DE1598621B2 - Verfahren und vorrichtung zur schnellen und kontinuierlichen untersuchung einer vielzahl von biologischen zellen - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Vorrichtung zur schnellen und kontinuierlichen Untersuchung einer Vielzahl von biologischen Zellen, insbesondere zur Schnelldiagnose von krebsartigen Erkrankungen dieser Zellen, bei welchem die zu untersuchenden Zellen gleichzeitig mindestens zwei genau definierten Strahlungen im UV-Bereich ausgesetzt werden, von denen eine im Absorptionsband der Nukleinsäuren liegt.

Ein derartiges Verfahren und eine derartige Vorrichtung sind in der DT-OS 14 98 824 bereits vorgeschlagen worden. Die Nachteile dieses Verfahrens werden anschließend noch dargelegt.

Neuere Untersuchungen haben gezeigt, daß die Gegenwart von Krebs festgestellt werden kann durch Messung der chemischen Veränderung innerhalb gewisser spezifischer Körperzellen, welche entweder durch Biopsie, durch Irregation von Körperorganen, beispielsweise des Uterus oder durch Ausschabung solcher Organe, z. B. der Zervix gewonnen werden. Die obengenannten Untersuchungen zeigten, so daß ein Anwachsen des Anteiles der Nukleinsäuren (Deoxyribonucleinsäure, Ribonucleinsäure, im folgenden mit DNS und RNS bezeichnet) innerhalb einer Probe auf einen Pegel oberhalb eines normalen Anteils bei bestimmten Zellen ein Zeichen für die Anwesenheit von Krebs innerhalb der Zellen des untersuchten Organs bzw. des die Körperflüssigkeit liefernden Organs ist. Es wurden bereits Vorrichtungen zur maschinellen Krebsdiagnose vorgeschlagen, die von der Tatsache Gebrauch machen, daß die Nukleinsäuren ein Absorptionsmaximum in der Nähe der Wellenlänge von 2537 A besitzen. Gewöhnlich werden dem zu untersuchenden Organ entstammende Zellen auf einen Objektträger gebracht, in bekannter Weise gefärbt und mittels einer Abtastmethode untersucht, wobei jede einzelne auf dem Bildträger befindliche Zelle durchstrahlt wird. Mittels einer derartigen Absorptionsmessung läßt sich feststellen, ob Nukleinsäuren in normalen oder abnormalen Anteilen in den untersuchten Zellen vorhanden sind. Die genannten Vorrichtungen machten teils von Absorptionsmessungen in Form eines Strahlungsprofils über der zu untersuchenden Zelle, teils von einer Messung der Gesamtabsorption der Zelle Gebrauch und waren verhältnismäßig erfolgreich, jedoch ist deren Benutzung nur dann angebracht, wenn eine verhältnismäßig begrenzte Anzahl von Zellproben untersucht werden sollen. Ist es jedoch erwünscht, z. B. im Rahmen einer Massenuntersuchung Proben mit 100 000 und mehr Zellen zu untersuchen, so sind die erwähnten Vorrichtungen zu zeitraubend und teuer. Diese ökonomischen Gründe, welche gegen die Verwendung der obengenannten Vorrichtung bei Massenuntersuchungen sprechen, resultieren aus der Tatsache, daß die Vorrichtungen zwar eine schnellere Untersuchung gestatten, als dies bei einem manuellen Verfahren der Fall ist, daß jedoch die Verminderung der Untersuchungszeit nicht groß genug ist, um sie für Massenuntersuchungen geeignet zu machen. Ein zusätzlicher Faktor, der gegen die Verwendung der obengenannten Vorrichtungen spricht, besteht in der Tatsache, daß sogar in einer abnormalen Probe Krebszellen nur verhältnismäßig selten zu finden sind, wodurch es erforderlich wird, jede einzelne Zelle zu untersuchen. Aus den genannten Gründen ist es wünschenswert, über ein Verfahren bzw. eine Vorrichtung zu verfügen, welches jede einzelne Zelle mit hoher Geschwindigkeit sowie mit großer Genauigkeit zu untersuchen gestattet. Dies stellt die einzige

Möglichkeit dar, die genannten zeitlichen, personellen und ökonomischen Schwierigkeiten zu überwinden.

Einer der Hauptgründe dafür, daß die Sterblichkeit infolge von Krebs in den letzten Jahren abgenommen hat, ist der Tatsache zuzuschreiben, daß die Medizin ihr Hauptaugenmerk auf eine möglichst frühe Erkennung dieser Krankheit richtete. Aus einem neueren Report des Präsidenten der Kommission für Herzkrankheiten, Krebs und Kreislaufkrankheiten geht hervor, daß bezüglich des Zervikalkrebses fast eine 100%ige Überlebungswahrscheinlichkeit für die Patienten besteht, welche in. den Genuß einer Frühdiagnose mit anschließender Behandlung kommen. Frühe Diagnose und Behandlung des Zervikalkrebses wurde grundsätzlich ermöglicht durch die Benutzung des wohlbekannten Papanikolaou-Verfahrens. Diese Methode besitzt den Vorteil, daß Untersuchungsproben leicht durch einen Arzt oder durch den Patienten selbst beschafft werden können und daß jährliche Untersuchungen des Zervikalkrebses in manchen Gegenden eine feststehende Einrichtung wurden. Es besteht somit Grund zur Annahme, daß infolgedessen in manchen Ländern der Zervikalkrebs aufgehört hat Todesfälle zu verursachen und daß sich dieses Ergebnis auf einer weltweiten Basis reproduzieren ließe, wenn die Möglichkeit bestünde, Proben der gesamten weiblichen Bevölkerung jährlich einer Untersuchung zu unterziehen. Wie bereits erwähnt wurde, sind die zur Zeit benutzten manuellen und maschinellen Zellenuntersuchungsverfahren verhältnismäßig zeitraubend und zu teuer. Fernerhin leiden die zur Zeit verfügbaren Untersuchungsmethoden unter einer gewissen Ungenauigkeit im Falle der Benutzung von Messungen der Absorptionsmaxima der Nukleinsäure, bei denen die Objektträger durch einen Lichtstrahl abgetastet werden, da große Zellen oder Zellanhäufungen die Anzeige einer abnormalen Zelle vortäuschen können, obwohl in Wirklichkeit die Dichte der Nukleinsäuren normal ist. Aus dem Gesagten geht hervor, daß ein starkes Bedürfnis nach einem Diagnostizierverfahren für Krebs vorliegt, welches geeignet ist für eine schnell durchzuführende Massenuntersuchung von Proben mit einer hohen Anzahl von Einzelzellen. Diese Untersuchung hat schnell und genau zu erfolgen, und es sollen auch die Zellgröße und der Anteil der Nukleinsäure der jeweils gemessenen Zelle in Betracht gezogen werden können.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch folgende Verfahrensschritte gelöst:

1. Einbringen einer Probe der zu untersuchenden Zellen in eine Lösung mit einem pH-Wert nahe zwei zur Erhöhung der Absorptionsdifferenz für Strahlungsenergie zwischen Zellen mit großen und Zellen mit kleinen Mengen von Nukleinsäuren;

2. Messen des jeweiligen Verlustes an auftreffender Strahlungsenergie für jede Zelle bei der einen Wellenlänge auf Grund von Absorption und bei einer anderen Wellenlänge auf Grund von Streuung und

3. Erzeugen eines sich aus der vektoriellen Addition der den Gehalt an Nukleinsäuren bzw. die Teilchengröße kennzeichnenden Teilsignale ergebenden Ausgangssignals.

Vorzugsweise geht man dabei so vor, daß als Lösung mit einem pH-Wert nahe zwei eine isotonische wäßrige Lösung von Natriumacetat und Essigsäure verwendet wird.

Besonders wichtig ist es, daß der pH-Wert bei 2,1 liegt. Des weiteren ist es von Bedeutung, daß die Bestrahlung mit UV-Licht einer Wellenlänge von 2537 A und Licht außerhalb desjenigen Bereiches erfolgt, der von der Nukleinsäure wesentlich absorbiert

ίο wird und daß die Verluste an auffallender Strahlungsenergie für jede Zelle der Probe bei einer zweiten Wellenlänge von über 4000 A gemessen werden, die eine Anzeige für das Volumen der Zelle liefert. Dabei werden die in einer Suspensionslösung suspendierten zu untersuchenden Zellen durch eine enge Kanüle innerhalb eines Objektglases aus Quarz getrieben. Das von einer Lichtquelle über eine Kondensorlinse gelieferte UV-Licht durchsetzt diese Kanüle sowie die Objektivlinse und eine weitere Linse und wird von dem Dichroidspiegel in zwei Strahlengänge aufgespalten. Der bei 2537 Ä liegende, der Zellenabsorption proportionale Spektralanteil wird einem ersten Elektronenvervielfacher, der restliche, dem gestreuten Lichtanteil und damit dem Zellenvolum proportionale Spektralanteil einem zweiten Elektronenvervielfacher zugeleitet, und das von einem Verstärker weiter verstärkte, der Zellabsorption proportionale Signal wird an die Vertikalablenkplatten, das von einem Verstärker weiter verstärkte, der Streuung bzw. dem Zellenvolumen proportionale Signal wird an die Horizontalablenkplatten eines Oszilloskopes angelegt. Gleichzeitig wird eine Helltastung des Kathodenstrahles mittels eines aus dem Signal des der Absorptionsmessung zugeordneten Elektronenvervielfachers durch einmalige zeitliche Differentiation gewonnenen Hilfssignals durchgeführt, so daß die Endpunkte der aufgezeichneten Bildkurven innerhalb keulenförmiger Bereiche liegen, deren Symmetriegeraden Steigungswinkel besitzen, die durch das Verhältnis der Zellabsorption/Zellvolumen gegeben sind.

Die Erfindung wird an Hand eines Ausführungsbeispiels in Verbindung mit den Zeichnungen erläutert. Dabei zeigt

F i g. 1 eine teils schematisch, teils als Blockdiagramm ausgeführte Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens nach der Erfindung,

F i g. 2 eine vergrößerte Ansicht des zur Durchleuchtung bzw. zur Streuungsmessung der einzelnen Zellen der biologischen Probe mit einer engen Kanüle versehenen Objektglases,

F i g. 3 ein von der Vorrichtung nach der Erfindung auf dem Schirm der Kathodenstrahlröhre zur Anzeige gebrachtes Diagramm.

Die den verschiedenen Zellarten zugeordneten Leuchtpunkte liegen in keulenartigen Flächenbereichen, wobei der Steigungswinkel der Symmetriegeraden der einzelnen Bereiche für die jeweilige Zellenart charakteristisch ist. Die größten Steigungswinkel sind den abnormalen Zellen, nämlich krebsbefallenen und Strahlungsgeschädigten Zellen zugeordnet.

Entsprechend der vorliegenden Erfindung wurde ein Verfahren sowie eine Vorrichtung entwickelt, die zur Untersuchung von großen Mengen von Zellen in der Größenordnung von 100 000 Zellen innerhalb von zwei oder drei Minuten geeignet ist. Man geht dabei aus von einer Zellenanhäufung innerhalb eines

4 :1-Gemenges einer isotonischen physiologischen Kochsalzlösung mit Äthanol. Es können auch andere sowohl fixative als nichtfixative Salzlösungen benutzt werden, jedoch ergab das erwähnte 4: 1-Gemenge von physiologischer Kochsalzlösung und Äthanol die besten Resultate. Die Proben können durch einen Arzt oder durch die Patienten selbst beschafft werden. Im Falle der Untersuchung auf Zervikalkrebs kann ein geeignetes Instrumentarium hierzu entweder von den Krankenhäusern oder im Handel erhalten werden. Zur Vorbereitung der Probe für die Untersuchung zur Verhinderung des Auslaugens der Konstituenten der Zelle sowie zur Standardisierung des Anteils des ohne Zerstörung der ultravioletten Absorptionscharakteristik für die Nukleinsäuren zulässige Denaturalisierung des Proteins werden die Proben für eine Zeitdauer von zwei Wochen nach der Entnahme in einer 5O°/oigen Äthanollösung und einer 2°/oigen Essigsäurelösung suspendiert. Es hat sich herausgestellt, daß bei Benutzung von Fixativen die Proben für eine Zeit bis zu drei Monaten aufbewahrt werden können mit nur geringen Abweichungen zwischen den Untersuchungsresultaten im Vergleich zu den nicht gealterten Proben. Bei der Vorbereitung der Proben für die Untersuchung wurde ebenfalls gefunden, daß die Differenz bezüglich der Absorption zwischen Zellen mit großem und solchen mit geringem Anteil von Nukleinsäuren vergrößert wird, wenn die Zellen nochmals suspendiert werden mit einer wäßrigen Lösung von Natriumazetat und Essigsäure, welche einen pH-Wert in der Nähe von 2, insbesondere einem solchen von 2,1 besitzt, bei einer Molarität des Natriums von etwa 0,15. Für pH-Werte von Molaritäten, die von den genannten Werten abweichen, wurde keine Konsistenz der Resultate erhalten. Die Inkonsistenz kann zum Teil auf das Anwachsen der Absorption der Nukleinsäure mit gleichzeitiger Denaturalisierung bei geringen pH-Werten zurückgeführt werden. Es wurde weiter gefunden, daß eine Probe, welche krebsbefallene Zellen enthält, bei einem von 2,1 abweichenden pH-Wert als normal erscheinen kann. In einem Experiment konnte eine Krebszellen enthaltende Probe in Natriumazetat und Essigsäurelösung mit einem pH-Wert von 3,8 nicht mehr unterschieden werden von einer Probe mit normalen Zellen innerhalb einer Lösung mit einem pH-Wert von 2,1. Andere Untersuchungen, welche verschiedene Krebszellen und Lösungen mit einem verschiedenen pH-Wert benutzten, zeigten eine ähnliche Tendenz. Absorption durch DNS und RNS wird fast um den Faktor 2 gesteigert durch die Benutzung von Lösungen mit einem pH-Wert in der Nähe von 2. Man glaubt, daß Lösungen mit einem derartigen pH-Wert eine Aufwicklung der Molekularstruktur der Nukleinsäure bewirkt und hierdurch das Absorptionsvermögen einer jeden Zelle erhöht. Das genannte Phänomen der Aufspulung des Moleküls der Nukleinsäure wurde zwar bereits anderweitig demonstriert, es ist aber anzunehmen, daß das vorliegende Verfahren und die Vorrichtung die erste Anwendung dieses Phänomens zur Verbesserung des Absorptionsvermögens einzelner Zellen darstellen, wobei die Messung der Dichte der Nukleinsäure zur Entscheidung der Frage herangezogen werden, ob in der Probe krebsbefallene Zellen anwesend sind oder nicht.

Die zu untersuchenden Zellen werden zunächst in einem Filter nach Buckbee Mears mit 250 Maschen pro Zoll, welches in ein Swinnyfilter eingesetzt ist, gefiltert und die Zellen in 2 ml einer wäßrigen Lösung von Natriumazetat und Essigsäure mit einem pH-Wert in der Nähe von 2 suspendiert. Nach der Filterung und Suspension in der Lösung wird die Probe in das Gerät der F i g. 1 eingegeben.

Nach erfolgter Untersuchung wird die Probe in dem Reagenzglas oder einem anderen Behälter 1 gesammelt, die ihrerseits durch das Rohr 2 mit der

ίο einen Seite der Kanüle 3 im Objektglas verbunden sind. Die andere Seite dieser Kanüle 3 ist mit der Speicherspule 4 aus Teflon verbunden. Eine Injektionsspritze 5 ist an die Speicherspule 4 angeschlossen, wodurch der Transport durch die Röhre sowie durch die Kanüle des Speicherglases bewerkstelligt wird. Die Spule aus Teflonrohr 4 kann zusätzlich auf einem Schüttelgerät montiert werden, um die Zellen in der Suspension zu halten. Die zu untersuchende Probe wird vor Beginn der Untersuchung in die Vorratsspule 4 eingebracht und verbleibt dort bis zur Inbetriebsetzung der Vorrichtung. Die zu untersuchende Flüssigkeit wird mit einer festen Rate in die Kanüle 3 injiziert, was beispielsweise mit einer Infusionsspritze geschehen kann. Eine geeignete Inas fusionsrate wurde etwa bei 0,5 ml/Min, festgestellt. Eine Anzeigevorrichtung für Luftblasen, bestehend aus der Photozelle 6 stellt die Anwesenheit von Luftblasen zu Beginn und am Ende der Untersuchung fest und liefert Signale, welche den Start bzw. die Außergangsetzung der Apparatur bewirken. Die zu untersuchende Flüssigkeit durchfließt die enge Kanüle innerhalb des Objektträgers mit den Abmessungen von 100 μ X 100 μ und fließt weiterhin in den Sammelbehälter 1. F i g. 2 zeigt detailliert die Kanüle 3, durch welche die Untersuchungsflüssigkeit hindurchgepumpt wird. Die Kanüle besitzt eine prismatische Gestalt und ist mittels eines Ultraschallschneidegerätes in einen Mikroskopobjektträger aus Quarz eingeschnitten. Nach dem Einschneiden wurden die Wandungen poliert. In der Nähe der Enden des Kanals wurden dann die Bohrungen 8 eingebracht. Die Quarzabdeckung 9 wurde dann oberhalb des Kanals 3 aufgesetzt und mit diesem verklebt. Rohrzuleitungen aus Polyäthylen 2 dienen der Ableitung und das Rohr 10 der Zuführung der zu untersuchenden Flüssigkeit. Das Polyäthylenrohr 10 ist mit der Vorratsspule 4 mittels eines nichtgezeigten Touhy-Borst-Adapters verbunden.

Der aus Quarz bestehende Objektträger 7 mit Abdeckung 9 mit der Durchflußkanüle 3 und den zugehörigen Polyäthylenrohren 2 und 10 wird dann auf dem Tischchen eines Mikroskops montiert. Dieses besitzt eine Zeiss-Ultrafluorobjektivlinse 100/1,25 mit Glyzerinimmersion, welche den mittleren Teil des Flußkanals auf eine Appertur abbildet. Eine Lichtquelle 13, bestehend aus einer Hanovia-Niederdruckquecksilberdampflampe mit Wasserkühlung wird mittels eines Zeiss 0,85 NA-Immersionskondensors 14 auf den Kanal 3 abgebildet. Die Lichtquelle 13 liefert ultraviolettes Licht. Der größte Teil ihrer Energie wird bei 2537 A ausgestrahlt, was in der Nähe des Absorptionsmaximums der Nukleinsäuren (DNA und RNA) liegt. Eine Quarzlinse 15 sowie ein Dichroid-Spiegel 16 bilden das die Objektivlinse 12 durchsetzende Licht mit einer Wellenlänge größer als 4000 A auf der Vorderseite einer Photovervielfachungsröhre 17 (EMR 541 A) ab und reflektieren

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kürzere Wellenlängen mit einem Ablenkungswinkel der Strahlintensitätsmodulationsklemme 26 zugeleivon 90° in der Weise, daß der reflektierte Strahl auf tet wird. Hierdurch wird erreicht, daß lediglich das einen zweiten Photovervielfacher 18 (EMR 541 F) Ende der auf dem Bildschirm erscheinenden Spur auftrifit, nachdem er zusätzlich ein 3-mm-Flüssig- eine genügende Intensität besitzt, um dort sichtbar keitsfilter durchsetzt hat, welches aus einem Quarz- 5 zu werden. Indem man die Strahlintensität des behälter mit 1-4 diphenylbutadien-Lösung in Äthanol Oszilloskops so einstellt, daß lediglich ein einzelner enthält. Das Filter 19 sowie die Photovervielfacher- Punkt für jede Zelle auf dem Schirm erscheint, und • röhre 18 isolieren in wirksamer Weise den Spektral- zwar an denjenigen Stellen, deren Koordinaten beanteil bei 2537 A. stimmt sind durch die Volum- bzw. die Absorptions-Die Zellen mit einer Flußrate von oberhalb io eigenschaften der Zellen, ist es möglich, aus der An-500 Zellen/Sekunde rufen Impulse von etwa zeige für jede Zelle den Gehalt an Nukleinsäure pro 200 μβεο Dauer an den Ausgangsklemmen der Volumeinheit zu erhalten. Durch Kombination einer Photovervielfacherröhre 17 und 18 hervor. Der Elek- . Kamera mit dem Oszilloskop ist eine laufende Auftronenvervielfacher 17 mißt den durch die Zellen zeichnung der Verteilung dieser Eigenschaften aus dem Lichtkegel 1.des Objektivs mit hoher Apper- 15 innerhalb einer speziellen Probe möglich. Aus dem tür gestreuten Lichtanteil, wobei das Licht dem Vorstehenden ist ersichtlich, daß bei den genannten Kondensor mit einer niedrigeren numerischen Apper- Messungen der Absorption/Volumeinheit die Leuchttur entstammt. Der Photovervielfacher 18 mißt die spur einer Zelle mit einem hohen Gehalt an Nuklein-Absorption des Lichtes bei 2537 A einer jeden Zelle säure auf der linken Seite des Oszilloskopschirmes bei ihrem Passieren der Kanüle 3. Die einzelnen von 20 innerhalb eines keulenförmigen Flächenbereiches mit dem Photovervielfacher 17 gelieferten Impulse, einem größeren Steigungswinkel der Symmetrieweiche ein Maß sind für den Lichtverlust infolge der geraden dieses Bereiches erscheinen wird. Man kann Streuung durch die Zellen ist dreißigmal geringer als daher nach einer geeigneten Maskierung des BiIdder durch Absorption hervorgerufene Impuls bei schirmes mittels einer Kamera eine Aufzeichnung gleicher einfallender Lichtenergie bei beiden Photo- 25 derjenigen Zellen erhalten, für die eine hohe Wahrvervielfach ern. Der allgemeine Energiepegel liegt scheinlichkeit besteht, von Krebs befallen zu sein, aber genügend hoch, um ein gutes Verhältnis zwi- Weiterhin kann nach einer Maskierung des Oszilloschen Signal und Rauschen an beiden Photoverviel- skopbildschirmes, die eine abnormale bzw. eine fachern zu gewährleisten. Die vor der Streuung er- krebsbefallene Zelle anzeigende Leuchtspur zur Bezeugten Signale dieser Größenordnung ergaben auf 3° tätigung einer Photozelle ausgenutzt werden. Die Grund von Experimenten die beste Abschätzung der Photozelle kann ihrerseits ein Alarmsignal auslösen, Zellgröße, wobei als Vergleich verschiedene andere so daß eine personelle Beaufsichtigung der Meßvor-Methoden in Betracht gezogen wurden, beispiels- richtung erst vom Zeitpunkt des ausgelösten Alarms weise Messungen des in den Zellen enthaltenden an erforderlich ist. Der Ausgang der Gesamtvorrich-Proteins, welches eine Absorption bei 2900A oder 35 tung braucht nicht notwendigerweise in einem sicht-3130 A aufweist sowie Änderungen der elektrischen baren Signal zu bestehen, sondern kann auch ein Leitfähigkeit über die Kanüle 3, welche durch den analoges oder digitales Signal sein, welches in VerDurchgang der Zellen verursacht wird. bindung mit zusätzlich zu benutzenden Datenverar-Die Ausgangssignale der Photovervielfacher 17 beitungseinrichtungen angewendet wird. Es sei dar- und 18 werden mittels eines Bandpasses zwischen 4° auf hingewiesen, daß auch andere Parameter, welche 300 Hz und 5 kHz gefiltert; es erfolgt weiterhin eine abnorme Eigenschaften von biologischen Zellen Verstärkung in den Verstärkern 170 und 180, welche charakterisieren gleichzeitig mit den obengenannten auch als Bestandteil des Oszilloskops sein können Messungen sichtbar gemacht oder angezeigt werden und die auch auf 0 geklemmt werden können. Das können. Zum Beispiel können Messungen mit Hilfe verstärkte Ausgangssignal des Photovervielfachers 18, 45 anderer Wellenlängen durchgeführt werden, welche welches dem Absorptionssignal entspricht, wird zu die Absorption des ultravioletten Lichtes durch das den vertikalen Ablenkungsplatten 21 des Oszillo- Protein oder das Zytoplasma einer Zelle betreffen, skops 22 geführt, welches z. B. ein Tektronix-536- So können Zellen mit einer durch Protein hervor-Oszilloskop sein kann. Das vom Photovervielfacher gerufene hohen Absorption bezüglich einer anderen 17 gelieferte Ausgangssignal, welches der Lichtinten- 5° Wellenlänge zusätzliche Daten ergeben, welche in sitätsminderung infolge Streuung an der jeweils unter- Verbindung mit den oben beschriebenen Messungen suchten Zelle entspricht, wird an die Horizontal- angezeigt werden oder einem Computer zugeführt ablenkplatten 23 der Oszilloskops 22 geführt. Jede werden, um nach Weiterverarbeitung noch genauere Zelle ruft bei ihrem Passieren durch die Kanüle 3 Information über eine individuelle Zelle zu erhalten, als Resultierende eine Gerade auf dem Bildschirm 55 F i g. 3 zeigt ein Diagramm der Absorption von des Oszilloskops 22 hervor, wobei die durch Strahl- Nukleinsäuren, aufgetragen gegen das Volumen für aufhellung allein sichtbar gemachten Endpunkte die- verschiedene Zelltypen. Charakeristisch ist bei dem ser Geraden Koordinaten besitzen, welche durch das Diagramm, daß normale Zellen einer vorgegebenen Größenverhältnis der beiden Signale gegeben sind. Art eine spezifische Lage innerhalb des Diagramms Zur Realisierung der erwähnten Strahlaufhellung ⁶° besitzen, während alle krebsbefallenen Zellen eine wird der Ausgang des Photovervielfachers 18 gleich- Lage einnehmen, welche im wesentlichen die gleiche falls einem Differenzierglied 24, bei dem es sich um ist, ohne Rücksicht auf die jeweilige Zellenart. Es sei eine in der Elektronik bekannte Schaltung handelt, darauf hingewiesen, daß die verschiedenen in F i g. 3 zugeführt. Das dem Absorptionsvermögen entspre- aufgezeichneten keulenförmigen Flächenbereiche in chende Signal wird differenziert und beim Überstrei- 65 Wirklichkeit Bereiche sind, welche durch eine große chen des Nullpunktes dieses Signals wird von einem Anzahl von Einzelzellen festgelegt werden, die nor-Impulsgeber 25 ein Impuls von einer Mikrosekunde malerweise auf dem Schirm des Oszilloskops als eine Dauer geliefert, welche weiterhin der Z-Achse bzw. Vielzahl von Einzelpunkten erscheinen. Die Umran-

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düngen, welche mit den Buchstaben A bis D bezeich- entfernten Tumoren untersucht, und es wurden Ver-

net sind, entsprechen Gebieten innerhalb derer die gleichsuntersuchungen gemacht, wobei nach Mög-

von den verschiedenen Arten normalen Zellen her- lichkeit die in Fig. 1 dargestellte Vorrichtung mit

vorgerufene Leuchtspuren fallen, während die Um- Zellsuspensionen von vergleichbarem gutartigem Ge-

randung D und F Gebieten entsprechen, in welche 5 webe benutzt wurde. Es wurden folgende Tumore auf

die von Krebszellen und Strahlungsgeschädigten ZeI- die genannte Art untersucht:

len hervorgerufene Leuchtspuren fallen. Das Ge- Epidermoidale Carcinome der Zervix, der Lunge, biet A zeigt den Bereich, in den die von normalen verhornte schuppenförmige Carcinome von Mund Erythrozyten hervorgerufene Leuchtpunkte fallen. und Pharynx, Adenocarcinome des Endometriums, Von den verschiedenen getesteten Zellkörpern wiesen io des Dickdarms, der Brust, des Ovariums sowie gediese die geringste Absorption des ultravioletten wisse Lymphome. Gutartiges Epithel der uterinen Lichtes pro Volumeinheit bei einer Wellenlänge von Cervix und orale sowie dem Colon entstammende 2537 A auf. Die Leuchtspuren von Leukozyten und Schleimhaut wurde mit den in Suspensionen aufbe-Epidermoidalzellen fallen in die Gebiete B und C und reiteten Tumoren verglichen, wobei die letzteren besitzen ein etwas größeres Absorptionsvermögen 15 durchweg ein Diagramm ergaben, welches ein höheals dies für die Erythrozyten der Fall ist. Unter den res Absorptionsvermögen pro Volumeinheit bei normalen Zellen besitzen die Lymphozyten in dem 2537 A aufwiesen als dieses der Fall war für die von Bereich D das höchste Absorptionsvermögen pro den gutartigen Geweben aufbereiteten Suspensionen. Volumeinheit wegen des großen Anteils von DNA In gleicher Art wurde die Absorption pro Volumeinin den Kernen dieser Zellen. Untersuchungen dieser 20 heit bei Vergleich mit gutartigen Lymphknoten höher normalen Zellkörper lassen die erwähnten Gebiete befunden für rektikuläre Zellsarkome, Lymphosarso weit abgrenzen, daß es möglich ist, für eine vor- kome und Hodgkin's-Lymphon. In allen Fällen wurgegebene Einstellung der Verstärkungsgrade der den auf dem Bildschirm erhaltene Diagramme als Verstärker der Vorrichtung nach F i g. 1 die ver- konsistent und reproduzierbar gefunden, mit geringen schiedenen Zelltypen zu identifizieren, wenn sie 25 Abweichungen sogar nach wiederholtem Gebrauch gleichzeitig in einer gegebenen Probe vorliegen. der Proben. In allen Fällen, in denen die Zellsuspen-Der Bereich E entspricht demjenigen Gebiet, in sionen die Anwesenheit von Krebs aufwiesen, wurden den die Leuchtspuren der meisten abnormalen bzw. zur Prüfung dieses Tatbestandes Untersuchungen krebsbefallenen Zellen fallen. Allgemein kann fest- zytologischer Abstriche durch Pathalogen herangegestellt werden, daß die abnormalen Zellen das 30 zogen. In umgekehrter Weise wurden Suspensionen höchste Absorptionsvermögen pro Volumeinheit von krebsbefallenem Gewebe angefertigt und ohne aufweisen, mit Ausnahme derjenigen Zellen, welche vorherige Kenntnis der Existenz des Krebses seitens z. B. durch Radioaktivität strahlungsgeschädigt sind. des Experimentators der Untersuchung zugeführt. In im Laufe der verschiedenen mit der Vorrichtung allen Fällen, abgesehen von wenigen, oben bereits erwach der Erfindung durchgeführten Experimente trat 35 wähnten Ausnahmen, lieferte die in Fig. 1 dargeediglich ein einziger Krebstyp auf, welcher eine nor- stellte Vorrichtung eine positive Diagnose der krebs-Tiale Verteilung der Leuchtspuren auf dem Anzeige- befallenen Zellen.

;chirm aufwies, wobei es sich um ein stromatisches Die Vorteile des beschriebenen Verfahrens bzw. iarkom des Endometriums handelte; andererseits der Vorrichtung zur Ausführung des Verfahrens ge- ;ab es Fälle, in denen normale Zellen das hohe Ab- 40 genüber dem bisher bekannten Stand der Technik ist orptionsvermögen zeigten, welches für Krebs beträchtlich. Die Untersuchungsdauer beträgt zwei ;harakteristisch ist. Derartige Verteilungen bilden bis drei Minuten pro Probe, wobei eine dauernde iber die Ausnahme und die Abweichung von dem Aufzeichnung der erhaltenen Resultate möglich ist lormalen Verhalten kann durch in jedem der ge- und durch eine am Oszilloskop befestigte Filmkamera annten Fälle auftretende ungewöhnliche Umstände 45 oder durch ein bekanntes von der Datenverarbeitung rklärt werden. So wurden z. B. derartige Ausnahme- her bekanntes Speicherungsverfahren realisiert wererhalten von Zellen gefunden bei der Untersuchung den kann. Infolge der genannten Eigenschaften ist die on Proben, die von Frauen im postmenopausalen in Fig. 1 dargestellte Vorrichtung hervorragend geiustand oder nach einer Krebsbehandlung stammten. eignet zur Erfassung dringend krebsverdächtiger Pa-)iese Ausnahmen gehören zu klinisch wohl definier- 5° tienten im Rahmen einer Massenuntersuchung. Eine en Zuständen, so daß ein Patient, dessen Krank- etwa erfolgende positive Anzeige bei jeder Probe ist eitsgeschichte diese speziellen Krankheitstypen auf- geeignet, diejenigen krebsverdächtigen Patienten auseist, einer gesonderten SpezialUntersuchung bzw. zusondern, die dann später einer Untersuchung von behandlung zugeführt werden kann, durch welche Zytologen oder Pathalogen zugeführt werden könmauere Aufschlüsse zu erhalten sind. 55 nen, wobei die Wahrscheinlichkeit der Wirksamkeit Zusätzlich zu dem durch Vaginalirrigation erhal- einer Krebsbehandlung durch die nunmehr mögliche nen uterinen Material wurden auch Suspensionen maschinelle Frühdiagnose wesentlich höher als früher 3n Zellproben aus einer Vielfalt von chirurgisch anzusetzen ist.

Hierzu 2 Blatt Zeichnungen

Claims (6)

Patentansprüche:

1. Verfahren zur schnellen und kontinuierlichen Untersuchung einer Vielzahl von biologisehen Zellen, insbesondere zur Schnelldiagnose von krebsartigen Erkrankungen dieser Zellen, bei welchem die zu untersuchenden Zellen gleichzeitig mindestens zwei genau definierten Strahlungen im UV-Bereich ausgesetzt werden, von denen eine im Absorptionsband der Nukleinsäuren liegt, gekennzeichnet durch folgende Verfahrensschritte:

— Einbringen einer Probe der zu untersuchenden Zellen in eine Lösung mit einem pH-Wert nahe zwei zur Erhöhung der Absorptionsdifferenz für Strahlungsenergie zwischen Zellen mit großen und Zellen mit kleinen Mengen von Nukleinsäuren;

— Messen des jeweiligen Verlustes an auftreffender Strahlungsenergie für jede Zelle bei der einen Wellenlänge auf Grund von Absorption und bei einer anderen Wellenlänge auf Grund von Streuung und

— Erzeugen eines sich aus der vektoriellen Addition der den Gehalt an Nukleinsäuren bzw. die Teilchengröße kennzeichnenden Teilsignale ergebenden Ausgangssignals.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Lösung mit einem pH-Wert nahe zwei eine isotonische wäßrige Lösung¹ von Natriumacetat und Essigsäure verwendet wird.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß der pH-Wert bei 2,1 liegt.

4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Bestrahlung mit UV-Licht einer Wellenlänge von 2537 A und Licht außerhalb desjenigen Bereiches erfolgt, der von der Nukleinsäure wesentlich absorbiert wird.

5. Verfahren nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Verluste an auffallender Strahlungsenergie für jede Zelle der Probe bei einer zweiten Wellenlänge von über 4000 A gemessen werden, die eine Anzeige für das VoIumen der Zelle liefert.

6. Vorrichtung zur Durchführung eines Verfahrens gemäß Anspruch 1 mit einer Lichtquelle und einem Detektorsystem für die Erfassung der Energiewerte zwei unterschiedlicher UV-Strahlungen sowie mit Vorrichtungen zum Zuführen und Ableiten einer Probenflüssigkeit, dadurch gekennzeichnet, daß im Lichtweg eine enge Kanüle (3) vorgesehen ist, durch die die Probenflüssigkeit derart hindurchleitbar ist, daß die zu untersuchenden biologischen Zellen einzeln erfaßbar sind und daß ferner im weiteren Strahlengang ein dichroitischer Spiegel (16) angeordnet ist, durch den die Strahlungen der beiden Wellenlängen trennbar und den jeweiligen Auswertevorrichtungen (17, 18) und von dort einer Anzeigevorrichtung (22) über getrennte Kanäle zuführbar sind.