DE19909979A1

DE19909979A1 - Verfahren zur Herstellung von Glycokonjugaten von 20(S)-Camptothecin

Info

Publication number: DE19909979A1
Application number: DE19909979A
Authority: DE
Inventors: Hans-Georg Lerchen
Original assignee: Bayer AG
Current assignee: Bayer AG
Priority date: 1999-03-06
Filing date: 1999-03-06
Publication date: 2000-09-07
Also published as: WO2000053614A8; EP1173454A1; CA2366632A1; WO2000053614A1; JP2002539132A; AU3159500A

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Glycokonjugaten von 20(S)-Camptothecin, in denen ein 3-O-methylierter beta-L-Fucose-Baustein über Thioharnstoff-modifizierte Peptidspacer mit der 20-Hydroxylgruppe eines Camptothecin-Derivats verknüpft ist, wobei der entscheidende Schritt in der Verknüpfung des Bausteins (II) DOLLAR F1 mit dem Baustein (V) DOLLAR F2 in Gegenwart eines besonderen Kupplungsreagenzes wie beispielsweise N-[(Dimethylamino)-1H-1,2,3-triazolo[4,5-b]pyridin-1-yl-methylen]-N- DOLLAR A methylmethan-aminiumhexafluorphosphat-N-oxid (HATU) besteht.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Glyco konjugaten von 20(S)-Camptothecin, in denen ein 3-O-methylierter β-L-Fucose- Baustein über Thioharnstoff-modifizierte Peptidspacer mit der 20-Hydroxylgruppe eines Camptothecin-Derivats verknüpft ist.

20(S)-Camptothecin ist ein pentacyclisches Alkaloid, das 1966 von Wall et al. isoliert wurde (J. Am. Chem. Soc. 88, 3888 (1966)). Es besitzt ein hohes Antitumor- Wirkpotential in zahlreichen In-vitro- und In-vivo-Tests. Leider scheiterte jedoch die Realisierung des vielversprechenden Potentials in der klinischen Untersuchungsphase an Toxizitäts- und Löslichkeitsproblemen.

Durch Öffnung des E-Ring-Lactons und Bildung des Natriumsalzes wurde eine wasserlösliche Verbindung erhalten, die in einem pH-abhängigen Gleichgewicht mit der ringgeschlossenen Form steht. Klinische Studien führten auch hier bisher nicht zum Erfolg.

Etwa 20 Jahre später wurde gefunden, daß die biologische Aktivität auf eine Enzym inhibition der Topoisomerase I zurückzuführen ist. Seither wurden die Forschungs aktivitäten wieder verstärkt, um verträglichere und in-vivo wirksame Camptothecin- Derivate zu finden.

Zur Verbesserung der Wasserlöslichkeit wurden Salze von A-Ring- und B-Ring- modifizierten Camptothecin-Derivaten sowie von 20-O-Acyl-Derivaten mit ionisier baren Gruppen beschrieben (Vishnuvajjala et al. US 4943579). Letzteres Prodrug- Konzept wurde später auch auf modifizierte Camptothecin-Derivate übertragen (Wani et al. WO 9602546). Die beschriebenen 20-O-Acyl-Prodrugs haben allerdings in-vivo eine sehr kurze Halbwertszeit und werden sehr schnell zum Grundkörper gespalten.

In der WO 9631532 werden zuckermodifizierte Cytostatika und Verfahren zu Ihrer Herstellung beschrieben, bei denen die Verknüpfung von verschiedenen cyto toxischen oder cytostatisch aktiven Verbindungen mit z. B. regioselektiv modifi zierten Kohlenhydratbausteinen über bestimmte Spacer zu einer Verbesserung der Tumorselektivität führt.

In der WO 9851703 werden spezifische Glycokonjugate von 20(S)-Camptothecin der Formel (I) sowie Verfahren zu Ihrer Herstellung beschrieben:

worin
R¹ für eine sterisch anspuchsvolle unpolare Seitenkette einer Aminosäure steht und
R² für eine basische Seitenkette einer Aminosäure steht.

Es zeigte sich überraschend, daß der besondere Aufbau der dort beschriebenen Camptothecinderivate, nämlich die Anknüpfung von in 3-Stellung modifizierten β-L- Fucose-Bausteinen über einen Thioharnstoff-modifizierten Peptid-Spacer, bestehend aus einer sterisch anspruchsvollen unpolaren und einer basischen Aminosäure an die 20-Hydroxyl-Gruppe von 20(S)-Camptothecin, zu ganz besonders bevorzugten Konjugaten führt, die gegenüber den bislang bekannten Verbindungen eine beson ders hohe Stabilität, bessere Wasserlöslichkeit, höhere Verträglichkeit, größere thera peutische Wirksamkeit gegenüber verschiedenen Tumoren sowohl in vitro als auch in vivo und eine deutlich höhere Tumorselektivität insbesondere im Hinblick auf Knochenmarktoxizität zeigen.

In der WO 9851703 sind zwei Verfahren zur Herstellung der Verbindungen der Formel (I) beschrieben.

Gemäß dem ersten Verfahren werden die erfindungsgemäßen Glycokonjugate der Formel (I) durch sequentielle Verknüpfung von 20(S)-Camptothecin mit zwei entsprechenden Aminosäuren über ein Peptidyl-Camptothecin der Formel (II) zu einem Peptidyl-Camptothecin der Formel (III) und anschließende Anbindung des Isothiocyanats der Formel (IV) hergestellt (lineare Synthese):

wobei R¹ und R² die vorstehend angegebenen Bedeutungen haben.

Dieses Verfahren weist jedoch den Nachteil auf, daß von toxischem Camptothecin ausgegangen und bei weiteren Stufen des Verfahrens jeweils ein toxikologisch nicht unbedenkliches Camptothecinderivat erhalten wird.

Es wurde deshalb in der WO 9851703 noch ein zweites Verfahren zur Herstellung der Verbindungen der Formel (I) vorgeschlagen, bei welchem das Isothiocyanat der Formel (IV) zunächst mit einer gegebenenfalls geschützten terminalen basischen Aminosäure zu einem Baustein der Formel (V) verknüpft und dieser Baustein anschließend mit der freien Aminogruppe des Aminosäurekonjugats der Formel (II) aus 20(S)-Camptothecin und einer unpolaren, sterisch anspruchsvollen Aminosäure umgesetzt wird (konvergente Synthese):

Bei diesem Verfahren wird bei der Herstellung des Bausteins (V) kein toxikologisch bedenkliches Camptothecinderivat als Zwischenprodukt durchlaufen, weswegen es aus Gründen der Sicherheit und der damit verbundenen Verringerung an einzu haltenden Sicherheitsmaßnahmen gegenüber dem ersten Herstellungsverfahren be vorzugt ist. Zudem besteht bei der konvergenten Syntheseroute die längste Reak tionsfolge aus zwei Stufen, was gegenüber der aus drei Stufen bestehenden linearen Syntheseroute eine Einsparung eines Reaktionsschritts mit den damit verbundenen ökonomischen Vorteilen bedeutet.

Der Schlüsselschritt beim zweiten Verfahren besteht in der Kupplung der Bausteine (II) und (V). Hierfür wird die Carboxylgruppe des Bausteins (V) aktiviert und anschließend mit der freien Aminogruppe des Bausteins (II) zur Reaktion gebracht. In der WO 9851703 werden für die Aktivierung der Carboxylgruppe die in der Peptidchemie bekannten Kupplungsreagenzien verwendet, wie sie z. B. in Jakubke/Jeschkeit: Aminosäuren, Peptide, Proteine; Verlag Chemie 1982 oder Tetrahedr. Lett. 34, 6705 (1993) beschrieben sind. Als Beispiele sind N-Carbon säureanhydride, Säurechloride oder gemischte Anhydride, Addukte mit Carbodi imiden z. B. N,N'-Diethyl-, N,N'-Diisopropyl-, N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid, N-(3-Dimethylaminopropyl)-N'-ethyl-carbodiimid-Hydrochlorid, N-Cyclohexyl- N'-(2-morpholinoethyl)-carbodiimid-metho-p-toluolsulfonat, oder Carbonylverbin dungen wie Carbonyldiimidazol, oder 1,2-Oxazoliumverbindungen wie 2-Ethyl-5- phenyl-1,2-oxazolium-3-sulfat oder 2-tert-Butyl-5-methyl-isoxazoliumperchlorat, oder Acylaminoverbindungen wie 2-Ethoxy-1-ethoxycarbonyl-1,2-dihydrochinolin, oder Propanphosphonsäureanhydrid, oder Isobutylchloroform, oder Benzotriazolyl oxy-tris-(dimethylamino)-phosphonium-hexafluorophosphat, 1-Hydroxybenzo triazol- oder N-Hydroxysuccinimidester genannt. Weiterhin wird vorgeschlagen, die Aminosäurekomponente in Form eines Leuchs'schen Anhydrids einzusetzen.

Es zeigte sich jedoch, daß mit den in der WO 9851703 offenbarten Kupplungs reagenzien die Verbindung der Bausteine (II) und (V) insbesondere mit zunehmender Größe der Reste R¹ und R² überhaupt nicht oder nur in mittelmäßigen bis schlechten Ausbeuten gelingt. Insbesondere wird für den Fall, daß R² für die Seitenkette der Aminosäure Histidin steht, eine Vielzahl von Nebenreaktionen beobachtet (z. B. Epimerisierung, intramolekulare Thiolyse des aktivierten Bausteins (V), andere Acylierungen am Baustein (II) usw.), welche die gewünschte Kupplungsreaktion entweder vollständig unterbinden oder nur in sehr schlechten Ausbeuten gelingen lassen. Wird die Kupplung beispielsweise mit N-(3-Dimethylaminopropyl)-N'-ethyl carbodiimid-Hydrochlorid (EDC1) als Kupplungsreagenz durchgeführt, liegen die erzielten Ausbeuten unter 10%. Ebenso werden bei der Kupplung in Gegenwart von Benzotriazolyloxy-tris-(dimethylamino)-phosphonium-hexafluorophosphat (BOP) erhebliche Nebenreaktionen der Carboxylkomponente (V) und lediglich eine sehr geringe Umsetzung zur Zielverbindung (I) beobachtet.

Es war daher die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, das vorstehende konvergente Verfahren zur Herstellung der Verbindungen der Formel (I) zu verbessern und insbesondere für eine größere Variationsbreite der Reste R¹ und R² durchführbar zu machen.

Überraschend wurde gefunden, daß durch die Verwendung bestimmter Kupplungsreagenzien bei dem Schritt der Kupplung der Bausteine (II) und (V) das vorstehende zweite Herstellungsverfahren mit allen herkömmlichen Aminosäuren in moderaten bis guten Ausbeuten durchführbar ist.

Die vorliegende Erfindung betrifft somit ein Verfahren zur Herstellung von Ver bindungen der Formel (I),

worin
R¹ für eine sterisch anspuchsvolle unpolare Seitenkette einer Aminosäure steht und
R² für eine basische Seitenkette einer Aminosäure steht,
bei dem man das Isothiocyanat der Formel (IV)

mit einer gegebenenfalls geschützten terminalen basischen Aminosäure

worin R² die vorstehend angegebene Bedeutung hat,
zu einem Aminosäurekonjugat der Formel (V) umsetzt,

worin R² die vorstehend angegebene Bedeutung hat,
dieses dann mit Aminosäurekonjugaten der Formel (II) umsetzt,

worin R¹ die vorstehend angegebene Bedeutung hat,
die Seitenkettenschutzgruppe abspaltet und die Verbindungen gegebenenfalls in ein geeignetes Salz überführt,
dadurch gekennzeichnet, daß
die Kupplung der Bausteine (II) und (V) in Gegenwart eines Kupplungsreagenzes durchgeführt wird, daß aus der aus folgenden Verbindungen bestehenden Gruppe ausgewählt ist:

Besonders bevorzugt wird als Kupplungsreagenz N-[(Dimethylamino)-1H-1,2,3- triazolo[4,5-b]pyridin-1-yl-methylen]-N-methylmethanaminiumhexafluorphosphat- N-oxid (HATU) eingesetzt:

Weiterhin ist erfindungsgemäß bevorzugt, bei dem vorstehenden Verfahren zur Herstellung von Verbindungen der Formel (I) Aminosäuren zu verwenden, bei denen R¹ für einen verzweigten Alkylrest mit bis zu 4 Kohlenstoffatomen steht und R² für einen Rest der Formel -(CH₂)_n-R³ steht, wobei
R³-NH₂,

bedeutet und n für eine Zahl von 1 bis 4 steht.

Insbesondere bevorzugt ist hierbei die Verwendung von Aminosäuren, bei denen R1 für einen verzweigten Alkylrest der Formeln

steht und R² für einen Rest der Formeln

Gemäß der am meisten bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Verbindung wird beim vorstehenden Herstellungsverfahren zunächst das Isothiocyanat der Formel (IV) mit gegebenenfalls geschütztem Lysin oder Histdin, vorzugsweise ungeschütztem Histidin, und das Camptothecin mit Valin umgesetzt. Nach Kupplung der so erhaltenen Bausteine (V) und (II) in Gegenwart von N-[(Dimethylamino)-1H- 1,2,3-triazolo[4,5-b]pyridin-1-yl-methylen]-N-methylmethanaminiumhexafluorphos phat-N-oxid (HATU) und gegebenenfalls anschließender Schutzgruppenabspaltung werden dann gemäß der am meisten bevorzugten Ausführungsform des erfin dungsgemäßen Verfahrens als Verbindungen der Formel (I) 20(S)-20-O-{N^α-[4-(3- O-Methyl-β-L-fucopyranosyl-oxy)-phenylamino-thiocarbonyl]-L-histidyl-L-valyl}- camptothecin oder 20(S)-20-O-{N^α-[4-(3-O-Methyl-β-L-fucopyranosyl-oxy)-phenyl amino-thiocarbonyl]-L-lysyl-L-valyl}-camptothecin erhalten, besonders bevorzugt 20(S)-20-O-{N^α-[4-(3-O-Methyl-β-L-fucopyranosyl-oxy)-phenylamino-thiocarbon yl]-L-histidyl-L-valyl}-camptothecin.

Nach Anknüpfung der ersten Aminosäure an Camptothecin unter Bildung des Bausteins (II) können Diastereomerengemische entstehen. Reine Diastereomere der erfindungsgemäßen Verbindungen lassen sich nach den oben angegebenen Verfahren beispielsweise herstellen, in dem man nach Anknüpfung des ersten Aminosäure bausteins an das Camptothecin und anschließender Schutzgruppenabspaltung die Diastereomere in geeigneter Weise trennt. Aus einer diastereomerenreinen Zwischen verbindung (II) kann auf dem oben angegebenen Weg die diastereomerenreine Zielverbindung (I) hergestellt werden.

Ebenfalls können nach Kupplung der Bausteine (II) und (V) Diastereomeren gemische entstehen. Diese können auf der Stufe des salzfreien Glykokonjugats (I) entweder durch Säulenchromatographie oder durch Kristallisations- oder Digera tionsverfahren voneinander getrennt werden. Bevorzugt ist ein Verrühren mit Methanol oder eine Fällung aus Dichlormethan/Methanol mit Diethylether oder Methyl-t-butylether.

Die Einzelschritte des vorstehenden erfindungsgemäßen Herstellungsverfahrens können bei verschiedenen Druck- und Temperaturverhältnissen, beispielsweise 0,5 bis 2 bar und vorzugsweise unter Normaldruck, bzw. -30 bis +100°C und vorzugs weise -10 bis + 80°C, in geeigneten Lösungsmitteln wie Dimethylformamid (DMF), Tetrahydrofuran (THF), Dichlormethan, Chloroform, niederen Alkoholen, Aceto nitril, Dioxan, Wasser oder in Gemischen der genannten Lösungsmittel durchgeführt werden. In der Regel sind Reaktionen in DMF, Dichlormethan, THF, Dioxan/Wasser oder THF/Dichlormethan bei Raumtemperatur oder unter Eiskühlung und Normal druck bevorzugt.

Das als Ausgangsverbindung dienende Isothiocyanat der Formel (IV) kann bei spielsweise gemäß dem in der WO 98/51703 beschriebenen Verfahren aus käuflich erhältlichem p-Nitrophenyl-β-L-fucopyranosid durch selektive Veretherung der Hydroxygruppe in 3-Position des Saccharidrestes mit Methyliodid und Dibutyl zinnoxid, Reduktion der Nitrogruppe mittels katalytischer Hydrierung und an schließender Umsetzung mit einem Thiokohlensäurederivat wie beispielsweise Thio phosgen oder Thiocarbonyl-bisimidazol in Gegenwart einer Base wie Ethyldiiso propylamin hergestellt werden.

Für die Aktivierung der Carboxylgruppen kommen die in der Peptidchemie be kannten Kupplungsreagenzien wie sie z. B. in Jakubke/Jeschkeit: Aminosäuren, Peptide, Proteine; Verlag Chemie 1982 oder Tetrahedr. Lett. 34, 6705 (1993) beschrieben sind, in Frage. Bevorzugt sind beispielsweise N-Carbonsäureanhydride, Säurechloride oder gemischte Anhydride.

Weiterhin geeignet zur Aktivierung der Carboxylgruppen ist die Bildung von Addukten mit Carbodiimiden z. B. N,N'-Diethyl-, N,N'-Diisopropyl-, N,N'-Dicyclo hexylcarbodiimid, N-(3-Dimethylaminopropyl)-N'-ethyl-carbodiimid-Hydrochlorid, N-Cyclohexyl-N'-(2-morpholinoethyl)-carbodiimid-metho-p-toluolsulfonat oder Car bonylverbindungen wie Carbonyldiimidazol, oder 1,2-Oxazoliumverbindungen wie 2-Ethyl-5-phenyl-1,2-oxazolium-3-sulfat oder 2-tert-Butyl-5-methyl-isoxazolium perchlorat, oder Acylaminoverbindungen wie 2-Ethoxy-1-ethoxycarbonyl-1,2-di hydrochinolin, oder Propanphosphonsäureanhydrid, oder Isobutylchloroform, oder Benzotriazolyloxy-tris-(dimethylamino)-phosphonium-hexafluorophosphat, 1-Hy droxybenzotriazol- oder N-Hydroxysuccinimidester.

Weiterhin kann die Aminosäurekomponente auch in Form eines Leuchs'schen Anhydrids eingesetzt werden. Diese Art der Aminosäureaktivierung ist bevorzugt bei der Acylierung von 20(S)-Camptothecin mit Aminosäurenkomponenten.

Wie vorstehend erwähnt ist für die Kupplung der Bausteine (II) und (V) ein beson deres Kupplungsreagenz erforderlich, das aus der aus folgenden Verbindungen be stehenden Gruppe ausgewählt ist:

Besonders bevorzugt wird hierbei als Kupplungsreagenz N-[(Dimethylamino)-1H- 1,2,3-triazolo[4,5-b]pyridin-1-yl-methylen]-N-methylmethanaminiumhexafluorphos phat-N-oxid (HATU) eingesetzt:

Diese besonderen Kupplungsreagenzien sind käuflich erhältlich. Beispielsweise kann HATU von der Firma Perseptive Biosystems GmbH, Wiesbaden. Deutschland, be zogen werden.

Als Basen können bei den Einzelschritten des erfindungsgemäßen Herstellungs verfahrens beispielsweise Triethylamin, Ethyldiisopropylamin, Pyridin, N,N-Di methylaminopyridin oder andere in derartigen Schritten herkömmlich verwendete Basen eingesetzt werden.

Als Schutzgruppen für Drittfunktionen der Aminosäuren können die in der Peptid chemie bekannten Schutzgruppen beispielsweise vom Urethan-, Alkyl-, Acyl-, Ester- oder Amid-Typ eingesetzt werden.

Aminoschutzgruppen im Rahmen der Erfindung sind die üblichen in der Peptid- Chemie verwendeten Aminoschutzgruppen.

Hierzu gehören bevorzugt: Benzyloxycarbonyl, 3,4-Dimethoxybenzyloxycarbonyl, 3,5-Dimethoxybenzyloxycarbonyl, 2,4-Dimethoxybenzyloxycarbonyl, 4-Methoxy benzyloxycarbonyl, 4-Nitrobenzyloxycarbonyl, 2-Nitrobenzyloxycarbonyl, 2-Nitro- 4,5-dimethoxybenzyloxycarbonyl, Methoxycarbonyl, Ethoxycarbonyl, tert-Butoxy carbonyl (Boc), Allyloxycarbonyl, Vinyloxycarbonyl, 3,4,5-Trimethoxybenzyloxy carbonyl, Phthaloyl, 2,2,2-Trichlorethoxycarbonyl, 2,2,2-Trichlor-tert-butoxy carbonyl, Menthyloxycarbonyl, 4-Nitrophenoxycarbonyl, Fluorenyl-9-methoxy carbonyl (Fmoc), Formyl, Acetyl, Propionyl, Pivaloyl, 2-Chloracetyl, 2-Bromacetyl, 2,2,2-Trifluoracetyl, 2,2,2-Trichloracetyl, Benzoyl, Benzyl, 4-Chlorbenzoyl, 4-Brom benzoyl, 4-Nitrobenzoyl, Phthalimido, Isovaleroyl oder Benzyloxymethylen, 4-Nitro benzyl, 2,4-Dinitrobenzyl, 4-Nitrophenyl oder 2-Nitrophenylsulfenyl. Besonders bevorzugt sind die Fmoc-Gruppe und die Boc-Gruppe.

Die Abspaltung von Schutzgruppen in entsprechenden Reaktionsschritten kann zum Beispiel durch Säure- oder Base-Einwirkung, hydrogenolytisch oder auf andere Weise reduktiv erfolgen.

Der als Ausgangsverbindung verwendete Camptothecin-Baustein kann in der 20(R)- oder in der 20(S)-Konfiguration oder als Gemisch dieser beiden steroisomeren Formen vorliegen. Bevorzugt ist die 20(S)-Konfiguration.

Die beim erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Aminosäuren können in der L- oder in der D-Konfiguration auftreten oder auch als Gemisch von D- und L-Form.

Der Begriff "Aminosäuren" bezeichnet erfindungsgemäß insbesondere die in der Natur vorkommenden α-Aminosäuren, umfaßt darüber hinaus aber auch deren Homologe, Isomere und Derivate. Als Beispiel für Isomere können Enantiomere genannt werden. Derivate können beispielsweise mit Schutzgruppen versehene Aminosäuren sein.

Unter Aminosäuren mit "sterisch anspruchsvollen" Seitenketten werden solche Aminosäuren verstanden, deren Seitenkette in der β- oder γ-Position eine Verzwei gung aufweist; als Beispiele seien Valin und Isoleucin bzw. Leucin genannt.

Als typische Beispiele für Aminosäuren mit unpolaren Seitenketten seien genannt: Alanin, Valin, Leucin, Isoleucin, Prolin, Tryptophan, Phenylalanin, Methionin.

Als typische Beispiele für Aminosäure mit basischen Seitenketten seien genannt: Lysin, Arginin, Histidin, Ornithin, Diaminobuttersäure.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen liegen bevorzugt in Form ihrer Salze vor. Im allgemeinen seien hier Salze mit organischen oder anorganischen Säuren genannt. Diese Salze können durch Umsetzung der freien Verbindungen der Formel (I) mit organischen oder anorganischen Säuren hergestellt werden. Als Säuren kommen hierbei erfindungsgemäß vorzugsweise Halogenwasserstoffsäuren, wie z. B. die Chlorwasserstoffsäure und die Bromwasserstoffsäure, insbesondere die Chlorwasser stoffsäure, ferner Phosphorsäure, Salpetersäure, Schwefelsäure, mono- und bifunk tionelle Carbonsäuren und Hydroxycarbonsäuren, wie z. B. Essigsäure, Trifluor essigsäure, Maleinsäure, Malonsäure, Oxalsäure, Gluconsäure, Bernsteinsäure, Fumarsäure, Weinsäure, Zitronensäure, Salizylsäure, Sorbinsäure und Milchsäure sowie Sulfonsäuren, wie z. B. p-Toluolsulfonsäure, 1,5-Naphthalindisulfonsäure oder Camphersulfonsäure in Frage.

Die vorliegende Erfindung wird nachstehend anhand von nicht einschränkenden Bei spielen und Vergleichsbeispielen veranschaulicht.

Beispiele

Bei den nachstehenden Beispielen beziehen sich alle Mengenangaben, soweit nicht anders angegeben, auf Gewichtsprozente.

1. Herstellung des Bausteins (V)

1a) p-Aminophenyl-3-O-methyl-β-L-fucopyranosid

6 g (21 mmol) p-Nitrophenyl-β-L-fucopyranosid in 300 ml absol. Methanol werden mit 7,84 g (31,5 mmol) Dibutylzinnoxid versetzt und 2 h unter Rückfluß erhitzt. Anschließend wird eingeengt, der Rückstand getrocknet und dann in 300 ml DMF aufgenommen. Nach Zugabe von 15,7 ml Methyliodid wird der Ansatz 40 h bei 70°C gerührt. Das Lösungsmittel wird im Vakuum entfernt und der Rückstand in 300 ml Dichlormethan aufgenommen. Die Suspension wird filtriert, die verbleibende Lösung erneut eingeengt und einer Flash-Chromatographie (Dichlormethan/Methanol 99 : 1) unterzogen. Nach Einengen erhält man 3,82 g (83%) des Zielproduktes.

3,81 g (12,73 mmol) des so erhaltenen p-Nitrophenyl-3-O-methylß-L-fucopyrano sids werden in Methanol gelöst und nach Zusatz von Palladium auf Aktivkohle (10%) in einer Wasserstoffatmosphäre bei geringem Überdruck hydriert. Nach Abfiltrieren des Katalysators und Fällen mit Ether erhält man 3 g (88%) des Zielprodukts. [DC: Dichlormethan/Methanol 9 : 1 R_f = 0,53].

1b) p-Isothiocyanatophenyl-3-O-methyl-β-L-fucopyranosid (IV)

Eine Lösung des nach 1a) erhaltenen 6,8 g (25,3 mmol) p-Aminophenyl-3-O-methyl β-L-fucopyranosids in 600 ml Dioxan/Wasser 1 : 1 wird unter Rühren mit 2,72 ml Thiophosgen (1,4 Äq.) versetzt. Nach 10 min. versetzt man mit 26 ml Ethyl diisopropylamin, rührt weitere 5 min bei RT und engt anschließend im Vakuum auf ein Volumen von 150 ml ein. Man setzt 800 ml Dichlormethan zu und trennt die Phasen. Die organische Phase wird zweimal mit Wasser gewaschen, über Natrium sulfat getrocknet und eingeengt. Der Rückstand wird mit 200 ml Methyl-tert.- butylether und 200 ml Petrolether verrührt und abgesaugt. Man erhält 7,26 g (92%) des Isothiocyanats.

1c) N^α-(4-(3-O-Methyl-β-L-fucopyranosyl-oxy)-phenylamino-thiocarbonyl]-L-histi din (V)

Eine Lösung von 10 g (0,0321 mol) des unter 1b) erhaltenen Isothiocyanats und 4,98 g (0,0321 mol) L-Histidin werden in 400 ml Dioxan/Wasser 1 : 1 suspendiert und mit 11 ml N-Ethyldiisopropylamin versetzt. Man rührt für 16 h bei Raumtemperatur, engt dann im Vakuum ein und redestilliert mit Dichlormethan/Methanol 1 : 1. Das Rohprodukt wird in 200 ml Methanol gelöst und in 1 L Methyl-t-butylether (MTBE) getropft. Der Rückstand wird abfiltriert, mit MTBE gewaschen und im Vakuum getrocknet. Man erhält das Zielprodukt in einer Ausbeute von 95% [DC: Aceto nitril/Wasser/Eisessig 5 : 1 : 0,2 R_f = 0,14].

2. Herstellung des Bausteins (II)

2a) 20(S)-20-O-[N-(tert-Butoxycarbonyl)-L/D-valyl]-camptothecin

Eine Suspension von 10 g (28,7 mmol) 20(S)-Camptothecin in 500 ml absolutem Dichlormethan wird unter Rühren mit 14 g (2 Äquivalenten) N-(tert-Butoxy-car bonyl)-valin-N-carbonsäureanhydrid sowie 1 g 4-(N,N-Dimethylamino)-pyridin ver setzt. Nach 4 Tagen Erhitzen unter Rückfluß wird im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wird mit 100 ml MTBE für 20 Minuten verrührt. Man setzt dann 200 ml Petrolether zu und filtriert. Man erhält 14,9 g (95%) der Zielverbindung. [DC: Acetonitril R_f = 0,34].

2b) 20(S)-20-O-L-Valylcamptothecin, Trifluoracetat (II)

Eine Lösung von Verbindung 2a (11,65 g, 21 mmol) in einer Mischung aus 300 ml Dichlormethan und 70 ml wasserfreier Trifluoressigsäure wird für 1 h bei 5°C gerührt. Nach Einengen im Vakuum auf ein kleines Volumen wird das Produkt mit Diethylether ausgefällt und gründlich mit Diethylether gewaschen. Das Produkt wird nochmals aus Dichlormethan/Methanol mit Diethylether gefällt. Gegebenenfalls wird das Rohprodukt nochmals in 40 ml Methanol aufgenommen, mit 120 ml Methyl-t butylether versetzt und auf 0°C abgekühlt. Der Niederschlag wird abfiltriert, und man erhält 9,4 g (80%) der gewünschten Verbindung [DC: Acetonitril/Wasser 20 : 1 R_f = 0,39].

3. Synthese der Verbindung (I)

3a) 20(S)-20-O{-N^α-[4-(3-O-Methyl-β-L-fucopyranosyl-oxy)-phenylamino-thiocar bonyl]-L-histidyl-L-valyl}-camptothecin

1,04 g (1,96 mmol) N^α-[4-(3-O-Methyl-β-L-fucopyranosyl-oxy)-phenylamino-thio carbonyl]-L-histidin (V, Beispiel 1) und 1 g (1,78 mmol) 20(S)-20-O-L-Valyl camptothecin Trifluoracetat (II, Beispiel 2) werden in 35 ml Dimethylformamid gelöst, die Mischung auf 0°C abgekühlt und anschließend mit 1,35 g (3,56 mmol) N- [(Dimethylamino)-1H-1,2,3-triazolo[4,5-b]pyridin-1-yl-methylen]-N-methylmethan aminiumhexafluorphosphat-N-oxid (HATU) und 616 µl N-Ethyldiisopropylamin versetzt. Man läßt über Nacht bei 0°C rühren. Die Mischung wird dann in 400 ml MTBE getropft, der Rückstand abfiltriert und anschließend in 100 ml Methanol und 5 ml DMF aufgenommen. 3 ml einer 17%igen wäßrigen Ammoniak-Lösung werden zugegeben und die Mischung 10 Minuten gerührt. Anschließend wird die Mischung in 500 ml MTBE getropft. Der Rückstand wird abfiltriert, anschließend mit MTBE gewaschen und dann mit 25 ml Wasser verrührt. Nach 15 Minuten wird der Rück stand erneut gesammelt und über Nacht getrocknet. Das so erhaltene Rohprodukt besteht im wesentlichen aus einem Diastereomerengemisch (L-Histidin- und D- Histidin-Epimer der Zielverbindung). Die Abtrennung des als Nebenprodukt erhaltenen D-Histidin-Epimers erfolgt durch Verrühren des Rohproduktes mit 35 ml Methanol für 2 Stunden. Anschließend wird der Niederschlag abfiltriert und noch zweimal dieser Reinigungsoperation unterzogen. Man erhält so 819 mg (51%) des diastereomerenreinen Zielproduktes [DC: Acetonitril/Wasser/Eisessig 5 : 1 : 0,2 R_f = 0,38].

3b) 20(S)-20-O-{N^α-[4-(3-O-Methyl-β-L-fucopyranosyl-oxy)-phenylamino-thiocar bonyl]-L-histidyl-L-valyl}-camptothecin, Hydrochlorid

806 mg (0,9 mmol) der Verbindung aus Beispiel 3a werden in 40 ml Wasser suspendiert und mit 0,86 ml (0,95 Eq) einer 1M-Salzsäurelösung in das Hydrochlorid überführt. Unter Rühren entsteht eine Lösung, die anschließend lyophilisiert wird. Man erhält so 814 mg (97%) der Zielverbindung [DC: Acetonitril/Wasser 10 : 1, R_f = 0,15, [a] 22|D = -37,6° (c = 0,21 DMF)].].

Claims

1. Verfahren zur Herstellung von Verbindungen der Formel (I),
worin
R¹ für eine sterisch anspuchsvolle unpolare Seitenkette einer Aminosäure steht und
R² für eine basische Seitenkette einer Aminosäure steht,
bei dem man das Isothiocyanat der Formel (IV)
mit einer gegebenenfalls geschützten terminalen basischen Aminosäure
worin R² die vorstehend angegebene Bedeutung hat,
zu einem Aminosäurekonjugat der Formel (V) umsetzt,
worin R² die vorstehend angegebene Bedeutung hat, dieses dann mit Aminosäurekonjugaten der Formel (II) umsetzt,
worin R¹ die vorstehend angegebene Bedeutung hat, die Seiten kettenschutzgruppe abspaltet und die Verbindungen gegebenenfalls in ein geeignetes Salz überführt,
dadurch gekennzeichnet, daß die Kupplung der Bausteine (II) und (V) in Gegenwart eines Kupplungsreagenzes durchgeführt wird, daß aus der aus folgenden Verbindungen bestehenden Gruppe ausgewählt ist:

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Kupplung der Bausteine (II) und (V) in Gegenwart von N-[(Dimethylamino)-1H-1,2,3- triazolo[4,5-b]pyridin-1-yl-methylen]-N-methylmethanaminiumhexafluor phosphat-N-oxid (HATU)
durchgeführt wird.

3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß Aminosäuren verwendet werden, bei denen
R¹ für einen verzweigten Alkylrest mit bis zu 4 Kohlenstoffatomen steht und
R² für einen Rest der Formel -(CH₂)_n-R³ steht, wobei
R³ -NH₂,
bedeutet und
n für eine Zahl 1 bis 4 steht.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß Aminosäuren verwendet werden, bei denen
R¹ für einen verzweigten Alkylrest der Formeln
steht und
R² für einen Rest der Formeln

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Isothiocyanat der Formel (IV) mit gegebenenfalls geschütztem Lysin oder Histdin umgesetzt wird.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Isothiocyanat der Formel (IV) mit ungeschütztem Histdin umgesetzt wird.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß das Camptothecin mit gegebenenfalls geschütztem Valin umgesetzt wird.