DE1598818A1

DE1598818A1 - Trockene Indikatorzubereitung zur Bestimmung von Protein in Fluessigkeiten

Info

Publication number: DE1598818A1
Application number: DE19661598818
Authority: DE
Inventors: Atkinson Roger Lee; Fader Marshall Lloyd
Original assignee: Miles Laboratories Inc
Current assignee: Bayer Corp
Priority date: 1965-10-01
Filing date: 1966-09-30
Publication date: 1970-04-16
Also published as: CH500487A; US3438737A; SE334758B; BE696319A; FR1515793A; GB1150296A

Description

frookene Indikatorzubereitung gur Bestimmung τοη Protein in flüssigkeiten.

Die Erfindung betrifft eine Zubereitung für qualitative und quantitative Bestimmungen τοη proteinartigen Substan«en in Flüssigkeiten, insbesondere τοη Albuminen in biologischen Flüssigkeiten. In einer besonderen Ausführungeform betrifft die Erfindung ein Diagnoatiaiermittel, das durch franken von saugfähigen Trägermaterialien mit dieser Zubereitung erhalten wurde.

Unter dem im Folgenden Terwendeten Begriff "Bestimmung" soll sowohl die quantitative Bestimmung als auch der qualitative nachweis verstanden werden.

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- 2 Die Bestimmung von wasserlöslichen proteinartigen

Substanzen in verschiedenen Flüssigkeiten 1st von besonderer Bedeutung für die überprüfung des menschlichen Gesundheitszustandea. So zeigt beispielsweise das Vorhandensein von Albumin im menschlichen Urin einen kranken oder traumatischen Zustand an· Aus diesem Grunde liegen zahlreiche Bestimmungsmethoden für solohe proteinartige Substanzen vor· Allerdinge sind diese Im allgemeinen sehr langwierig, machen eine uiafangreiohe LaborausrUstung und die Anstellung geschulten Personals notwendig· Wenn es nötig ist, in kurzer Zeit eine relativ große Anzahl solcher Bestimmungen durchzuführen, so machen die verhältnismäßig umständlichen bisher bekannten Beotimmungsisethoden eine entsprechend große Anzahl von Analytikern (Personal) erforderlich, wenn die Ergebnisse innerhalb brauchbarer Zelt erhalten werden sollen·

Ua diese Schwierigkeiten zu umgehen, wurden in neuerer Zeit Beatirnntungsmethoden entwickelt, die auch von ungeeohultem Personal durchgeführt werden können und nur geringeren apparativen Aufwand erfordert· Diese Beetimnmngsraathoden beruhen darauf, daß viele pH-Farbindikatoren in Gegenwart von Proteinen bei einem anderen pH-Wert umschlagen, also einen höheren bzw. niedrigeren pH-Wert vortSusohen· Das Kaß, In dem der Uinsohlagspunkt des Indikators gegenüber dem normalen Vert verschoben wird, ist ein KaS für die Menge an Protein in der Lüaung. Im

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Folgenden soll diese Blgonachaft vieler Farbindikationen ale Proteinfei&er te zeichnet werden. Bei den Diagnostizieralttein bzw. Beetiima&ngeverfahren, die auf dem Proteinfeliler beruhen, werden entsprechende Farbindikatoren verwendet und ein Puffer, der die unmittelbare Umgebung dee Indikators «of einem bestiawten pH-Wert halt. Dieser pH-Wert wurde bisher unmittelbar angrenzend, aber außerhalb de« Bereiches eingestellt, In dem der Indikator normalerweise umschlägt. Spricht beispielsweise der Indikator la pH-Bereloh zwischen 3,0 und 4,5 an, eo wurde im Falle dee Protein-Diaßnoetisiermittela der Indikator im allgemeinen auf eine® pü-Werfc von 3»0 oder etwas unterhalb gepuffert·

Für die Herstellung eines Magnoatizierxaittele, das leicht ssu handhaben, gut lagerfähig und wirtschaftlich herstellbar iat, zieht man es vor, die Zubereitung, im folgenden meist eXa Beagenagetaiach besolohnet, auf ein Trägertaaterial aufzubringen· Ia allgemeinen wird ein absorbierendes, bsw. saugfähigea Material, wie Filterpapier, üolz, faeerige synthetische ilaterlallen und dergleichen, verwendet· Der träger kann mit dem Heagensgemisch getränkt oder beschichtet werden, und diese Kombination kann als oelcne oder mit einer zuetitzlichen Stilt aunt erläge versehen benutzt werden. Bai den bekannten Heagenzgeaiaohen bzw. Bestisnungsverfahren für Proteine in 1st daa Ansprechen auf den Proteingehalt

009116/0174 QRtGHPiAl

Insofern begrenzt, als die maximale Sensibilität dee speziellen Indikator*» nicht erreicht wird, die erzeugten Farben schwach sind und es folglich sehr schwierig ist, den Gehalt an vorhandenem Protein viouell zu aohfitsen· Dies trifft vor allem dann zu, wenn ein saugf&higes Trilgeroaterial verwandet wird und der Trliger aus Gründen der Wirt schaft lichko it und Herstellung sehr dünn iat und die entsprechende Kenge an enthaltendem Tteagcnagomisoh dementsprechend gering ist. Abgesehen davon vollziehen sich eolohe Farbwechsel im allgemeinen eher im 'Jinne einer Farbtiafe als la Sinne eines Farbtoneο und sind daher schwierig abzuoohUtaen.

ßie boiden Begriffe Farbtiefe und Farbton aollen kurs erläutert werdon. Unter Farbton wird die Farbqualltitt verstanden, wechselt also beispielsweise die Parbo von gelb nach grün, so handelt es sich um einen '.-«'eoirsol im Farbton« Unter Parbtiefe soll die StSrke eines bestisaaten Farbtones verstanden werden, beinpielsweise iat ein Wechsel von einem hellen Weinrot zu einezc tiofon Velnrot ein V/echsol in der Farbtiefe·

Ee ist ein Ziel der vorliegenden iirfindung, ein verbessertes hochempfindliches Heagenagoniiach zur Bestimmung proteinartiger iJubatansen in Flüssigkeiten herzustollen.

rad 00 9816/0974 ^B

Dieses Reagenzgemisch, soll ein starkes ohromogenes Ansprechvermögen auf vorhandene Proteine zeigen, und zwar einen starken Wechsel im Farbton in Abhängigkeit von der vorhandenen Proteinmenge. Weiteres Ziel der Erfindung ist es, dieses Reaganζgemisch mit einem saugfähigen Trägermaterial zu kombinieren.

Wild der pH-Wert des Reagenzgemisohes bei einem pH-Wert gepuffert, der innerhalb und vorzugsweise nahe beim Umschlagspunkt des Indikators liegt, erhält man ein hochempfindliches Protein-Bestimmungsreagenz. Verwendet man beispielsweise einen Farbindikator, dessen ümschlagsbereioh normalerweise zwischen pH 3,0 und pH 4,5 liegt, so wird das Reagenzgemisch vorzugsweise bei einem pH- zwischen 3,5 und 4,0 gepuffert.

Es ist darauf hinzuweisem, daß die tatsächlichen Parbumsohlagsbereiche im falle bestimmter Indikatoren beträchtlich von der Art des gewählten Lösungsmittels abhängen können, außerdem von den Beieuchtungsbedingungen, der Reinheit des Indikators, der subjektiven Beobachtung des Farbweohsels, den Konzentrationen, Salzeffekten des Puffers, Zusätzen von oberflächenaktiven Mitteln usw. Dementsprechend ist es möglich, daß die angegebenen normalen Umsohlagsbereiche eines Indikators beträchtlich abweichen können von den speziellen Versucheergebnieeen eines einzelnem Unterauchera. lie feststellung solcher Unterschiede

§0981S/Ql74

bedeutet nicht, daß Abweichungen von den hier angegebenen Bereichen eines speziellen Indikatorsystems bedingen, daß dieses außerhalb des Anwendungsbereiches der vorliegenden Erfindung liegt. Hier wird lediglich gezeigt, daß die festgesetzten Bereiche unter Anwendung der speziellen Bestimmungsbedingungen und der speziellen angegebenen Indikatoreigenschaften erhalten wurden. Dementsprechend kann der normale pH-Farbwechselbereich eines Indikators als derjenige pH-Bereich definiert werden, bei der die Indikatorsubstanz von einem stationären sauren Farbton zu einem stationären basischen Farbton unter Anwendung der bestimmten Versuchsbedingungen wechselt. Unter dem Begriff "stationärer" Farbton wird verstanden, daß der Zusatz weiterer Säure bzw. Base zu einer bestimmten Indikatorlösung den Farbton nicht ändert. Als saurer Farbton wird derjenige bezeichnet, der bei einem pH-Wert unterhalb des pH-Umsohlagsbereiches vorhanden ist, als basischer Farbton derjenige,- den der Indikator zeigt, wenn der pH-Wert der Indikatorlöeung oberhalb des pH-Umschlagbereiches liegt Diese Definitionen sind also unabhängig davon, ob der pH-Wert oberhalb oder unterhalb pH 7 liegt.

• Es konnte nun festgestellt werden, daß bei einer Indikator sub er ei tung, bestehend aus einem Träger, der mit einem Farbindikator und einem Puffer imprägniert ist, wobei der Puffer bei Berührung mit der Untersuchungsflüssigkeit einen pH-Wert einstellt, der innerhalb des normalen pH-Umsohlag-

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Fl V « Il ι ill ϊ I U ¹J

bereichs des Farbindikators liegt} dadurch eine Verbesserung erreicht werden kann, wenn erfindungsgemäß noch ein Grundfarbstoff vorhanden ist, dessen Farbton dem des Indikator· vor dem Ansprechen auf Protein entspricht.

Diese Grundfarbe dient einmal dazu, geringe Farbänderungen, die der Indikator durch das Puffern bei einen pH-Wert innerhalb des Umschlagbereiohes sseigt, zu markieren. Außerdem ermöglicht diese eine genauere quantitative Bestimmung des in der Testlösung vorhandenen PrQteingehaltes. Die Anwendung von Grundfarben ist an sich schon bekannt gewesen. In den Fällen, bei denen Reagenzgemische bew. Diagnostisiermittel im nicht reagierten Zustand ein unschönes Aussehen oder Veränderungen bzw. Entfärbungen beim Altern aeigen, dient die Grundfarbe sum besseres Aussehen des Diagnostisiermittels und zur

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- 8 - Aufroohterhaltung des ursprünglichen Aussehens während

längerer Lagerung·

Ia Folgenden sollen die einzelnen Bestandteile des erfindungageinKßan ReagenzgoBiischee nHiier erliiutert werden· Wie schon ausgeführt, handelt es eich bei dem Farbindikator, der auf das Vorhandensoin von Proteinen anspricht, also einen Proteinfehler steigt, im wesentlichen um pH-Indikatoren· Als Indikatoren können also alle pH-eiapfindliohen Farbstoffe benutzt werden, die den sogenannten Proteinfehler zeigen. Es können sowohl alkalische als auoh saure pH-Indikatoren verwendet werden, d.h. der bestimmte pH~3ereioh, in dem der chromogene Indikator normalerweise umschlägt , kann oberhalb oder unterhalb pH 7 liegen. Außerdem kann die Verschiebung des Urnschlagpunktes beim Vorhandensein von Protein von sauren in Richtung alkalischer '/orte oder umgekehrt erfolgen. Zu den Farbstoffen, die den Proteinfehler zeigen, gehb'ren beispielsweise die folgenden: Tstrabroiaphenolblau, BromkresolgrUn, Methylgelb, Kongorot, Bromthymolblau, Thyraolblau, Bromphenolblau, Tetrabromphenolphthaleinüthyl- und -butyl-Ester, Methylviolett 5B, Natriuraalizarinsulfonat, Alizarin, Bromkresolpurpur, o-Krosolsulfonphthaiein, und dergleichen. Da ausgezeichnete saure FuffermatGrialien in fester Form leioht erhältlich sind, verwendet man bevorzugt solche Indikatoren, die im sauren pll-3ereich anspreohen. Infolge ihrer hohen Itapfindliohkeit gegenüber Proteinen

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verwendet man bevorsugt Totrabroaphenolblau und iitwbromphonolphthalein-iithyloBtar. Die Indikatoren können in der Praxis sowohl als freie Basen ale auch in Form der Salze vorliegen· Wendet icon due Diagnoetiaienaittel In einem wässrigen System an, verwendet man

das Salz eines Indikators, da dieses eine erhöhte V

Test löslichkeit zvigt. Bei der Berstellttag: von ^e^-poetreifen

Diagrtootisiermittel nua Lösungen des Reagenzgemisoho3 ist θ β im allgemeinen man OtÜttäen der KUiohtigkelt des LSsungsisittela erwOnsoht, Alkohol oder alt Waeser miöohbare organische lösung ma It toi im verwenden, wobei dann der Indikator ia Torrn der freien Base verwendet werden kann· Die Wahl 1st nioht annsohlaggebend mn wird 1» allgemeinen vom gewählten Indikatonaaterial selbst unä von den Erfordernissen der Beetinssungaaethode abhängen»

Hat man ein bestimmtes Puffereyatom für das Reagenagemisch gewählt, so 1st dl« Wahl ami Indikators natürlich hiervon abhängig. Verwendet mm einen In sauren Bereich, aneprechenden Indikator, so kann ale Paffer jede geeignete sauer reagierende Subetane verwendet werden» wenn sieh mit Ihr der pH-Boreioh auf den gewUneohten Bereich innerhalb des norraalen pH-Parbweohnel~Bereiohee dee Indikator« einstellen IaBt. Ίίτά belapieleweie« als Indikator Tetrabromphenolblim verwendet, das normalerweise la pH-Bereich zwiaohen. 3,0 und 4,6 anspricht, so mB der Puffer In der

lage sein, das Gemisch In dieses Bereich einzustellen. Im 009816/0974

' ' * BAD ORIGINAL

- ίο -

allgemeinen ist bevorzugt, ein Puffer zu verwenden, dessen pH-Wert in der Mitte des normalen Umschlagbereichs liegt. Im Falle des genannten Indikatormaterials soll daher vorzugsweise ein pH-Bereich zwischen 3»4 und 4,0 eingestellt werden. Verwendet man den ebenfalls bevorzugten Tetrabromphenolphthaleinäthylester als Indikator, der im pH-Bereich von etwa 3,7 bis etwa 5,2 umschlägt, so ist ein entsprechendes Puffersystem zu wählen, das etwa den Bereich zwischen 4,0 und etwa 4,8 einstellt.

Die folgenden Säuren bzw. deren Salze oder Kombinationen hiervon erwiesen sich im Rahmen der vorgelegten Erfindung als besonders nützlich: Zitronensäure, Weinsäure, Haieinsäure, Ascorbinsäure, Salicylsäure, Sulfosalioylsäure, Oxalsäure, Itaoonsäure, Gluconsäure, Sulfamidsäure, Bernsteinsäure, Benzoesäure, Mandelsäure, Glutarsäure, Apfelsäure, Phthalsäure, Borsäure, Phosphorsäure und dergleichen. Zweckmäßige Kombinationen in geeigneten Mengen der oben genannten Substanzen können dem Fachmann überlassen bleiben. In der bevorzugten Durchführungsfora der vorliegenden Erfindung wird ein Citrat-Zitronensäure-Puffer verwendet.

ORIGINAL INSPECTED

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Die Wahl der geeigneten Grundfarbe hängt von dem speziellen sauren bzw. basischen Farbton des Indikators ab. In diesem Zusammenhang wurde festgestellt, daß die Grundfarbe bevorzugt einen Farbton aufweisen sollte ι der dem des Indikators vor dem Ansprechen auf Protein entsprioht, und der in Kombination mit dem Farbton, den der Indikator nach Ansprechen auf Protein zeigt, einen dritten unterschiedlichen Farbton bildet. Benutzt man beispielsweise Tetrabromphenolblau und Setrabromphenolphthalein-lthylester, deren saurer Farbton gelb und deren basischer Farbton, der sich beim Ansprechen auf Protein einstellt, blau ist, verwendet man als Grundfarbstoff bevoräugt einen gelben Farbton, Dieser verdeckt eine geringe Blau- bzw. Grünfärbung, die im Zusammenhang mit den verwendeten pH-Bedingungen auftreten könnte. Solche falsche positive Reaktionen können beispielsweise erfolgen, wenn der zu testende Urin oder eine andere Flüssigkeit stark alkalisch ist. Wird ein stärkerer Farbton durch den Indikator erzeugt, wie dies in Gegenwart von Protein in mittleren Mengen der Fall ist, so ergibt der gelbe Grundfarbstoff zusammen mit dem gebildeten blauen Farbton einen grünen Farbton, was eine exaktere quantitative Bestimmung ermöglicht, als wenn eine solche Grundfarbe nicht vorhanden wäre.

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- 12 Ala Beispiele fUr zahlreiche Grundfarbstoffe seien

die folgenden auegeführt» Dinatriumaalz der 2,4-Dinitro-1-naphthol-7-eulfonBäure, Dikallumaalz der 2,4-Dinitro-1-naphthol-7-sulf οnature, Trinatriuraaalz des 3-Carboxy-5-hydroxy-1-£-aulfophenyl-4-p-sulfophenylazopyrazol, Kononatrlumsalz des 4-ra-3ulfophenylazodiphonylamin, Dinatriumsalz dee 4~(^4-(n~Ätbyl-27Sulfobenzylaniino)-phenyl7-(2·- eulf oni\imphenyl) -methylen)-^T-( H-äthyl-N-£-aulf obenzyl )-

ρ. π ^

fa ' -oyelohexadienitain/1 Dinatritimaalz von 9-o-Carboxyphenyl-6-hyclroxy-2,4,517,tetrajodo-3-ieoxanthon, Dinatriumealz von 4-(^4-N-Äthyl-£-8ulfobenzylamino)-phenyl7-(4-e\ilfoniuaiphen3UL)-raethylen)-£T-(H-iithyl-H-2_>-a\i3fobenzyl)-

2 ς —

λ * -cyolohexadienimin/, Mononatriumsalz von 4-£-S\ilfophenylazo-1-naphthol·

Wenn auch im allgemeinen protein- und pll-unempfindliohe Grundfarben verwendet werden, ao könnon aber auch Subetanzen wie o-Kreaolsulfonphthalein, die einen Frotelnfehler aufweisen, oder 1,2-Dihydroxyanthraohinon, daa pll-empfindlioh ist, als Grundfarben verwendet werden, vorausgesetzt, da3 die Substanzen im verwendeten pH-Dereloh die Farbe nioht weohseln· Bei den bevorzugten Reagenzgeaiiaohen der vorliegenden Erfindung wird als Grundfarbe für die Indikatoren Tetrabromphenolblau und TotrabroraphenolphtUalein-äthylestor, daa Trinatriumaalz dos ^-Carboxy^-hydroxy-i-p-aulfophenyl-4-p-sulfophenylazopyra^ol (Tartrazin), verwendet.

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- 13 Gemä3 dor großen Ansah! an verschiedenen Komponenten, dl· in den erfindunßügeaUßen Reegönzgoiaiaohon enthalten aoin können, variieren auch die Kengenverhflltnteee in einem weiten Bereich. Kit Hilfe der hier vermittelten Lehre ist es Jedoch jedem Fachmann möglich, solche KengenverhMltniase in Houtinevörauohön ia einzelnen ?all zu ermitteln· Wie schon anfange erwähnt, wird das Reagenzgemiaoh ie allgemeinen mit eirssra Trägermaterial kombiniert , vao ein bequemes DlagBoatlziermittel liefert* Doch können die neuen Heagenzgeisieohe auoh in Fora von tabletten, Pulver und Losungen angewendet werden· In einer bevorzugten Auaführungeform der Erfindung wird jedoch dao Reagonsgeiaiooh einem Träger-toaterlal inkorporiert· Diea kann auf veroohiodene Weise geschehen, bevorzugt wird ein aaugffthlgee i-iaterial alt einer Lösung des Hoagenzgeiaiaclioe getränkt und an» schließend getrocknet·

Falle der Verwendung von aaugföhigen Trilgeruaterialien koonien belopielsweiae Filtriarpapier, Holzatiibchen, Materialien aua faeeriijam Kunst at off, nicht-gewebte und gewebte Tuche uow· in Frage· Bevorzugt verwendet man Filtrierpapier mit einer Dicke von etwa 0,25 bis 0,5

Die Anwendung einsa Biagnoatisioroittela,' das in olnota gotrßnkfcen Trfißor bootoht, sei kurz beaohrioben· Dae Diagnostiaiormittol wird in die auf Protein zu tootende

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' - 14 Flüssigkeit getaucht und sofort wieder herausgezogen. Das

soll deshalb geschehen, damit der duroh den Puffer eingestellte pH-Wert erhalten bleibt. liißt man das Diagnooti-Bioraittol su lanse ZsIt in der Flüssigkeit, beatehi die Gefahr, dal) Bestandteile des lioasensgooleohea von der FlUösigkoit herauoijelUet werden. Die getsllß äer vorhandenen Proteireienge entwickelte Farbe wird dann visuell oder mit Hilfe einer Farbkarte aufgewertet. Zur Beatianmng.der Jtetrbqualltiit kymion jedoch auoh verschiedene optisohe Gerste verwendet werden, wodurch die Genauigkeit der Beetlamungesiethode otelgt und die Subjektivität des meneohliohen Auges ausgeschaltet wird·

Die Erfindung soll anhand der folgenden. Beispiele nUher erlUutert werden·

BelBplol 1-6

Die in der Tabelle X enthaltenen Keagenzgemisohe wurden folgendermaßen hergestellt: Zunüohst wurde eine Pufferluoung duroh Miachon von Na&rlumoltrat, Zitronenaäure und Wnaaor hergo3tollt. Diese Lösung wurde dann mit der in der Tabelle angegebenen Henge einer 0,1 ;iigen wlis3ri@en LtJaung von golbom Varbatoff (Tcrtraain) hinzugefügt und uit einer Löauni; von Äthanol und Tetrabroaphoaol vermenet. Die pH-v/ertö dor llifferlUoung oind in Tabelle I enthalten· Fllterpapiarutreifon der Firma ilatraan dz Dii:eoan No.

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- 15 wurden dann in die verschiedenen KeagenzlUsungen getaucht

und anschließend TT Minuten bei IQO⁰C !getrocknet.

2
Extrahiert man 260 as der get rankten Dt reif an mit 15 nl Wasser, so seigen die Streifen tamer noch etwa den pH-Wert der Pufferlösung« Bringt aan die alt den Reag&nzgemisohen der Beispiele 1-6 hergsetellten Streifen in Kontakt mit verschiedenem Lösungen, dl· 0 Me 1000 sag £ Protein enthalten, 80 ISSt sich der Pjdteingehalt bis zu einer unteren Konzentrat ionogrenze von etwa 5 "biß 10 ag ^ genau "beetlasen. Der Farbton wechselt von gelb nach blau alt mehreren Zwlsohenf arbtönen, Je nach der In der LÖaung anwesenden

II
rroteinmenge. Die faballe/zeigt den Farbweohoel im Falle doe iieagenzgeniechaa von Beispiel 2· Besondere gtinotig bozU^llcn Farbstilrice und Farbweoheel erwiesen sich die ReagensgeaisQiie gegaSÜ Beispiel 2-5· Itarserhin erwiesen sioh auoh die liaagonzgmnieohö geaäö Beispiel 1 und 6 besUglioh Smpfindliohkeit und Genauigköit den bisher bekannten Heagexisgeaieohen überlegen·

Tabelle I

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	β	SK	W ■	VO	O	! 121.	VO	VO	ο	*«ί-*
	Πί	O		O	O	<«*	S	öS	ο	Ο
	%	H Q		O			VO	VO	O
	Ίο	«Η		O	O tr»	KN τ-	CO	' ω	ό .
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tabelle II

O	*	BAD
O		O 37
co		δ
«ο
o>
ο · co -J
*^

Proteingehalt dar ( $)

5-20

30

100 300

1000+

(2)

¹O)

Farbton

(D

dee

Yellow ($1) Apple Gr#en (57) Varlaoate 5r©ea (66) .tlhmm, (72) Blue (75) Blue g^rcfuolao (7B)

I>i· Emfiuitloa der J'arbiöna eirfolgfce e©aiiS Wa'faater'q Hew Intsrnatiooal Biqtiosary of the SEgllak *T

ί<2>

2.

q (1941'}

Unterschiedliche Gehalt· zwischen 5 bie 20 ag ?C Protein

»loh. to*oh geriJige Sohattlerangen des "Apple Gr«m (57)* tinter-

öoheiden·

-Vf-

Betepielo 7-11

Die in dör Tabelle III angeführten Lösungen wurd*m hergestellt durch Auflösen von 3,5 g wasserfreier ZitroneneSure und den angegebenen ringen en Xatrtazroitrat-dihydrat in 100 al destilliertem Wasser_p danaoh. wurde die Löaung mit 100 ml einer 0,04 £ Tetrabronphenolphthalein-iithylooter (normaler pH-Umoohlagboroioh. 5»7 Me 5»2) enthaltenden Äthyialkohol-Itötmng ga&iGoht. Der pH der so erhaltenen ist in Tabelle III angegeben* Hit Bilfo dieser

wurden Teat at reif en, wie in den Beiopielen 1-6 besolirleben, hergeetellt·

•	Tabelle	III	(	1	Beispiele	9	Kr·	10	11
			5.	3	2.5		5.7	4.2 ; i 1
	7	100	.6	5.5		5.5	! 5.5
Katriuooitrat (g) (Dihydrat)	r 1.0		•5	100		100	100 . i
Zitronensäure (g)	5.5			0.04		0.04	0.04
Waeaer (ml)	100	0.04	100		100	100
Tetrabromphoiiolphthalein -Uthyleater (g)	0.04	100	4.4		4.8	5.2
Äthanol (95.5) (al)	100	4,
pH der Geeasatltieung	5.75
,0

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D ORIGINAL

Di« Teststreifen wiesen nach dem Trocknen folgende

Farben auf:	Beispiel	Farbton
7	Gelb
8	Gelb
	GrünsticnTges Gelb
IO	Grüngelb
11	Grünblau

Die Teststreifen wurden Bit rerschiedenen Urinproben_t die unterschiedliche Proteingehalte enthielten» in Berührung gebracht. Hierbei wurde festgestellt» daO die gemäß Beispiel 7 und 11 hergestellten Teststreifen gerade noch O,004$ (4b&0 Protein durch einen geringen Tarbwechsel erkennen ließen, wahrend die gemäß Beispiel β bis 10 hergestellten Streifen bei diesen Gehalt bereits einen deutlichen Farbwechsel zeigten. Bei all diesen Versuchen wurde jeweils ein Vergleichastreifen benutet, der in praktisch proteinfreies Urin getaucht wurde und als Basis für die Farbrergleiche diente·

In den folgenden Beispielen 12-18 wurden Reagensgemische bzw. Teststreifen gemäß der in den Beispielen 1-6 beschriebenen Verfahren hergestellt. Zusammensetzung und Eigenschaften sind welter unten angegeben. Bei den pH-%erten handelt es sich üb diejenigen der Tränklösung. Bei den Alkohol enthaltenden Tränklösungen wurde festgestellt! daß der pH-Wert etwa 0,2 pH-Einheiten höher liegt als der der rerwendeten Pufferlösung. Die daraus hergestellten Streifen zeigten einen pH-*ert» der etwa 0,2 pH-Einheiten niedriger als der der Tränklösungen lag.

0098 18/0 97 4 ^{ßAD ORI01NAL}

- 19 -

-VS-

Beispiel 12

Testgemisch; Natriumcitrat-dihydrat Wasserfreie Zitronensäure Br omkr es lgrün Äthanol (95 $) Destilliertes Wasser pH-Wert der Tränklösung 5,2 g

2,0 g

0,1 g 50,0 ml 120,0 ml 4,5

Bromkresolgrün (Eigenschaften des Indikators): Saurer Farbton gelb

Basischer Farbton blau

Normaler pH-Umschlagbereich 3,8 -

Eigenschaften des Teststreifens: Farbton des trockenen Streifens

Farbton des Streifens nach Berührung mit Protein enthaltender Lösung gelb
blau

Beispiel 13

Reagenzgemisch: Natriumcitrat-dihydrat Wasserfreie Zitronensäure Bromkresolpurpur Äthanol (95 t) Destilliertes Wasser pH-Wert der Tränklöeung 27,0 g 2,0 g 0,1 g

30,0 ml 120,0 ml 5,8

0098 16/Ü974

(Eigenschaften dee Indikator«):

Saurer Farbton Baeieoher f arbton

gelb pnrpur 5»2 - 6,8

■ ';f:Ji

Farbton döa trocknen Streife»» gelb

Farbton dee Streifena naoh Berührung

aait Frotöin enthaltender Lorning purpur

o-Krosoleulfonphthalein (95 3«)

plf-Vert d«r

11,1 S 0,05 β 30,0 mi 120,0 G&

Saurer Parbton Nonaaler

gelb ,/ ' rot -

7,0 - 6,8

■01 S11 S / I If i BAD ORIGINAL

- 21 Eigenschaften dsa "ootatraifens;

Farbton des trookonen Streiföne

Farbton den Streifens nach Berührung mit Protein enthaltender Lösung

rot-orange gelb

Beispiel 15

Phoepbatpuffer - pH 6,61 (0,2 K Brorathyiaolblau W.^·

Äthanol (35 fr)

pH-Wert der TränJclösung t20,0 al 0,05 « 50,0 7,0

Brömthymolblnu Vf♦ So (Sigensohaftan des Indikatora)

Saurer Farbton

Daaieoher Farbton

Normaler pll-üi33chlagbereioh gelb blau 6,0 - 7,6

Slgenoohafton doa Teatotroifens:

Porbtön dea trookonen nfereifons grün

Farbton des Streife no nach llerUhrung

lait Protein enthaltender Lüsung gelb

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Beispjol 16

Ren ge nz ^omisoh:	9,6 g	«elb
Ifatriuiaoitrat-dihydrat	. 9,0 β	blau
Waaserfreio Zitronensäure	0,04 g	5,0 - 4,6
Broinphenoiblau (Hatriuasals)	100,0 BtI
Dostilliortoa Wasser	5,4
pll-tfert der irHnklösang	Bro.tiphenolblau-Natriumaalz (Eigenschaften doe Indikators):
	Saurer Farbton
Basischer Farbton
Horaaler piWJDSohlasbereioh.
Sigengchaften des ?©arfcatreifens:

Farbton des trookenon Streifens gelb

Farbton des Streifen® naoh Berührung mit Frotöin entlialtefider LÖsunß blau

Beiapiel 17

Reagens göfliia oh:	5,0 g
Borax	0,65 g
Borafiure	0,016 &
Thyoolblau	100,0 nl
Deetilliortea ".'asaer	8,8
pH-Wort der Trlinklöasing
0 0 O Ö 1 6 / 0 9 7 U	BAD ORIGINAL

Thymolblau (Slgeneohaften dee Indikators):

Saurer Farbton . gelb

Baeieoher Farbton , blau

normaler pH-Utnsohlagboreioh 8,0 - 9,6

Sigenaohaften dea TeBtotreifenot

Farbton doe trookenen Streifens bleu

Farbton do8 Streifens nach Berührung

rait Protein enthaltender Lösung grau

Beispiel 1Q

Ea wurde ein trockenes KeagensgoEaißoh mit der in Beispiel 5 angegebenen Zusammensetzung (Jedoch ohne Vaaeor) hergoetellt· Das Scaisch vmrde mit Alkohol angefeuchtet und zu kleinen Tabletten tait einem Gowioht von 0,14 g verpreüt· Zn der folgenden :;«rie von Urinprobon mit o,>, 0,01y5, 0,03^, 0,1ji, 0,3^ und 1,0^ Protein **urde Jewoilo ein· Tablette hinzugegeben· Die proteinfreie Urinprobe nahm ein gelbliches Olivgrün an, w.'ihrend die Vp Protein enthaltende Urlnprobe in ein blaues Türkie umechlug· Die Proben mit dazwisohenliegenden Proteincehalton zeigten je nach Proteingohalt verschiedene blaugrllne Farbtöne. Die Probon erwiesen sioh ale geoignet zur viouellon utid optiachon Bestimmung dos Farbtonos und damit zur Bestitamun# der Proteingohalte·

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Zuaammenfasaend kann geaaeli werden, do3 die vorliegende Erfindung oin neue α außerordentlich enpf indliches Reagonsgeaiieoh "bsw- Diagnostiaienaittel für die Beetitacaung von Protein in .Flüaeigkeiten daratellt· Dieoee R©agena~ e<«aieoh enthält einen Farbindilcator ait Proteinfehler, einon Puffer, der einen pH-Wert innerhalb dee normalen pH~U5asohlagb©reiohes deo indicators einotollt und ßegebonenfalla ßualltalioa eine Grundfarbe zur Vermeidung von falschen positiven Bestiuaaungen und um in Abhängigkeit von untersohiedliohen Proteingeholten der (Teetflüssigkeit eioh deutlich unterscheidende Farbtöne eu erhalten.

pqtentanaprüohe

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009816/0974

Claims

Patentansprüche

1. Trockene Indikatorzubereitung zur Bestimmung von Protein in Flüssigkeiten, bestehend aus einem Träger, der mit einem Farbindikator und einem Puffer imprägniert ist, wobei der Pruffer bei Berührung mit der Untersuchungsflüssigkeit einen pH-Wert einstellt, der innerhalb des normalen pH-Umschlagbereichs des Farbindikators liegt, dadurch gekennzeichnet, daß noch ein Grundfarbe t of fjvor hand en ist, dessen Farbton dem des Indikators vor dem Aneprechen auf Protein entspricht.

2. Indikatorzubereitung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Indikator bei Gegenwart τοη Protein eine Farbänderung in Richtung auf den basischen Farbton erfährt und der Grundfarbstoff dem sauren Farbton dta Indikators entspricht.

3. Indikatorzubereitung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß ein Puffer vorhanden ist, dcsssn pH-Wert in der Mitte des normalen pH-Umschlag- bereiohe des Indikator· liegt.

Neil« Untej1afl6ⁿ (Art 7 11 Abi. 2 Nr. l GaU 3 d»e Änderung«*, it & 9. 193?'

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4·. Indikatorzubereitung nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß ein Indikator vorhanden ist, der bei Gegenwart von Protein einen Parbwechsel von gelb nach blau zeigt, während der Grundfarbstoff einen gelben Farbton aufweist.

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