DE2163147C3

DE2163147C3 - Vorrichtung zur Durchführung von Gel-Diffusionstests

Info

Publication number: DE2163147C3
Application number: DE2163147A
Authority: DE
Inventors: Sheldon H. Redondo Beach Calif. Forel
Original assignee: Baxter Travenol Laboratories Inc
Current assignee: Cooper Laboratories Inc
Priority date: 1970-05-20
Filing date: 1971-12-20
Publication date: 1981-07-23
Also published as: CH548604A; US3718436A; AU3711771A; DE2163147A1; US3674438A; CA961748A; AU457921B2; NL7117592A; FR2120947A5; GB1379035A; DE2163147B2; US3725004A

Description

Die Erfindung geht aus von einer Vorrichtung zur Durchführung von Gel-Diffusionstests nach dem Oberbegriff des Anspruchs 1.

Bei einer derartigen bekannten Vorrichtung ist in einem Außenraum zwischen einer inneren Wand und einer äußeren Wand, die beide parallel zueinander verlaufen, ein Gel eingefüllt (DE-OS 15 98 163). In das Gel kann eine große Anzahl von Löchern gestanzt werden, die von den Rändern gleichen Abstand und damit gleiche Abmessungen besitzen. Zur Bestimmung des Antigens werden konstante Volumina von Antigenlösungen abgestufter bekannter Konzentrationen in einige der ausgestanzten Löcher eingebracht, und in die verbleibenden Löcher werden die zu bestimmenden Antigenlösungen eingetragen. Im Laufe einer bestimmten Zeit diffundieren die Antigene in das Agargel, reagieren mit dem Antikörper und bilden um die Löcher getrübte Präzipitationsringe, deren Durchmesser von der Konzentration abhängig ist

Diese mit der genannten Vorrichtung durchführbaren immunchemischen Testverfahren sind vor allem geeignet zur quantitativen Bestimmung bestimmter Blutproteine.

Da die bei der Gelierung verwendeten Antisera oder Antikörper relativ teuer sind, wurden Versuche unternommen, um die Flächengröße möglichst klein zu halten und dennoch gute Ergebnisse zu erzielen. Gemäß CHn. Chim. Acta 21,517-520 (1968) soll Antikörpermaterial dem Gel in kleinen Agar-Scheiben zugesetzt werden. Antigen wird in eine mittlere Bohrung jeder Scheibe gegeben, diffundiert dann durch den Agar und bildet einen konzentrischen Niederschlagsring. Diese Vorrichtung ist schwer herzustellen, da voneinander getrennte Scheiben erforderlich sind; außerdem ist sie nicht leicht im richtigen Verhältnis und genau zu füllen, da für jede einzelne Scheibe getrennte Gießvorgänge für Gel und Antisera erforderlich sind.

In einer weiteren bekannten Vorrichtung wird ein flacher Behälter benutzt, in den im gleichen Abstand angeordnete Löcher für das Antigen angeordnet sind, ohne daß eine Überlappung der konzentrisch zu den Löchern gebildeten Präzipitations- oder Niederschlagszonen auftritt (Bericht von Lou and Shanbrom, J. Amer. Med. Ass'n. 200, Seite 323 (1967)).

Ferner wird der Behälter einer weiteren wirtschaftlichen Vorrichtung durch Trennwände in kleine den Agar enthaltende Flächen von 1,27 χ 7,62 cm unterteilt. Eine derartige kleine Fläche liefert jedoch bei sechs Bohrungen keine befriedigenden Ergebnisse. Bei dieser Ausführungsform sind die Trennwände in Längsrichtung verlaufende Seitenwände, die parallel zueinander und im Abstand von nur 1,27 cm voneinander verlaufen. Dieser geringe Abstand bewirkt eine konkave, meniskusförmige Gestalt der Agar-Gelatine und eine Dehydrierung der Gelatine, so daß die Ergebnisse des Diffusionstests verzerrt werden, indem das Antigen nicht-kreisförmige Muster bildet.

Bei allen bisher bekannten kleinen Behältern für radiale Gel-Diffusion wurden entweder verzerrte Diffusionszonen und unbrauchbare Testergebnisse erzielt oder sie waren unpraktisch in der Herstellung und im Gebrauch. Bei kleinen Geloberflächen, die durch gerade Kanten — äußere oder innere Trennwände —

begrenzt sind, treten dabei folgende Probleme auf: Liegen die Löcher nahe beieinander, stehen die Reaktionszonen miteinander in Verbindung und verhindern dadurch die Bildung runder Niederschlagszonen.

Liegen die Löcher dagegen weiter auseinander, aber s näher an den Kanten des Behälters oder der Platte, geschieht folgendes: Wo die Zonen nahe den Plattenkanten liegen, werden die Ringe in Richtung zur Trennwand gezogen, bis die Niederschlagszonen die Trennwand entweder berühren, oder bis sie an den ι ο Stellen der Ringe, die der Trennwand am nächsten liegen, eine spitze oder rechteckige Form erhalten.

Bei den bisherigen Ausführungsformen wurde das Grundproblem noch nicht befriedigend gelöst, nämlich in einer mit geringem Aufwand herstellbaren Vorrich- is tung mit sehr wenig Gel und biochemisch aktiver Substanz darin einwandfreie Testergebnisse zu erzielen.

Zu der Erfindung gehört daher die Aufgabe, eine wenig aufwendig herstellbare Vorrichtung zur Durchführung von Gel-Diffusionstests der eingangs genannten Gattung so weiterzubilden, daß mit Einsatz minimaler Gelmengen gut auswertbare Testergebnisse erzielt werden.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch eine Vorrichtung mit den in dem kennzeichnenden Teil des Anspruchs 1 angegebenen Merkmalen gelöst

Diese Vorrichtung hat insbesondere den Vorteil, daß an jeder beliebigen Stelle der Aussparung flüssiges Gelmaterial eingefüllt werden kann. Da das gelierende Material fließfähig ist, strömt es in die anderen Bereiche oder Buchten der Aussparung, wodurch vermieden wird, daß das gelierende Material in einzelne Testzonen gesondert gefüllt werden muß.

Weitere vorteilhafte Ausgestaltungen der Erfindung ergeben sich aus den Unteransprüchen.

Die Erfindung ist im folgenden anhand der Zeichnung beispielsweise erläutert Es zeigt

F i g. 1 schaubildlich eine Draufsicht auf eine Vorrichtung zur Gel-Diffi;sion mit aufgesetztem Deckel;

Fig.2 eine Darstellung wie nach Fig. 1, wobei jedoch der Deckel von dem flachen Behälter abgehoben ist;

F i g. 3 eine Stirnansicht der Vorrichtung mit aufgesetztem Deckel;

Fig.4 einen Querschnitt nach der Linie 4-4 der Fig.l;

F i g. 5 eine Draufsicht auf den flachen Behälter;

F i g. 6 schaubildlich eine Draufsicht auf eine andere Ausführungsform der Gel-Diffusionsvorrichtung mit aufgesetztem Deckel;

Fig. 7 eine Darstellung wie in Fig.6, wobei der Deckel von dem flachen Behälter abgehoben ist;

Fig.8 eine Stirnansicht der Ausführungsform nach Fig.7;

Fig.9 einen Querschnitt nach der Linie 9-9 der Fig.6;

Fig. 10 eine Draufsicht auf die Ausführungsform nach Fig.9;

F i g. 11 eine Draufsicht auf den flachen Behälter einer anderen Ausführungsform, und

F i g. 12 eine Draufsicht auf den flachen Behälter einer weiteren abgeänderten Ausführungsform.

F i g. 1 zeigt eine Gel-Diffusionsvorrichtung 11. Unter dem Deckel 13 ragt ein Teil des flachen Behälters 12 hervor. Die Gel-Diffusionsvorrichtung hat in dieser b5 Stellung eine rechteckige Form mit relativ gleichmäßiger geringer Höhe. Fi g. 2 zeigt den flachen Behälter 12 deutlicher, welcher eine rechteckige flache, plattenförmige Ausbildung aufweist und von dem ein größerer Teil an mehreren bzw. allen Seiten vorsteht so daß an jeder Seite eine Schulter 14 gebildet wird. Die sich in horizontaler Richtung erstreckenden Kanten 15 des flachen Behälters ragen an der Unterseite über den Verschlußdeckel 13 vor.

Der Verschlußdeckel 13 weist einen verhältnismäßig flachen obersten Teil 16 auf. Von diesem obersten Teil 16 aus erstrecken sich Seitenwände 17 und in ähnlicher Weise Stirnwände 18 nach unten und außen. Die nach oben ragenden Seitenwände 19 und Stirnwände 20 des flachen Behälters 12 sind nach innen geneigt Die inneren Abmessungen des lichten Querschnitts des Verschlußdeckels sind größer als die Querschnittsabmessungen des flachen Behälters 12 in seiner Oberfläche, jedoch kleiner als die Querschnittsabmessungen unterhalb der Oberfläche des flachen Behälters. Aufgrund dieser Abmessungen sitzt der Verschlußdekkel fest auf den betreffenden Seiten- und Stirnwänden des flachen Behälters. Bei Verwendung eines Verschlußdeckels mit genügend hohen Seiten- und Stirnwänden sitzt die Unterseite des flachen oberen Teils 16 nicht fest auf der oberen Oberfläche 21 des flachen Behälters, sondern ist vertikal von dieser abgesetzt F i g. 3 ist eine Stirnansicht und zeigt den Festsitz des Verschlußdeckeis auf dem flachen Behälter, wie im Querschnitt nach F i g. 4 noch besser dargestellt ist Aus F i g. 3 und 4 ist zu ersehen, daß die nach unten gerichteten Kanten des Verschlußdeckels nicht gegen die Oberfläche der Schulter 14 stoßen.

F i g. 2 und 5 zeigen, daß der flache Behälter 12 eine längliche Aussparung 23 mit einem Boden 22 aufweist. Die Seitenwände 24 der Aussparung besitzen eine Vielzahl im Abstand angeordneter bogenförmiger Ausrundungen 25. Die bogenförmigen Ausrundungen einer Seitenwand sind genau gegenüber den bogenförmigen Ausrundungen der anderen Seitenwand angeordnet Jede der durch die gegenüberliegenden Ausrundungen gebildeten Bogen bilden etwa Viertelkreisbogen eines imaginären Kreises. Die gesamte Aussparung 23 sieht daher so aus, als bestehe sie aus einer Vielzahl von kreisförmigen Ausnehmungen mit weggenommenen Zwischenstegen, so daß alle Ausnehmungen miteinander in Verbindung stehen.

Die Gel-Diffusionsvorrichtung kann aus Kunststoff hergestellt sein, z. B. einem starren transparenten oder durchscheinenden Kunststoff. In diesem Fall können der Verschlußdeckel 13 und der flache Behälter 12 im Spritzgußverfahren hergestellt sein. Aus Fig.4 ist zu ersehen, daß der flache Behälter entlang seinem Boden hinterschnitten ist. Bei Verwendung von transparentem Material kann der Diffusionsgrad während des Tests leicht sowohl durch den Boden als auch durch den Deckel hindurch festgestellt werden, ohne daß der Verschlußdeckel 13 abgenommen werden müßte.

Fig.6 bis 10 entsprechen den oben beschriebenen F i g. 1 bis 5, zeigen jedoch eine andere Ausführungsform. Die Änderung liegt vor allem darin, daß zwei parallel zueinander verlaufende Aussparungen 31, 32 vorgesehen sind, von denen jede ',vie die Aussparung 23 der Fig. 1—5 ausgebildet sind. Bei der Ausführungsform nach 6—10 ist es vorteilhaft, den flachen Behälter zur Aufnahme der zwei Aussparungen etwas breiter zu gest?'ten. Da diese Ausführungsform im wesentlichen der erstbeschriebenen Ausführungsform entspricht, braucht sie nicht im einzelnen beschrieben zu werden.

F i g. 11 ist eine Draufsicht auf eine weitere Ausführungsform, bei der der flache Behälter kreisförmig

ausgebildet ist und eine Aussparung 35, die wieder bogenförmige Ausbuchtungen aufweisende Wände besitzt ringförmig ist. Fig. 12 zeigt eine weitere abgeänderte Ausführungsform, bei welcher eine Aussparung 41 quadratisch gestaltet ist und einen quer durch die Quadratfläche verlaufenden vertieften Teil 42 aufweist. Bei dieser Ausführungsform ist gewöhnlich die gesamte Vorrichtung viereckig, ebenso der Verschlußdeckel. Aus den obigen Ausführungen ergibt sich, daß die das Gelmedium aufnehmenden Aussparungen in einer Anzahl von Reihen angeordnet sein können und verschiedene andere Ausbildungen möglich sind.

Der Vorteil der in Fig.6—12 dargestellten Ausführungsform liegt darin, daß auf ein- und derselben Platte Kombinationen einzelner Aussparungen die Durchführung verschiedener Tests zu verschiedenen Zeiten ermöglichen, ohne daß von früheren Reaktionszonen Stoffe in den auf der Platte befindlichen unbenutzten Teil des Gels durchsickern. Wenn die Aussparungen also wie in F i g. 6—10 in Reihen angeordnet sind, kann zwischen den Bohrungsreihen keine Wechselwirkung entstehen, weil jede Bohrungsreihe für sich eine gesonderte Aussparung bildet Wenn die Aussparung kreisförmig auf einer Platte angeordnet ist, wie in Fig. 11, kann in gleicher Weise diagonal über den Kreis hinweg keine Wechselwirkung entstehen. Zum Vergleich sei erwähnt, daß bei bekannten Platten, die eine Vielzahl von Bohrungen aufweisen, beispielsweise 24 Bohrungen auf einer einzigen durchgehenden GeI-oberfläche, nach Gebrauch dieser Bohrungen einige der übrigbleibenden unbenutzten Bohrungen zur Verwendung nicht mehr geeignet sind, weil eine Wechselwirkung mit den schon gebrauchten Bohrungen eintreten würde.

Beim Gebrauch wird das durch ein Paar gegenüberliegender bogenförmiger Ausbuchtungen begrenzte Feld eingestanzt und ergibt so eine einzige Bohrung oder Lochung pro Feld. Die Abmessungen sind gemäß der Erfindung genau gewählt und liegen bei etwa 1,10 cm² bis etwa 1,16 cm² und vorzugsweise bei 1,14 cm² pro Feld. Das Feld hat somit vorzugsweise einen Durchmesser von etwa 12 mm.

Aufgrund der neuartigen Verwendung der bogenförmigen Ausbuchtungen der Seitenwände der Aussparung können mit der Gel-Diffusionsvorrichtung mit den oben erwähnten Feldgrößen genaue Proteinbestimmungen gemacht werden, für welche bisher Gelmedium-Oberflächen von zwischen 1,61 bis etwa 3,87 cm² pro Bohrung erforderlich waren.

Die Gel-Diffusionszone wird durch die Aktivität und

die Menge des Antigens bzw. der Antikörper oder anderer in dem Gel befindlicher biochemisch aktiver Substanz und die Konzentration der zugehörigen in je einer Bohrung des Lochsystems enthaltenen reagierenden Substanz bestimmt. Nach den anerkannten herkömmlichen Verfahren sollen die spezifischen Eigenschaften des Antigen oder Antikörper enthaltenden Gels Ringe mit einem Durchmesser von mindestens 3 mm bilden, da kleinere Zonen für genaue quantitative

ίο Resultate nicht ausreichen. Dieses Erfordernis ergibt sich aus der Verwendung einer Standard-Bohrung von etwa 2,5 mm im Durchmesser, die auf beiden Seiten der Bohrung einen Radius bzw. radialen Abstand von wenigstens 0,25 mm um die Bohrung herum für einen Mindest-Diffusionsring von 3 mm Durchmesser beläßt. Der Durchmesser der Gel-Diffusionszone soll vorzugsweise aber zwischen 3,5 und 9 mm betragen, weil dann die beste Empfindlichkeit und Genauigkeit der quantitativen Bestimmung erzielt wird.

Ferner ist die Tiefe der Aussparung 23 von Bedeutung, welche zwischen 2 und 3 mm und vorzugsweise 2,5 mm beträgt, also, wie oben beschrieben, ziemlich gering ist. Die in Fig. 1—5 dargestellte Aussparung hat gewöhnlich ein Volumen von etwa 1,4 bis 1,6 ml. Bei Verwendung der zweireihigen Ausführungsform nach Fig.6—10 ist das Gesamtvolumen etwa 2,8 bis 3,2 ml. Bei einem flachen Behälter mit Außenabmessungen von etwa 3,81 χ 9,525 cm können tatsächlich zwei Reihen von Aussparungen unterge bracht werden. Bei den oben erwähnten Abmessungen erhält man im allgemeinen sechs ausgerundete Zonen oder Felder bei nur einer einzigen Aussparung und 12 Felder bei zwei Aussparungen.

Jede Aussparung des Behälters weist vorzugsweise

mindestens vier ausgerundete Felder auf, von denen drei gewöhnlich für Kontrollproben dreier verschiedener

Aktivitätsgrade verwendet werden und eine weitere für

eine unbekannte Probe dient

Die hier beschriebene Gel-Diffusionsvorrichtung ist

keinesfalls auf einen spezifischen Radialdiffusionstest beschränkt, sondern kann bei allen derartigen Tests angewendet werden. Die Vorrichtung kann beispielsweise zur quantitativen Bestimmung kleiner Konzentrationen von Antigenen, Antikörpern, Enzymen, Hormo- nen, Proteinen, Steroiden, Kohlehydratprodukten, Protein, und üpoid-Stoffwechsei, Antibiotika und anderen Arzneimitteln zur Behandlung von Krankheiten sowie ähnlicher Komponenten biologischer Flüssigkeiten oder fließfähiger Medien, wie Blutserum, Plasma, Urin und cerebrospinaler Flüssigkeit verwendet werden.

Hierzu 5 Blatt Zeichnungen

Claims

Patentansprüche:

1. Vorrichtung zur Durchführung von Gel-Diffusionstests, insbesondere mit radialer Gel-Diffusion, umfassend einen flachen Behälter mit mindestens einer entlang seiner Oberfläche verlaufenden Aussparung, dadurch gekennzeichnet, daß die Aussparung (23, 31, 32, 35, 41) an ihren Seitenwänden (24) bogenförmige Ausbuchtungen (25) aufweist und daß die Ausbuchtungen der einen Seitenwand den Ausbuchtungen der anderen Seitenwand gegenüberliegen und durch diese Zuordnung eine Vielzahl von Feldern begrenzen, von denen jedes mit mindestens einem anderen Feld über Bereiche der Aussparung in Verbindung steht, die schmäler als der größte Abstand der Seitenwände an zwei sich so gegenüberliegenden Ausbuchtungen sind.

2. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Oberfläche (21) des Behälters (12) mit Ausnahme der Aussparung (23, 31, 32, 35, 41) eine praktisch ununterbrochen durchgehende Oberfläche ist

3. Vorrichtung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Aussparung (25, 31, 32) langgestreckte Form hat, wobei je ein Paar einander gegenüberliegender Ausbuchtungen (25) je ein Feld begrenzen.

4. Vorrichtung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Aussparung (35) Kreisform hat

5. Vorrichtung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Aussparung (41) viereckige, vorzugsweise rechteckige oder quadratische Form hat

6. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1—5, dadurch gekennzeichnet, daß der Behälter (12) Außenwände (19, 20) aufweist, die vom Boden aus nach oben ragen und nach innen geneigt sind.

7. Vorrichtung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß ein Deckel (13) vorgesehen ist, der aus einer Deckplatte (16) und Seitenwänden (17) besteht, die von der Deckplatte nach außen geneigt sind, die auf die schrägen Außenwände des Behälters (12) passen und solche Abmessungen aufweisen, daß die Unterseite der Deckplatte (16) des Deckels bei aufgesetztem Deckel in Abstand von der Oberfläche (21) des Behälters angeordnet ist.

8. Vorrichtung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß vom Boden des Behälters (12) ein sich von seinen Seitenwänden nach außen erstreckender Flansch (14) vorgesehen ist.

9. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1—8, dadurch gekennzeichnet, daß die Aussparung (23,31, 32,35,41) mit einem Gelmedium gefüllt ist.

10. Vorrichtung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß das in jedem Feld enthaltene Gel mit je einer kleinen Bohrung mittig zum Feld versehen ist.

11. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1—8, dadurch gekennzeichnet, daß der Behälter (12) und der Deckel (13) aus Kunststoff bestehen.

12. Vorrichtung nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß der Kunststoff mindestens für den Deckel transparent ist.

13. Vorrichtung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Oberfläche des Gelmediums etwa 1,097 bis 1,16 cm² pro Feld beträgt.

14. Vorrichtung nach Anspruch 13, dadurch

gekennzeichnet, daß die Tiefe der Aussparung (23, 31,32,35,41)2-3 mm beträgt