DE1909965B2 - Verwendung von biologischen proteasen- inhibitoren zur konservierung von organen, geweben und nahrungsmitteln - Google Patents

Description

; werden dargestellt: NADH-Cyasc (NADH-C-R), Laktatdehydroge-DHi Glukose-6-phosphat-Dehydrogenase Γ Sucdnodehydrogenase (SDH) Cytochrom-[CO), unspezifische Esterasen (UE), alka ische p_h'_nhaLen (AP) und saure Phosphatasen (SP). Die Phosphatasen ^r; Hydrolysen werden

^hiSt°h^C _ee ^efün^Sr^Ct Z* ί GTe P ears e^Histochemistry; _:hgefuhrt nacn.A._: ^ ^.^ ^ _{& A} Churchill

Beispiel 1

Frische Nieren von gesunden Ratten v/erden entnommen und durch einen Mittelschnitt in 2 Teile geteilt Die eine Gruppe der Nierenhälften wird in physiologische Kochsalzlösung und die andere in Kochsalzlösung, die mit dem Kallikrein-Trypsin-Inhibitor (KTI) in einer Konzentration von 8 mg pro ml versetzt ist, gebracht. Die Nierenhälften werden bei Zimmertemperatur in diesen Lösungen unter sterilen Bedingungen aufbewahrt, zu verschiedenen Zeiten nach ^T, PrVtS. and Bibliography«; Harper and Row. Inc· New York (1963)]. An histologischen Härtungen werden die Hämatoxylin-Eosin-Färbung (HETunddieGoldner-Färbungdurchgefuhrt

Nach 6 Stunden Inkubation m physiologischer Kochsalzlösung färbte sich mit HE das Plasma wesentlich schwächer an; die Tubuluszellen erscheinen _w verquollen. Es kommt im gesamten Gewebe zu ejner starken Auflockerung. Die Aktivität an LDH, NADH-C-R und SDH hat nrch nicht eindeutig r_g°nom:nen. jedoch zeigen sich bereits Unregelmäßig^ Weiten in Form und Dichte der Granula. Be, der G6PDH „ we den ähnliche Veränderungen, besonders in der Smedullären Zone, beobachtet. Der CO-Nachwe.s erXeine fleckige Anfärbung. Be₅ den UE finden sich

gekommen jedoch erfolgt immer eine klare Darstel-4, fung Se Quellung ist kaum zu beobachten. D.e Lumina der Tubuli sind schärfer abgegrenzt. D,e Anfarbung fur die «nannten Enzyme ergibt allgemein keine wesenthcheAbTeSg vo^ym Norma.bild. Die Aktivität ,st stark und regelmäßig verteilt. Die Farbstoffgranula sind ^aiaif^n^hden^efmdet man ohne KTI ein weiteres Fortschreiten der Autolyse. Die Kerne verdämmern und sind zum großen Teil, besonders in den inneren Abschnitten der Gewebestücke, nicht mehr farbbar. Die

« Tubuli zeigen nur noch dünne Wandungen Das Lumen stellt sich nicht mehr geschlossen dar. Der gesamte Gewebebereich zeigt beginnende Auflösungserscheinungen; auch das interstitielle Bindegewebe'^st W' hend aufgelöst. Nach Anfärbung auf LDH, NADH-C-K,

to SDH und CO sind die Farbstoffpartikeln zu homogenen Massen zusammengelagert, und die Kerne sind im Farbstoffbereich nicht mehr deutlich abgegrenzt Die Aktivität an G6PDH ist stark abgesunken. Die UE sind völlig verschwunden. Die AP sind zwar teilweise noch in

6s starker Aktivität vorhanden, stellen sich jedoch nur in Form verklumpter Klekse dar. Die SP zeigen eine homogene Anfärbung mit stark verminderter Aktivität. Unter KTI-Einwirkung sind nach 24 Stunden die

Kernstrukturen noch fast alle gut erhalten. Es machen sich zwar erste Anzeichen beginnender Autolyse bemerkbar, jedoch erscheint das Gewebe geschlossen, und das Interstitium ist noch gut erhalten. Die Farbstoffverteilung der angefärbten Enzyme ist allgemein regelmäßiger. Die Aktivität ist wesentlich besser erhalten. Allerdings ist bei der G6PDH eine abfallende Tendenz bereits zu erkennen, und die UE sind nicht mehr nachweisbar. Der Unterschied zur Kontrolle ohne KTl ist besonders deutlich bei den SP, die in Aktivität und Struktur noch gut erhalten sind.

Nach 5 Tagen ist es ohne KTI zu völliger Auflösung der Strukturen gekommen. Das Präparat ist mit HE fast farblos, nur vereinzelte Kerne sind noch dargestellt Konturen sind nicht mehr zu erkennen. Die A.ifärbung auf LDH und NADH-C-R ergibt nur noch homogene Massen. CO und AP sind nicht mehr nachweisbar. Die SP zeigen noch Aktivität, aber ohne Strukturierung. Nach 5tägiger Aufbewahrung mit KTI sind noch deutliche Strukturen des Rindengewebes zu erkennen; die Tubuli sind zum großen Teil noch in der Form erhalten. Die Anfärbung auf LDH und NADH-C-R zeigt noch deutliche Granulierung. Bei der LDH-Färbung sind die Glomeruli noch immer durch ihre Negativität abgegrenzt. CO ist noch deutlich nachweisbar. Die Aktivität der SP ist stärker und besser verteilt als bei den Kontrollen.

Beispiel 2

Lebergewebe von gesunden Ratten wird in Würfel von 5 mm Kantenlänge zerschnitten und wie bei Beispiel 1 in Kochsalzlösungen ohne und mit Zusatz des KTl aufbewahrt. Die weitere Aufarbeitung und Untersuchung erfolgt wie bei Beispiel 1 beschrieben.

Nach 6 Stunden findet man bei der LDH, NADH-C-R und SDH fleckenförmige Aktivitätsabnahmen. Die G6PDH hat bei den meisten Zellen wesentlich abgenommen; die Strukturierung und die Negativität der Kerne sind aber noch erhalten. Bei den UE kommt es zu fleckigen Ausfällen. Bei den SP ist die Begrenzung der Kapillaren unscharf und die Aktivität erscheint unregelmäßig verteilt. Nach 6stündiger Aufbewahrung in KTI-haltiger Lösung weisen LDH, NADH-C-R, SDH und G6PDH noch keinerlei Veränderungen auf. Die UE zeigen geringere Ausfälle. Die SP sind schärfer begrenzt und regelmäßiger verteilt als bei den Kontrollen.

Nach 24 Stunden kommt es ohne KTl zu einer Strukturauflösung. Die Läppchen sind nicht mehr deutlich abgegrenzt; die Sinus sind unregelmäßig begrenzt und zeigen tiefe Einbuchtungen. Die Aktivität an LDH, NADH-C-R, SDH und besonders an G6PDH hat abgenommen. Bei der Anfärbung auf SP tritt neben einer starken Aktivitätsabnahme eine beginnende Auflösung der Kanälchensysteme zutage. Nach 24stündiger Aufbewahrung in KTI-Lösung ist die Begrenzung der Läppchen und Sinus regelmäßiger. Die Aktivität an LDH, NADH-C-R, SDH und G6PDH ist allgemein noch verhältnismäßig stark. Auch nach der Anfärbung auf SP ist die Aktivität noch wesentlich stärker, und die Kanälchensysteme erscheinen besser erhalten.

Nach 5 Tagen ist ohne KTI bei LDH, NADH-C-R und SDH nur noch minimale homogene oder fleckig dargestellte Aktivität zu finden. Nur die SP zeigen noch mäßige Farbstoffbeladung. Auch bei Aufbewahrung in KTI-Lösung hat nun eine gewisse Strukturauflösung eingesetzt Es zeigen aber LDH, NADH-C-R und SDH noch deutliche Aktivität Die Aktivität der SP ist wesentlich stärker als die der Kontrollen.

Beispiel 3

Man entnimmt dem menschlichen Sternum mit einer Punktionskanüle 2 bis 4 ml Knochenmark. Dieses suspendiert man im doppelten Volumen Tyrodelösung, der pro ml 15 mg Kallikreim-Trypsin-Inhibitor zugesetzt sind. Man bewahrt die Suspension bei etwa — 20⁰C auf. Vergleicht man die Suspension nach einem Jahr mit einer entsprechenden Suspension von Knochenmarkzellen, die ohne Inhibitorzusatz, aber im übrigen gleich hergestellt wurde, so findet man in dieser nach Anfärbung mit Trypanblau oder Eosin mehr tote Zellen als in der erfindungsgemäßen.

Beispiel 4

Eine menschliche Leber, die für die Transplantation vorgesehen ist, perfundiert man durch die Pfortader und die Arteria hepatica mit Tyrodelösu ng, der pro mil O mg Kartoffel-Inhibitor zugesetzt sind. Das Lebergewebe bleibt besser erhalten als das einer anderen Leber, die unbehandelt geblieben ist Die hijtologisch sichtbaren autolytischen Veränderungen werden deutlich zurückgehalten.

Claims (1)

1. Patentanspruch:

   Verwendung eines biologischen Protease-Inhibitors aus der Reihe Kallikrein-Trypsin-Inhibitor und Kartoffelinhibitor zur Konservierung von Organen, Geweben und Nahrungsmitteln.

   Bei der Aufbewahrung von Organen und Geweben, vor allem von solchen, die für Transplantationen bestimmt sind, treten häufig Schwierigkeiten dadurch auf, daß diese Organe und Gewebe durch postmortale Autolyse mehr oder weniger zerstört und dadurch für den genannten Zweck unbrauchbar werden. Auch Pilze und Bakterien, welche Proteasen enthalten, können den gleichen ungünstigen Effekt bewirken. Ähnliche Verhältnisse liegen bei Nahrungsmitteln vor, welche ebenfalls durch die Einwirkung von Proteasen unbrauchbar werden können.

   Die genannten unerwünschten Effekte können zwar durch bekannte Konservierungsmittel mehr oder weniger verhindert werden, der Nachteil solcher Verfahren liegt jedoch darin, daß viele der gebräuchlichen Konservierungsmittel vom Organismus nicht gut vertragen werden.

   Es wurde nun gefunden, daß man Organe, Gewebe und Nahrungsmittel durch die Verwendung eines biologischen Protease-Inhibitors aus der Reihe Kallikrein-Trypsin-Inhibitor und Kartoffelinhibitor konservieren kann.

   Diese biologischen Proteasen-Inhibitoren haben den großen Vorteil, daß sie vom Organismus praktisch ohne Komplikationen angenommen werden. Vor allem aber zeigen sie den gewünschten Konservierungseffekt in hohem Maße.

   Als Organe und Gewebe, die erfindungsgemäß konserviert werden können, kommen vor allem Leber, Niere, Herz, Pankreas, Lunge, Haut und Knochenmark in Frage.

   Die genannten Inhibitoren werden vorzugsweise in wäßrigen Lösungen angewandt. Man kann die zu konservierenden Organe, Gewebe und Nahrungsmittel in diese wäßrigen Lösungen einlegen, man kann jedoch auch die wäßrigen Lösungen in diese Organe usw. injizieren oder diese mit ihnen durchströmen. Außerdem ist es jedoch möglich, die Inhibitoren in fester Form, gegebenenfalls mit Trägersubstanzen, mit den zu konservierenden Organen usw. in Berührung zu bringen.

   Wendet man zur Durchführung der erfindungsgemäßen Konservierung wäßrige Lösungen an, so genügen bereits geringe Konzentrationen zur Erreichung des gewünschten Effekts. In Abhängigkeit vom besonderen Fall kann es sich jedoch auch als zweckmäßig erweisen, höhere Konzentrationen anzuwenden.

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