie Gemische dieser Verbindungen, Sorbitan-mono- und ^r> trioleate bzw. -stearate, Polyäthylenglykolmonoäther mit Stearyl- bzw. Laurylalkohol oder Nonylphenol, Polyäthylenglykolmonoester mit ölsäure, Stearinsäure und anderen Fettsäuren mit mehr als 10 C-Atomen sowie das Na-SaIz des Sulfobernsteinsäuredioc- '< > tylesters verwendet werden. Diese Stoffe werden in mengen von vorzugsweise 0,1 bis 10%, bezogen auf die Monomeremaischung, eingesetzt und allgemein in der Kohlenwasserstoffphase gelöst. Die Partikelgröße der Suspensionspolymerisate kann außer durch Ver- ι größerung der Rührgeschwindigkeit durch Zugabe von 0,1 bis 2%, bezogen auf Monomere, einer weiteren oberflächenaktiven Substanz, z. B. eines Alkylsulfonates verringert werden.

Die Polymerisation wird durch radikalische Initia- -'« toren ausgelöst. Geeignete Initiatoren sind z. B. Azoverbindungen oder Perverbindungen. Die zur Polymerisationsauslösung gebräuchlichste Azoverbindung ist das Azoisobuttersäurenitril. Als Perverbindungen kommen hauptsächlich Diacylperoxide wie Diben- 2> zoylperoxid, oder Percarbonate, wie Diisopropyl- und Dicyclohexylpercarbonat, in Frage, es können jedoch auch Diacylperoxide, Hydroperoxide und in organischen Lösungsmitteln wirksame Redoxsysteme zur Initiierung verwendet werden. 3< >

Die Initiatoren werden in Mengen von 0,01 bis 10%, vorzugsweise 0,1 bis 3%, bezogen auf die Gewichtsmenge der Monomermischung zugesetzt.

Die Polymerisation wird bei Temperaturen von etwa 20 bis 200° C, vorzugsweise 50 bis 100° C in r> Abhängigkeit von der Zerfallsgeschwindigkeit der Initiatoren und meistens unterhalb des Siedepunktes der Lösungsmittel und bei Perlpolymerisationen unterhalb der Mischungstemperatur der beiden Phasen durchgeführt. Außerdem ist es in der Regel vorteilhaft, in inerter Atmosphäre unter Abwesenheit von Sauerstoff zu polymerisieren.

Die durch Fällungspolymerisation erhaltenen Copolymerisate sind farblose bis schwach gelb gefärbte, pulvrige Substanzen mit Schüttvolumina von 1,5 bis 30 ml/g, vorzugsweise 2 bis 20 ml/g und spezifischen Oberflächen von 0,1 bis 500 mVg, bevorzugt 1 bis 400 m²/g. Der nach Verseifung der Anhydridgruppen titrimetrisch bestimmte Gehalt an Carboxylgruppen liegt bei 0,02 bis 10 mÄquiv/g, vorzugsweise bei 0,4 >o bis 4 mÄquiv/g.

Die Suspensionspolymerisate sind weiße oder schwach gefärbte Perlen, die in einigen Fällen unregelmäßig geformt sein können und einen Durchmesser von 0,03 bis 1 mm, vorzugsweise 0,05 bis 0,5 mm und Schüttvolumina von etwa 1,4 bis 8 ml/g, vorzugsweise 1,4 bis 5 ml/g, besitzen. Ihr nach der Hydrolyse der Anhydridgruppen bestimmter Carboxylgruppe ngehalt beträgt 0,02 bis 10 mÄquiv/g, vorzugsweise 0,4 bis 4 mÄquiv/g. to

Die erfindungsgemäßen Copolymerisate enthalten die copolymerisierten Einheiten statistisch verteilt. Aufgrund ihrer hohen Vernetzungsdichte sind die Copolymerisate in allen Lösungsmitteln unlöslich. Molekulargewichte sind daher nicht bestimmbar.

Die Copolymerisate können in Wasser auf das 1,1 bis 2,5fache ihres Schüttvolumens quellen. Sie eignen sich vorzüglich als Trägerharze zur Fixierung von Substanzen, die mit den Anhydridgruppen der Copolymerisate reagieren können.

Die Trägerharze werden bei Temperaturen zwischen 0 und 30° C direkt in die wäßrige Lösung des zu bindenden Stoffes, vorzugsweise in die wäßrige Lösung eines Proteins eingetragen, wobei der pH-Wen konstant zu halten ist.

Sollen Proteine an die erfindungsgemäßen Copolymerisate gebunden werden, so arbeitet man zweckmäßigerweise mit einem pH-Staten in einem pH-Bereich von 3 bis 10, vorzugsweise von pH 5,5 bis pH 9,0. Wird als Protein Penicillinacylase eingesetzt, so arbeitet man zweckmäßigerweise zwischen pH 5,7 und pH 6,8. Während der Bindungsreaktion muß zur Konstanthaltung des pH-Bereiches ständig eine Base zugesetzt werden. Dabei kommen anorganische Basen (beispielsweise Alkalilaugen) und organische Basen (beispielsweise tertiäre organische Amine) in Frage.

Im Gegensatz zu den Erfahrungen der Literatur mit anderen Harzen, nach denen die Umsetzung in gepufferten Lösungen durchgeführt wird, waren die Ausbeuten an gebundenem Enzym mit den oben beschriebenen Harzen um so besser, je niedriger der Salzgehalt der Lösungen war.

Das Gewichtsverhältnis von gebundener Substanz, beispielsweise Protein bzw. Peptid zu Trägerharz kann in weiten Grenzen variiert und dem späteren Verwendungszweck angepaßt werden. Gute Ausbeute erhält man bei einem Verhältnis von 1 Gew.-Teil Protein zu 4 bis 10 Gew.-Teilen polymerem Träger. Die optimalen Verhältnisse sind jedoch sowohl von der Zusammensetzung und der Struktur des Polymeren als auch von der Art des Proteins abhängig. Bei zahlreichen Enzymen ist es zweckmäßig, Stabilisatoren der Enzymlösung zuzusetzen.

Als solche kommen Polyäthylenglykole oder nichtionische Netzmittel zur Abschwächung der Denaturierung an Oberflächen in Frage, sowie die bekannten SH-Reagentien oder Metallionen bei speziellen Enzymen.

Die notwendige Reaktionszeit ist abhängig von der Art des Polymeren. Im Notfall ist die Reaktion nach 20 Stunden bei Raumtemperatur abgeschlossen. Bei 4⁰C läuft die Reaktion besser noch etwas länger. Bei präparativen Ansätzen wird der Ansatz nicht früher als 2 Stunden nach Beendigung der Alkalizugabe durch den pH-Staten abgebrochen. Das Polymere mit dem gebundenen Protein wird hierauf abgesaugt oder abzentrifugiert und der Rückstand mit Salzlösungen hoher Ionenstärke, beispielsweise 1 M-Natriumchloridlösung, und anschließend mit einem Puffer gewaschen, in dem das Enzym stabil ist. Schließlich wird mit einer Lösung hoher Salzkonzentration gewaschen, wobei sich ionogen gebundes Protein vom Träger löst.

Zur Beurteilung des Erfolges der Proteinbindung wurde bei Enzymen die enzymatische Aktivität sowohl im Polymeren als auch in der Restlösung und in den Waschwassern bestimmt. Bei Proteinen ohne spezifische Wirkung wurde der Stickstoffgehalt im Polymeren nach K jeldahl bestimmt. Die Ausbeuten bei der Proteinbindung liegen zwischen 10 und über 80%. Betrachtet man die enzymatische Aktivität, so ist es in einigen Fällen vorteilhaft, keinen zu großen Überschuß an Polymermaterial zu verwenden, da sonst zwar das Protein vollständig gebunden wird, die Aktivität jedoch darunter leidet.

Die Trägerharze sind geeignet, alle Substanzen zu binden, die eine funktionell Gruppe tragen, die befä-

higt ist, mit der Anhydridgruppe des Polymeren zu reagieren. Bei den Proteinen und Peptiden sind dies vor allem die endständigen Aminogruppen des Lysins und die freien Aminogruppen der Peptidkettenenden.

An Träger gebundene Peptide und Proteine sind von großer wissenschaftlicher und technischer Bedeutung. Die in den meisten Fällen teuren und instabilen Enzyme werden durch die Bindung an das Harz wesentlich stabilisiert. Außerdem gestattet die leichte und vollständige Rückgewinnung des Enzymharzes eine vielfache Anwendung über lange Zeitspannen.

Folgende Substanzen können beispielsweise an die erfindungsgemäßen Copolymerisate fixiert werden:

Enzyme: Hydrolasen wie Proteasen, beispielsweise Trypsin, Chymotrypsin, Papain, Elastase; Amidasen, beispielsweise Asparaginase, Glutaminase, Urease; Acyltransferasen, beispielsweise Penicillinacylase; Lysen, beispielsweise Hyaluronidase.

Andere Proteine, wie Plasmabestandteile, Globuline (Antikörper).

Polypeptide, wie Kallikrein-Inhibitor oder Insulin. Aminosäuren wie Lysin oder Alanin.

Die erfindungsgemäß eingesetzten Proteine werden im allgemeinen aus Bakterien, Pilzen, Aktinomyceten oder aus tierischem Material gewonnen.

Einige Beispiele für technisch wichtige Umsetzungen iiiii gebundenen Enzymen sind der hydrolytische Abbau der Stärke durch covalent gebundene Amylase, die Klärung von Fruchtsäften u. a. durch gebundene Pektinase, die Herstellung enzymatisch abgebauter Eiweißhydrolysate, die Hydrolyse von Penicillinen zur 6-Aminopenicillansäure. Außerdem wurden auch gebundene Enzyme, Peptide u. a. zur Isolierung von Inhibitoren durch Affinitätschromatographie und umgekehrt gebundene Inhibitoren zur Isolierung von Enzymen verwendet. Andere Anwendungen liegen im Gebiet der Medizin. Ein Beispiel ist die Verwendung von gebundener L-Asparaginase oder Urease in einem extrakorporalen Kreislauf zur Erniedrigung des Asparagin- bzw. Harnstoffspiegels im Blut.

Die Siedepunkte in den Beispielen wurden bei Normaldruck bestimmt.

Beispiel la

80 g Tetraäthylenglykoldimethacrylat, 20 g Maleinsäureanhydrid und 1 g Azoisobuttersäurenitril werden in 1 1 Benzol gelöst und unter Rühren 4 Stunden auf 60⁰C erwärmt. Dann gibt man 1 g Azoisobuttersäurenitril und 200 ml Benzin (Kp 100-140⁰C) zu und polymerisiert weitere 5 Stunden bei 70° C. Das pulvrige Polymere wird abgesaugt, einmal in Benzol und dreimal in Petroläther (Kp 30-50° C) aufgeschlämmt und im Vakuum getrocknet.

Ausbeute: 94 g

Schüttvolumen: 3,5 ml/g

Quellvolumen in Wasser: 4,7 ml/g

spez. Oberfläche: 5 m²/g

Säuregehalt nach Verseifung der Anhydridgruppen: 3,5 mÄquiv/g

Beispiel Ib

1 gdes nach Beispiel 1 a hergestellten Trägerharzes wird in 30 ml einer wäßrigen Lösung von 120 U Penicillinacylase [spez. Aktivität 1 U/mg Protein (Biuret)] suspendiert. Unter Konstanthaltung des pH-Wertes auf 6,3 durch Zugabe von 1 N-Natronlauge mit einem pH-Staten wird die Suspension 20 Stunden bei 25° C gerührt. Anschließend saugt man über eine Glasfritte G3 ab und wäscht das Harz mit je 50 ml 0,05 M-Phosphatpuffer pH 7,5, der 1 M-Natriumchlorid enthält und mit dem selben Puffer ohne Natriumchlorid. Durch weiteres Waschen wird die Aktivität des Harzes "> nicht mehr verändert.

Enzymatische Aktivitäten (NIPAB-Test; C. Kutzbach und E. Rauenbusch Z. physiol. Chem. 354, [1974J, 43-53).

Ausgangslösung: 132 U
Überstand und Waschwasser: 12 U

Harz nach der Umsetzung: 86 U

das sind 65% der Ausgangsaktivität.

Die enzymatische Aktivität der Penicillin-Acylase wurde colorimetisch oder titrimetrisch mit 0,002 M- !■"' 6-Nitro-3-(N-phenylacetyl)-aminobenzoesäure (NI-PAB) als Substrat bei pH 7,5 und 25° C gemessen. Der molare Extinktionskoeffizient der entstehenden 6-Nitro-3-aminobenzoesäure beträgt E_{405 nm} = 9090.

Einheit (U) entspricht dem Umsatz von ΙμΜοΙ Sub- -" strat pro Minute.

Beispiel 2a

Eine Lösung von 90 g Äthylenglykoldimethacrylat, g Maleinsäureanhydrid und 1 g Azoisobuttersäu- -¹"' renitril in 1 1 Benzol wird unter Rühren zunächst bei 60° C polymerisiert. Nach 4 Stunden gibt man 200 ml Benzin (Kp 100-140° C) und 1 g Azoisobuttersäurenitril zu und polymerisiert 2 Stunden bei 70° C und Stunden bei 80° C weiter.

i» Anschließend saugt man das Polymere ab, wäscht gründlich mit Petroläther (Kp 30-50° C) und trocknet im Vakuum.
Ausbeute: 97 g
Schüttelvolumen: 6,4 ml/g
r> Quellvolumen in Wasser: 8,0 ml/g
spez. Oberfläche: 298 m²/g
Säuregehalt nach Verseifung der Anhydridgruppen 1,5 mÄquiv/g

_4II Beispiel 2b

6 g des nach Beispiel 2 a erhaltenen Trägerharzes wurden analog zu Beispiel 1 b mit 590 U Penicillin-Acylase in 165 ml Wasser umgesetzt.

Ergebnis:

■n Enzymische Aktivitäten (NIPAB-Test)
Ausgangslösung: 590 U
Überstand und Waschwasser: 26 U
Trägerharz nach der Umsetzung: 325 U
das sind 60% der Ausgangsaktivität.

Beispiel 2c

1 g des nach Beispiel 2 a erhaltenen Trägerharzes wurde analog zu Beispiel ibmit 100 mg Asparaginase umgesetzt.

Enzymatische Aktivitäten (Asparagin-Hydrolyse) Ausgangslösung: 21000 U
Überstand nach der Umsetzung: 3360 U
Trägerharz nach der Umsetzung: 3910 U
das sind 19% der Ausgangsaktivität.

Beispiel 3a

Die Copolymerisation von 90 g Diäthylenglykoldimethacrylat mit 10 g Maleinsäureanhydrid unter den Bedingungen von Beispiel 2 a ergibt:
Ausbeute: 96 g

Schüttvolumen: 5,5 ml/g

Quellvolumen in Wasser: 6,7 ml/g

spez. Oberfläche: 9,2 m²/g

22 \5 509

ίο

Säuregehalt nach Verseifung der Anhydridgruppen: 1,9 mÄquiv/g

Beispiel 3b

1 g des nach Beispiel 3 a hergestellten Trägerharzes wurden zu einer Lösung von 50 mg unspezifischer Elastase mit einer enzymatischen Aktivität von 139 U in 32 mi Wasser gegeben. Der Ansatz wurde i6 Stunden bei Raumtemperatur gerührt, wobei das pH auf 5,8 konstant gehalten wurde. Nach der Umsetzung wurde das Harz abgesaugt und mit 50 ml 1 N-Natriumchloridlösung in 0,05 M-Phosphatpuffer pH 7,5 und anschließend mit 50 ml 0,05 M-Phosphatpuffer pH 7,5 gewaschen.

Ergebnis:

Aüsgangsiösung: 139 E

Überstand und Waschlösungen: 51 E

am Trägerharz gebunden: 15 E

das sind 11% der Ausgangsaktivität.

Hierbei wurde die enzymatische Aktivität titrimetrisch mit Casein als Substrat (Konzentration 11,9 mg/ml) bei pH 8,0 und 25° C bestimmt. 1 Einheit (E) entspricht einem Verbrauch von 1 μΜοΙ Kalilauge pro Minute.

Beispiel 3c

1 g des nach Beispiel 3 a hergestellten Trägerharzes wurde zu einer Lösung von 50 mg Urease kristallisiert (Merck) in 32 ml Wasser gegeben. Der Ansatz wurde bei Raumtemperatur 16 Stunden gerührt, wobei das pH auf 6,3 konstant gehalten wurde. Die Aufarbeitung erfolgte wie in Beispiel 2d angegeben.

Ergebnis:

Ausgangslösung: 5013 U

Überstand und Waschlösungen: 1397 U

am Trägerharz gebunden: 1405 U

das sind 28% der Ausgangsaktivität.

Die enzymatische Aktivität der Urease wurde titrimetrisch mit 0,17 M-Harnstoff als Substrat, 25 ° C und pH 6,1 bestimmt. 1 Einheit (U) entspricht der Enzymmenge, die ΙμΜοΙ Harnstoff pro Minute spaltet.

Beispiel 3d

0,4 g des nach Beispiel 3 a erhaltenen Trägerharzes wurden mit 40 mg Glutathion in 32 ml Wasser 16 Stunden bei einem konstanten pH-Wert von 6,3 bei Raumtemperatur umgesetzt. Das Harz wurde abgesaugt und mit einer Lösung von 1 N-Natriumchlorid in 0,05 M-Phosphatpuffer pH 7,5 und anschließend mit Wasser gewaschen. Nach dem Trocknen des Harzes im Vakuum bei 100° C über Phosphorpentoxid wurden 0,47 g erhalten. Die Stickstoffbestimmung nach Dumas ergab einen Wert von 1,1% N der einem Gehalt von 8,04% oder 37,8 mg Glutathion entspricht. Das sind 94% der eingesetzten Menge von Glutathion.

Beispiel4a

80 g Tetraäthylenglykoldimethacrylat, 20 g Maleinsäureanhydrid und 1 g Azoisobuttersäurenitril werden in 11 Benzol gelöst und unter langsamem Rühren 16 Stunden bei 80° C polymerisiert. Das Polymere wird analog zu Beispiel 1 a aufgearbeitet.

Ausbeute: 95 g

Schüttvolumen: 2,5 ml/g

Quellvolumen: 3,0 ml/g

spez. Oberfläche: 2,7 m²/g

Säuregehalt nach Verseifung der Anhydridgruppen: 2,6 mÄquiv/g

Beispiel 4b

Die Umsetzung von 1 gdes nach Beispiel 4 a hergestellten Trägerharzes mit Penicillin-Acylase analog zum Beispiel Ib liefert folgende Ergebnisse:
' Enzymatische Aktivitäten (NIPAB-Test)
Ausgangslösung: 123 U
Überstand und Waschlösungen: 13 U
Trägerharz nach der Umsetzung: 79 U
das sind 64% der Ausgangsaktivität.

Beispiel 4c

0,4 g des nach Beispiel 4 a hergestellten Trägerharzes wurden zu einer Lösung von 40 mg Trypsin in ,-, 32 ml 0,01 M-Calciumchloridlösung gegeben und 16

des pH-Wertes auf 6,3 gerührt. Das Harz wurde abgesaugt und nach Beispiel Ib gewaschen.
Enzymatische Aktivität
in der Ausgangslösung: 44 U
in Überstand und Waschlösungen: 5,2 U
am Harz gebunden: 8,3 U
das sind 19% der Ausgangsaktivität.
Die enzymatische Aktivität wurde colorimetrisch nachTuppy, Z. Physiol. Chem. 329 (1962) 278, mit Benzoyl-arginin-p-nitroanilid (BAPNA) als Substrat gemessen. 1 Einheit (U) entspricht der Spaltung von 1 μΜοΙ Substrat bei 25° C und pH 7,8.

_Jn Beispiel 4d

1 g des nach Beispiel 4 a hergestellten Harzes wurden zu einer Lösung von 50 mg unspezifischer Elastase in 32 ml Wasser gegeben. Die Suspension wurde 16 Stunden bei Raumtemperatur unter Konstanthalj-) tung des pH-Wertes auf 5,8 gerührt. Die Aufarbeitung und titrimetrische Bestimmung der Enzymaktivitäten mit Casein als Substrat wurde wie in Beispiel 3 b angegeben durchgeführt.

Enzymatische Aktivität
..; ^;n der Ausgangslösung: 139 U

in Überstand und Waschlösungen: 32 U

am Harz gebunden: 36 U

das sind 26% der Ausgangsaktivität.

₄-, Beispiel 5a

In einem Rührgefäß werden 11 Benzin (Kp 100-140° C) und 1 g Azoisobuttersäurenintril 1 Stunde auf 90° C erwärmt. Dann wird bei 80° C eine Lösung von 95 g Äthylenglykoldimethacrylat, 5 g Maleinsäureanhydrid und 1 g Azoisobuttersäurenintril innerhalb 3 Stunden zugetropft und weitere 2 Stunden bei der gleichen Temperatur gerührt.

Das Polymere wird abgesaugt, mehrmals mit Benzol und Petroläther (Kp 20-50° C) gewaschen und im ^r>5 Vakuum getrocknet.

Ausbeute: 96 g

Schüttvolumen: 14 ml/g

Quellvolumen in Wasser: 18,2 ml/g

spez. Oberfläche: 70 m²/g

bo Säuregehalt nach Verseifung der Anhydridgruppen: 0,5 mÄquiv/g *

Beispiel 5b

* 0,4 g des nach Beispiel 5 a hergestellten Harzes

b5 wurden mit 40 mg Glutathion in 32 ml Wasser 16 Stunden unter Konstanthaltung von pH 6,3 bei Raumtemperatur gerührt. Das Harz wurde abgesaugt und nach Beispiel 3d gewaschen und getrocknet. Es

wurden 0,46 g Harz erhalten, das 0,9% N nach Dumas enthielt. Dem entspricht ein Gehalt von 6,6% oder 30,4 mg Glutathion, das sind 76 % der eingesetzten Menge.

Beispiel 6a

Eine Lösung von 62,5 g Tetraäthylenglykoldimethacrylat, 37,5 g Maleinsäureanhydrid und 1 g Azoisobuttersäurenintril in 150 ml Butylacetat und 1 I Benzin (Kp 100-140° C) wird unter Rühren 2 Stunden bei 70° C, 2 Stunden bei 75° C und 1,5 Stunden bei 90° C polymerisiert. Das Polymere wird abgesaugt, 24 Stunden im Soxhlet-Extrator mit Benzol extrahiert und im Vakuum getrocknet.

Ausbeute: 77 g

Schüttvolumen: 7,3 ml/g

Quelivolumen in Wasser: 8,2 ml/g

spez. Oberfläche: 19,4 mVg

Säuregehalt nach Verseifung der Anhydridgruppen: 4,0 mÄquiv/g

Beispiel 6b

Die Umsetzung von 1 gdes nach Beispiel 6 a hergestellten Trägerharzes mit Penicillin-Acylase analog zu Beispiel Ib lieferte folgende Ergebnisse:
Enzymatische Aktivitäten (NIPAB-Test)
Ausgangslösung: 107 U
Üoerstand und Waschlösungen: 28 U
Trägerharz nach der Umsetzung: 55 U
das sind 51% der Ausgangsaktivität.

Beispiel 7a

Eine Lösung von 90 g Tetraäthylenglykoldimethacrylat, 10 g Maleinsäureanhydrid und 1,0 g Azoiso- ~> buttersäurenitril in 200 ml Acetonitril wird in 1000 ml Benzin (Kp 100-140° C) in dem 5 g eines Gemisches von Glycerin-mono- und -dioleat gelöst wurden, suspendiert. Das Reaktionsgemisch wird bis zur Bildung fester Perlen (ca. 2 Stunden) bei 60° C und anschlie- ^u> ßend 20 Stunden bei 65° C polymerisiert. Das Polymerisat wird abfiltriert, dreimal in Benzol und dreimal in Petroläther (Kp 30-50° C) aufgeschlämmt und im Vakuum bei 50° C getrocknet.

Ausbeute: 94 g

¹> mittlerer Teilchendurchmesser: — 0,35 mm
Schüttvolumen: 2,8 ml/g
Quellvolumen in Wasser: 3,1 ml/g
spez. Oberfläche: 3,4 m²/g
Säuregehalt nach Verseifung der Anhydridgrup- -° pen: 1,5 mÄquiv/g

Beispiel 7b

Die Umsetzung von 1 gdes nach Beispiel 7 a hergestellten Trägerharzes mit Penicillin-Acylase analog ?"> zum Beispiel Ib lieferte folgende Ergebnisse:
Enzymatische Aktivitäten (NIPAB-Test)
Ausgangslösung: 107 U
Überstand und Waschlösungen: 51 U
Trägerharz nach der Umsetzung: 19 U
)» das sind 18% der Ausgangsaktivität.

Claims

Patentansprüche:

1. Vernetzte Copolymerisate bestehend aus copolymerisierten Einheiten von

A) 0,1 bis 50 Gew.-% α, /3-monoolefinisch ungesättigten Dicarbonsäureanhydriden mit 4 bis 9 Kohlenstoffatomen, und

B) 99,9 bis 50 Gew.-% Di- und/oder PoIy-(M eth) Acrylaten von Di- und/oder Polyolen,

wobei die vernetzten Copolymerisate Schüttvolumina von 1,4 bis 30 ml/g, und spezifische Oberflächen von 0,1 bis 500 m²/g besitzen und nach der Verseifung der Anhydridgruppen 0,02 bis 10 MiI-liäquivalente Säure pro Gramm enthalten.

2. Verfahren zur Herstellung von Copolymerisaten gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man — bezogen auf Gesamtmonomere —

A) 0,1 bis 70 Gew.-% α, /3-monoolefinisch ungesättigte Dicarbonsäureanhydride mit 4 bis 9 Kohlenstoffatomen, und

B) 99,9 bis 30 Gew.-% Di- und/oder PoIy-(Meth)Acrylate von Di- und/oder Polyolen

nach der Methode der Fällungspolymerisation oder der Perlpolymerisation in Lösungsmitteln oder Lösungsmittelgemischen, die gegen Anhydridgruppsn inert sind, bei Temperaturen von 20 bis 200° C in Gegenwart Radikale bildender Verbindung polymerisiert.

3. Verwendung der Copolymerisate gemäß Anspruch 1 zur Fixierung von Substanzen, die mit den Anhydridgruppen der Copolymerisate reagieren.

4. Verwendung der Copolymerisate gemäß Anspruch 1 zur Fixierung von Proteinen.

5. Verwendung der Copolymerisate gemäß Anspruch 1 zur Fixierung von Enzymen.

6. Verwendung der Copolymerisate gemäß Anspruch 1 zur Fixierung von Penicillinacylase.

7. Verwendung der Copolymerisate gemäß Anspruch 1 zur Fixierung von Inhibitoren.