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In vielen Fällen ist es vorteilhaft, Gemische der obengenannten Lösungsmittel zu verwenden, oder die
Polymerisation in einem Lösungsmittel für das Polymere zu beginnen und im Verlauf der Polymerisation kontinuierlich ein Fällungsmittel für das Polymere zuzugeben. Das Fällungsmittel kann auch zu bestimm- ten Zeitpunkten in einer oder mehreren Portionen zugegeben werden. Ausserdem kann die Monomerenmi- schung zusammen mit einem geeigneten Initiator als Lösung oder ohne Lösungsmittel in eine vorgelegte Lö- sungsmittelmenge eingespeist werden, so dass während der Polymerisation eine gleichmässige, geringe Mono- merenkonzentration aufrecht erhalten wird.
Durch Verwendung von (Meth)-Acrylmonomeren unterschiedli- cher Hydrophilie und Variation der Polymerisationsbedingungen lassen sich innerhalb eines sehr weiten Be- reiches Produkte mit dem jeweiligen Verwendungszweck angepasster Quellbarkeit, Dichte und spezifischer
Oberfläche bei guter mechanischer Stabilität herstellen.
Die Copolymerisate können durch Suspensionspolymerisation hergestellt werden. Die gebräuchlichste
Art der Perlpolymerisation, bei der die Monomeren, gegebenenfalls unter Zusatz eines organischen Lö- sungsmittels, in Wasser suspendiert werden, lässt sich in diesem Fall nur mit geringem Erfolg anwenden, da das Anhydrid sehr rasch hydrolysiert, die entstehende Dicarbonsäure hauptsächlich in die Wasserphase über- geht und nur in geringer Menge in das Polymere eingebaut wird. Daher wird die Suspensionspolymerisation zweckmässig in organischem Medium durchgeführt. Die Monomeren und der Initiator werden in einem mit
Paraffinen nicht mischbaren, gegen Anhydridgruppen inerten Lösungsmittel wie z. B. Acetonitril, Dimethyl- formamid, Dimethylsulfoxyd oder Hexamethylphosphorsäuretriamid gelöst und meistens unter Zusatz von
Dispergatoren in der zusammenhängenden Phase verteilt.
Als zusammenhängende Phase eignen sich beson- ders Paraffinkohlenwasserstoffe wie Hexan, Heptan, Octan und höhere Homologe, Cycloaliphaten wie Cyclo- hexan, sowie Paraffingemische wie Benzinfraktionen oder Paraffinöl. Das Volumenverhältnis, zusammen- hängende Phase : Monomerenphase beträgt 1 : 1 bis 10 : 1, vorzugsweise 2 : 1 bis 5 : 1.
Zur Stabilisierung der Suspension können beispielsweise Glycerin-mono-und dioleate, sowie Gemische dieser Verbindungen, Sorbitan-mono-und trioleate bzw. -stearate, Polyäthylenglykolmonoäther mit Stearyl- bzw. Laurylalkohol oder Nonylphenol, Polyäthylenglykolmonoester mit Ölsäure, Stearinsäure und andern
Fettsäuren mit mehr als 10 C-Atomen, sowie das Na-Salz des Sulfobernsteinsäuredioctylesters verwendet werden.
Diese Stoffe werden in Mengen von vorzugsweise 0, 1 bis 10%, bezogen auf die Monomerenmischung, eingesetzt und im allgemeinen in der Kohlenwasserstoffphase gelöst. Die Partikelgrösse der Suspensionspoly- merisate kann ausser durch Vergrösserung der Mhrgeschwindigkeit durch Zugabe von 0, 1 bis 2%, bezogen auf
Monomeren, einer weiteren oberflächenaktiven Substanz, z. B. eines Alkylsulfonates verringert werden.
Die Polymerisation wird durch radikalische Initiatoren ausgelöst. Geeignete Initiatoren sind z. B. Azoverbindungen oder Perverbindungen. Die zur Polymerisationsauslösung gebräuchlichste Azoverbindung ist das Azoisobuttersäurenitril. Als Perverbindungen kommen hauptsächlich Diacylperoxyde wie Dibenzoylperoxyd oder Perearbonate wie Diisopropyl- und Dicyclohexylpercarbonat in Frage, es können jedoch auch Dialkylperoxyde, Hydroperoxyde und in organischen Lösungsmitteln wirksame Redoxsysteme zur Initiierung verwendet werden.
Die Initiatoren werden in Mengen von 0,01 bis 10%, vorzugsweise 0, 1 bis 3%, bezogen auf die Gewichtsmenge der Monomerenmischung zugesetzt.
Die Polymerisation wird bei Temperaturen von etwa 20 bis 200 C, vorzugsweise 50 bis 1000C in Abhängigkeit von der Zerfallsgeschwindigkeit der Initiatoren und meistens unterhalb des Siedepunktes der Lösungsmittel und bei Perlpolymerisationen unterhalb der Mischungstemperatur der beiden Phasen durchgeführt. Ausserdem ist es in der Regel vorteilhaft, in inerter Atmosphäre unter Abwesenheit von Sauerstoff zu polymerisieren.
Die durch Fällungspolymerisation erhaltenen Copolymerisate sind farblose bis schwach gelb gefärbte, pulvrige Substanzen mit Schüttvolumina von 1, 5 bis 30 ml/g, vorzugsweise 2 bis 20 ml/g, und spezifischen Oberflächen von 0, 1 bis 500 m2/g, bevorzugt 1 bis 400 m2/g. Der nach Verseifung der Anhydridgruppen titrimetrisch bestimmte Gehalt an Carboxylgruppen liegt bei 0,02 bis 10 mÄquiv/g, vorzugsweise bei 0, 4 bis 4 mÄquiv/g.
Die Suspensionspolymerisate sind weisse oder schwach gefärbte Perlen, die in einigen Fällen unregelmässig geformt sein können und einen Durchmesser von 0,03 bis l mm, vorzugsweise 0,05 bis 0, 5 mm, und Schüttvolumina von etwa 1, 4 bis 8 ml/g, vorzugsweise 1, 4 bis 5 ml/g, besitzen. Ihr nach der Hydrolyse der Anhydridgruppen bestimmter Carboxylgruppengehalt beträgt 0, 02 bis 10 mÄquiv/g, vorzugsweise 0, 4 bis 4 mÄquiv/g.
Die erfindungsgemäss erhältlichen Copolymerisate enthalten die copolymerisierten Einheiten statisch verteilt. Auf Grund ihrer hohen Vernetzungsdichte sind die Copolymerisate in allen Lösungsmitteln unlöslich.
Molekulargewichte sind daher nicht bestimmbar.
Die Copolymerisate können in Wasser auf das 1, bis 2,5-fache ihres Schüttvolumen quellen. Sie eignen sich vorzüglich als Trägerharze zur Fixierung von Substanzen, die mit den Anhydridgruppen der Copolymerisate reagieren können.
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Die Trägerharze werden dabei bei Temperaturen zwischen 0 und 300C direkt in die wässerige Lösung des zu bindenden Stoffes, vorzugsweise in die wässerige Lösung eines Proteins eingetragen, wobei der pH-Wert konstant zu halten ist.
Sollen Proteine an die erfindungsgemäss erhältlichen Copolymerisate gebunden werden, so arbeitet man zweckmässigerweise mit einem pH-Staten in einem pH-Bereich von 3 bis 10, vorzugsweise von PH 5, 5 bis PH 9,0. Wird als Protein Penicillinacylase eingesetzt, so arbeitet man zweckmässigerweise zwischen PH 5,7 und PH 6, 8. Während der Bindungsreaktion muss zur Konstanthaltung des pH-Bereiches ständig eine Base zugesetzt werden. Dabei kommen anorganische Basen (beispielsweise Alkalilaugen) und organische Basen (beispielsweise tertiäre organische Amine) in Frage.
Im Gegensatz zu den Erfahrungen der Literatur mit andern Harzen, nach denen die Umsetzung in gepufferten Lösungen durchgeführt wird, waren die Ausbeuten an gebundenem Enzym mit den oben beschriebenen Harzen umso besser, je niedriger der Salzgehalt der Lösungen war.
Das Gewichtsverhältnis von gebundener Substanz, beispielsweise Protein bzw. Peptid zu Trägerharz kann in weiten Grenzen variiert und dem späteren Verwendungszweck angepasst werden. Gute Ausbeuten er-
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polymeremtimalen Verhältnisse sind jedoch sowohl von der Zusammensetzung und der Struktur des Polymeren als auch von der Art des Proteins abhängig. Bei zahlreichen Enzymen ist es zweckmässig, Stabilisatoren der Enzym- lösung zuzusetzen.
Als solche kommen Polyäthylenglykole oder nichtionische Netzmittel zur Abschwächung der Denaturie- rung an Oberflächen in Frage, sowie die bekannten SH-Reagentien oder Metallionen bei speziellen Enzy- men.
Die notwendige Reaktionszeit ist abhängig von der Art des Polymeren. Im Normalfall ist die Reaktion nach 20 h bei Raumtemperatur abgeschlossen. Bei 40C läuft die Reaktion besser noch etwas länger. Bei präparativen Ansätzen wird der Ansatz nicht früher als 2 h nach Beendigung der Alkalizugabe durch den pH-Staten abgebrochen. Das Polymere mit dem gebundenen Protein wird hierauf abgesaugt oder abzentrifu- giert und der Rückstand mit Salzlösungen hoher Ionenstärke, beispielsweise 1 M-Natriumchloridlösung, und anschliessend mit einem Puffer gewaschen, in dem das Enzym stabil ist. Bei der Waschung mit Lösungen hoher Salzkonzentration wird ionogen gebundenes Protein vom Träger abgelöst.
Zur Beurteilung des Erfolges der Proteinbindung wurde bei Enzymen die enzymatische Aktivität sowohl im Polymeren als auch in der Restlösung und in den Waschwassern bestimmt. Bei Proteinen ohne spezifische Wirkung wurde der Stickstoffgehalt im Polymeren nach Kjeldahl bestimmt. Die Ausbeuten bei der Proteinbindung liegen zwischen 10 und über 90%. Betrachtet man die enzymatische Aktivität, so ist es in einigen Fällen vorteilhaft, keinen zu grossen Überschuss an Polymerenmaterial zu verwenden, da sonst zwar das Protein vollständig gebunden wird, die Aktivität jedoch darunter leidet.
Die Trägerharze sind geeignet, alle Substanzen zu binden, die eine funktionelle Gruppe tragen, die befähigt ist, mit der Anhydridgruppe des Polymeren zu reagieren. Bei den Proteinen und Peptiden sind dies vor allem die endständigen Aminogruppen des Lysins und die freien Aminogruppen der Peptidkettenenden.
An Träger gebundene Peptide und Proteine sind von grosser wissenschaftlicher und technischer Bedeutung. Die in den meisten Fällen teuren und instabilen Enzyme werden durch die Bindung an das Harz wesentlich stabilisiert. Ausserdem gestattet die leichte und vollständige Rückgewinnung des Enzymharzes eine vielfache Anwendung über lange Zeitspannen.
Folgende Substanzen können beispielsweise an die erfindungsgemäss erhältlichen Copolymerisate fi- xiert werden :
Enzyme : Hydrolasen wie Proteasen, beispielsweise Trypsin, Chymotrypsin, Papain, Elastase ; Amidasen, beispielsweise Asparaginase, Glutaminase, Urease ; Acyltransferasen, beispielsweise Penicillinacylase ; Lyasen, beispielsweise Hyaluronidase.
Andere Proteine, wie Plasmabestandteile, Globuline (Antikörper).
Polypeptide, wieKallikrein-Inhibitor oder Insulin.
Aminosäuren wie Lysin oder Alanin.
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l : 80g Tetraäthylenglykoldimethacrylat, 20gMaleinsäurea. tihydridundlgAzoisobutter-säurenitril werden in 11 Benzol gelöst und unter Rühren 4 h auf 600C erwärmt. Dann gibt man 1 g Azoisobuttersäurenitril und 200mlBenzin (Kp. 100 bis 140 C) zu und polymerisiert weitere 5 h bei 70 C. DaspulverigePolymere wird abgesaugt, einmal in Benzol und dreimal in Petroläther (Kp. 30 bis 500C) aufgeschlämmt und im Vakuum getrocknet.
Ausbeute : 94 g
Schüttvolumen : 3, 5 ml/g
Quellvolumen in Wasser : 4,7 ml/g spez. Oberfläche : 5 m/g Säuregehalt nach Verseifung der Anhydridgruppen : 3, 5 mÄquiv/g.
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Beispiel 2 : Eine Lösung von 90 g Äthylenglykolidimethacrylat, 10 g Maleinsäureanhydrid und 1 g Azoisobuttersäurenitril in 11 Benzol wird unter Rühren zunächst bei 60 C polymerisiert. Nach 4 h gibt man 200 ml Benzin (Kp. 100 bis 140 ) und 1 g Azoisobuttersäurenitril zu und polymerisiert 2 h bei 70 C und 2 h bei 80 C weiter.
Anschliessend saugt man das Polymere ab, wäscht gründlich mit Petroläther (Kp. 30 bis 50 C) und trocknet im Vakuum.
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Ausbeute <SEP> : <SEP> 97g <SEP>
<tb> Schüttvolumen <SEP> : <SEP> 6, <SEP> 4 <SEP> ml/g
<tb> Quellvolumen <SEP> in <SEP> Wasser <SEP> : <SEP> 8,0 <SEP> ml/g
<tb> spez. <SEP> Oberfläche <SEP> : <SEP> 298 <SEP> m2/g
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Säuregehalt nach Verseifung der Anhydridgruppen: 1,5 mÄquiv/g.
Beispiel 3 : Die Copolymerisation von 90 gDiäthylenglykoldimethacrylatmitlOgMaleinsäureanhydrid unter den Bedingungen von Beispiel 2 ergibt :
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<tb> Ausbeute <SEP> : <SEP> 96 <SEP> g
<tb> Schüttvolumen <SEP> : <SEP> 5, <SEP> 5 <SEP> ml/g
<tb> Quellvolumen <SEP> in <SEP> Wasser <SEP> : <SEP> 6,7 <SEP> ml/g
<tb> spez. <SEP> Oberfläche: <SEP> 9,2 <SEP> m2/g
<tb>
Säuregehalt nach Verseifung der Anhydridgruppen : 1, 9 mÄquiv/g.
Beispiel 4: 80 g Tetraäthylenglykoldimethacrylat, 20 g Maleinsäureanhydrid und 1 g Azoisobutter-
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mere wird analog zu Beispiel 1 aufgearbeitet
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<tb>
<tb> Ausbeute <SEP> : <SEP> 95 <SEP> g
<tb> Schüttvolumen <SEP> : <SEP> 2, <SEP> 5 <SEP> ml/g
<tb> Quellvolumen <SEP> : <SEP> 3,0 <SEP> ml/g
<tb>
Säuregehalt nach Verseifung der Anhydridgruppen : 2, 6 mÄquiv/g.
Beispiel 5 : In einem Rührgefäss werden 1 1 Benzin (Ip, 100 bis 140 C) und 1 g Azoisobuttersäurenitril 1 h auf 900C erwärmt. Dann wird bei 800C eine Lösung von 95 g Äthylenglykoldimethaerylat, 5 g Maleinsäureanhydrid und 1 g Azoisobuttersäurenitril innerhalb 3 h zugetropft und weitere 2 h bei der gleichen Temperatur gerührt.
Das Polymere wird abgesaugt, mehrmals mit Benzol und Petroläther (Kp. 30 bis 50 C) gewaschen und im Vakuum getrocknet
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<tb>
<tb> Ausbeute <SEP> : <SEP> 96 <SEP> g
<tb> Schüttvolumen <SEP> : <SEP> 14 <SEP> ml/g
<tb> Quellvolumen <SEP> in <SEP> Wasser <SEP> : <SEP> 18, <SEP> 2 <SEP> ml/g
<tb> spez. <SEP> Oberfläche <SEP> : <SEP> 70 <SEP> m2/g <SEP>
<tb>
Säuregehalt nach Verseifung der Anhydridgruppen : 0, 5 mÄquiv/g.
Beispiel 6 : Eine Lösung von 62,5 g Tetraäthylenglykoldimethacrylat, 37,5 g Maleinsäureanhydrid und 1 g Azoisobuttersäurenitril in 150 ml Butylacetat und 11 Benzin (Kp. 100 bis 140 C) wird unter Rühren 2 h bei 70oC, 2 h bei 750C und 1, 5 h bei 90 C polymerisiert. Das Polymere wird abgesaugt, 24 h im SoxhletExtraktor mit Benzol extrahiert und im Vakuum getrocknet.
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Ausbeute <SEP> : <SEP> 77 <SEP> g
<tb> Schüttvolumen <SEP> : <SEP> 7, <SEP> 3 <SEP> ml/g <SEP>
<tb> Quellvolumen <SEP> in <SEP> Wasser <SEP> : <SEP> 8, <SEP> 2 <SEP> ml/g
<tb> spez. <SEP> Oberfläche <SEP> : <SEP> 19, <SEP> 4 <SEP> m2/g <SEP>
<tb>
Säuregehalt nach Verseifung der Anhydridgruppen: 4,0 mÄquiv/g.
Beispiel 7: Eine Lösung von 90 g Tetraäthylenglykoldimethacrylat, 10 g Maleinsäureanhydrid und 1, 0 g Azoisobuttersäurenitril in 200 ml Acetonitril wird in 1000 ml Benzin (Kp. 100 bis 140 C), in dem 5 g eines Gemisches von Glycerin-mono- und -dioleat gelöst wurden, suspendiert. Das Reaktionsgemisch wird bis zur Bildung fester Perlen (etwa 2 h) bei 600C und anschliessend 20 h bei 650C polymerisiert.
Das Polymerisat wird abfiltriert, dreimal in Benzol und dreimal in Petroläther (Kp. 30 bis 50 C) aufgeschlämmt und im Vakuum bei 500C getrocknet.
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Ausbeute <SEP> : <SEP> 94 <SEP> g
<tb> mittlerer <SEP> Teilchendurchmesser <SEP> :-0, <SEP> 35 <SEP> mm
<tb> Schüttvolumen <SEP> : <SEP> 2, <SEP> 8 <SEP> ml/g <SEP>
<tb> Quellvolumen <SEP> in <SEP> Wasser <SEP> : <SEP> 3, <SEP> 1 <SEP> ml/g
<tb> spez. <SEP> Oberfläche <SEP> : <SEP> 3, <SEP> 4 <SEP> m <SEP> /g
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Säuregehalt nach Verseifung der Anhydridgruppen : 1, 5 mÄquiv/g.