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Verfahren zur Konservierung von flüssigen Nahrungsmitteln.
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[Ausscheidung aus Patent .(Pat.Anm. P 20 59 864.5-41)) Die Erfindung
betrifft ein Verfahren zur Konservierung von flüssigen Nahrungsmitteln. Insbesondere
betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Konservieren von flüssigen Nahrungsmitteln,
das darin besteht, daß man zu den flüssigen Nahrungsmitteln, die aus der Gruppe,
bestehend aus flüssigen Würzen, nicht-alkoholischen Getränken, Fruchtwein und Sake,
ausgewählt werden, einen DihydroxybenzoeRäureester oder ein Dihydroxyphenylalkylketon
hinzufügt.
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Der Ausdruck "flüssiges Nahrungsmittel", wie er in der vorliegenden
Anmeldung und in den Ansprüchen verwendet wird, bedeutet flüssige Würzen, wie Sojabohnenöl,
Essig und Saucen und- nichtalkoholische Getränke, wie natürliche Fruchtsäfte und
Getränke, die Kohlensäure enthalten, Fruchtwein, Wein und Sake bzw. Reiswein.
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Konservierungsstoffe, die im allgemeinen bei flüssigen Nahrttngsmitteln
verwendet werden, sind Benzoesäure, Salicyîsaure, Dehydracetsäuresalze, p-Hydroxybenzoesäureester
und Salze der Sorbinsäure.
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Bei diesen Konserrierungsstoffen geschieht es manchmal, daß eine ausreichende
Konservierungswirkung nicht erreics- wird, wenn sie
in den Mengen
zugefügt werden, die von den Nahrungsmittelgesetzen erlaubt sind. Weiterhin hängt
ihre Wirkung von den Arten der Nahrungsmittel, zu denen sie zugefügt erden, ab.
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Im Falle von Sojabohnenöl werden die Propyl- und Butylester von p-Hydroxybenzoesäure
verwendet, um die fäulniserregenden Mikroorganismen, wie wilde Hefe, zu kontrollieren,
aber diese Ester werden im Falle von Sojabohnenöl, das nicht während 20 bis 30 Minuten
auf 8000 erwärmt worden war, durch Esterase, die in dem Soljabohnenöl zu rückbleibt,
zersetzt und ihre Wirkung geht verloren. Im falle von Reiswein ist es in Japan erlaubt,
Silicylsäure in einer Me@ ge bis zu 250 ppm zu verwenden, um die hauptsächlichsten
fäulniserregenden Bakterien, wie Lactobacillus homochiochi und @iochis Lactobacilli
zu kontrollieren, aber eine Zugabe von Salicylsäure ren in solchen Mengen ergibt
eine ausreichende Konservierung wirkung. Weiterhin besteht im @alle von Salicy@säure
das @@i@ tätsproblem. Gegen die hauptsichlichsten fäulniserregende Ba@ terien des
Essigs, wie Acetobacter xylinum und anderen Essigsäurebakterien, wird Butyl-p-hydroxybenzoat
hauptsächlich als Konservierungsmittel verwendet. Jedoch hat Butyl-p-hydroxybenzoat
bei einer Konzentration, die zum Kontrollieren solcher @äu niserregenden Bakterien
wirksam ist, beispielsweise um 140 ppm die Neigung, während des Lagerns bei ungefähr
0°C auszufallen, da es in Essig beschränkte Löslichkeit besitzt und der Essig wird
opak und trübe. Werden Benzoesäure oder Sorbinsäure verwendet, um die fäulniserregenden
Mikroorganismen in Fruchtsäften@ wie Hefe und Schimmel, zu kontrollieren, so beeinflussen
diese Säuren den Duft und den Geschmack der Säfte nachteilig. Werden Dutyl-p-hydroxybenzoat
und Sorbinsäure als Konservierungsmittel für r Reiswein oder Fruchtwein verwendet,
so haben sie bei ihren wirksamen Konzentrationen (70 bis 100 ppm bei dem ersteren
und
200 bis 400 ppm beim letzteren) sehr schlechten Einfluß auf
solche Getränice, mit dem Ergebnis, daß der Wert eines Getränks verloren geht.
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Es wurde nun gefunden, daß aromatische Carbonsäureester oder aromatische
Ketone, die zwei Hydroxylgruppen, gebunden an einen Benzolkern enthalten ausgezeichnetes
antibakterielles Spektrum besitzen und eine sehr niedrige Toxizität aufweisen, da
Vorlaufer dieser Verbindungen in der Natur vorkommen und im allgemeiner für den
menschlichen Körper unschädlich sind.
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Weiterhin wurde gefunden, daß diese Verbindungen in flüssigen Nahrungsmitteln
ausgezeichnet löslich sind und daß sie eine hervorragende Lagerungsstabilität aufweisen.
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Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Konservierung
von flüssigen Nahrungsmitteln, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man einem flüssigen
Nahrungsmittel, das aus der Gruppe, bestehend aus flüssigen Wurzeln, nicht-alkoholischen
Getränken, Fruchtweinen und Sake, ausgewählt wird, eine Verbindung der Formel:
zufügt, worin n 2, R eine Alkylgruppe mit 3 bis 8 tohlenstoffatomen und M ein Wasserstoffatom,
ein Alkalimetall oder ein halbes Mol eines Erdalkalimetalls bedeuten.
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In den allgemeinen Formeln I und II können die durch R ausgedrückten
Alkylgruppen entweder geradkettig oder verzweigt sein, aber im allgemeinen ist es
vorzuziehen, daß R eine geradkettige Alkylgruppe ist.
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Verbindungen der Formeln I und II, die bei der vorliegenden Erfindung
verwendet
werden können, sind in Tabelle I angegeben.
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Tabelle I
| verbin- Löslichkeit (ml) S0chmelzpunkt |
| dung Strukturformel Wasser 150%ige waß- |
| Ringe Lösung iedepunkt, |
| }ir StrukturSormel Wasser zi S Lo s g 6 S3 depunkts |
| ~ H~ |
| i HO5 COOC3H7 2. 50 x 102 7.02 » 102 39. |
| 2 b 00004119 1.0 x 102 5.13 x 102 60 - 61 |
| 3 1 000c5t111 3,88 x 10 8.62 x 10 [145/0.0S inrnllgJ |
| 4 n -000061113 1s37 x 10 4.21 x 10 tl47/Q,l mmHg] |
| 5 1 c7}I15 5,82 2.50 x 10 [l56/0. 1 mmHg] |
| 6 tr - COOCgHL7 3,28 1.61 x 10 tl60/o. 2 innilig] |
| OH |
| 7 ffi$/\cooo3<7 1.5? x 103 5.21 x 103 60 |
| 110 |
| 7 ,011 1.57 x 103 5.91 x 103 60 |
| 8 " - COOC4H9 7.53 x 102 1. 35 - x 102 62 - 4 |
| 9 1I - COOCsHll 3.10 x 102 6.19 x 102 [145/l mmHg] |
| 10 ,1 -COOC6H13 1.91 x 102 5.72 x 102 [170/2 mmHg] |
| 11 1 -COOG7H15 5.65 x 10 1.13 x 102 [168/1 mmIIs3 |
| 12 " - COQC8H17 2.46 x 10 2.00 x 10 [178/1 mmHg| |
| 13 HO |
| HOOCOOC3H7 1.29 x 103 4.37 x 103 115 |
| 14 1l -000C4H9 5.45 x 102 1.49 x 103 113 - 5 |
| 15 | - COOCsHll 2.92 x 102 1 7.80 x 102 93.5 - 94. 5 |
| 16 " - COOC6H13 1.81 x 102 5.43 x 102 117 |
| 17 -C°°C7}i15 7.20 x 10 1.45 x 102 84 - 86 |
| 18 1i -COOCgH17 1.91 x 10 2.75 x 10 101 - 103 |
| HO |
| 19 t3FCOOC3H7 1.86 x 103 7.29 x 103 60 - 61 |
| 110 |
| 20 " -COOC4Hg 6.48 x 102 1.35 x 103 [198/0.2 mmHgl |
| 21 1 -COOCHll 2.14 x 102 6.48 x 102 1205 - 210 |
| /0.15 mmHgJ |
| 22 " -COOC6H13 8.22 x 10 4.87 x 102 [208 212 |
| /0.1 mmHg3 |
| 23 1' C00ll15 3.92 x 10 1.20 x 102 (215/0.1 romHg] |
| lt -Co°C8Nl7 2.12 x 10 6. 88 x 10 [220/0.1 rawnHg] |
| 011 |
| UQG3N'I l x iOX LQ-a ) 3 52 |
| 26 11 - ONl52 3,9 x 10 X lo2 , e93so2 57 - 60 |
| 27 - O0%t11 5.6 x 1, 18 x 102 53 - 5 |
| 28 " 1l XT33 2, 50 2 10 l.Ag x 102 42 7 47 |
| 29 11 "@OC6115 9.13 t 62 62 63 |
| II |
| 33 ß °C32t? 2.61 x 102 53l x 102 79 - g2 |
| 110 |
| 31 11 ( 0OAF1H? F^24/F X )0 2s93 x 102 51 - 4 |
| 32 8 wC00 3ç7fZ x 10 7.96 :: 10 77 - 9 |
| 33 1I 00C6¼3 1rf,; 3 10 7@21 wie $8 " 9C |
| 34 II -C0O7l5 l x- ; 6.4 ic SO 85 - 87 |
| HO |
| 35 HC; O 3i-17 7.70 l.99 X 103 144 - 6 |
| X t 'COC;b9 Jfflg 3 9@Ab x 152 9 6 |
| 36 r -CICSII11 1.80 tl gnya8 x |
| i0 x i2 77 - |
| 37 -°DO5} 77 5§58 x i.c 77 |
| 38 lt -C6(JH13 3.16 x 10 14½ x io2 83 - 85 |
| 33 lt -C0H15 3..3Q x 10 6.00 x 10 81 - 86 |
Bei der vorliegenden Erfindung ist es kritisch, daß die Verbindung,
die durch die Formeln I oder II ausgedrückt wird, eine Alkylgruppe R besitzt, die
3 bis 8 Kohlenstoffatome enthält.
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Unter den Verbindungen, die durch die Formeln I und II ausgedrückt
werden, sind solche, die Alkylgruppen mit bis zu 2 Kohlenstoffatomen als Rest R
besitzen, nicht geeignet, da ihre antibakterielle Wirkung sehr schwach und ihre
Toxozität sehr hoch ist. Andererseits sind Verbindungen, die als Gruppe R eine Alkylgruppe
mit 9 oder mehr Kohlenstoffatomen enthalten, wegen ihrer geringen Löslichkeit nicht
bevorzugt.
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.Die erfindungsgemäßen Dihydroxybenzoesäureester oder die Dihydroxyphenylalkylketone
können in Form eines Salzes verwendet werden, wenn das Wasserstoffatom von einer
oder mehreren Hydroxylgruppen durch ein Alkalimetall, wie Natrium oder Kalium, oder
durch ein Erdalkalimetall, wie Magnesium und Calcium ersetzt ist. Wenn die erfindungsgemäßen
Ester oder Ketone als Salze verwendet werden, ist ihre Löslichkeit in Wasser noch
verbessert.
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Alle Verbindungen der Formeln I und II, die erfindungsgemäß verwendet
werden, sind in den flüssigen Nahrungsmitteln leicht löslich. Weiterhin haben die
erfindungsgemäßen Verbindungen eine Struktur, die ähnlich der Struktur von p-Hydroxybenzoesäureester
ist. Die Verwendung von p-Hydroxybenzoesäurester wird von der World Health Organization
(WHO) und der Food and Agriculture Organization (FnO) als sicher und harmlos betrachtet
und man nimmt an, daß der Verlauf des inneren Metabolismus der erfindungsgemäßen
Verbindungen ähnlich dem Metabolismus von p-Hydroxybenzoesäureester ist. Andere
Verbindungen, die den erfindungsgemäßen Verbindungen analog sind, wie Gallussäure,
Protokatechinsäure und Phloroglucincarbonsäure, sind in der Natur weit verbreitet
und ihre Sicherheit ist sehr hoch.
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Die erfindungsgemäßen Verbindungen können für viele flüssige Nahrungsmittel,
wie flüssige Gewürze, beispielsweise Sojabohnenöl, Essig und Saucen und für nicht-alkoholische
Getränke, beispielsweise natürliche Fruchtsäfte, Getränke, die Kohlensiure enthalten,
Wein,
Fruchtwein und Sake, verwendet werden, aber sie sind besonders wirksam, wenn sie
zur Konservierung von Fermentationsprodukten, wie Essig, Sojabohnenöl, Bruohtweine
und Sake, verwendet werden.
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Wenn die obigen Verbindungen für Nahrungsmittel verwendet werden,
die viel Protein enthalten, neigen sie dazu, an die Proteine gebunden zu werden
und ihse Konservierungswirkung zu verlieren. Dementsprechend ist es nichts sinnvoll,
die erfindungsgemäßen Verbindungen zur Konservierung von Nahrungsmitteln zu verwenden,
die Proteine in großen Mengen enrthalten Die erfindungsgemäßen Verbinquiigen zeigen
eine hohe Löslichkeit in flüssigen Nahrungsmitteln und selbst wenn sie in relativ
hohen Konzentrationen, beispielsweise 300 ppm zugefügt werden, fallen sie während
des Lagerns nicht aus. Da die obigen Verbindungen im allgemeinen hohe antibakterielle
Aktivität besitzen, kann man ausreichende Wirkung erhalten, wenn man sie zu flüssigen
Nahrungsmitteln in Mengen von 5 bis 60 ppm zufügt.
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Bei der iurchführung der vorliegenden Erfindung können die Verbindungen
der Formeln I oder II bei jeder Stufe bei der Herssellung der flüssigen Nahrungsmittel
zugefügt werden Sie können in Form einer wäßrigen Lösung in Alkalihydroxyden, wie
Natriumhydroxyd und Kaliumhydroxyd, zugefügt werden. Sie koimen ebenfalls zugefügt
werden, nachdem eine oder zwei ihrer Hydroxyl gruppen in die entsprechenden Alkalimetallsalze
überführt Wurden.
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Weiterhin konnten sie in Form der Phosphorsäureester oder Glycerinäther
oder in Form einer Lösung in Äthanol, Propylenglykol oder anderen genießbaren harmlosen
lösungsmitteln, wie Glycerin und Wasser zugefügt werden. Beispielsweise können sie
in einer Lösungsmittelmischung von Propylenglykol und Natriumhydroxyd verwendet
werden.
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Dei antibakterielle Aktivität von einigen Verbindungen der Formeln
I und II, die erfindungsge@@d@ verwendet werden, wird in den Tabellen II und III
angegebenen die numerischen Werte, die
in den Tabellen gegeben
sind, sind Werte der minimalen Wachstumsinhibierungskonzentration, die bei antibakteriellen
Versuchen erhalten wurden, wobei die Versuche bei 3000 während 4 Tagen in einem
Kartoffeldextrosemedium oder in einem Agarmedium durchgeführt wurden und wobei man
verschiedene Bakterien, Hefen und Pilze verwendete.
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Tabelle II
| Verbindung (γ/ml) |
| Bacterium |
| 1 2 3 7 8 9 13 14 15 19 20 21 |
| Sthaphylococcus aureus 209F 100 100 25 400 400 100 400 400
200 800 800 800 |
| Bacillus subtilis PCI219 100 100 25 400 400 50 400 400 100
400 400 400 |
| Salmonella enteritidis 1891 400 200 >100 400 400 100 200
200 200 400 400 400 |
| Escherichia coli 0-55 400 400 >100 400 400 >200 400 400
400 800 800 800 |
| eu |
| Prot##s vulgaris HX19 50 50 >100 400 400 50 400 200 100
200 200 200 |
| Aspergillus niger IAM3001 125 125 >250 250 250 125 500 500
250 1000 1000 1000 |
| Rhizopus nigricens IAM6070 125 125 250 250 |
| Saccharomyces cerevisiae 62.5 62.5 62.5 125 125 62.5 250 250
125 500 500 500 |
| Hansenula anomala 62.5 62.5 >250 125 125 >62.5 250 250
125 1000 1000 1000 |
| Candida utilis 62.5 62.5 125 250 250 62.5 250 250 125 500 500
500 |
Tabelle III
| Verbindung( γ/ml) |
| Bacterium |
| 25 26 27 30 31 32 35 36 37 |
| Sthaphylococcus aureus 209p 400 200 100 800 100 100 800 800
400 |
| Bacillus subtilis PCI219 400 200 50 400 100 100 800 800 800 |
| Salmonella enteritidis 1891 400 100 200 400 >200 200 800
400 200 |
| Escherichia coli 0-55 400 400 >200 800 >200 200 800 800
400 |
| Proteus vulgaris HX19 200 100 25 400 100 100 800 400 200 |
| Aspergillus niger IAM3001 250 125 125 >250 625 >31.25
>500 >500 250 |
| Saccharomyces cerevisiae 250 125 <7.85 >250 31.25 >31.25
>500 500 250 |
| Hansenula anomala 250 125 31.25 >250 31.25 >31.25 >500
>500 250 |
| Candida albicans #250 125 31.25 >250 31.25 >31.25 >500
500 250 |
In den Tabellen II und III entsprechen die Zahlen der Verbindungen
den Zahlen der Tabelle I. Diese Zahlen werden auch in den folgenden Tabellen verwendet.
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Im allgemeinen besitzen die meisten flüssigen Nahrungsmittel einen
pH-Wert von 2,0 bis 5,0 und sie enthalten gewisse Mengen organischer Säuren, Aminosäuren
oder von Sacchariden. Dementsprechend neigen sie dazu, ein Kulturmedium für Bakterien,
wie Milchsäurebakterien, Schimmelpilze und filmbildende Hefen zu ergeben. Welzn
die oben erwähnten Verbindungen der Formeln d und II zu solchen flüssigen Nahrungsmitteln
in den oben angegebenen Konzentrationen. zugefügt werden, so zeigen sie bessexe
Konservierungswirkung, verglichen mit den üblichen Konservierungsmitteln. Weiterhin
werden diese Verbindungen durch die flüssigen Nahrungsmittelprodukte nicht zersetzt,
sondern erhöhen die Haltbarkeit der Nahrungsmittel. Dementsprechend können die flüssigen
Nahrungsmittel, in die die erfindungsgemäßen Verbindungen- eingearbeitet wurden,
ohne daß man ihre Toxizität fürchten muß, gegessen werden und ihre Unschädlichkeit
und Sicherheit ist viel besser, verglichen mit bekannten Konservierungsstoffen für
Nahrungsmittel.
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Die Konservierungswirkungen und die antibakteriellen Aktivitäten der
erfindungsgemäßen Verbindungen hängen von der Art der meisten fäulniserregenden
Mikroorganismen des entsprechenden flüssigen Nahrungsmittels und der Stellung der
Hydroxylgruppen und der Anzahl der Kohlenstoffatome der Alkylgruppe und stark von
der Art des Nahrungsmittels ab, bei dem die Verbindungen verwendet werden. Dementsprechend
wird eine geeignete Verbindung in Abhängigkeit von der Art des flüssigen Nahrungsmittels,
das zu das konserviert werden soll, ausgewählt.
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Beispielsweise ist im Falle von Sojabohnenöl, Essig und Fruchtsäften
die Anzahl der Kohlenstoffatome der Alkylgruppen wichtiger als die Stellung der
Hydroxylgruppen und es ist gewünscht, eine Verbindung zu verwenden, die in ihrem
alkylteil 3 bis 5 Kohlenstoffatome enthält.
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Man hat bis heute häufig für Sojabohnenöl Butyl-p-hydroxybenzoat als
Konservierungsmittel verwendet. Diese Verbindung zeigt jedoch eine relativ geringe
antibakterielle Aktivität und es ist daher erforderlich, diese Verbindung in einer
Konzentration vor.
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50 bis 100 6/ml zu verwenden. So kommt es manchmal vor, daß ein Teil
ausfällt una)an er Wand der Sojabohnenölflasche schwarze Trübungen bilden. Im Winter
wird die Löslichkeit der Verbindungen oft unterhalb ihrer wirksamen Konzentration
erniedrigt. Wei terhin weim dieser Konservierungsstoff zu Sojabohnenöl zugefügt
wird, das nicht ausreichend erhitzt wurde, oder zu rohem Sojabohnenöl, wird er durch
die Esterase, die in dem Sojabohnenöl vorhanden ist, zersetzt und es ist unmöglich,
eine Pasteurisierungsbehandlung durchzuführen, die geeignet ist, den Geschmack und
Geruch des Sojabohnenols zu erhalten. Andererseits wurde gefunden, daß der erfindungsgemäße
Dihydroxybenzoesäurealkylester bei so niedrigen Konzentrationen, wie 15 bis 20 t/ml
SoUabohnenöl ausreichend konserviert und daß er die obigen Nachteile der bekannten
Konservierungsstoffe überwindet. Es wurde ebenfalls gefunden, daß die Zugabe von
erfindungsgemäßen Dihydroxybenzoesäurealkylester bei einer Konzentration von 10
bis 20 d g/ml bei Saucen und Stoclcflüssigkeiten, beispielsweise zum Verdünnen für
Sojabohnen oder Flüssigkeiten, die Aminosäure enthalten, ausgezeichnete Konservierungswirkung
aufweist, wie im Falle des Sojabohnenöls selbst.
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Die Zersetzung und Fäulnis von Essig werden durch Essigsäurebakterien,
wie Acetobacter xylinum und Acetobacter aceti, bewirkt und es bildet sich ein Film,
Trübung tritt auf und der Säuregehalt wird erniedrigt. Die Verwendung von Salicylsäure
und p-Hydroxybenzoesäureestern als Konservierungsmittel für Essig ist erlaubt, aber
Salicylsäure wirkt nicht bei den erlaubten Konzentrationen und p-Bydroxybenzoesäureester
fallen oft bei ihren wirksamen Konzentrationen (140 &/ml) im Winter aus, wodurch
der Essig trübe wird. Die erfindungsgemäßen Verbindungen verhindern die Zersetzung
und die Fäulnis von Essig bei Konzentrationen von 20 bis 30 ( /ml und sie überwinden
die oben erwähnten Nachteile, die die bekannten Konservierungsmittel für Essig besitzen.
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Erfrischungsgetränke werden eingeteilt in Arten, die Kohlensäure enthalten,
und solche, die keine Kohlensäure enthalten. Es ist erlaubt, Benzoesäure (600 γ/ml),
Dehydracetsäure (50 γ/ml) und einen p-Hydroxybenzoesäureester (100 γ/ml)
als Konservierungsstoffe für beide Arten von Erfrischungsgetränken zu verwenden,
doch selbst wenn diese Stoffe in erlaubten Konzentrationen zugefügt werden, kann
man oft die durch Hefen verursachte Bildung von Trübung beobachten. Die erfindungsgemäßen
Verbindungen verhindern das Auftreten solcher Zersetzung bei der Konzentration von
20 bis 30 γ/ml.
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Natürliche Fruchtsäfte werden leicht durch Mikroorganismen im Verlaufe
des Auspressens bis sum Abfüllen in Kannen oder Flaschen verderben und derartige
Zersetzung bewirkt das Auftreten von @rübungen und Gasbildung durch Schimmel, Hefen,
und säurewiderstandsfähige Milchsäurebakterie@ Soloche Zersetzungen können durch
Zugabe von Benzoesäure in Konzentrationen von 500 γ/ml in einigem Ausmaße
vermieden werden, aber dieser Konservierungsstoff verleiht dem Saft einen besonders
@mangenehmen Geschmack, daher erhält man mit diesem Konservierungsstoff kaum annehmbare
Ergebnisse. Dehydracetsäure ist als Konservirungsstoff für Saft ungeeignet, da sie
sich allmählich in dem Saft zersetzt und ihre Aktivität verliert, und daher kann
leicht Zersetzung auftreten, wenn eine Saftflasche nach langer Lagerungszeit geöffnet
wird. Werden die erfindungsgemäßen Verbindungen der Formeln I oder II als Konservierungsstoffe
bei einer Konzentration von 10 bis 50 γ/ml verwendet, so konnen die oben erwähnten
Nachteile der bekannten Konservierungsstoffe überwunden werden.
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Werden die erfindungsgemäßen Verbindungen als Konservierungsstoffe
für Reiswein verwendet, ist es wünschenswert, daß in den oben erwähnten Formeln
I und II die zwei Hydroxylgruppen an den Benzolkern in 2,4- oder 3,4-Stellungen
gebunden sind, und daß die Alkylgruppe R eine Kettenlänge besitzt, die 5 bis 8 Kohlenstoffatomen
entspricht. Verbindungen mit diesen Struktureigenschaften zeigen ausgezeichnete
Löslichkeit, sie sind stabil und sie weisen hohe antibakterielle Aktivität auf.
Weiterhin sind sie
zum Kontrollieren von hiochic43akteria in einem
weiten Bereich wirksam und sie beeinflussen den Geschmack und den Geruch von Reiswein
nicht schlecht, wenn sie als Konservierungsstoffe für Reiswein verwendet werden.
Weiterhin bewirken sie keine Entfärbung oder kein Trübwerden von Reiswein, selbst
während langen Lagerungszeiten. Wie es in den Beispielen gezeigt wird, sind diese
Verbindungen bei einer sehr niedrigen Konzentration gegen typische hiochic-Bakteria
wirksam und sie ermöglichen die Kontrolle des ganzen Bereichs an hiochic-Bakteria,
die in einer Brauerei gefunden werden. Die vollständige Kontrolle von hiochac'akteria
kann man erreichen; indem man als Konservierungsstoff für Reiswein beispielsweise
n-Hexyl-1 , 4-dihydroxybenzoat bei einer Konzentration von 15 bis 20 ppm verwendet.
Dies beweist, daß die erfindungsgemäßen Verbindungen Lysozym überlegen sind, das
als neues Konservierungsmittel große Beachtung gefunden hat, da Lysozym gegen hiochec-Bakterien
der Lactobacillus acidophillus-Art nicht wirksam ist, obgleich es die Eigenschaftee
des Reisweins nicht negativ beeinflußt und es daher als Konservierungsstoff vielversprechend
erschien.
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Die Konservierung von Sake gemäß der vorliegenden Erfindung wird in
die folgenden drei Verfahren eingeteilt. Das erste Verfahren ist hauptsächlich darauf
ausgerichtet, die Zersetznng ährend der Lagerung im Tank -zu vermeiden. Klarer und
durchsichtiger Reiswein, der erhalten wird, indem man Verunreinigungen aus rohem
Reiswein entfernt, wird auf ungefähr 55 0C erwärmt und dann in einem Tank gelagert.
Wenn diese Wärmebehandlung nicht ausreicht, verbleiben verschiedene Hefen und hiochic3akterien
in dem Reiswein und durch diese Organismen wird Zersetzung verursacht. Um das Auftreten
derartiger Zersetzung zu vermeiden, ist es bevorzugt, eine Verbindung der Formeln
I oder II in einer Menge von 5 bis 200 ppm zuzufügen, wodurch das Wachstum während
der üblichen Lagerungszeit von Mikroorganismen (höchstens 1 Jahr) verhindert wird
und wodurch eine Zersetzung während der Lagerungszeit nicht auftritt und pilztötende
Virkung ist zu beobachten, was eine wirkungsvolle Konservierung mit sich bringt.
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Gemäß dem zweiten Verfahren wird Sake, in den die Konservierungsverbindung
der Formeln I oder IT gemäß dem obigen ersten Verfahren eingearbeitet ist, mit aktivem
Kohlenstoff oder anderen geeigneten Adsorbentien behandelt vor seinem Versenden,
um im wesentlichen alle Konservieriuigsverbindung aus dem Reiswein zu entfernen.
Bei diesem Verfahren ist es möglich, wenn man bei den nachfolgenden StuSen vorsichtig
arbeitet, wie bei dem Abfüllen in Flaschen, Sake herzustellen, der im wesentlichen
frei von allen Konservierungsmitteln ist und der überhaupt keine hiochicÆakterien
enthält.
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Das dritte Verfahren besteht darin, daß man eine Verbindung der Formeln
1 oder II in der oben angegebenen Menge zu Reiswein zufügt, der mit Aktivkohle behandelt
worden war, bevor er versendet wird. Dieses Verfahren wird dann angewendet, wenn
Gefahr besteht, daß Hiochi-Fäulnis auftritt, selbst nach dem Abfüllen in Flaschen.
Wird eine Reisweinflasche von dem Verbraucher aufgekorkt, fängt - insbesondere im
Sommer - der Reiswein, der keine Konservierungsmittel enthält, innerhalb kurzer
Zeit an, durch Hiochi zu faulen. Das dritte Verfahren ist dazu geeignet, um das
Faulen, bedingt durch Hiochi-Bakterien, nach dem Öffnen der Flasche zu verhindern.
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Ergebnisse der antibakteriellen Untersuchungen der zuvor erwahnten
Arten gegen gewöhnliche Nikroorganismen, die durchgeftilirt wurden, indem man ein
Kartoffeldextrosemedium (im Falle von Hefen und Schimmelpilzen) oder ein Agarmedium
(im Falle gewöhnlicher Bakterien) verwendete, sind in Tabelle IV angegeben. Die
numerischen Werte in der Tabelle sind Werte der minimalen Wachstumsinhibierungskonzentration
(γ/ml), wenn man während 4 Tagen bei 3000 kultiviert.
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Tabelle IV
| Bakterien-Art Verbindung 17 Verbindung 29 |
| Saccharomyces cerevisine 15.6 <7.81 |
| Saccharomyces rouxii <3.91 <7.81 |
| Asporgillus niger 62.5 62.5 |
| Staphylococcus aureus 50 12 |
| Bacillus subtilis 50 12 |
| Proteus vulgaris 50 12 |
Die wichtigsten antibakteriellen Aktivitäten von anderen Verbindungen sind in Tabelle
V angegeben.
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Tabelle V
| Milchsäurebazil- |
| Verbindung Nr. Hefe |
| li |
| 16 <7.81 - 62.5 250 |
| 11 3.91 - 31.25 <25 |
| 28 7.81 - 15.63 <50 |
| 34 3.91 - 15.63 25 - 50 |
| 4 7.81 - 125 <5 |
Die Unschädlichkeit und Sicherheit dieser Verbindungen wird dadurch
charakterisiert, daß sie bei der oralen Verarbreichung an Mäusen fast alle LD50-Wert
von 3 bis 6 g besitzen und die Verbindungen sind daher durch sehr niedrige Toxizitäten
charakterisiert.
-
Die vorliegende Erfindung wird ebenfalls wirksam zur Konservierung
von Fruchtweinen, wie Wein aus Trauben, verwendet. Im allgemeinen bilden sich in
Fruchtweinen, wie Weinen aus Trauben, durch @erobe Bakterien, wie durch Mycoderma
genus, Filme. Durch Bakterien der Acetobacter oder Bacterium genus tritt Verunreinigung
durch Essigsäure auf und durch Bakterien der Bacterium ge-@@ tritt Weinsäurefermentation,
Mannitfermentation, die Bildung on Bitterstoffen, Fettsäuren und Milchsäuren auf
und zwar während des Herstellungsverfahrens, oder während des Abfüllen@ @n Flaschen.
Dieses beeinfluß die Qualität des Produktes in vielen Fällen schlecht. Besonders
im Falle von Weißwein ist die Verwendung von Konservierungsstoffen zur Kontrolle
der Qualität des Produktes unumgänglich. Aus diesem Grunde wird empfchlen, Schwefelsäure
(sulfurous acid) in einer Konzentration von 450 γ/ml oder Salicylsäure in
einer Konzentration von 350 γ/ml zu verwendet, aber diese Konservierungsstoffe
bringen das Problem der Toxizität mit sich und ihre Wirkung reicht nicht aus Wird
die vorliegende Erfindung zur Konservierung von Fruchtwein verwendet, so kann man
mit dem erfindungsgemäßen Verfahren ausgezeichnete Konservierungswirkungen im Vergleich
mit den bekannten Konservierungsverfahren, bei denen Schwefelsäure verwendet wird,
erreichen. Weiterhin wurde überraschenderweise gefunden, daß durch das erfindungsgemäße
Verfahren der Geschmack oder
der Geruch des eines in keiner Weise
negativ beeinflußt werden.
-
Die minimalen ltachstumsinhibierungskonzentrationswerte (r/ml) der
erfindungsgemäßen Verbindungen, die man erhält, wenn man Kulturversuche an Hefe
und Essigsäurebakterien bei 30°C während 20 Tagen in Wein durchführt, dem man 10
% Wasser zugefügt hat, sind in Tabelle VI angegeben. Aus den in Tabelle VI angegebenen
Ergebnissen ist ersichtlich, daß die bei der vorliegenden Erfindung verwendeten
Verbindungen besonders gegen die Filmbildung und Verunreinigung durch Essigsäure
wirksam sind.
-
Tabelle VI
| Verbindung Hefe Essigsäure- Verbindung Hefe Essigsäure- |
| Nr. bakterium Nr. bakterium |
| 26 7.81 25 9 7.81 10 |
| 27 3.91 25 10 3.91 10 |
| 28 3.91 10 11 1.92 10 |
| 29 .1.95 5 12 1.92 5 |
| 31 15.63 50 21 15.63 50 |
| 32 7.81 50 22 7.81 25 |
| 33 7.81 25 23 7.81 25 |
| 34 3.91 10 24 3.9i 10 |
| 15 31.26 50 3 15.63 50 |
| 16 15.63 50 4 7.81 25 |
| 17 7.81 25 5 3.91 10 |
| 18 7.81 -25 6 3.91 10 |
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung, ohne sie jedoch zu beschränken.
-
Beispiel 1 Rohes Sojabohnenöl, das frei von Konservierungsmitteln
war, wurde 30 Minuten bei 600 oder 80°C einer Pasteurisierungsbehandlung unterworfen
und dann wurden anschließend die Verunreinigungen entfernt. Jede der in Tabelle
VII angegebenen Verbindungen wurde zu 20 ml einer so pasteurisierten Sojabohnenölprobe
zugegeben.
-
Die zu untersuchende Probe wurde in Form einer Lösung in 1 n wäßrigem
Natriumhydroxyd bei verschiedenen Konzentrationen in 10 Teilen von 3 γ/ml
bis 30 d'/ml zugefügt. Jede Probe wurde mit einer Platinöse voll filmbildender Hefe
infiziert und dann wurden die Proben 7 Tage bei 3000 aufbewahrt und das Wachstum
der Hefe wurde untersucht. Die Ergebnisse (minimale Wachstuminhibierungskonzentration
- γ/ml) sind in Tabelle VII angegeben. In Tabelle VII bedeutet das Symbol
"+", daß in der Probe von Sojabohnenöl Trübung beobachtet wurde.
-
Tabelle VII
| Pasterisierung b.60° |
| Zugegebenes Konser- bei 80°C |
| vierungsmittel |
| 3 Tage 7 Tage 3 Tage 7 Tage |
| Vergleichsversuch, |
| nichts zugefügt + + + + |
| Butyl para- |
| >30 >30 27 30 |
| hydroxybenzoat |
| -Verbindung 1 18 18 |
| Verbindung 2 18 18 |
| Verbindung 3 24 27 |
| Verbindung 8 24 27 |
| (Verbindung 9 24 24 |
| Verbindung 14 21 24 |
Beispiel 2 Eine Lösung der in Tabelle VIII ausgegebenen Testverbindung in 1 n-wäßrigem
Natriumhydroxyd wurde zu ungefähr 100 ml Essig, der
frei von Konservierungsmitteln
war, zugegeben und jede Probe wurde mit einer Platinöse voll einer Flüssigkeit infiziert,
die wirkende Saprogen-Bacteria enthielt, und während 20 Tagen bei 30°C aufbewahrt.
Nan untersuchte das Auftreten von Trübung und das Abnehmen in der Säurestärke, verursacht
durch Hefe und Essig säurebakterien. Die Ergebnisse sind in Tabelle VIII angegeben.
-
In Tabelle VIII ist der Säuregehalt durch den Ausdruck der Menge (ml)
von 0,1 n-wäßrigem Natriumhydroxyd angegeben, das verbraucht wurde, um 10 g der
Probe zu neutralisieren. Der Säuregehalt des Essigs betrug zur Zeit der Zugabe der
Testverbindung 4,21. Die Symbole "-" zu "+++" bedeuten die Abwesenheit von Trübung
und den Intensitätsgrad der Trübung.
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Tabelle VIII
| Zugefügte |
| Trübung Säuregehalt |
| Konservierungs- Menge |
| verbindung (γ/ml) |
| 10Tage 20Tage 10Tage 20Tage |
| Vergleichsver- |
| such, nichts ++ +++ 3.44 3.02 |
| zugegeben |
| Butyl-para- |
| 50 - +bis++ 4.20 3.70 |
| hydroxybenzoat |
| " 140 - #bis+ 4.18 3.85 |
| Verbindung 1 30 - #bis+ 4.22 4.06 |
| Verbindung 2 30 + +- 4.18 4.10 |
| Verbindung 3 30 - # 4.19 4.12 |
| Verbindung 4 30 - #bis+ 4.18 3.98 |
Ähnliche Verbindungen wurden in bezug auf andere flüssige Würzen, wie Saucen und
Stockflüssigkeiten, durchgeführt und es wurde bestätigt, daß die erfindungsgemäßen
Verbindungen höhere Wirkungen gegen Fäulnis und Zersetzungen haben, bei Konzentrationen
von 30 γ/ml als p-Hydroxybenzoesäureester bei einer Konzentration von 100
bis 200 /ml.
-
Beispiel 3 Eine Flasche eines Getränkes, das kein Konservierungsmittel
ent-@ielt, aber kohlensäurehaltig war, wurde bei 0°C aufgemacht und zu dem offenen
kohlensäurehaltigen Getränk (ungefähr 200 ml) gab man die in Tabelle IX angegebenen
Testverbindungen in 1 n-wäßiger Natriumhydroxydlösung. Dann wurde das Getränk mit
1 ml einer Flüssigkeit infisziert, die wirksame Hefe (die Zahl der He-@ betrug ungefähr
105 pro g) anthielt, und dann wurde die Flache mit einem Korken verschlossen. Die
Flasche wurde 21 Tage bei 30°C aufbewahrt und das Auftreten von weißer Trübung wurde
untersucht. Die Ergebnisse sind in Tabelle IX angegeben. Die Symole "-" zu "+++"
bedeuten die Abwesenheit von Trübung und dem @ensitätsgrad der Trübung.
-
Tabelle IX
| Zugegebene |
| weiße Trübung |
| Konservierungs- |
| (γ/ml) |
| mittel |
| 7 Tage 14 Tage 21Tage |
| Vergleichsversuch |
| nichts zugefügt + ++ +++ |
| Benzoesäure 600 - #bis+ +bis++ |
| Dehydracetsäure 50 - #bis+ +bis++ |
| Butyl para- |
| 70 # + ++ |
| hydroxybenzoat |
| Verbindung 8 30 - #bis+ |
| Verbindung 9 30 - #bis+ |
Aus den in Tabelle VIII angegebenen Ergebnissen ist ersichtlich, daß die erfindungsgemäßen
Verbindungen vorgleichen mit den bekannten Konservierungsmitteln, wie Benzoesäure,
Dehydracetsäure und p-Hydroxybenzoesäureester, viel wirksamer sind bei der Inhidaß
sie bierung des Wachstums von Hefe und/ das Auftreten von weißer Trübung in kohlensäurehaltigen
Getränken verbindeln.
-
Wurden ähnliche Untersuchungen in bezug auf nicht kohlenstoffhaltige
Getränke durchgeführt, wurde bestätigt, daß die erfindungsgemäßen Verbindungen ausgezeichnete
Konservierungsergebnisse liefern.
-
Beispiel 4 Eine Platinöse voll einer Fäulnisbakterienflüssigkeit (die
aktive Hefe, Schimmelpilze, säurewiderstandsfähige Milchsäurebakterien und andere
Bakterien enthielt) wurde zu 50 ml Fruchtsaft gegeben, der hergestellt worden war
durch Auspressen einer Orange (Onshyu Qualität) und dann wurde dazu Zucker in solcher
Menge gegeben, daß man einen Zuckergehalt von 10 % erhielt. Zu dem Saft wurde dann
eine Lösung der in Tabelle X angegebenen Verbindung in 1 n-wäßrigem Natriumhydroxyd
zugegeben und der Saft wurde bei 30°C aufbewahrt. Das Wachstum von Schimmelpilzen
und das Auftreten von Trübung in dem Saft wurde untersucht. Die Ergebnisse sind
in Tabelle X angegeben. Die Symbole "-" zu "+++++", die in der Tabelle auftreten,
bedeuten die Abwesenheit von Schimmel oder Trübung und den Intensitätsgrad des Schimmelwachstums
oder der Trübung in dem Saft. Tabelle 1
| Zugegebene |
| Konservie- Trübung Schimmelwachstum |
| rungsstoff |
| (γ/ml) |
| 3Tage 7 Tage 10Tage 3 Tage 7Tage 10 Tage |
| Vergleichs- |
| versuch, + ++ +++ + +++ +++++ |
| hichts zu- |
| gegeben |
| Benzoesäure 500 - #bis+ ++ - -bis+ + |
| Btityl-para- |
| hydroxy- 30 - - -bis# - - - |
| benzoat |
| Verbind. 2 30 - -bis# #bis+ - - # |
| Verbind. 3 30 - -bis# #bis + - - -bis # |
| Verbind. 90 30 - - - - - - |
| Verbind. 15 30 - - - - - - |
Beispiel 5 Rohes Sojabohnenöl, das frei von Konservierungsstoffen
war, wurde während 30 Minuten bei 60°O oder 80°C einer Pasteurisierungsbehandlung
unterworfen und anschließend wurden die Verunreinigungen entfernt. Jede der in Tabelle
XI angegebenen Verbindungen wurde zu 20 ml einer pasteurisierten Probe aus Sojabohnenöl
zugefügt.
-
Die zu untersuchende Verbindung wurde in Form einer Lösung in 1 n-wäßrigem
Natriumhydroxyd bei Konzentrationen, die in 10 Teilen von 3 γ/ml bis 30 Vml
variierten, zugegeben. Eine Platinöse voll aktiver filmbildender Hefe wurde zu jeder
Probe gegeben und dann wurde die Probe während 7 Tage bei 3000 aufbewahrt und das
Hezewachstum wurde untersucht. Die Ergebnisse (minimale Wachstumsinhibierende Konzentration
- S/ml) sind in der Tabelle XI angegeben. Die Verbindung A ist ein Äthylketon, das
der Verbindung 25 entspricht, Verbindung B ist ein Hexylketon, das der Verbindung
25 entspricht, Verbindung a ist ein Äthylketon, das der Verbindung 30 entspricht
und die Verbindung D ist ein Ilexylketon, das der Verbindung 30 entspricht. Das
Symbol "+" in der Tabelle bedeutet, daß in der einfachen Sojabohnenölprobe Trübung
auftrat.
-
Tabelle XI
| 60°C Pasteurisierung 80°C Pasteurisierung |
| Konservierungsstoff |
| 3 Tage 7 Tage 3 Tage 7 Tage |
| Vergleichsversuch |
| + + + + |
| nichts zugegeben |
| Butyl-para >30 >30 27 30 |
| hydroxybenzoat |
| .........................|............|............|...........|.............| |
| Verbindung A 18 21 18 21 |
| Verbindung 25 12 15 15 15 |
| Verbindung 26 12 15 12 15 |
| Verbindung 27 .12 12 12 15 |
| Verbindung B 24 24 ?> 30 > 30 |
| Verbindung C | >30 | >30 | >30 | >30 |
| Verbindung 32 12 15 12 15 |
| Verbindung D | >30 | >30 | >30 | >30 |
Beispiel 6 Eine Lösung der in Tabelle XII angegebenen Verbindung in 1 n-wäß rigem
Natriumhydroxyd wurde zu ungefähr 100 ml Essig gegeben, der keine Konservierungsstoffe
enthielt und die Essigprobe wurde mit einer Platinöse voll einer Fäulnisbakterienflüssigkeit,
die aktive Saprogenusbacteria enthielt, infiziert und während 30 Tagen bei 3000
aufbewahrt. Das Auftreten von Trübung und die Abnahme des Säuregehaltes verursacht
durch Essigsäurebakterien und Hefen wurden untersucht. Die Ergebnisse sind in Tabelle
XII angegeben. In der Tabelle ist der Säuregehalt in Form der Menge (ml) 0,1 n-wäßrige,
Natriumhydroxyd angegeben, die verbraucht wird, um 10 g der Probe zu neutralisieren.
Die Säure des Essigs zur Zeit der Zugabe der Testverbindung betrug 4,21. Die Symbole
"-" zu "+++" bedeuten die Abwesenheit von Trübung und den Intensitätsgrad der Trübung.
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Tabelle XII
| Zugegebene |
| Trübung Säuregehalt |
| Menge |
| Konservierungs- |
| (γ/ml) |
| stoff 10 Tage 20 Tage 10 Tage 20 Tage |
| Vergleichsver- |
| such, nichts ++ +++ 3.44 3.02 |
| Butyl-para- |
| 50 - +bis++ 4.20 3.70 |
| hydroxybenzoat |
| " 140 - #bis+ 4.18 3.85 |
| Verbindung 25 30 - #bis+ 4.19 4.01 |
| Verbindung 26 30 - - 4.18 4.17 |
| Verbindung 27 30 - - 4.20 4.19 |
| Verbindung B 30 - #bis+ 4.23 4.10 |
| Verbindung 31 30 - # 4.19 4.12 |
| Verbindung 32 30 - # 4.22 4.11 |
| Verbindung 36 30 - # 4.19 4.08 |
| Verbindung 37 30 - @bis# 4.18 4.16 |
Ähnliche Untersuchungen wurden durchgeführt mit anderen flüssigen Würzen, wie Saucen
und Stockflüssigkeiten, und es wurde bestätigt, daß 2,4-Dihydroxyphenylalkylketone,
die als Alkylgruppe R in der Formel II eine Butyl- oder Pentylgruppe enthalten,
bessere Wirkung bei der Konservierung gegen Fäulnis und Zersetzung bei Konzentrationen
30 γ/ml zeigen, vergleichen mit Butyl-phydroxybenzoat bei einer Konzentration
von 100 bis 200 γ/ml.
-
Beispiel 7 Eine Flasche von kohlensäurehaltigem Getränk, das frei
von Konservierungsstoffen war und bei 0°C gehalten wurde, wurde entkorkt und eine
Lösung der in Tabelle XIII @gegebenen Testverbindungen in 1 n-wäßrigem Nytriumhydroxyd
anode zu dem offenen kohlensäurehaltigen Ge@ränk (ungefäh @ @ ml) ungegeben. Das
Getränk
wurde mit 1 ml einer Flüssigkeit infiziert, die aktive
Hefe enthielt (die Zahl der Hefe betrug ungefähr 105 pro g) und dann wurde die Flasche
mit einem Korken verschlossen. Die Flasche wurde bei 30°C während 21 Tagen aufbewahrt
und das Auftreten von Trübung wurde untersucht. Die Ergebnisse sind in Tabelle XIII
angegeben. Die Symbole "-" zu "+++" bedeuten die Abwesenheit von Trübung und den
Intensitätsgrad der Trübung.
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Tabelle XIII
| Zugegebene |
| weiße Trübung |
| Konservierungs- Menge |
| stoff (γ/ml) 7 Tage 14 Tage 21 Tage |
| Vergleichsver- |
| such, nichts + 4+ +4+ |
| zugegeben........|...............|...............|............|............ |
| Benzoesäure 600 - | #bis + bis |
| Dehydracetsäure@ 50 | - | #bis+ | +bis++ |
| Butyl-para-hydroxy- 70 f + ++ |
| benzoat |
| ...................|...............|............|............|............ |
| Para-hydroxyphenyl- 30 . + |
| butyl-keton |
| ...................|...............|............|............|............ |
| Verbindung 26 30 - - | # |
| Verbindung 27 30 w - t |
Aus den in Tabelle XIII angegebenen Ergebnissen ist ersichtlich, daß die Verbindungen,
die bei der vorliegenden Erfindung verwendet werden, bei der Inhibierung des Hefewachstums
wesentlich wirksamer sind und daß sie das Auftreten von Trübung im kohlensäurehaltigen
Getränk verhindern, verglichen mit den bekannten Konservierungsstoffen, wie mit
Benzoesäure, Dehydracetsäure und p-Hydroxybenzoesäureestern.
-
Es wurden ähnliche Versuche durchgeführt mit Getränken, die keine
Kohlensäure enthielten, dabei wurde bestätigt, daß die
erfindungsgemäßen
Verbindungen ausgezeichnete Konservierungsergebnisse liefern.
-
beispiel 8 Eine Platinöse voll Fäulnisbakterienflüssigkeit (die aktive
Hefem Schimmelpilze, säurewiderstandsfähige Milchsäurebakterien und andere Bakterien
enthielt) wurde zu 50 ml Fruchtsaft gegeben, der durch Auspressen einer Orange (Onshyu-Qualität)
und Zuckerzugabe in einer Menge bis zu einem Zuckergehalt von 10 % gewonnen worden
war. Dann wurde eine Lösung der in Tabelle XIV angegebenen Verbindung in 1 n-wäßrigem
Natriumhydroxyd zu dem Saft zugefügt und der Saft wurde bei 30°C aufbewahrt. Das
Wachstum von Schimmelpilzen und das Auftreten von Trübung wurde untersucht. Die
Ergebnisse sind in Tabelle XIV angegeben. Die Symbole "-" zu "+++++", die in der
Tabelle auftreten, bedeuten die Abweseinheit von Schimmelwachstum oder von Trübung
und den Intensitätsgrad des Schimmelwachstums oder der Trübung in der Saftprobe.
-
tabelle XIV
| Zugege- |
| Konservier- Trübung Schimmelpilzwachstum |
| rungsstoff |
| Menge |
| 3 Tage 7 Tage 10 Tage 3 Tage 7 Tage 10Tage |
| (γ/ml) |
| Vergleichs- |
| versuch, + ++ +++ + +++ +++++ |
| keine Zugabe |
| Benzoesäure 500 - #bis+ ++ - -bis# + |
| Butyi-para- |
| hydroxy- 30 - - bis i - | - | - |
| ben zoat |
| ...............|........|........|........|........|........|........|........ |
| Verbind 2 30 - | - | # | - | - | - |
| Verbind. 27 30 - - # - - -bis |
| Verbind. 37 150 - - # - - -bis |
Aus den in Tabelle XIV angegebenen Ergebnissen ist ersichtlich,
daß die erfindungsgemäßen Verbindungen sehr wirksam sind, um das Wachstum von Schimmelpilzen
zu inhibieren und um das Auftreten von Trübung im Bruchtsaft/verhindern, verglichen
mit Benzoesäure.
-
Beispiel 9 Eine alkoholische Lösung einer in Tabelle XV angegebenen
Verbindung wurde zu einem Reiswein-Peptonmedium zugegeben. Der Gehalt der Verbindung
in der alkoholischen Lösung betrug weniger als 1 .
-
Wasser wurde dann zu dem Medium zugegeben, um die Alkoholkonzentration
auf 13 /o einzustellen. Jede der folgenden vier Bakterien, die oft bei Versuchen
als Standard-hiochc-Bakterien verwendet werden, wurden getrennt in einer Menge von
105 Zellen pro ml zu dem Medium zugegeben. Das Medium wurde bei 30 0C aufbewahrt
und nach 20-tägigem Kultivieren wurde die minimale Wachstumsinhibierungskonzentration
( γ /ml) bestimmt Zum Vergleich wurden ähnliche Versuche unter Verwendung
von Salicylsäure und Lysozym durchgeführt. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der
Tabelle XV angegeben.
-
Verwendete hiochS-Bakterien Lactobacillus homohiochi (H 42) Lactobacillus
heterohiochi (H 1 ) Lactobacillus fermentum (H 34) Lactobacillus acidophilus (H
7 )
Tabelle XV
| Konservie- Minimale Wachstumsinhibierungskonzentration(γ/ml) |
| rungsstoff |
| Lactobacillus Lactobacillus Lactobacillus Lactobacillus |
| homohiochi heterochiochi fermentum acidophilus |
| Salic,ylsäure | 400 200 200 400 |
| Lysozym 20 10 <1 >100 |
| Verbindung 26 100 75 100 100 |
| Verbindung 27 50 50 50 50 |
| Verbindung 28 25 10 25 25 |
| Verbindung 29 10 10 10 10 |
| Verbindung 31 100 100 100 100 |
| Verbindung 32 50 50 50 50 |
| Verbindung 33 25 10 25 25 |
| Verbindung 34 10 10 10 '10 |
| Verbindung 38 100 100 50 50 |
Beispiel 10 Ein Reiswein, der keine Konservierungsmittel enthielt und eine Alkoholkonzentration
von 16,0 % besaß, wurde mit 2 x 105 Zellen pro ml von hiochic-Lactobacilli infiziert,
die man in einer Brauerei in Nada, Probe, Japan, gewonnen hatte. Zu dem infizierten
Reiswein fügte man eine Lösung einer in Tabelle XVI angegebenen Verbindung in Alkohol,
mit der in Tabelle XVI angegebenen Konzentrat ion. Durch Zugabe von Wasser wurde
die Zunahme des Alkoholgehaltes in der Probe, die durch die Zugabe der alkoholischen
Lösung des Konservierungsmittels hervorgerufen war, auf die ursprüngliche Konzentration
eingestellt und dann wurde die Probe in blaue Glasflaschen abgefüllt und die Flasche
mit einem Korken verschlossen. Zum Vergleich wurden ähnliche Versuche unter Verwendung
von Lysozym mit 40 γ/ml und unter Verwendung von Salicylsäure
durchgeführt.
-
Die Flasche wurde dann bei 30°C aufbewahrt und das Auftreten von Trübung,
verursacht durch hiochicEakterien wurde untersucht. Die Ergebnisse sind in Tabelle
XVI angegeben. In Tabelle XVI bedeutet sas Symbol "+", daß Fäulnis durch hiochic-Bakterien
auftrat und das Symbol "-" bedeutet, daß keine Fäulnis, bedingt durch hioch-Bakterien
beobachtet wurde. In der Tabelle bedeutet "weiße Trübung", daß weiße Trübung, verursacht
durch Ausfallen von Kristallen, auftrat, wenn die Probe 48 Stunden bei 0°C aufbewahrt
wurde. Aus den in Tabelle XVI angezeigten Ergebnissen ist ersichtlich, daß die erfindungsgemäßen
Verbindungen bei niedrigen Konzentrationen eine ausgezeichnete Aktivität aufweisen,
um das Wachstum von hiochic-Bakterien zu verhindern und daß sie wesentlich wirksamer
sind als Salicylsäure, wenn diese bei einer Konzentration von 500 ppm verwendet
wird. Diese Konzentration ist doppelt so hoch wie die erlaubte obere Grenze der
Salicylsäurekonzentration.
-
Tabelle XVI
| Zuge- |
| Lagerungszeit Lagerung bei |
| Konservie- fügte |
| rungsstoff Menge 0°C während |
| 7 Tage 14 Tage 21 Tage 70Tage |
| ( /ml) 48 Stunden |
| Vergleichsver- |
| such, nichts + + + + |
| zugegeben |
| Salicylsäure 500 - - - + |
| " 250 - + + + |
| Lysozym 40. zu | + + + + |
| Verbindung 28 50 - - - - weiße Trübun |
| tr 25 - - - - |
| " 10 - - - + |
| Verbindung 34 25 - - - - weiße Trübung |
| " 10 - - - - |
| " 5 - - - + |
Wurden Proben aus Reiswein, die die erfindungsgemäßen Verbindungen in Konzentrationen
eingearbeitet enthielten,die über den wirksamen Konzentrationen lagen, d.h. Proben,
die 50 γ/ml der Verbindung 28 oder 25 γ/ml der Verbindung 34 enthielten,
vor der Infektion mit hiochic-Bakterien geschmacklich untersucht, so fand man, daß
die Zugabe dieser Verbindungen den Geschmack oder den Geruch des Reisweins auf keine
Weise beeinflußte. Proben, in die die obigen Verbindungen überhalb der wirksamen
Konzentration eingearbeitet waren, zeigten keine sichtbaren Wechsel, wie ein Farbwechsel,
selbst nachdem man sie 70 Tage lang gelagert hatte.
-
Beispiel 11 Ein im Handel erhältlicher Reiswein, der frei von Konservierungsstoffen
war,
wurde mit 10 Koji, extra hergestellt, vermischt und dann führte man bei 3000 während
4 Stunden und filtrierte.
-
Zu dem Filtrat wurde Alkohol zugeftigt, um e zu die Allcoholkonzentration
auf 200 einzustellen. Zu dem Medium wurde aktiver Kohlenstoff in einer Menge von
200 ppm zugefügt, dann wurde das Medium filtriert und während 20 Minuten in einem
Wasserbad bei 56°C gehalten, wobei das Medium in einem Reaktionsgefäß war, das einen
Rückflußkühler enthielt. dann wurde das Medium mit 1,2 x 102 Zellen pro ml hiochic-Bakterien
angesteckt, bzw. infiziert, die man in einer Brauerei in Nada, Kobe, Japan, gesammelt
hatte und zu der infizierten Probe wurden alkoholische Lösungen der Verbindungen
28 oder 34 gegeben. Die Endkonzentration der zugesetzten Verbindung wurde auf 25
ppm oder 10 ppm eingestellt. Für Vergleichszwecke wurden Salicylsäure bei Konzentrationen
von 250 ppm und 500 ppm zugefügt. Der erhöhte Alkoholgehalt, der durch die Zugabe
der Lösung der Konservierungsstoffe bedingt war, wurde, durch Zugabe von Wasser
auf 20 0vermindert. Jede Probe wurde in ein,200 ml Becherglas überführt und mit
einer Polyäthylenfolie versiegelt. In diesem Zustand wurden die Proben bei 3000
aufbewahrt und dann wurde der Zustand der Probe untersucht. Die Ergebnisse sind
in der Tabelle XVII angegeben.
-
Tabelle XVII
| Zugegebene |
| Lagerungszeit |
| Konservierungs- Menge |
| stoff (γ/ml) |
| 7 Tage 14Tage 21 Tage 70Tage |
| Vergleichsver- + + + + |
| such, nichts |
| zugefügt .........|..............|..........|..........|..........|.......... |
| Salicylsäure 250 - | + + + + |
| 11 500 - - - - |
| ...................|..............|..........|..........|..........|.......... |
| Verbindung 28 25 - - - - |
| Verbindung 34 | 10 | - | - | - | - |
n Tabelle XVII bedeutet das Symbol "-", daß keine Hiochi-Fäulnis
beobachtet wurde und das Symbol "+" bedeutet, daß Hiochi-Fäulnis beobachtet wurde.
-
Wurde der obige Versuch mit Hiochi-Fäulnisbakterien in einem Faß durchgeführt,
so zeigte die Probe, die Salicylsäure mit einer Konzentration von 250 γ/ml
entheilt, Hiochi-Fäulnis.
-
nachdem man 70 Tage gelagert hatte, wurde jede Probe Reiswein tit
400 ppm aktiven Kohlenstoff vermischt und filtriert Das Filtrat wurde dann mit pasteurisiertem
Wasser verdünnt, so daß die Alkoholkonzentration 16 % betrug. Die Probe wurde dann
sorgältig in eine pasteurisierte Flasche überfüllt und die Flasche wurde mit einem
Korken verschlossen und bei 30°C aufbewahrt.
-
Die Ergebnisse sind in Tabelle XVIII angegeben, wobei das Symbol
"@" bedeutet, daß keine Hiochi-Fäulnis beobachtet wurde und das Symbol "+" bedeutet,
daß Hiochi-Fäulnis beobachtet wurde.
-
Tabelle XVIII
| Zugegebene Lagerungszeit |
| Konservierungs- |
| Menge ( /ml) |
| stoff 7 Tage 14Tage 21Tage 70Tage |
| Salicylsäure 500 |
| Verbindung 28 25 |
| Verbindung 34 10 |
Die Menge an Konservierungsmittel, die in den Proben zurückblieb, wurde durch Ultraviolettabsorptionsanalyse
bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle XIX angegeben. In den Proben, die mit aktivem
Kohlenstoff behandelt worden waren, wurde der Alkoholgehalt, der durch Verdampfen
von Wasser erniedrigt worden war, wieder eingestellt,
Tabelle XIX
| Konservie- Zurückbleibendes Ronservii"Eottelverhält- |
| rungsstoll ! nia ('e) 0 . . |
| erade nach Zu- Iliachdom m--Ln 70 h CI YCI |
| rh ~Ir?-^ -celaeis- - hn~117 mi~t |
| Salicylsäurs hatte hatte 100 zuaktive»OKohlet stoff |
| (Sso6/iL) |
| Verbindung 2E 100 100 C l |
| (2sK |
| Verbindung 34 100 100 < l |
| {so r/wl |
Beispiel 12 20 ltr. Mirin (süßer Reiswein), der 17 % Alkohol, 0,01 % Säuren (identifiziert
als Milchsäure) und 41,2 Zucker enthielt, wurden in vier Proben mit jeweils 5 ltr.
geteilt. Zu zwei Proben gab man die Verbindungen 28 und 34 in Konzentrationen von
25 g/ml und 10 /ml. Für Vergleichs zwecke wurde zu einer anderen Probe Salicylsäure
in einer Konzentration von 250 &/ml zugefügt. Die Verbindungen wurden in Form
alkoholischer Lösungen zugegeben. Die Zunahme des Alkoholgehaltes wurde durch Zugabe
von Wasser reguliert. Jede Probe wurde in 25 200-ml-Flaschen verteilt und eine Platinöse
voll aktiver Lactobacillus acidophilus wurde zu jeder Flasche gegeben, dann wurde
die Flasche mit einem Korken verschlossen. Jede Flasche wurde bei 30°C gelagert
und der Zustand der Probe wurde untersucht.
-
Die Proben, die die erfindungsgemäßen Verbindungen 28 und 34 eingearbeitet
enthielten, zeigten nach 3 Monaten keine Wechsel. Aber alle Proben, die Salicylsäure
enthielten, waren innerhalb von 30 Tagen verfault.
-
Beispiel 13 Versuche wurden in einem (lever piece) Reiswein-Peptonkulturmedium
während 20 Tagen auf gleiche Weise wie in Beispiel 9 durchgeführt, wobei man aber
die in Tabelle XX angegebenen Dihydroxybenzoesäureester verwendete. Die Ergebnisse
(minimale Wachstumsinhibierungskonzentration - γ/ml) sind in Tabelle XX angegeben.
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Tabelle XX
| Konservierungs- Minimale Wachstumsinhibierungskonzentration
(γ/ml) |
| stoff |
| Lactobacillus Lactobacillus Lactobacillus Lactobacillus |
| homohiochi heterohiochi fermentum acidiphilus |
| Salicylsäure 400 200 200 400 |
| Lysozym 20 10 <1 >100 |
| Verbind.15 200 150 200 200 |
| 16 16 100 75 100 100 |
| " 17 | 30 | 20 | 30 | 30 |
| 18 10 3.0 10 10 |
| " 9 300 250 250 250 |
| 10 10 150 100 100 150 |
| 11 | 25 | 25 | 25 | 25 |
| 12 10 10 10 10 |
| " 21 400 200 200 400 |
| " 22 300 100 300 100 |
| " 23 200 50 50 200 |
| " 24 50 30 30 50 |
| " 3 60 45 45 50 |
| " - 4 20 8 15 15 18 |
| " 5 8 5 <5 <5 |
| " 6 <5 <5 <5 <5 |
Beispiel 14 Reiswein, der frei an Konservierungsmitteln war und einen Alkoholgehalt
von 16 54 hatte, wurde mit 2 x 105 Zellen pro ml Hiochi-Bakterien infiziert und
dann in eine 300 ml blaue Glasflasche überfüllt. Zu der Flasche fügte man die in
Tabelle EI angegebene Verbindung in den in der Tabelle ebenfalls angegebenen Mengen.
-
Für Vergleichszwecke wurde Salicylsäure ebenfalls untersucht.
-
Die Flaschen wurden mit korken verschlossen und bei 30 0C aufbewahrt.
Das Auftreten von Trübung, durch Hiochi-Bakterien verursacht, wurde geprüft. Die
Ergebnisse sind in Tabelle XXI angegeben, wobei das Symbol "-" bedeutet, daß keine
Trübung beobachtet wurde und das Symbol "+" bedeutet, daß Trübung beobachtet wurde.
Jedes Konservierungsmittel wurde in Form einer alkoholischen Lösung zugegeben und
die Zunahme des Alkoholgehaltes durch die Zugabe des Konservierungsmittels wurde
auf den ursprünglichen Alkoholgehalt von 16 % durch Zugabe von Wasser eingestellt.
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Tabelle XXI
| Zugege- Lagerungszeit Lagerung bei |
| Konservie- |
| bene 0°C während |
| rungsstoff 7Tage 14Tage 21 Tage 70Tage |
| Menge 48 Stunden |
| ( /ml) |
| Vergleichs- |
| + + + + |
| such, nichts |
| zugegeben |
| 500 - - + + |
| Salicylsäure |
| " 250 - + + + |
| Verbind. 17 50 - - - - weiße Trübung |
| " 30 - - - - |
| " 20 - - + + |
| Verbind. 11 50 - - - - weiße Trübung |
| " 25 - - - - |
| " 10 - - + + |
| Verbind. 4 20 - - - - |
| " 10 - - - - |
| " 5 - - - + |
Wurden Proben, in die die obigen Verbindungen in Konzentrationen
eingearbeitet waren, die über den wirksamen Konzentrationen lagen, geschmacklich
untersucht, so fand man, daß diese Verbindungen keinen schlechten Einfluß auf den
Geschmack oder Geruch des Reisweines hatten. In allen Proben, die die erfindungsgemäßen
Verbindungen enthielten, wurde selbst nach Lagern während 70 Tagen kein Farbwechsel
beobachtet.
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Beispiel 15 20 ltr. Mirin ( süßer Reiswein),. der 17,0 % Alkohol,
0,01 % Säuren (bestimmt als Milchsäure) und 41,2 % Zucker enthielt, wurde in vierTeile
zu jeweils 5 ltr. geteilt. Die Verbindungen 17, 11 und 5 wurden in alkoholischer
Lösung in Konzentrationen von 30 Wml, 25 </mI und 5 5 γ/ml zu den drei
Teilen zugefügt.
-
Der zurückbleibende eine Teil wurde als Vergleichsprobe ohne Konservierungsstoff
untersucht. Jeder Verbindung wurde in Form einer äthanolischen Lösung zugegeben
und die Zunahme des Alkoh gehaltes durch die Zugabe des Konservierungsstoffes wurde
durch Zugabe von Wasser auf den @rsp@ ngleichen Alkoholgehalt von 17 % ausgegleichen.
JederTeil wurde in 25 200-ml-Flaschen abgefüllt und jede Flasche wurde mit einer
Platinöse voll aktiven Lactobacillus acidophilus infiziert. Dann wurde jede Flasche
bei 30°C aufbewahrt und der Zustand der Probe wurde untersucht Die Proben, die die
erfindungsgemäßen Verbindungen enthielten aren nach 3 Monaten nach unverändert,
wohingegen alle Vergleichsproben innerhalb von 10 bis 20 Tagen verschimmelt waren.
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Beispiel 16 Eine Äthanollösung des in Tabelle XXII angegebenen Konservierungsmittels
wurde zu rotem Wein zugegeben, der kein Konservierungsmittel enthielt und dann wurde
der Wein jeweils mit einer Platinöse voll filmbildender Hefe und Essigsäurebakterium
infiziert und während 70 Tagen bei 3000 gelagert. Der Wechsel in der Qualität des
Weines wurde untersucht. In keiner Probe konnte irgendwelche Zersetzung gefunden
werden, die durch den Geschmack bzw. den Geruch erkenntlich war, nachdem man das
Konservierungsmittel zugegeben hatte. Weiterhin wurd nach 70 Tagen Lagerung in keiner
Probe ein Farbwechsel beobachtet. Die Ergebnisse der Konservierungsuntersuchungen
sind in Tabelle XXIIangegeben, wobei das Symbol "+" bedeutet, daß weiße Trübung,
verursacht durch das Wachstum von Miktoorganismen, beobachtet wurde.
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Tabelle XXII
| Zugegebene |
| Konservie- Lagerungszeit |
| rungsstoff 7 Tage 14 Tage 21 Tage 70 Ta |
| Salycylsäure 250 - - + + |
| SO2 400 - - + + |
| trerbindung 28 25 - - - - |
| Verbindung 17| 30 | - | - | - | - |
| Verbindung 6 5 - | - | - | - |
Beispiel 17 Eine Äthanollösung des in Tabelle XXIIIangegebenen Konservierungsmittels
wurde zu Weißwein zugegeben, der kein Konservierungsmittel enthielt, und dann wurde
der Wein mit aktiver filmbildender Hefe und Essigsäurebakterien infiziert (wobei
der
Verunreinigungsrad an Bakterien 2 x 10² Zellen pro ml betrug)
und dann wurden die Proben in Flaschen bei ca. 30°C aufbewahrt.
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Der Unterschied in der Qualität wurde geprüft. In keiner Probe konnte
irgendwelche Verunreinigung mittels Geruch festgestellt werden, nachdem man gerade
die Konservierungsstoffe zugegeben hatte, In keiner Probe wurde ein Farbwechsel
festgestellt, nachdem die Probe 70 Tage gelagert war. Die Ergebnisse der Konservierungsuntersuchungen
sind in Tabelle XXIII angegeben, wobei das Symbol "+" bedeutet, daß durch das Wachstum
von Mikroorganismen weiße Trübung auftritt.
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Tabelle XXIII
| Zugegebene |
| Lagerungszeit |
| Konservierungs- Menge |
| stoff (γ/ml) |
| 7 Tage 14 Tage 21 Tage 70 Tage |
| Salicylsäure 250 - - + + |
| SO2 400 - - + + |
| Verbindung 28 25 - - - - |
| Verbindung 17 30 - - - - |
| Verbindung 6 5 - - - - |
| ein Zusatzstoff |
| ergleichsver + + + + |