DE2212276B2 - Verfahren zur herstellung von 7-amino- desacetoxy-cephalosporansaeure - Google Patents

Description

dadurchgekennzeichnet, daß man ein Alkalisalz einer 7-Acylamino-desacetoxy-cephalosporansäure der allgemeinen Formel

R —CO —NH--

S O

•N

COO^M

in welcher R eine Benzyl- oder Phenoxymethylgruppe ist; und M ein Alkalimetallatom ist, welches fähig ist, ein wasserlösliches Salz zu bilden; mit einem Kulturfiltrat von Bacillus megaterium B-400 FERM-P Nr. 748 oder mit einer Enzymzubereitung, welche sich von diesem enzymerzeugenden Stamm herleitet, in einem wäßrigen Medium behandelt und die gebildete 7-Aminodesacetoxy-cephalosporansäure in üblicher Weise isoliert.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man das Enzym auf Kieselgur adsorbiert.

lat, welches von Phenoxymethylpenicillin hergeleite* ist, in einem wasserfreien organischen Lösungsmittel in Anwesenheit von Pyidin mit PCI5 behandelt wird und das sich ergebende Imidchlorid mit einem Alkohol behandelt wird, wobei sich ein Imidester bildet, welcher dann der Hydrolyse unterworfen wird (belgische Patentschriften 7 17 741 von 1969 und 7 37 761 von 1970).
Sämtliche obenerwähnten Verfahren sind jedoch chemische Zersetzungsprozesse, und es ist kein Verfahren zur enzymatischen Herstellung von 7-ADCA vorgeschlagen worden.

Erfindungsgemäß soll nun 7-ADCA mit Vorteil auf enzymatischem Wege erzeugt werden. Es wurde überraschenderweise gefunden, daß ein Stamm B-400, welcher zur Gattung Bacillus gehört und welcher aus Erdböden isoliert worden ist, ein Enzym produziert, welches in der Lage ist, die Amidbindungen von 3- Methyl-7-phenoxyacetamido-J ³-cephem-4-carbonsäure und 3-MethyI-7-phenylacetamido-J³-cephem-4-carbonsäure zu spalten, wobei 7-ADCA erzeugt wird, welche an sich inaktiv ist, jedoch mit Hilfe von Phenylacetylchlorid quantitativ in das zweitgenannte Produkt rückverwandelt werden kann.

Mycologische Eigenschaften des obenerwähnten Stammes B-400 sind die folgenden:

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Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung von 7-Amino-desacetoxy-cephalosporansäure (nachstehend als »7-ADCA« bezeichnet) durch enzymatisches Deacylieren von Alkalisalzen der 7-Phenylacetamido- oder Phenoxyacetamido-desacetoxy-cephalosporansäure. Die Ausgangsverbindungen werden auch als 3-Methyl-7-phenoxyacetamido- Δ ³-cephem-4-carbonsäure bzw. 3-Methyl-7-phenylacetamido- <d ³-cephem-4-carbonsäure bezeichnet.

Bisher wurde 7-ADCA hergestellt nach einem Verfahren, bei welchem Cephalosporin C katalytisch in Anwesenheit von Palladium-Kohle zur Erzielung von 3-Methyl-7-(cu-aminoadipoylamido)-/l³-cephem-4-carbonsäure reduziert wird, welche dann durch Hydrolyse deacyliert wird (US-Patentschrift 31 24 576 von 1964); ferner nach einem Verfahren, bei welchem 7-Aminocephalosporansäure durch katalytische Reduktion deacyliert wird (die gleiche US-Patentschrift wie obenerwähnt); und nach einem Verfahren, bei welchem 3- Methyl-7-phenoxyacetamido-.d ³-cephem-4-carboxy-

I. Morphologische Eigenschaften (Schrägkultur auf Agarbrühe, 18 oder 24 Stunden bei 30⁰C):

(1) Zellen stabförmig, hauptsächlich in langen Keilen, runde Enden.

(2) Größe 1,2 bis 1,5 ■ 2,0 bis 3,5 Mikron.

(3) Kein Häutchen.

(4) Beweglich mit Geißeln (am Umfang).

(5) Grampositiv.

(6) Sporen (Sojabohnenagar, 5 Tage bei 30⁰C): Größe: 1,0 bis 1,2 · 1,5 bis 2,0 Mikron. Gestalt: oval.

I age zentral bis para-zentral. Sporangia nicht deutlich gequollen.

II. Verhalten auf verschiedenen Kulturmedien:

(1) Agarbrühen-Strichplatte (30°C, 24 Stunden): gutes Wachstum, kreisförmig, konvex, sich nicht ausbreitend, weiß bis blaßgelb, glänzend, weich, naß, durchscheinend; keine Farbänderung des Mediums.

(2) Brühagar-Schrägrohre (3O⁰C, 24 Stunden): gutes Wachstum, Oberfläche glatt, sich nicht ausbreitend, glänzend, naß. Kolonien milchigweiß, durchscheinend ; keine Farbänderung des Mediums.

(3) Brühe (3O⁰C, 2Tage): gutes Wachstum, einheitliche Trübung mit Sediment; kein Häutchen.

(4) Brühen-Gelatinestich (30⁰C, 20Tage): Oberflächenwachstum zum Zentrum längs Stichlinie. Keine Gelatineverflüssigung.

(5) Lakmusmilch (30⁰C, 20Tage): nicht peptonisiert: Lakmuspigment ist reduziert; Kulturflüssigkeil wird gelblichbraun.

(6) Sojabohnenagar-Schrägkultüren (30° C, 24 Stunden): gutes Wachstum, weiß bis gelblichweiß Oberfläche glatt und weich. Gute Sporenbildung

(7) Glucosenitratagar-Schrägkultur (3O⁰C, 3 Tage) Wachstum knapp.

(8) Tyrosinagar-Schrägkulturen (3O⁰C, i Tage) gutes Wachstum; Medium ist gebräunt.

(9) Kartoffel (30°C, 5 Tage): gutes Wachstum; Kolonien rosa bis braun, Oberfläche glatt und naß, konvex und glänzend; Medium ist an etwa dem 3. Tag gebräunt.

III. Physiologische Eigenschaften:

(1) Optimale Wachstumsbedingungen: aerob bei pH 7,0 bis 8,0 und 28 bis 35⁰C.

(2) Wachstumsbedingungen: aerob, bei pH 5 bis 10 und 7 bis 45 ⁰C.

(3) Säurebeständigkeit: gering, kein Wachstum bei unterhalb pH 5,0.

(4) Verhalten gegenüber Sauerstoff: aerob, kein Wachstum in Glucosebrühe unter anaeroben Bedingungen.

(5) Indol wird nicht erzeugt.

(6) Schwefelwasserstoff wie erzeugt.

(7) Denimfizierungsreaktion: keine Gasbildung.

(8) Nitrate werden reduziert.

(9) Kataiasebildung: positiv.

(10) Ureasebildung: positiv.

(11) Stärke wird hydrolysiert.

(12) Citrate werden ausgenutzt (in Medien nach K ο s e r und Christensen).

(13) Lakmuspigment wird reduziert.

(14) Methylenblau wird reduziert.

(15) Wasserlösliches Pigment wird in Kartoffelmedium gebildet.

IV. Fermentative Spaltbarkeit von Kohlehydraten:

Kohlehydrate

Säurebildung Gasbildung

I \	3	.	Aiabmose
	I		Xylose
> ,*■ f			Glucose
i			Mannose
		Fructose
e.		Galactose
	Ribose
	Rhamnose
	Maltose
	Saccharose
	Lactose
	Trenalose
Raffinose
Cellobiose
Sorbit
Mannit
Inosit
Glycerin
Glucit
Salicin
Inulin
Stärke

Bacillus	Bacillus
megaterium	megaterium
B-400	var, penicillalyticum
	ATCC 14 945

Gelatinever- kaum Verfiüssi- allmähliche
fiüssigung gung Verflüssigung

Lakmusmilch Pigment ist Pigment wird

reduziert alkalisch und ist

nicht reduziert

Kartoffelagar- Bildung von keine Pigment-Schrägkulturen wasserlöslichem bildung

braunen Pigment

Säurebildung Säurebildung keine
aus Mannose Säurebildung

Bei der Prüfung der taxonomischen Stellung des Stammes B-400 mit den obenerwähnten mycologischen Eigenschaften unter Bezugnahme auf Bergeys Manual of Determinative Bacteriology, 7. Ausgabe, wurde identifiziert, daß der Stamm zur Gattung Becillus megaterium gehört. Demgemäß wurde der Stamm B-400 mit der Typenkultur verglichen, welche von der American Type Culture Collection (ATCC) gesendet wurde, um zu erkennen, daß der Stamm ähnlich Bacillus megaterium var. penicillalyticum ATCC 14 945 war, jedoch in den folgenden Punkten hiervon unterschiedlich ist:

zo Aus dem obigen wurde erkannt, daß der Stamm B-400 ein neuer Stamm ist, welcher der Gattung Bacillus megaterium angehört. Der Stamm B-400 wurde hinterlegt unter der Nummer »FERM-P Nr. 748« im Research Institute of Microorganism Industry, Agency of Industrial Science & Technology, Japan.

Das Enzym, welches in der Lage ist, die Amidbindung von 7-Phenylacetamido- oder -Phenoxyacetamido-desacetoxy-cephalosporansäure zu spalten, wird erhahen, indem man Bacillus megaterium B-400 FERM-P Nr. 748 bei 25 bis 37°C 12 bis 60 Stunden in einem Medium aerob kultiviert, welches gewöhnlich zum Kultivieren von Bakterien verwendet wird, beispielsweise in einem Nährmedium mit einem Gehalt an angemessenen Mengen einer Stickstoffquelle wie Pepton, Fleischextrakt, Getreideeinweichlauge, Hefeextrakt, Trockenhefe, zersetztes Sojabohnenprotein oder Sojabohnenextrakt; an einer Kohlenstoffquelle wie Melasse, Glucose oder Glycerin; und anorganischen Salzen; und, in einigen Fällen, anderen wachstumsfördernden Substanzen. Im allgemeinen bewirkt man ein Luftrühren der Kultur in Flüssigkeit.

Das obenerwähnte Enzym ist ein Exo-Enzym und liegt in einem Kulturfiltrat vor, welches von den Zellen befreit ist. Bei der Enzymreaktion wird daher

4S das Enzym in Form eines Kulturfilirats oder einer Enzymzubereitung verwendet, welche aus dem Kulturfiltrat bereitet wurde. Diese Enzymzubereitung wird erhalten, indem man das Enzym einer bekannten Reinigungsmethode unterwirft. Beispielsweise wird es erhalten, indem man das Kulturfiltrat konzentriert oder nicht konzentriert und man das Enzym durch Halbsättigung oder Sättigung mit einem löslichen Salz wie Ammoniumsulfat oder Natriumchlorid auffällt oder dieses durch Hinzusetzen einer hydrophilen

organischen Verbindung wie Methanol, Äthanol odei Aceton austjllt. Die Ausfällung löst man in Wassei auf, und die sich ergebende Lösung wird unter Verwendung einer semipermeablen Membrane dialysiert wodurch niedermolekulare Verunreinigungen entfern werden können. Man kann aber auch, wobei man aui dem Unterschied der Adsorptionsaffinität für eil Adsorptionsmittel oder Gelfiltermittel Vorteil zieht niedermolekulare Verunreinigungen, gefärbte Sub stanzen, Proteine und ähnliche Stoffe in der Kultur flüssigkeit wirksam abtrennen gemäß einer gewöhn liehen Arbeitsweise wie Adsorptionschromatographie Ionenaustauschchromatographie oder Gelfiltration Die gemäß den obenerwähnten Arbeitsgängen erhal

5 ^l 6

tene Enzymlösung kann der Konzentrierung unter Enzyms zum Träger. Beim Adsorbieren des Enzyms vermindertem Druck, dem Gefriertrocknen oder nach der ansatzmäßigen Arbeitsweise kann jedoch die ähnlichen Operationen unterworfen werden, um ein Menge an verwendetem Träger etwa 5 bis 35% Standardenzymprodukt in Form ei aes Feststoffes zu (Gew./Vol.), bezogen auf die Menge des Kultur&ltrats, erhalten, oder sie kann, wie sie ist, zur Behandlung 5 sein. Im Falle der Adsorption nach der ansatzmäßigen der 7-Phenylacetamido- oder Phenoxyacetamido-des- Arbeitsweise rührt man ein Gemisch des Kulturfiltrats acetoxy-cephalosporansäure verwendet werden. Falls und des Trägers, und dann trennt man den Träger ab die Enzymzubereitung weiter gereinigt werden muß, und wäscht ihn mit Wasser. Ire Falle des Adsorbieren kann man irgendeines der gewöhnlichen Mittel an- nach der kolonnenmäBigen Arbeitsweise benetzt man wenden, welche man zum Reinigen von Proteinen und io den in eine Kolonne gepackten Träger mit Wasser Enzymen anwendet, beispielsweise ein Adsorptions- oder mit Pufferlösung, welche auf den stabiles pH-Wert mittel oder ein Gelfiltermittel. des deacylierenien Enzyms eingestellt ist, mm läßt Die Enzymreaktion wird in solcher Weise durch- das Kulturfiltrat durch die Kolonne gehen, und dann geführt, daß das Alkalisalz des Cephalosporins in wäscht man die Kolonne mit Wasser, wodurch ein Wasser oder einer Pufferlösung aufgelöst und dann 3.5 Träger erhalten werden kann, auf welchem das mit der obenerwähnten Enzymzubereitung behandelt deacylierenie Enzym adsorbiert ist.
wird. Das Cephalosporin bringt man gewöhnlich in Wenn der so erhaltene Träger mit adsorbiertem die Form eines wasserlöslichen Natrium- oder Kalium- deacylierendem Enzym getrocknet wird, so neigt das salzes und verwendet es in einer Konzentration inner- deacylierende Enzym dazu, inaktiviert zu werden, halb des Bereiches von 0,1 bis 20 Milligramm/cm³, 20 Demgemäß ist es erwünscht, daß der Träger in der vorzugsweise von etwa 2 bis 5 Milligramm/cm³. nachfolgenden enzymatischen Deacylierungsreaktion Der pH-Wert der Reaktionsflüssigkeit wird Vorzugs- in einem nassen Zustand verwendet wird, ohne geweise innerhalb des Bereiches von etwa 7 bis 8 ge- trocknet zu werden.

halten. Die Reaktionstemperatur beträgt 30 bis 45° C, Die beim erfindungsgemäßen Verfahren verwendete vorzugsweise etwa 35 bis 40⁰C, wodurch günstige 25 7-Phenylacetamido- öler Phenoxyacetamido-desacet-Ergebnisse erzielt werden können. Die Reaktionszeit oxy-cephalosporansäure kann nach bekannten Vervariiert je nach den Reaktionsbedingungen, beträgt fahren bereitet werden, beispielsweise nach einem Verjedoch gewöhnlich etwa 5 bis 30 Stunden. Die Reak- fahren, bei welchem man einen Benzyl- oder Phenoxytion kann in einem geeigneten Stadium betadet wer- methyi-penicillinsulfoxydester der Ringausdehnung den, wobei man die Zeit prüft, bei welcher die Ausbeute 30 unterwirft (US-Patentschrift 32 75 626, belgische Pader 7-ADCA ein Maximum wird. Man kann das tentschrift 6 96 026, niederländische Patentveröffenterfindungsgemäße Verfahren vorteilhafterweise aber lichung 68 06 532, belgische Patentschrift 7 45 845, auch in der Weise durchführen, daß man das Enzym britischen Patentschrift 12 04 394 und belgische Patentauf einem Träger adsorbiert. Dabei ist es erforderlich, Schriften 7 47118, 747119 und 747120) und daß den Träger unter Betrachtung der Gesichtspunkte 35 man den sich ergebenden 7-Acylamino-desacetoxyauszuwählen, daß er das deacylierende Enzym adsor- cephalosporansäureester entestert oder nach einem bieren kann, ohne dieses zu inaktivieren; daß er das Verfahren, bei welchem man Phenylacetamido- oder Enzym selbst beim Waschen mit Wasser nicht freigibt Phenoxyacetamido-cephalosporansäure entacetoxyliert und daß er die sich ergebende 7-ADCA nicht oder (US-Patenischrift 32 75 626).

i~ kaum adsorbiert. Wenn beispielsweise ein anorga- 40 Die obenerwähnte Enzymreaktion wird im allgenischer Träger, wie aufbereitete Kieselgur, Terra alba, meinen nach der kolonnenmäßigen Arbeitsweise aktiver Ton, Kaolin, Aktivkohle oder Silicagel, ein durchgeführt, weil diese Reaktion kontinuierlich Ionenaustauscher wie Carboxymethylcellulose oder bewirkt werden kann. Die Konzentration des hinzumit Epichlorhydrin 3-dimensional vernetztes Carboxy- zusetzenden Cephalosporins variiert hauptsächlich methyldextran oder ein Ionenaustauschharz wie ein 45 je nach dem Enzymtiter, d. h. je nach Deacylierungsschwach saurer Ionenaustauscher für chromatogra- vermögen des deacylierenden Enzyms, sowie nach der phische Zwecke oder ein kernsulfonierter Polystyrol- Strömungsgeschwindigkeit, doch wird sie erwünschterharz-Ionenaustauscher als Träger verwendet wird, so maßen unter Betrachtung des Punktes entschieden, wird das durch Bacillus megaterium B-400 Ferm-P daß die Menge des nicht reagierten Cephalosporins, Nr. 748 erzeugte deacylierende Enzym gut adsorbiert 50 weiches in der ausfließenden Reaktionsflüssigkeit ohne inaktiviert zu werden, jedoch wenn Aluminium- zurückbleibt, nicht größer wird. Im allgemeinen beträgt oxid, Cellulosepulver, Diäthylaminoäthylcellulose, ver- die Konzentration an Cephalosporin 0,1 bis 2,0 ^Q/ _o netztes Diäthyldextran oder Anionenaustauschharz (Gew./Vol.), vorzugsweise etwa 0,5 bis 1,0% (Gew./ verwendet wird, so wird das deacyüerende Enzym Vol.), doch erübrigt es sich, auszuführen, daß die kaum adsorbiert, oder es wird inaktiviert, selbst wenn 55 Konzentration, je nach der Art des verwendeten Träes adsorbiert worden ist. gers. mehr oder weniger variiert. Die obenerwähnte Beim Adsorbieren des deacylierenden Enzyms auf Reaktion vollzieht man natürlich bei angemessenem dem Träger ist es erwünscht, daß der pH-Wert des pH-Wert und angemessener Temperatur, vorzugs-Kulturfiltrats vorher auf den für das deacylierende weise bei optimalem pH-Wert und optimaler Tempe-Enzym stabilen pH-Wert eingestellt ist. Beispielsweise 60 ratur, des deacylierenden Enzyms. Jedoch ist es wünstellt man beim Adsorbieren auf Kieselgur den pH-Wert sehenswert, daß verschiedene Reaktionsbedingungen des Kulturfiltrats im allgemeinen auf etwa 6 bis 8 ein. so ausgewählt werden, daß die in der Reaktionsflüssig-Das Adsorbieren des deacylierenden Enzyms auf keit gebildete 7-ADCA mit einer Konzentration ausdem Träger kann gemäß irgendeiner der ansatzmäßigen fließt, welche so hoch wie möglich ist. Die Reaktionsoder kolonnenmäßigen Arbeitsgänge ausgeführt wer- 65 zeit kann richtig variiert werden, indem man die den. Die amzuwendende Trägermenge variiert je nach Menge an zugesetzter wäßriger Cephalosporin-Lösung der Mengo und dem Enzymtiter des Kulturfiltrats und steigert oder vermindert. Im allgemeinen ist die je nach dem Adsorptionsverhältnis des deacylierenden Reaktion vollendet, bevor wäßrige Cephalosporin-

7 8

Lösung durch die Trägerschicht in der Kolonne hin- Methoden zur Bestimmung von 7-ADCA

durchgegangen ist. Wenn jedoch das Deacylierungs- ₍₁₎ Bestimmungsmethode 1
verhältnis niedrig gewesen ist und eine große Menge .

an Cephalosporin in der Reaktionsflüssigkeit zurück- Die Reaktionsflüssigkeit unterwirft man dem Miikro-

geblieben ist, so setzt man die Reaktiönsflüssigkeit, 5 organismustest (37⁰C^ 16 Stunden) gemäß der Papier-

SO wie sie ist, erneut zu der Trägerschicht hinzu, oder schetbenmethode oder der Bechermethode unter Ver-

man setzt sie zu einer anderen Trägerschicht hinzu, wendung von Bacillus subtilis PCI-219 als Teststa,mrh,

welche das deacylierende' Enzym adsorbiert aufweist, und man mißt den Durchmesser des Kreises, welcher

wodurch eine Reaktionsflüssigkeit erhalten werden das Wachstum hemmt. Aus der Standardkurve 'von

kann, deren Deacylierungsverhältnis hoch ist. io S-Methyl^-phenylacetamido- bzw. 3-Methyl-7-phen-

Wenn es gewünscht ist, die obenerwähnte Enzym- oxyacetamido-z!³-cephem-4-carbonsäure berechnet reaktion kontinuierlich durchzuführen, so ist es aus- man die Menge an Cephalosporin, und die Mengenreichend, die wäßrige Cephalosporin-Lösung kontinu- differenz zwischen dem Ausgangs-Cephalosporin. und ierlich der Trägerschicht mit adsorbiertem, deacy- dem restlichen Cephalosporin wird wiedergegebe ι als lierendem Enzym hinzuzusetzen. Jedoch wegen der 15 Prozentsatz gegenüber dem Ausgangs-Cephalosporin. schädlichen Einwirkung diverser Bakterien neigt das Dieser Prozentsatz ist das Zersetzungsverhältnis des Deacylierungsverhältnis dazu, allmählich täglich abzu- Ausgangs-Cephalosporins.
nehmen. Wenn man zum Oberteil der Kolonne oder

zum Substrat Toluol hinzugesetzt hat, so kann die & Bestimmungsmethode 2

schädliche Auswirkung infolge Verunreinigung auf ein 20 Eine bestimmte Menge an Reaktionsflüssigkeil: stellt

Mindestmaß herabgesetzt werden. man unter Verwendung von 1 η-Salzsäure auf einen

Beim erfindungsgemäßen Verfahren kann man eine pH-Wert von 2,5 ein, man wäscht dreimal mit einer Trägerschicht für mehr als 10 Tage verwenden, so daß Hälfte dieser Menge an Butylacetat, und man stellt die 7-ADCA in hoher Ausbeute gewonnen und mit dann unter Verwendung einer wäßrigen 1 n-Natriumgerlngen Kosten hergestellt werden kann. Demgemäß 25 hydroxydlösung auf einen pH-Wert von 7,5 ein. Anist das erfindungsgemäße Verfahren ein höchst vor- schließend behandelt man eine bestimmte Menge der teilhaftes Verfahren zur Herstellung von 7-ADCA so behandelten Reaktionsflüssigkeit mit einem Säuredurch enzymatische Deacylierung von 3-Methyl- chlorid, welches der Säure auf der Seitenkette des 7-phenylacetamido- oder 3-Methyl-7-phenoxyacet- Ausgangs-Cephalosporins entspricht und unterwirft amido-zJ ³-cephem-4-carbonsäure. 30 dann dem gleichen Mikroorganismustest wie in Be-

Die Gewinnung der 7-ADCA aus der so erhaltenen Stimmungsmethode 1. Aus der Menge des sich erge-Reaktionsnübsigkeit kann gemäß ^kannten Arbeits- benden Cephalosporins berechnet man rückwärts die gangen durchgeführt werden. Beispielsweise stellt man Menge an 7-ADCA, welche dann als Prozentsatz die Reaktionsflüssigkeit auf einen pH-Wert von etwa 2 wiedergegeben wird. Dieser Prozentsatz ist die Ausein und wäscht mit einem hydrophoben 01 ganischen 35 beute an 7-ADCA.
Lösungsmittel wie Äthylacetat, Butylacetat oder

Methylisobutylketon zum Entfernen von nicht umge- (3) Bestimmungsmethode 3

setztem Cephalosporin dann konzentriert man die Trinitrobenzolsulfonatmethode
wäßrige Schicht und stellt unter Abkühlen auf einen

pH-Wert von etwa 3,7 ein, um die 7-ADCA isoelek- 40 Zu 1 cm^s einer Probe setzt man 2 cm⁸ einer irisch auszufällen. Man kann aber auch die Reaktions- 0,3 m-Phosphatpufferlcsung (pH 8,0) und 2 cm³ einer flüssigkeit auf einen pH-Wert von etwa 3,7 einstellen, 0,1 %igen Trinitrobenzolsulfonat-Lösung hinzu, und konzentrieren und dann abkühlen, und man wäscht das sich ergebende Gemisch läßt man in der Dunkeiden sich ergebenden Niederschlag zwecks Entfernen heit bei 5O⁰C 90 Minuten reagieren. Nach dem Abvon nicht umgesetztem Cephalosporin und nebenher 45 kühlen gibt man zu der Reaktionsflüssigkeit 1 cm⁸ gebildeter Carbonsäure mit Aceton. 6 η-Salzsäure hinzu, und man mißt die Absorption

bei 395 m\L. Die Menge an 7-ADCA wird aus der Standard-Kurve von 7-ADCA berechnet.

Methode zum Messen der Aktivität _u .

adsorbierten Enzyms 50 Herstellung der Enzymzubereitung

a) 20 Liter eines flüssigen Kulturmediums (pH 7,0)

Ein Träger, auf welchem das deacylierte Enzym mit einem Gehalt an 1 % Polypepton, 1 % Hefeextrakt adsorbiert ist, wird in einem L-förmigen Testrohr und 0,5 % Natriumchlorid gibt man in einen 30-Litergewogen. Zu dem Testrohr setzt man 4,5 cm³ einer Schüttelfermentator, und man sterilisiert 20 Minuten 0,lmolaren Phosphatpufferlösung (pH 7,5) hinzu, und 55 mit Wasserdampf bei 120°C. Danach überträgt man das Testrohr schüttelt man 10 Minuten in einem 200 cm³ einer Saatkulturflüssigkeit von Bacillus mega-Thermostatschüttler, welcher bei 37°C gehalten wird. terium B-400 FERM-P Nr. 748, welche bei 30⁰C Anschließend setzt man 0,5 cm³ (10 Milligramm je cm^a 24 Stunden in einem Kulturmedium der gleichen Zuals freie Säure ausgedrückt) einer wäßrigen Lösung sammensetzung wie oben kultiviert worden ist, unter des Natriumsalzes der 7-Phenylacetamido-desacetoxy- 60 sterilen Bedingungen in das obengenannte Kulturcephalosporansäure hinzu, und das sich ergebende medium, und man fermentiert 48 Stunden bei 30⁰C Gemisch läßt man 30 Minuten reagieren. Nach der mit Belüftung und Rühren bei einer Luftcinführungs-Reaktion kühlt man die Reaktionsflüssigkeit sofort geschwindigkeit von 20 Litern je Minute und einer ab, und 7-ADCA in der Reaktionsmutterlauge, welche Rührgeschwindigkeit von 300 U/Min. Nach der vom Träger befreit ist, wird gemäß der Trinitrobenzol- 65 Fermentierung werden die Zellen mittels eines Zensulfonat-Methode bestimmt. trifugaltrenners entfernt, und man erhält 17,4 Liter

Ein Enzym titer, welcher 100 y/cm⁸ 7-ADCA bildet, -eines Kulturfiltrats.

wird dafür gehalten, daß er 100 Einheiten (U) ist. b) Das Kulturftltrat, welches in a) erhalten wurde,

/r j

10

konzentriert man bei einer Außentemperatur von 1 n-Natriumhydroxydlösung auf einen pH-Wert von 30 bis 35⁰C auf V₃, und das Konzentrat beschickt 7,5 ein. Zu dieser Lösung setzt man 2 g Natriumman mit Ammoniumsulfat, bis eine 80%ige Sättigung S-methyl^-phenoxyacetamido-zF-cephem^-carboxyerreicht wird. Den abgeschiedenen Niederschlag löst lat, und das sich ergebende Gemisch läßt man 15 Stunman m destilliertem Wasser auf, und man entsalzt 5 den bei 37⁰C reagieren. Danach befreit man die unter Verwendung einer Kolonne mit 3-dimensional Reaktionsflüssigkeit von Proteinen unter Verwendung vernetzten! Dextran. Die entsalzte Lösung wird eines Filters, man stellt mit 1 η-Salzsäure auf einen gefriergetrocknet, und man erhält 24,3 g eines Stan- pH-Wert von 2,5 ein, wäscht dreimal mit der Hälfte dard-Enzymproduktes. _ ihrer Menge an Butylacetat und stellt dann mittels c) 20 Liter eines flussigen Kulturmediums (pH 7,0) io wäßriger 1 n-Natriumhydroxydlösung auf einen pH-nut einem Gehalt an 0,5 % Glucose, 0,3 % Glycerin, Wert von 6,5 ein. Diese Flüssigkeit adsorbiert man an l/₀ Fleischextrakt und 1% Polypepton gibt man in einer 2 · 15-cm-Kolonne mit einem stark basischen einen Schuttelfermentator von 30 Liter Inhalt, und Polystyrol-Anionenaustauscher, vernetzt mit 8% Di-™V^ten "ι ^nurten mit Wasserdampf bei vinylbenzol (Essigsäuretyp), und man eluiert mit 120 C Danach über ragt man 200 cm einer Saat- i₅ 1 η-Essigsäure. Danach mißt man die Adsorptionskulturlauge von Bacillus megatermm B-400 FERM-P fähigkeit jeder Fraktion bei 260 ηιμ, oder man führ. Nr. 748, welche 24 Stunden bei 30°C in einem Kultur- einen biologischen Test nach dem Aufsprühen von medium der gleichen Zusammensetzung wie oben Phenoxyacetylchlorid auf Filterpapier durch, und kultiviert worden ist, unter sterilen Bedingungen in das Fraktionen, welche 7-Amino-3-methyl-^-cephem-

?ΪΓΓΛΤςί'ϊ 'Γ,' * ^maA i^err^ntif · ²⁰ ^^onsäure enthalten, sammelt man und unterwirft

bei 30 C 72 Stunden mit Be uftung und Ruhren bei sie dem Gefriertrocknen. Das getrocknete Produkt

S^iiS^Si^¹^¹??""¹"¹!?^· T ²⁰ "™ ^{1ÖSt man in einer} geringstmöglichen Menge destillierten

η/Μ· ν- h η % R^rgeschwindigkeit von 300 Wassers auf, und die sich ergebende Lösung stellt

U/M n. Nacn dem Fermentieren werden die Zellen man durch Hinzusetzen von 1 η-Salzsäure auf einen

£"* ^^ntf ^US^alal*^renners entfernt, und das *₅ pH-Wert von 3,7 ein. Dann läßt man über Nacht unter

^n 30 S tfc,^ η T ^Aui^entT^Pe^r ^EisküWung stehen, wobei sich farblose Kristalle ab-

von 30 bis 35 C auf V₃ Das Konzentrat beschickt scheiden. Die Kristalle wäscht man mit einer serinest-

Z ÄIT ^{60% id Ölih MenSe EiSWaSSer}' --seht danTn if Aceton

j Standard-Enzymproduktes erha.ten werden. t

d) Das in a) erhaltene Kulturfiltrat von Bacillus 69 6^O/

megaterium B-400 FERM-P Nr. 748 stellt man auf ' '"'

einen pH-Wert von etwa 7 ein. Zu je 1 Liter des B e i s ρ i ε 1 2

Kulturnitrats sew man einzeln je 50 g Kieselgur, 35 Zu einer Lösung von 10 mg des in b) erhaltenen

Danach gewinnt man jeden Träger durch Abfiltrieren WnTMetSKSKSAn^T^^^

und wäscht dann mit Wasser, wobei man einen nassen säure und die Seute Γη 7 A nr^t^

Träger enthält. Das Enzymadsorptionsverhältnis jedes Werte v"on 95 % Ä/ erhält ' ' "**

Tragers wird berechnet unter der Annahme eines 45 ^/o

100 %igen Enzymadsorptionsverhältnisses von Kiesel- r, ·

gur. Die erzielten Ergebnisse sind die folgenden: Beispiel 3

. ^^as Bespiel 1 wird wiederholt mit der Ausnahme,

Träger Relatives Adsorp- f "T ^Nainum-³-meÜiyl-7-phenylacetamido-J³-ce-

tionsverhältnis ⁵° Pnem-4-carboxylat anstelle des Natrium-3-methyl-

(%) '■P^henoxy^acetamido-Zl³-cephem-4-carboxylats ver-

wendet. Man erhält 849 mg 7-Amino-3-methyi-

Kieseleur mn f -cephem-^carbonsäure vom Schmelzpunkt 239 bis

Carboxymethylcellulose 100 B e i s ρ i e 1 4

Schwach saurer Chromate- 81,2

graphie-Ionenaustauscher ^'^{e in d}) erhaltene Kieselgur mit adsorbiertem

deacyherendem Enzym (Enzymüter 1800 U/g) wird

Das erfindungsgemäße Verfahren sei nunmehr φΐΐ ^^^Α⁰¹ ^^Pufferlösung i£^{ld ΑΛ}^^ ^ - Llonne

oei einer bestimmten Strömungsgeschwindigkeit Beispiel 1 ^aumgeschwindigkeit «= 0,5 Std.-*) mit der gleichen

4 g des rohen Enzyms, welches in b) erhalten wurde, ⁶ ^TS^^ST^ löst man in 500 cm* Wasser auf, und die sich ergebend^ gehalten ?Ä Ä ¹^ T* ^"^ Lösung stellt man unter Verwendung einer wäßrigen Mantel^SnTL ^? DanXlIßt ΪΓδ S

(5 mg/cm³, ausgedrückt als freie Säure) einer wäßrigen Lösung von Natrium-7-phenylacetamido-desacetoxycephalosporant durch die Kolonne mit einer konstanten Strömungsgeschwindigkeit (Raumgeschwindigkeit = 0,5 Std.-¹ [2,6 ml/h]) strömen, und die ausfließende Flüssigkeit fraktioniert man in Einzelfraktionen (Fraktionsmenge 10,8 cm³). Es wird eine Zeit von etwa 16 Stunden zum Vollenden des Ausfließens benötigt.

6,4 Liter der gesamten ausgeflossenen Flüssigkeit stellt man auf einen pH-Wert von 6 ein, und dann konzentriert man auf etwa Vio· Das Konzentrat stellt man unter Verwendung von 6 η-Salzsäure auf einen pH-Wert von 3,7 ein, wodurch das Ausfallen der gebildeten 7-ADCA eingeleitet wird. Dieses Konzentrat kühlt man zur Vollendung der Ausfällung mit Eis. Die Ausfällung gewinnt man durch Abfiltrieren, man wäscht mit einer kleinen Menge Eiswasser, trocknet genügend mit Aceton und trocknet dann zur Erzielung von 14,0 g an weißer 7-ADCA vom Schmelzpunkt 240 bis 242⁰C. Ausbeute: 72,4%. Dieses Produkt löst man in wäßriger 2,5 n-Natriumhydroxydlösung auf. Die entstehende Lösung entfärbt man mit Aktivkohle, stellt unter Verwendung von 6 n-Salzsäure den pH-Wert auf 3,7 ein und kühlt dann mit Eis ab, wobei sich 7-ADCA niederschlägt. Anschließend gewinnt man die 7-ADCA durch Abfiltrieren, Waschen mit einer kleinen Menge Eiswasser, Waschen mit Aceton und Trocknen, wodurch 11,4 g eines gereinigten Produktes erhalten werden.

Beispiel 5

Das Beispiel 4 wird wiederholt mit der Ausnahme, daß man anstelle der Kieselgur mit adsorbiertem deacylierendem Enzym jeden der in d) erhaltenen Träger, d.h. Aktivkohle mit adsorbiertem Enzym, Carboxymethylcellulose mit adsorbiertem Enzym und schwach sauren Chromatographie-Ionenaustauscher mit adsorbiertem Enzym verwendet. Die erzielten Ergebnisse sind die folgenden:

Art des Trägers

Erhaltene
Menge

(g)

Ausbeute

Aktivkohle	37,5	58	,2
Carboxymethylcellulose	32,9	51	,8
Schwach saurer Austauscher	31,3	48	,5
B e i s ρ i	el 6

Zur Erzielung einer Kultur bewirkt man die gleiche Kultivierung wie in a). Einen Liter dieser Kultur überträgt man in einen 250-1-Kulturtank, welcher 200 Liter eines Mediums der gleichen Zusammensetzung wie in a) enthält, und man kultiviert 48 Stunden bei 30⁰C.

Es werden zwei dieser 250-1-Tanks gefahren, um 350 Liter eines Kulturnitrats zu erhalten. Zu dem Kulturnitrat setzt man 3,5 kg Kieselgur hinzu, und das sich ergebende Gemisch rührt man 30 Minuten, wobei man den pH-Wert bei 7 hält. Anschließend entwässert man das Gemisch auf einer Zentrifuge, und den Rückstand wäscht man mit Wasser. Man erzielt 5,2 kg an nasser Kieselgur (Enzymtiter 5000 U/g). Diese Kieselgur packt man in eine Vinylchloridkolonne der Ausmaße 120 · 900 mm, und man läßt durch die Kolonne eine Lösung von 5 mg/cm³ 7-Phenylacetamido-desacetoxy-cephalosporansäure in einem 0,05 m-Phosphatpuffer (pH 7,5) fließen, während man die Temperatur bei 37⁰C hält (Gesamtmenge 1,8 kg/ 360 Liter, Strömungsgeschwindigkeit 5 Liter je Stunde).

Die Eluierung ist in 72 Stunden vollendet, und man erhält insgesamt 375 Liter eines Eluats. Zu diesem Eluat setzt man 290 Liter Aceton hinzu, und das sich ergebende Gemisch stellt man unter Verwendung von 6 η-Salzsäure auf einen pH-Wert von 4,0 ein. Man rührt hinreichend für 30 Minuten und läßt dann zum Absetzen eines Niederschlages über Nacht stehen. Der Niederschlag wird durch Abfiltrieren gewonnen, mit Aceton gewaschen und dann getrocknet. Man erhält 1130,2 g Kristalle von 7-ADCA (Reinheit 90,0 %ig), Ausbeute 89,2

o/ /o·

Claims (1)

1. Patentansprüche:

   1, Verfahren zur Herstellung von 7-Amino-■desacetoxy-cephalosporansäure der allgemeinen Formel

   H₂N

   (Π)