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DE19961951A1 - Verfahren zur Herstellung einer biosensorischen Schicht und Vorrichtung zur Messung mit derartigen Schichten - Google Patents

Verfahren zur Herstellung einer biosensorischen Schicht und Vorrichtung zur Messung mit derartigen Schichten

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Publication number
DE19961951A1
DE19961951A1 DE1999161951 DE19961951A DE19961951A1 DE 19961951 A1 DE19961951 A1 DE 19961951A1 DE 1999161951 DE1999161951 DE 1999161951 DE 19961951 A DE19961951 A DE 19961951A DE 19961951 A1 DE19961951 A1 DE 19961951A1
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DE
Germany
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ion channels
membrane
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biosensory
lipid bilayers
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DE1999161951
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Steffen Friedrich
Reiner Salzer
Klaus Herzog
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Technische Universitaet Dresden
Original Assignee
Technische Universitaet Dresden
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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer biosensorischen Schicht, bestehend aus einer löchrigen Membran (6), in deren Löcher (29) sich freistehende Lipiddoppelschichten (30) mit integrierten Ionenkanälen (32) befinden, und die Membran (6) zur Ausbildung von zwei Flüssigkeitsreservoirs (3; 4) vorgesehen ist. Das Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß in eine 2 bis 30 mum dünne Membran (6) aus Polyester durch Beschuß mit Ionen und anschließender Ätzung Löcher (29) eingebracht werden, die einen mittleren Durchmesser von 400 nm bis 40 mum aufweisen, die so hergestellten Löcher (29) in der Membran (6) mit einer eine Lipiddoppelschicht (30) ausbildenden Flüssigkeit unter Normaldruck gefüllt werden, anschließend in die sich ausbildenden freistehenden Lipiddoppelschichten (30) Ionenkanäle (32) eingebracht werden, wobei die Zusammensetzung der freistehenden Lipiddoppelschichten (30) so gewählt ist, daß die Fähigkeit der integrierten Ionenkanäle (32) zu Kanalöffnungen bei der jeweiligen Arbeitstemperatur zumindest eingeschränkt erhalten bleibt. DOLLAR A Eine Vorrichtung zur Messung mit derartigen biosensorischen Schichten ist beschrieben.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer biosensorischen Schicht nach dem Oberbegriff des Anspruchs 1. Die Erfindung betrifft weiterhin eine Vorrichtung zur Messung mit derartigen Schichten nach dem Oberbegriff des Anspruchs 8 für pharmakologische und toxikologische Fragestellungen.
Der Bedarf an biosensorischen Schichten (Biosensoren), die eine extrem hohe Sensitivität und Selektivität aufweisen, steigt ständig. Primäre Bedeutung haben dabei pharmakologische und toxikologische Fragestellungen erlangt. Darüber hinaus wird der Einsatz von Biosensoren bereits in der Medizin in diagnostischen und therapeutischen Verfahren erprobt.
Von den verschiedenen Biosensoren haben sich vor allem die modifizierten Biofunktionskomponenten mit natürlichem Vorbild bewährt. Hierzu gehören Enzyme, Antikörper und natürlich vorkommende Ionenkanäle. Die wichtigsten Anwendungsgebiete für Biosensoren mit natürlichen Ionenkanälen sind die Pharmaforschung, die Toxikologie, die Neurologie und der Bereich der technischen Aktoren.
Für die Pharmaforschung sind Ionenkanäle als die zentralen biologischen Bausteine für Reizentstehung, Reizleitung und Informationsaustausch zwischen den Zellen interessant. Eine Vielzahl von Krankheiten können auf die veränderte Aktivität von Ionenkanälen zurückgeführt werden. Damit erschließt sich ein breites Anwendungsfeld in der Entwicklung und Erprobung von Pharmaka sowie im Screening bei der Wirkstoffsynthese.
Die hohe Selektivität - insbesondere von ligandengesteuerten Ionenkanälen - kann zur biochemischen Detektion von Toxinen in der Umweltüberwachung, Militärtechnik und Lebensmittelüberwachung genutzt werden. Dabei sind kontinuierliche Langzeitmessungen für das online-Monitoring von Neurotoxinen sowie der Einsatz von Teststreifen für den spezifischen Nachweis von Pilzgiften u. ä. in Nahrungsmitteln möglich.
Die Erfassung in Nerven geführter Reize ist für neurologische Diagnosen eine wichtige Größe. Gestörte Areale der Nerven könnten nach genauer Lokalisation gezielt substituiert werden. Darüber hinaus ermöglichen Biosensorsysteme mit Ionenkanälen als Rezeptorkomponente die technische Entwicklung von Neuroprothesen.
Durch einen geöffneten Ionenkanal können in einer Sekunde ca. 107 Ionen strömen, so daß das primäre Signal intrinsisch um ein Vielfaches verstärkt wird. Ionenkanäle können folglich nicht nur als biochemischer Schalter sondern auch als biochemischer Verstärker genutzt werden. Sie entsprechen der biologischen Form eines Transistors. Die Nachbildung natürlicher Speicherstrukturen ist daher wie die biologische Informationsverarbeitung an Ionenkanäle gebunden.
Ionenkanäle können aus biologischem Material isoliert [W. Schiebler, F. Hucho, Eur. J. Biochem., 1978, 85, 55-63], danach teilweise chemisch modifiziert [B. A. Cornell, V. L. B. Braach-Maksvytis, L. G. King, P. D. J. Osman, B. Raguse, L. Wieczorek, R. J. Pace, Nature, 1997, 387, 580-583] oder synthetisch hergestellt werden [M Tamaki, M. Takimoto, I. Muramatsu, Bull. Chem. Soc. Jpn., 1988, 61, 3925-3929]. Insbesondere beim Einsatz von Ionenkanälen aus biologischem Material ist es häufig erforderlich, sie nach der Gewinnung noch weiter im Probenmaterial anzureichern. Dafür geeignete Methoden sind u. a. die Saccharosdichtegradientenzentrifugation [J. R. Duguid, M. A. Raftery, Biochemistry, 1973, 12(19), 3593-3597], die pH11-Extraktion [S. Hertling-Jaweed, G. Bandini, F. Hucho in Purification of nicotinic acetylcholine receptors (Hrsg.: E. C. Hulme), Oxford University Press, Oxford, 1990, Kapitel 7, S. 163], die Hochleistungsflüssigkeitschromatographie [R. E. Koeppe II, L. B. Weiss, J. Chromatogr., 1981, 208, 414-418] und die Affinitätschromatographie [R. Olsen, J. C. Meunier, J.-P. Changeux, FEBS Lett., 1972, 28(1), 96-100].
Die biologischen, teilsynthetischen oder vollsynthetischen Ionenkanäle können schließlich in Lipidvesikel [R. Anholt, D. R. Fredkin, T. Deerinck, M. Ellisman, M. Montal, J. Lindstrom, J. Biol. Chem., 1982, 257(25), 7122-7134], in eine freistehende Lipiddoppelschicht in einem Polymerfolieloch [A. J. Williams in The measurement of the function of ion channels reconstituted into artificial membranes (Hrsg.: R. H. Ashley), Oxford University Press, Oxford New York Tokio, 1995, Kapitel 2, S. 43], in eine freistehende Lipiddoppelschicht in einer Glaspipettenspitzen [B. A. Suarez-Isla, K. Wan, J. Lindstrom, M. Montal, Biochemistry, 1983, 22(10), 2319-2323] oder in trägergestützte Lipiddoppelschichten [R. Naumann, A. Jonczyk, R. Kopp, J. von Esch, H. Ringsdorf, W. Knoll, P. Gräber, Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 1995, 34(18), 2056-2058] integriert werden.
Derzeit sind eine Vielzahl von Verfahren zur Herstellung von Lipidvesikeln [H. Ringsdorf, B. Schlarb, J. Venzmer, Angew. Chem., 1988, 100(1), 117-162] und Riesenliposomen [G. Riquelme, E. Lopez, L. M. Garcia-Segura, J. A. Ferragut, J. M. Gonzales-Ros, Biochemistry, 1990, 29, 11215-11222] bekannt. Die Herstellung von Lipiddoppelschichten erfolgt dagegen ausschließlich mit der Streichtechnik oder über das Zusammensetzen von Lipidmonoschichten [O. Alvarez in How to Set up a bilayer system (Hrsg.: C. Miller), Plenum Press, New York, London, 1986, Kapitel 5, S. 115].
Der Nachweis der Ionenströme durch geöffnete Ionenkanäle erfolgt nach dem derzeitigen Stand der Technik ausschließlich durch Ionenflußmessungen mit Radiotracern [T. M. Fong, M. G. McNamee, Biochemistry, 1986, 25(4), 830-840] oder durch elektrophysiologische Messungen [E. Neher, B. Sakmann, J. H. Steinbach, Pflügers Arch., 1978, 375(2), 219-228].
Sämtliche nach herkömmlichen Methoden hergestellten Vesikel sind für elektrophysiologische Untersuchungen unzugänglich. Ursache ist vor allem deren geringe Größe. Ein Ausweg stellt zwar die Herstellung von Riesenliposomen dar, insbesondere deren Handhabbarkeit schränkt ihre praktischen Einsatzmöglichkeiten in Biofunktionskomponenten jedoch stark ein. Ionenflußexperimente mit Radiotracern lassen sich im Unterschied zu elektrophysiologischen Messungen sehr gut an Vesikeln durchführen. Im Vergleich zu den Patch-Clamp-Messungen weisen die Ionenflußexperimente aber sowohl eine niedrigere Empfindlichkeit als auch eine deutlich schlechtere Zeitauflösung auf.
Ein Nachteil von Vesikeln, der sowohl bei den elektrophysiologischen als auch bei den Ionenflußexperimenten zu erwähnen ist, ist die schlechte Zugänglichkeit des Vesikelinneren für chemische Manipulationen.
Freistehenden Lipiddoppelschichten, die nach dem derzeitigen Stand der Technik in Polymerfolielöchern mit Durchmessern von 200 bis 2000 µm aufgebaut wurden, sind aufgrund ihrer geringen thermischen und mechanischen Stabilität für den praktischen Einsatz von Biosensoren mit Ionenkanälen kaum geeignet.
Gleiches gilt für freistehende Lipiddoppelschichten in Glaspipettenspitzen. Bei diesen sind als weiterer Nachteile eine schlechte technische Handhabbarkeit und eine niedrige Reproduzierbarkeit zu nennen.
Trägergestütze Lipiddoppelschichten weisen zwar eine hohe thermische und mechanische Stabilität auf, sie sind nach dem derzeitigen Stand der Technik jedoch ebenfalls nicht für Biosensoren auf der Basis von Ionenkanälen geeignet, da sie für viele Ionenkanäle eine zu niedrige Fluidität besitzen und da sie kein wäßriges Milieu auf der Substratseite aufweisen. Letzteres ist für den Abtransport der durch die Ionenkanäle fließenden Ionen erforderlich.
Außerdem ist es für die Funktionstüchtigkeit von Transmembranproteinen essentiell, daß deren extramembranen Bereiche von wäßrigem Medium umgeben sind.
Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren anzugeben, womit biosensorische Schichten auf der Basis von Ionenkanäle enthaltenden Membranen herstellbar sind, die zur Durchführung von Messungen in einer geeigneten Vorrichtung sich langzeitstabil verhalten und somit pharmakologische und toxikologische Untersuchungen an bzw. mit Ionenkanälen im technischen Maßstab durchführbar sind.
Diese Aufgabe wird durch ein Verfahren mit den im Anspruch 1 genannten Merkmalen gelöst. Vorteilhafte Varianten des Verfahrens ergeben sich aus den abhängigen Unteransprüchen. Die Aufgabe wird weiterhin durch eine Vorrichtung zur Durchführung von Messungen mit derartigen Schichten mit den im Anspruch 8 genannten Merkmalen gelöst. Vorteilhafte Ausgestaltungen sind Gegenstand von Unteransprüchen.
Die Ionenkanäle werden gestützt durch Lipiddoppelschichten in einer künstlichen Matrix gehalten. Damit wird eine gute Reproduzierbarkeit sowie eine hohe mechanische und thermische Stabilität des Biosensors auf der Basis der Ionenkanäle erreicht.
Durch die freistehenden Lipiddoppelschichten wird einerseits eine hohe Membranfluidität und andererseits ein wäßriges Milieu auf beiden Seiten der rekonstituierten Ionenkanäle gewährleistet.
Das erfindungsgemäße Verfahren bietet die Möglichkeit, mit äußerst geringem technischen Aufwand chemische Manipulationen auf beiden Seiten der Lipidmembran durchzuführen.
Der hergestellte Biosensor erlaubt in Verbindung mit der Meßtechnik aus der Elektrophysiologie die Messung von Einzelkanalereignissen. Die statistische Auswertung dieser Aufnahmen liefert für die integrierten Ionenkanäle u. a. mittlere Kanalöffnungszeiten, mittlere Leitfähigkeiten und Öffnungswahrscheinlichkeiten. Aus diesen sehr charakteristischen Informationen können sowohl Rückschlüsse auf die Art und den Zustand der integrierten Ionenkanäle als auch auf die Anwesenheit von Pharmaka und Neurotoxinen in den umgebenden Flüssigkeitsreservoirs gezogen werden. Nach einer Eichung des Systems sind darüber hinaus auch Konzentrationsbestimmungen verschiedener Pharmaka und Toxine möglich.
Durch die Verwendung von Rädiotracern läßt sich mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung der Ionenfluß durch die rekonstituierten Ionenkanäle messen. Nach einer Eichung des gesamten Systems können aus der Stärke dieses Ionenflusses Rückschlüsse auf Pharmaka- und Toxinkonzentrationen in den Flüssigkeitsreservoirs gezogen werden.
Nachfolgend wird die Erfindung an Hand mehrerer Ausführungsbeispiele mittels der Zeichnungen näher erläutert. Es zeigen:
Fig. 1 eine schematische Darstellung einer erfindungsgemäßen Vorrichtung,
Fig. 2 eine Ausführung einer erfindungsgemäßen Vorrichtung aus Mikroskopadapter und zwei Meßkammern,
Fig. 3 eine rasterelektronenmikroskopische Aufnahme einer Membran aus Polyester,
Fig. 4 eine schematische Darstellung des Querschnitts eines Loches innerhalb einer löchrigen Membran, die durch eine Lipiddoppelschicht mit zwei integrierten Ionenkanälen verschlossen ist,
Fig. 5 eine elektrophysiologische Messung von einem Biosensor mit integrierten Gramicidin A-Kanälen aus der Kulturflüssigkeit von Bacillus brevis,
Fig. 6 eine elektrophysiologische Messung von einem Biosensor mit integrierten Gramicidin A-Kanälen von Bacillus brevis, bei der die Gramicidin A-Kanäle durch Ca2+-Ionen teilweise blockiert werden; und
Fig. 7: eine elektrophysiologische Messung von einem Biosensor mit integrierten nikotinischen Acetylcholinrezeptoren aus dem Marmorzitterrochen Torpedo marmorata.
In Fig. 1 ist eine erfindungsgemäße Vorrichtung zur Durchführung von Messungen mit einer erfindungsgemäßen biosensorischen Schicht (Biosensor) schematisch dargestellt. Die Vorrichtung besteht aus einer äußeren Meßkammer 1 aus Polytetrafluorethylen und einer inneren Meßkammer 2 aus demselben Material. In der Meßkammer 1 befindet sich ein Flüssigkeitsreservoir 3, wogegen die Meßkammer 2 mit einem Flüssigkeitsreservoir 4 gefüllt ist. In der Meßkammer 2 befindet sich eine Öffnung 5 mit einem Durchmesser von 0,6 mm. Diese Öffnung 5 wird mit einem Biosensor verschlossen, der aus einer löchrigen Membran 6 besteht, in deren Löcher 29 sich Lipiddoppelschichten 30 mit integrierten Ionenkanälen 32 befinden. Die löchrige Membran 6 ist dabei mit einem schlecht leitenden Silikonklebstoff 7 an der Meßkammer 2 befestigt. An der Unterseite der Meßkammer 1 ist ein handelsübliches Mikroskopdeckgläschen 8 mit einer Dicke von 0,2 mm befestigt. Dieses läßt die Beobachtung mit einem Mikroskop zu, dessen Strahlengang 9 angedeutet wurde. Zur Perfusion befindet sich an der äußeren Meßkammer 1 ein Einströmkanal 10 und ein Ausströmkanal 11. Zum Zweck der Injektion von Applikationslösungen 14 in das Flüssigkeitsreservoir 3 befindet sich im Einströmkanal 10 ein aus der Gas- und der Flüssigkeitschromatographie bekanntes Teflon- bzw. Gummiseptum 12. Durch dieses können mit einer Mikroliterspritze 13 die Applikationslösungen 14 injiziert werden. Über den Entlüftungsspalt 15 werden mögliche Luftbläschen 16 aus der einströmenden Lösung befreit. Die Injektion von Applikationslösungen 17 in das Flüssigkeitsreservoir 4 kann über eine Mikropipette 18 durch Anlegen eines kurzzeitigen Überdrucks 19 mittels eines handelsüblichen Mikroinjektors erfolgen. Für elektrophysiologische Messungen befindet sich im Flüssigkeitsreservoir 3 eine Silberchloridelektrode 20 und im Flüssigkeitsreservoir 4 eine Silberchloridelektrode 21. Einerseits zum Schutz der Oberfläche der Elektrode 21 vor Verunreinigungen durch Stoffe aus dem Flüssigkeitsreservoir 4 und andererseits zum Schutz der in der Lipidschicht in der löchrigen Membran 6 integrierten Ionenkanäle 32 vor einer möglichen Inhibierung durch Silberionen befindet sich im dargestellten Ausführungsbeispiel die Silberelektrode 21 in einer Mikropipette 22, die mit einer Pipettenlösung 23 gefüllt ist. Durch den kleinen Innendurchmesser der Pipettenspitze 24 von etwa einem Mikrometer wird eine Diffusionsbarriere für den Konzentrationsausgleich der im Flüssigkeitsreservoir 4 und in der Pipettenlösung 23 befindlichen Stoffe geschaffen.
In der Fig. 2 ist eine Ausführung einer erfindungsgemäßen Vorrichtung, bestehend aus einem Mikroskopadapter 25 mit den dazugehörigen Meßkammern 1 und 2 in demontierten Zustand dargestellt. Der abgebildete Mikroskopadapter 25 dient zur Befestigung der Meßkammern 1 und 2 an einem Mikroskoptisch eines inversen Mikroskops. Alle drei dargestellten Teile sind aus Polytetrafluorethylen hergestellt. Die Meßkammer 1 enthält zwei zylindrische Bohrungen 26, durch welche Kühlflüssigkeit zur Thermostatierung der Vorrichtung geleitet werden kann. Ferner ist in der abgebildeten Meßkammer 1 eine Halterung 27 für eine Silberchloridelektrode zu erkennen. In der Meßkammer 2 ist eine Nut 28 für einen laminaren Fluß der Lösung von Flüssigkeitsreservoir 3 eingearbeitet.
Fig. 3 zeigt eine rasterelektronenmikroskopische Aufnahme einer löchrigen Membran 6 aus Polyethylenterephthalat, in die durch Ionenbeschuß mit anschließender Ätzung annähernd kreisrunde Löcher 29 mit einem mittleren Durchmesser von 400 nm eingebracht wurden. Die Membrandicke der abgebildeten Polyesterfolie beträgt 10 µm und die Porosität 10%.
In Fig. 4 ist eine schematische Darstellung eines Querschnitts durch ein kreisrundes Loch 29 entsprechend Fig. 3 abgebildet. Die Begrenzung ist massives Material der Polymermembran 6. Ein Loch 29 dieser Polymermembran 6 wird durch eine Lipiddoppelschicht 30 verschlossen, die in horizontaler Richtung über die Lipidreservoire 31 mit der Polymermembran 6 verbunden ist. In vertikaler Richtung grenzt die Lipiddoppelschicht 30 einerseits an das Flüssigkeitsreservoir 3 und andererseits an das Flüssigkeitsreservoir 4. In der Lipiddoppelschicht 30 sind in der schematischen Darstellung zwei Ionenkanäle 32 integriert.
Die elektrophysiologische Messung in Fig. 5 wurde mit einem erfindungsgemäßen Biosensor mit integrierten Gramicidin A-Kanälen bei einer Kommandospannung von -150 mV und einer Temperatur von 21°C erhalten. Für den Aufbau der Lipiddoppelschicht wurde eine 3% (w/v)-igen-Dekanlösung von einem natürlichen Sojabohnenextrakt und Cholesterin, welche im Molverhältnis 60 : 40 zueinander standen, verwendet. In den Flüssigkeitsreservoiren befanden sich jeweils 1 M CsCl-Lösungen. Als löchrige Membran 6 wurde eine 10 µm dicke Polyethylenterephthalatfolie eingesetzt, die Löcher mit einem mittleren Durchmesser von 10 µm und eine Porosität von 15% besaß. Aus der elektrophysiologischen Einzelkanalaufnahme dieses Ausführungsbeispiels kann man entnehmen, daß bei einer Stromstärke von ca. 3 pA kein Ionenkanal, bei einer Stromstärke von ca. 11 pA jeweils genau ein integrierter Gramicidin A-Kanal, bei einer Stromstärke von ca. 19 pA jeweils genau zwei integrierte Gramicidin A-Kanäle und bei einer Stromstärke von ca. 27 pA jeweils genau drei integrierte Gramicidin A-Kanäle gleichzeitig geöffnet sind.
In Fig. 6 ist das Ergebnis einer elektrophysiologische Messung dargestellt, bei deren Aufnahme sich in beiden Flüssigkeitsreservoiren CsCl und CaCl2 in der Konzentration von jeweils 1 mol l-1 befanden. Ansonsten galten die gleichen Bedingungen wie bei der elektrophysiologischen Aufnahme in Fig. 5. Zu erkennen ist, wie die Gramicidin A-Kanäle durch die zweiwertigen Ca2+-Ionen blockiert werden. Im Unterschied zu der Aufnahme in Fig. 5 sind bei der Messung in Fig. 6 deutlich kürzere mittlere Kanalöffnungszeiten und kleinere mittlere Stromamplituden der integrierten Ionenkanäle zu beobachten.
Das Ausführungsbeispiel in Fig. 7 zeigt schließlich das Ergebnis einer elektrophysiologische Messung, die mit einem erfindungsgemäß hergestellten Biosensor mit nikotinischen Acetylcholinrezeptoren, einem ligandengesteuerten Ionenkanal mit Acetylcholin als Agonisten, aufgenommen wurde. Die Kommandospannung betrug +200 mV und die Arbeitstemperatur lag bei 21°C. Für den Aufbau der Lipiddoppelschicht wurde eine 3% (w/v)-ige Squalenlösung von einem natürlichen Sojabohnenextrakt und Cholesterin, welche im Molverhältnis 60 : 40 zueinander standen, verwendet. Im Flüssigkeitsreservoir 3 befand sich eine Pufferlösung mit 1,3.10-1 mol l-1 CsCl, 2.10-3 mol l-1 CaCl2, 10-2 mol l-1 Ethylenbis(oxyethylennitrilo)- tetraessigsäure und 10-2 mol l-1 [4-(2-Hydroxyethyl)-piperazino]-ethansulfonsäure, die mit 1 M CsOH-Lösung auf pH = 7,3 eingestellt war. Im Flüssigkeitsreservoir 4 war eine Pufferlösung mit 10-6 mol l-1 Acetylcholin, 1,24.10-1 mol l-1 NaCl, 2.10-3 mol l-1 CaCl2, 2.10-3 mol l-1 MgCl2, 3,25.10-3 mol l-1 D-Glukose und 10-2 mol l-1 [4-(2-Hydroxyethyl)-piperazino]-ethansulfonsäure, die mit 1 M NaOH-Lösung auf pH = 7,4 eingestellt war. Als löcherige Membran 6 wurde eine 10 µm dicke Polyethylenterephthalatfolie eingesetzt, die Löcher mit einem mittleren Durchmesser von 10 µm und eine Porosität von 15% besaß. Bei einer Stromstärke von ca. 3,5 pA waren alle Ionenkanäle geschlossen, wogegen bei einer Stromstärke von ca. 9 pA jeweils genau ein Ionenkanal geöffnet war.
Bezugszeichenliste
1
Meßkammer
2
Meßkammer
3
Flüssigkeitsreservoir
4
Flüssigkeitsreservoir
5
Öffnung
6
Membran
7
Silikonklebstoff
8
Mikroskopdeckgläschen
9
Strahlengang
10
Einströmkanal
11
Ausströmkanal
12
Septum
13
Mikroliterspritze
14
Applikationslösung
15
Entlüftungsspalt
16
Luftbläschen
17
Applikationslösung
18
Mikropipette
19
Überdruck
20
Silberchloridelektrode
21
Silberchloridelektrode
22
Mikropipette
23
Pipettenlösung
24
Pipettenspitze
25
Mikroskopadapter
26
Bohrung
27
Halterung
28
Nut
29
Loch
30
Lipiddoppelschicht
31
Lipidreservoire
32
Ionenkanal

Claims (21)

1. Verfahren zur Herstellung einer biosensorischen Schicht, bestehend aus einer löchrigen Membran (6), in deren Löcher (29) sich freistehende Lipiddoppelschichten (30) mit integrierten Ionenkanälen (32) befinden, und die Membran (6) zur Ausbildung von zwei Flüssigkeitsreservoirs (3; 4) vorgesehen ist, dadurch gekennzeichnet, daß in eine 2 bis 30 µm dünne Membran (6) aus Polyester durch Beschuß mit Ionen und anschließender Ätzung Löcher (29) eingebracht werden, die einen mittleren Durchmesser von 400 nm bis 40 µm aufweisen, die so hergestellten Löcher (29) in der Membran (6) mit einer eine Lipiddoppelschicht (30) ausbildenden Flüssigkeit unter Normaldruck gefüllt werden, anschließend in die sich ausbildende freistehende Lipiddoppelschichten (30) Ionenkanäle (32) eingebracht werden, wobei die Zusammensetzung der freistehenden Lipiddoppelschichten (30) so gewählt ist, daß die Fähigkeit der integrierten Ionenkanäle (32) zu Kanalöffnungen bei der jeweiligen Arbeitstemperatur zumindest eingeschränkt erhalten bleibt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Dicke der Membran (6) 5 bis 15 µm beträgt und die Löcher (29) einen mittleren Durchmesser von 2 µm bis 10 µm aufweisen.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die freistehenden Lipiddoppelschichten (30) durch eine Streichtechnik oder mit der Langmuir-Blodgett-Technik hergestellt werden.
4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Lipiddoppelschichten (30) mit einem organischen Lösungsmittel hergestellt werden, die integrierten Ionenkanäle (32) lösungsmittelempfindlich sind und die Temperatur der Flüssigkeitsreservoire (3; 4) zyklisch um den Schmelzpunkt des Lösungsmittels schwankt, so daß einerseits die Membranfluidität für die Funktionstüchtigkeit der integrierten Ionenkanäle (32) noch ausreichend hoch ist, andererseits aber so viel Lösungsmittel ausgefroren ist, daß die Ionenkanäle (32) durch das organische Lösungsmittel in der Lipiddoppelschicht (30) nicht inhibiert werden.
5. Verfahren nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Lipiddoppelschichten (30) mit dem organischen Lösungsmittel Squalen hergestellt werden und es sich bei den integrierten Ionenkanälen (32) um den nikotinischen Acetylcholinrezeptor handelt, dessen Fähigkeit zu Kanalöffnungen durch die Anwesenheit von Squalen in der Lipidschicht nicht blockiert wird.
6. Verfahren nach Anspruch 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die biosensorische Schicht für die Messung von Strömen zwischen zwei Elektroden (20; 21), die sich in jeweils einem der beiden Flüssigkeitsreservoirs (3; 4) befinden, verwendet wird.
7. Verfahren nach Anspruch 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die biosensorische Schicht für den Fluß von Radiotracern von einem Flüssigkeitsreservoir (3; 4) in das andere verwendet wird.
8. Vorrichtung zur Messung mit biosensorischen Schichten, wobei die biosensorische Schicht aus einer löchrigen Membran (6) besteht, in deren Löcher (29) sich freistehende Lipiddoppelschichten (30) mit integrierten Ionenkanälen (32) befinden und beidseitig der biosensorischen Schicht Flüssigkeitsreservoirs (3; 4) für elektrophysiologische Messungen oder Ionenflußmessungen mit Radiotracern vorgesehen sind, dadurch gekennzeichnet, daß für jedes Flüssigkeitsreservoir (3; 4) eine mit einer wäßrigen Lösungen füllbare Meßkammern (1; 2) vorgesehen ist, das Material dieser Meßkammern (1, 2) jeweils ein elektrischer Isolator ist, die beiden Meßkammern (1, 2) mittels eine Öffnung (5) mit einem Durchmesser von 0,2 bis 2 mm miteinander verbunden sind, wobei über der Öffnung (5) eine biosensorische Schicht mit einer löchrigen Membran (6), in deren Löcher (29) sich freistehende Lipiddoppelschichten (30) mit integrierten Ionenkanälen (32) befinden, positionierbar ist, so daß die Ionenkanäle (32) eine Verbindung zwischen den beiden Flüssigkeitsreservoirs (3; 4) darstellen.
9. Vorrichtung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens eine der beiden Meßkammern (1; 2) mit einem Ein- und einem Ausströmkanal (10; 11) versehen ist.
10. Vorrichtung nach Anspruch 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, daß unmittelbar nach dem Einströmkanal (10) ein Entlüftungsspalt (15) zur Abtrennung mit der einströmenden Lösung mitgeführter Luftbläschen (16) vorgesehen ist.
11. Vorrichtung nach Anspruch 8 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß eine der Meßkammern (1; 2) in die andere eingesetzt ist und sich im Boden der eingesetzten Meßkammer (1; 2) eine Nut (28) befindet, so daß die zugeführte Lösung laminar an der biosensorischen Schicht vorbeiströmt.
12. Vorrichtung nach Anspruch 8 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß im Einströmkanal (10) ein Bauteil (12) zur Injektion von Applikationslösungen (14) vorgesehen ist.
13. Vorrichtung nach Anspruch 8 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß in einer oder beiden Meßkammern (1; 2) eine Vorrichtung (27) zum Halten einer Elektrode (20; 21) vorgesehen ist.
14. Vorrichtung nach Anspruch 8 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß in einer der Meßkammern (1; 2) eine Pipette (18) zur Injektion von Applikationslösungen (17) vorgesehen ist.
15. Vorrichtung nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß die Pipette (18) für Mikroinjektionen mit einem Mikroinjektor verbunden ist.
16. Vorrichtung nach Anspruch 8 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß die biosensorische Schicht über der Öffnung (5) mit einem elektrisch schlecht leitenden Kleber (7) befestigt ist.
17. Vorrichtung nach Anspruch 8 bis 16, dadurch gekennzeichnet, daß sich in den wäßrigen Lösungen der beiden Meßkammern (1, 2) jeweils eine Elektrode (20; 21) befindet, die an einen handelsüblichen Patch-Clamp-Verstärker angeschlossen ist.
18. Vorrichtung nach Anspruch 8 bis 17, dadurch gekennzeichnet, daß sich mindestens eine Elektrode (20; 21) zum Schutz der Elektrodenoberfläche vor Verunreinigungen und zum Schutz der Ionenkanäle (32) der biosensorischen Schicht vor Metallionen des Elektrodenmaterials in einer handelsüblichen Mikropipette (22) befindet, die mit einer geeigneten Lösung (23) gefüllt ist.
19. Vorrichtung nach Anspruch 8 bis 18, dadurch gekennzeichnet, daß eine oder beide Meßkammern (1; 2) mit Bauteilen zur Thermostatierung der Lösungen, die sich in den Meßkammern (1, 2) befinden, versehen ist.
20. Vorrichtung nach Anspruch 8 bis 19, dadurch gekennzeichnet, daß beide Meßkammern (1, 2) direkt oder über einen Mikroskopadapter (25) an einem Mikroskoptisch befestigt sind.
21. Vorrichtung nach Anspruch 8 bis 20, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens eine der Meßkammern (1; 2) mit einem Mikroskopdeckgläschen (8) versehen ist, so daß die biosensorische Schicht und deren unmittelbare Umgebung über ein Mikroskop beobachtet werden können.
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