DE19838535A1

DE19838535A1 - Verfahren zur Herstellung von teilchenförmigen Immobilisaten

Info

Publication number: DE19838535A1
Application number: DE19838535A
Authority: DE
Inventors: Heiko Thielking; Stefan Michel; Helmut Brod; Bernd Klinksiek
Original assignee: Wolff Walsrode AG
Current assignee: Dow Produktions und Vertriebs GmbH and Co OHG
Priority date: 1998-08-25
Filing date: 1998-08-25
Publication date: 2000-03-02
Also published as: AU5622199A; EP1105211A1; WO2000010700A1

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von teilchenförmigen Immobilisaten eines Substrats in einem Trägermaterial, bei dem Substrat und Trägermaterial ein mittel- bis hochviskoses und gegebenenfalls viskoelastisches Gemisch bilden und bei dem die Struktur des Immobilisates erst nach Herstellung des Gemischs aus Trägermaterial und Substrat in einem flüssigen Medium fixiert wird.

Description

Die Herstellung von Immobilisaten, d. h. die Fixierung von (wirksamen) Substraten in verteilter Form in einer Matrix oder Hülle aus einem Trägermaterial, hat in den letzten 30 Jahren insbesondere im Bereich der Biotechnologie immer mehr an Bedeutung gewonnen. Es wurden unterschiedlichste Systeme und Verfahren entwickelt, welche die Immobilisierung von z. B. Enzymen, Nutzorganismen, Saatgut oder Zellkulturen im Labormaßstab ermöglichen. Ähnliche Lösungswege wurden für die Immobilisierung von chemischen Wirk-, Duft- und Farbstoffe, Katalysatoren, Adsorbern und anderen Substraten für technische Anwendungen beschritten.

In den meisten Forschungsarbeiten steht die chemische Zusammensetzung des Immobilisates und die zu erzielende Eigenschaft im Vordergrund nicht jedoch die technische Realisierung der Herstellung solcher Immobilisate insbesondere in größe ren Mengen. Im allgemeinen wird das zu immobilisierende Substrat in das Trägerma terial eingebracht und mit diesem in einzelne Portionen zerteilt. Die meisten Laborverfahren für Immobilisate, deren Struktur in einem flüssigen Medium fixiert wird, beruhen auf einer Zerteilung mittels Schwerkraft, Zentrifugalkraft, schwingungsinduzierter Tröpfchenbildung oder Zerteilung mittels einer mechanischen Vorrichtung. Anschließend durchfallen die Portionen eine gewisse Strecke, die es ihnen ermöglicht eine Kugelform anzunehmen, bevor sie in das fixierende flüssige Medium (z. B. Fällbad) gelangen.

In dem UK-Patent 2135954 wird das Abtropfen einer polyanionische Lösung über eine Fallhöhe von einigen Zentimetern in eine entgegengesetzt geladenen polykationische Lösung beschrieben.

In dem US-Patent 4744933 wird ein Verfahren beschrieben, bei dem eine polyanioni sche Lösung in eine entgegengesetzt geladenen Polymerlösung gesprüht wird um dort Komplexkoazervate zu bilden.

In der Patentschrift DE 44 24 998 ist ein Verfahren beansprucht, bei dem ein Flüssig keitsstrahl in Abschnitte zerteilt wird, die sich in ihre ursprünglich Richtung weiterbewegen und erst nach einem gewissen Abstand auf die zur Aushärtung benötigte Umgebung treffen.

Es wird deutlich, daß alle diese Verfahren geeignet sind, um kleinere Mengen nie drigviskoser Lösungen zu zerteilen und die nach einer definierten Flugzeit entstehen den tröpfchenförmigen Teilchen in eine zur Fixierung geeignete Flüssigkeit eintreten zu lassen.

Jedoch sind diese Verfahren für höherviskose und gegebenenfalls viskoelastische Systeme ungeeignet; da die Tropfenbildung stark verzögert oder gar nicht eintritt, so daß die entstehenden Teilchen keine einheitliche Struktur haben und ggf. sogar Agglomerate bilden, bzw., wenn ein Strahl geformt und mechanisch zerteilt wird, nach der Zerteilung die ursprüngliche Bewegungsrichtung nicht beibehalten werden kann. Auch wird mit zunehmender Elastizität der zur Bildung tröpfchenförmiger Teilchen erforderliche Abstand zwischen dem zerteilenden Aggregat und der zur Fixierung benötigten Flüssigkeit größer. Damit wird die praktische Realisierung eines gleichmäßigen und reproduzierbar herstellbaren teilchenförmigen Immobilisats mit zunehmender Viskosität oder Viskoelastizität schwieriger.

Zur Herstellung von teilchenförmigen Immobilisaten wird daher ein Verfahren benö tigt, daß die Einbringung eines zu irrmobilisierenden Substrats in ein Trägermaterial unter Bildung eines mittel- bis hochviskosen und gegebenenfalls viskoelastischen Gemisches und die Zerteilung des Gemisches unter Fixierung des Immobilisates in einem flüssigen Medium in reproduzierbarer Weise und für größere Mengen ermög licht.

Überraschenderweise läßt sich diese Aufgabe lösen, wenn das im folgenden beschrie bene, erfindungsgemäße Verfahren angewendet wird:

In das Trägermaterial, welches allein in niedrigviskoser oder vorzugsweise bereits in mittel- bis hochviskoser und gegebenenfalls viskoelastischer Form vorliegen kann, wird mittels handelsüblicher Misch- oder Rühraggregate das zu immobilisierende Substrat eingemischt. Bei dem Trägermaterial handelt es sich vorzugsweise um ein natürliches oder synthetisches Polymer, insbesondere um ein Polymer, das eine Car boxylat-, Sulfat- oder Sulfoalkylgruppe enthält, insbesondere ein Derivat der Cellu lose, wobei ein Polymer aus der Gruppe Carboxymethylcellulose, Sulfoethylcellulose, Sulfopropylcellulose, Cellulosesulfat, Methylsulfoethylcellulose, Carboxymethylsulfoethylcellulose, Hydroxyethylsulfoethylcellulose, Hydroxyethylcarboxymethylcellulose ganz besonders geeignet ist, ein anionisches Derivat des Alginats oder des Chitins. Auch Polymere mit einer kationische Funktionalität wie insbesondere Polydiallyldimethylammoniumchlorid, Poly(N,N- dimethyl-3,5-dimethylenpiperidiniumchlorid oder ein kationisches Derivat des Chitins (z. B. Chitosan) können eingesetzt werden. Das Trägermaterial wird bevorzugt in Form einer Schmelze, eines Gels, einer Suspension oder insbesondere einer Lösung eingesetzt. Dabei ist das erfindungsgemäße Verfahren insbesondere dann im Vergleich zu anderen Verfahren nach dem Stand der Technik vorteilhaft, wenn die Viskosität des Trägermaterials so eingestellt wird, daß die Viskosität der Mischung aus Trägermaterial und Substrat mindestens 1 Pa.s bei einer Schergeschwindigkeit von 2,5 s^-1, insbesondere mehr als 100 Pa.s bei einer Schergeschwindigkeit von 2,5 s^-1 beträgt.

Die entstandene Mischung wird anschließend durch einen geeigneten Auslaß, vor zugsweise eine Loch- oder Düsenplatte, als ein Strang oder vorzugsweise mehrere Stränge in das zur Fixierung dienende flüssige Medium gepreßt. Hierfür kann z. B. ein Extruder oder eine Zahnradpumpe verwandt werden. Unmittelbar hinter der Austrittsseite des Auslasses wird der Strang mittels einer geeigneten Schneidvorrichtung, vorzugsweise einem oder mehrerer Schneidmessers in einzelne Portionen zerteilt. Dabei wird die gesamte Schneidvorrichtung von dem zur Fixierung dienenden flüssigen Medium umströmt, so daß an der Oberfläche der einzelnen Portionen sofort die Fixierung einsetzen kann und eine weitere Verformung oder Agglomerierung während der weiteren Fortbewegung vermieden wird. Geeignete technische Ausgestaltungen von Auslaß und Schneidvorrichtung sind beispielsweise aus Vorrichtungen für die Unterwassergranulierung von Polymeren bekannt.

Die entstehenden teilchenförmigen Immobilisate werden von dem Strom des flüssigen Mediums abtransportiert. Die benötigte Reaktionszeit für die Fixierung läßt sich über die Verweilzeit in dem zur Fixierung dienenden flüssigen Medium steuern. Bei dem zur Fixierung dienenden flüssigen Medium handelt es sich vorzugsweise um eine Flüssigkeit, insbesondere eine Lösung, die aufgrund ihrer Zusammensetzung und/oder Temperatur eine physikalische oder bevorzugt chemische Fixierung des Immobilisates bewirkt. Besonders bevorzugt ist die Verwendung einer wäßrigen Lösung. Bevorzugte physikalische Fixierungsverfahren sind die Erstarrung, die Gelierung und insbesondere die Fällung, bevorzugtes chemisches Fixierungsverfahren ist die Vernetzung durch Reaktion mit einem die Vernetzung des Trägermaterials bewirkenden Reagenz. Bevorzugte Beispiele für Vernetzer, mit den sich nach dem erfindungsgemäßen Verfahren unter Einsatz eines geeigneten Träger/Substratssystems teilchenförmige Immobilisate herstellen lassen, sind Lösungen kationischer Polymere wie Polydiallyldimethylammoniumchlorid und kationische Derivate des Chitins (z. B. Chitosan), aber auch niedermolekulare Amine (z. B. Triethylamin) und Salze (z. B. CaCl₂, AlCl₃). Besonders bevorzugte Trägermaterial/Vernetzer-Kombinationen sind AlCl₃/Carboxymethylcellulose, Alginat/CaCl₂, Benzylmethylamoniumbromid/Carboxymethylcellulose, CaCl₂/Al ginat, Cellulosesulfat/Triethylamin, Cellulosesulfat/Poly diallyldimethylammoniumchlorid, Chitosan/Sulfoethylcellulose, Methylsulfoethylcellulose/Polyethylenimin, Polydiallyldimethylammoniumchlorid/Sulfo ethylcellulose, Polydiallyldimethylammoniumchlorid/Cellulosesulfat, Poly(N,N-dimethyl-3,5-dimethylenpiperidiniumchlorid)/Hydroxy ethylsulfoethylcellulose, insbesondere Hydroxyethylsulfoethylcellulose/Poly (N,N-dimethyl-3,5-dimethylenpiperidiniumchlorid), Sulfoethylcellulose/ Chitosan, Carboxymethylcellulose/AlCl₃, Carboxymethylcellulose/ Benzylmethylamoniumbromid und ganz besonders bevorzugt Sulfoethylcellulose/ Polydiallyldimethylammoniumchlorid

Die teilchenförmigen Immobilisate werden anschließend mit üblichen Methoden von dem zur Fixierung dienenden flüssigen Medium abgetrennt und können gegebenenfalls gewaschen und anschließend getrocknet werden.

Beispiel (Immobilisat mit Proteinmischung)

Eine Sulfoethylcellulose, die einen durchschnittlichen Substitutionsgrad von DS = 0,35 und eine Grenzviskositätszahl [η] = 432 ml/g bei einer mittleren Molmasse von 5,5.10⁵ g/mol aufwies, wurde im Verhältnis 1 : 5 mit Maiskleber als Beispiel einer zu immobilisierenden Proteinmischung vermengt und mittels eines Extruders (Misch- und Knetbesatz mit zwei Knetzonen, Wasserkühlung) so mit Wasser vermischt, daß eine pastenartige, viskose Mischung mit einem Feststoffanteil von 46% resultierte. Diese pastenartige Mischung wurde mittels des Extruders bei einem Druck von 13,5 bar direkt durch eine Lochplatte mit einer 5 mm Bohrung in eine Vernetzerlösung gedrückt und unmittelbar hinter der Bohrung von Hand mit einem mechanischen Messer in Abschnitte von 5 mm portioniert. Als Vernetzerlösung wurde eine 8%ige wäßrige Lösung eines Polydiallyldimethylammoniumchlorids mit einer mittleren Molmasse von 100 000 g/mol eingesetzt. Die Verweilzeit in der Vernetzerlösung wurde auf 10 min eingestellt. Die Immobilisate wurden über ein Sieb abgetrennt und vor der Trocknung auf dem Sieb zweimal mit reinem Wasser gewaschen. Es wurden gleichmäßige, stabile Immobilisate von gelber Farbe erhalten.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung von teilchenförmigen Immobilisaten eines Substrats in einem Trägermaterial, bei dem Substrat und Trägermaterial ein mittel- bis hochviskoses und gegebenenfalls viskoelastisches Gemisch bilden und bei dem die Struktur des Immobilisates erst nach Herstellung des Gemischs aus Trägermaterial und Substrat in einem flüssigen Medium fixiert wird, dadurch gekennzeichnet, daß das zuvor hergestellte Gemisch aus Trägermaterial und Substrat durch einen geeigneten Auslaß als ein Strang oder mehrere Stränge in das zur Fixierung dienende flüssige Medium gepreßt und unmittelbar hinter der Austrittsseite des Auslasses mittels einer Schneidvorrichtung in einzelne Portionen zerteilt wird, wobei die gesamte Schneidvorrichtung von dem zur Fixierung dienenden flüssigen Medium umströmt wird.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Mischung aus Substrat und Trägermaterial eine Viskosität von mindestens 1 Pa.s bei einer Schergeschwindigkeit von 2,5 s^-1 aufweist.

3. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Auslaß um eine Loch- oder Düsenplatte und bei der Schneidvorrichtung um ein oder mehrere Messer handelt.

4. Verfahren gemäß einem der Anspüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem zur Fixierung dienenden flüssigen Medium um eine Flüssigkeit handelt.

5. Verfahren gemäß einem der Anspüche 1 bis 4 dadurch gekennzeichnet, daß die Schneidvorrichtung von dem zur Fixierung dienenden flüssigen Medium umströmt wird und die teilchenförmigen Immobilisate von diesem abtransportiert werden.

6. Verfahren gemäß einem der Anspüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Trägermaterial um ein natürliches oder synthetisches Polymer, vorzugsweise in Form einer Schmelze, eines Gels, einer Suspension oder insbesondere einer Lösung handelt.

7. Verfahren gemäß einem der Anspüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem zur Fixierung dienenden Medium um eine Lösung eines die Vernetzung des Trägermaterials bewirkenden Reagenz handelt.

8. Verfahren gemäß einem der Anspüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem zur Fixierung dienenden Medium um eine Lösung eines die Fällung oder Gelierung des Trägermaterials bewirkenden Reagenz handelt.