DE10240118A1

DE10240118A1 - Verfahren zur Identifizierung von Nierenzellkarzinom spezifischen Proteinen und deren Verwendung

Info

Publication number: DE10240118A1
Application number: DE2002140118
Authority: DE
Inventors: Bernd Dr.rer.nat. Mühlenweg; Barbara Prof. Dr. Seliger; Thomas Dr. Halder; Alois Dr. Harder; Michael Dr. Kersten
Original assignee: Wilex AG
Current assignee: Toplab 82152 Planegg De GmbH
Priority date: 2002-08-30
Filing date: 2002-08-30
Publication date: 2004-03-11
Also published as: WO2004025302A2; WO2004025302A3; AU2003258690A1; AU2003258690A8

Abstract

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Charakterisierung oder/und von Proteinen, die für das Monitoren, die Diagnose und Prognose von Patienten mit primärem Nierenzellkarzinom, für die Selektion von Patienten, die auf Therapie mit G250 spezifischen Antikörpern ansprechen, sowie als therapeutische Zielstrukturen für die Behandlung dieser Erkrankung eingesetzt werden können. Die Proteine oder Polypeptide oder diese kodierenden Nukleinsäuren können auch verwendet werden, um pharmakologisch aktive Substanzen zu identifizieren oder/und selbst als Immunogene für die Stimulierung spezifischer Immunantworten zu dienen.

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Charakterisierung oder/und Identifizierung von Proteinen, die für das Monitoren, die Diagnose und Prognose von Patienten mit primärem Nierenzellkarzinorn, für die Selektion von Patienten, die auf Therapie mit G250 spezifischen Antikörpern ansprechen, sowie als therapeutische Zielstrukturen für die Behandlung dieser Erkrankung eingesetzt werden können. Die Proteine oder Polypeptide oder diese kodierenden Nukleinsäuren können auch verwendet werden, um pharmakologisch aktive Substanzen zu identifizieren oder/und selbst als Immunogene für die Stimulierung spezifischer Immunantworten dienen.
Das humane Nierenzellkarzinom stellt die häufigste Neoplasie der Niere dar. Jedoch sind die molekularen Mechanismen, die zur Initiation sowie Progression beim Nierenzellkarzinom führen, relativ wenig geklärt. Untersuchungen zeigen, dass es sich um einen komplexen Mehrschrittprozess handelt, der mit der Akkumulation verschiedener genetischer Alterationen, unter anderem Amplifikationen des EGF-Rezeptors und/ oder Mutationen bzw. Verlust von Tumorsupressorgenen, wie dem von Hippel-Lindau-Gen, einhergeht.
Nur das Tumorstadium, das durch die Tumorverbreitung, Beteiligung von regionalen Lymphknoten und das Vorhandensein von Fernmetastasen charakterisiert wird, wird heute von den Pathologen und Urologen als Indikator für die Patientenprognose breitflächig akzeptiert. Bisher ist wenig über die Funktion molekularer Regulation und Interaktion der genetischen Alterationen in der Entwicklung des Nierenzellkarzinoms sowie in der Metastasierung bekannt. Aus diesem Grund existieren bisher zur Zeit weder valide molekulare Marker, die für die Diagnose, Prognose und das Monitoren auf Therapieansprechen eingesetzt werden können. Solche Tumormarker sind von essentieller Bedeutung und führen langfristig zu einer effizienteren Behandlung des Nierenzellkarzinoms.
Viele der Gene/Proteine, die bei der Initiierung und Progression des Nierenzellkarzinoms involviert sind, sind ebenfalls nicht bekannt. Die Identifizierung solcher differenziell exprimierter Gene im Nierenzellkarzinom liefert die Basis zur Identifizierung von Markern für die biologischen Phänomene, wie Invasivität oder Metastasierung. Diese sind wiederum von großer klinischer Bedeutung, insbesondere für die Diagnose, Prognose und Behandlung des Nierenzellkarzinoms.
Generell ist das Nierenzellkarzinom ein therapierefraktärer Tumor und konventionelle Therapien, wie Chirurgie, Bestrahlung und Chemotherapie, sind relativ erfolglos. Die hohe spontane Regressionsrate, die Existenz von lymphozytären Infiltraten und einige objektive Remissionen bei klinischen Studien mit verschiedenen Immuntherapeutika weisen daraufhin, dass das Nierenzellkarzinom ein attraktives Ziel für verschiedene immuntherapeutische Strategien darstellt. Eine dieser Strategien ist die Behandlung des Nierenzellkarzinoms mit einem monoklonalen Antikörper (mAb), der gegen G250 gerichtet ist, wobei G250 zu einem hohen Prozentsatz auf der Zelloberfläche von klarzelligen Nierenzellkarzinomen exprimiert wird (vgl. WO 02/062972). Um Patienten, die auf eine Therapie mit einem mAb, der gegen G250 gerichtet ist, ansprechen, zu präselektionieren, ist die Identifizierung von differenziell exprimierten Tumormarkern, die nach Antikörper-Behandlung entweder induziert oder inhibiert werden, wesentlich.
Um Expressionsunterschiede zwischen normalen Zellen und Krebszellen sowie zwischen unbehandelten und behandelten Krebszellen zu evaluieren, werden verschiedene mRNA-, oder Protein-basierende Methoden eingesetzt. Zu diesen zählen neben der differenziellen Display-PCR, cDNA Microarrays und DNA-Chip Technologie die serielle Analyse der Genexpression (SAGE). Diese Methoden werden erfolgreich für die Erstellung von globalen und quantitativen mRNA-Expressionsprofilen von Zellen und Geweben verwendet. Nachteil dieser Analysen sind die fehlende Detektion posttranskriptioneller Mechanismen, wie z.B. (i) Proteinmodifikationen, (ii) Halbwertszeit spezifischer Proteine oder mRNAs, (iii) intrazelluläre Lokalisation und (iv) molekulare Assoziation von Proteinprodukten. Aus diesem Grunde ist komplementär zu den mRNA-Expressionsanalysen „Proteomics" zu sehen. Diese Technologie kann neben den quantitativen Proteinexpressionsprofilen außerdem Informationen über entsprechende Proteinmodifikationen liefern. Auch über Protein-Protein-Wechselwirkungen sowie die subzelluläre Protein-Lokalisation können bei geeigneter Versuchsdurchführung Informationen erhalten werden. Die Proteomanalyse basiert dabei technisch auf der Kombination von zweidimensionaler Gelelektrophorese (2DE) für die Separierung und Quantifizierung der Proteine und analytischen Methoden, wie Massenspektrometrie und N-terminale Proteinsequenzierung, die die Proteinidentifikation ermöglichen.
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung bestand darin, Tumormarker zur Identifizierung, zum Monitoring und zur Behandlung von Nierenzellkarzinomen bereitzustellen. Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch ein Verfahren zur Charakterisierung oder/und Identifizierung von Nierenzellkarzinom spezifischen Proteinen, welches folgende Schritte umfasst:

(a) Bereitstellen eines ersten und eines zweiten Extrakts, umfassend lösliche Proteine, worin zumindest der erste Extrakt aus Nierenzellkarzinomzellen gewonnen wird,
(b) Auftrennen des ersten und zweiten Extrakts mittels zweidimensionaler Gelelektrophorese, wobei ein erstes und zweites Proteommuster, jeweils bestehend aus einer Vielzahl von Proteinspezies erhalten wird,
(c) Vergleichen des ersten und zweiten Proteommusters und
(d) Charakterisierung oder/und Identifizierung von Nierenzellkarzinom spezifischen Proteinen.

Ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren, welches geeignet ist, mittels einer differenziellen Proteomanalyse Nierenzellkarzinom spezifische Tumormarker zu identifizieren, die für eine optimierte Diagnose, Prognose oder/und Behandlung von Nierenzellkarzinompatienten eingesetzt werden können.
In Tabelle 2 sind Proteine dargestellt, die in Nierenzellkarzinomzellen im Vergleich zu gesunden Nierenzellen diffentiell exprimiert sind. Eines oder mehrere dieser Proteine, insbesondere mindestens 5, mehr bevorzugt mindestens 10 dieser Gene, können zur Diagnose des Zustandes von Nierenzellen verwendet werden. Die in Tabelle 2 dargestellten Proteine eignen sich insbesondere als molekulare Marker für die Diagnose bzw. Prognose eines Nierenzellkarzinoms. Insbesondere sind die in Tabelle 2 dargestellten Gene bei der Initiierung oder/und Progression des Nierenzellkarzinoms involviert. Sie können deshalb als Marker für biologische Phänomene, wie beispielsweise Invasivität oder Metastasierung, verwendet werden und sind deshalb von großer Bedeutung für die Diagnose, Prognose bzw. Behandlung des Nierenzellkarzinoms.
Die erfindungsgemäß angewendete Proteomanalyse basiert insbesondere auf der Kombination von zweidimensionaler Gelelektrophorese für die Separierung und Quantifizierung von Proteinen, gekoppelt mit analytischen Methoden für die Proteinindentifikation, wie beispielsweise Massenspektrometrie und Proteinsequenzierung.
Die dabei aufgefundenen Proteine, welche in Tabelle 2 dargestellt sind, können insbesondere als Tumormarker oder als therapeutische Zielstruktur Verwendung finden. Darüber hinaus können diese Tumormarker in Immunoassays, wie bei der Protein-Chipherstellung, Verwendung finden. Zusätzlich können auch die kodierenden Nukleinsäuren zur DNA-Chip-Herstellung Verwendung finden.
Die identifizierten Tumormarker fallen im Wesentlichen in folgende Untergruppen: am Metabolismus beteiligte Proteine, mit Proliferation/Apoptose assoziierte Proteine, Struktur/Zytoskelettproteine, Onkogen/Tumorsupressorgen-assoziierte Proteine, Transporter von Substanzen, Adhäsionsproteine, Proteinprozessierungs/Abbau-Proteine, Tumorantigene, Stressproteine, putative Tumorantigene und unbekannte Proteine.
Ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Identifizierung von neuen Tumormarkern. Dabei soll mindestens eines der Proteine, die in Tabelle 1, 2 und 3 zusammengefasst sind, als genereller Tumormarker oder therapeutische Zielstruktur eingesetzt werden. Dabei sollen die in der Tabelle aufgeführten Tumormarker spezifisch beim Nierenzellkarzinom eingesetzt werden. Eine weitere Möglichkeit besteht in der Verwendung dieser Tumormarker in Immunoassays sowie in Protein- und DNA-Chip-Herstellung, welche dann wieder zum Monitoren eines großen Patientenstammes eingesetzt werden kann.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Identifizierung von Tumormarkern beim Nierenzellkarzinom, deren Expression durch Behandlung mit Antikörpern, die gegen G250 gerichtet sind, beeinflusst wird. Eine Voraussetzung stellt die Frequenzanalyse von G250-Oberflächenexpression auf Nierenzellkarzinomzelllinien und normalen Nierenepithelzellen dar. Durchflusszytometrische Analyse von 35 Nierenzellkarzinomzelllinien ergab, dass ca. 50 % der analysierten klarzelligen Nierenzellkarzinomzelllinien, nicht aber autologe normale Nierenepithelien G250-Antigen auf der Zelloberfläche exprimierten. Die G250-Expression variierte mit einer spezifischen mittleren Fluoreszenzintensität (MFI) von 2,6-33,2 jedoch stark zwischen den einzelnen Nierenzellkarzinomzelllinien. Dies führte zur Klassifizierung von „Iow", „medium" und „high"-G250-„Expressors".
Im weiteren Schritt wurden entsprechende „low", „medium" und „high" G250-exprimierende Zelllinien für unterschiedliche Zeitpunkte mit Antikörpern gegen G250 behandelt und das Protein-Expressionsmuster von unbehandelten mit dem von Antikörpern gegen G250-behandelten Tumorzellen verglichen. Die differenziell exprimierten Proteine wurden identifiziert, wobei die 2DE und Massenspektrometrie als Methoden eingesetzt wurden. Die identifizierten Proteine sind in Tabelle 1 zusammengefasst und können als Tumormarker in Immunoassays sowie für die Protein- und DNA-Chip-Herstellung, deren Einsatz dann eine Vorselektion eines großen Patientenstammes bezüglich eines putativen Ansprechens auf eine Antikörper-basierende Therapie ermöglicht, verwendet werden.
Bei den bei Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens identifizierten und charakterisierten Proteine handelt es sich im wesentlichen um

– Strukturproteine
– Chaperone
– Signaltransduktionsproteine
– am Metabolismus beteiligte Proteine
– am Proteinabbau/Prozessierung beteiligte Proteine
– an Apoptose/Zellzyklus beteiligte Proteine
– Transporterproteine
– Tumorantigene
– Immunophiline
– unbekannte Proteine.

Hierbei wurden ausschließlich mindestens 1,5fach regulierte, sowohl in positiver als auch in negativer Richtung, statistisch signifikant differenziell regulierte Proteine berücksichtigt.
Die in Tabelle 1 dargestellten Proteine können insbesondere. zum Monitoring des Behandlungserfolgs einer Behandlung mit Antikörpern gegen G250 eingesetzt werden. Darüber hinaus können sie herangezogen werden, um Kombinationspräparate zur Behandlung von Nierenzellkarzinomen bereitzustellen. Solche Kombinationspräparate enthalten neben dem Antikörper gegen G250 bevorzugt einen weiteren Wirkstoff, welcher das Major vault Protein, ein Protein ausgewählt aus Tabelle 3a oder 3b, oder ein Protein ausgewählt aus Vimentin, Moesin, Heat shock 27 kD Protein 1, Heat shock 90 kD Protein 1 Beta oder Aldehydreduktase beeinflusst. Durch die gezielte Kombination, ausgehend von den gefundenen, differenziell exprimierten Proteinen, kann einerseits der Behandlungserfolg verstärkt, andererseits gegebenenfalls auch die Ausbildung unerwünschter Nebenwirkungen unterdrückt werden.
Zur weiteren Verdeutlichung der vorliegenden Erfindung dienen folgende Beispiele, Abbildungen und Tabellen.
1 zeigt die G250-Expression in unterschiedlichen Nierenzellkarzinomzelllinien.
2 zeigt FACS-Diagramme von zwei unterschiedlichen G250-Phänotypen in Nierenzellkarzinomen.
Tabelle 1 zeigt Proteine, die in mit einem Antikörper G250 behandelten Nierenzellkarzinomzelllinen differenziell zu unbehandelten Nierenzellkarzinomzelllinien exprimiert werden.
Tabelle 2 zeigt in Nierenzellkarzinomläsionen im Vergleich zu gesundem Nierenepithel differenziell exprimierte Proteine.
Tabelle 3 zeigt signifikante Subgruppen von G250-regulierten Proteinen.
Beispiel 1:
Expression von G250 auf der Oberfläche von Nierenzellkarzinomzelllinien zur Auswahl geeigneter Zelllinien zur Detektion von G250-regulierten Tumormarkern (Tabelle 1, 3)
(i) FACS-Analyse
Es wurden insgesamt 35 humane Nierenzellkarzinomzelllinien, die von chirurgisch entferntem Nierentumorgewebe abstammen, sowie autologe Nierenzellepithelien auf G250-Oberflächenexpression analysiert. In 18 von 35 Nierenkarzinomzelllinien wurde mittels Durchflusszytometrie G250-Oberflächenexpression nachgewiesen, wobei die Expression zwischen den verschiedenen Zelllinien stark variierte (1 und 2).
Für die nachfolgenden Proteomanalysen wurden bisher 4 verschiedene G250-exprimierende Nierenzellkarzinomzelllinien ausgewählt: eine „low„-, eine „medium„- und zwei „high"-Expressor. Diese Zellen wurden in Anwesenheit bzw. Abwesenheit von G250 (5 μg/ml) für 24 bzw. 48 Stunden und 21 Tage inkubiert, bevor Proteinextrakte hergestellt wurden.
(ii) 24 Stunden-Behandlung der Nierenzellkarzinomzelllinien mit G250

– Zellen ausplattieren, so dass ca. 50 % konfluent
– 1 Tag in Medium stehen lassen
– Zugabe von neuem Medium, davon 5 T125-Flaschen unbehandelt, 5 T125 Flaschen mit G250 5,3 μg/ml (entspricht 30 μ1 [5 mg/ml] auf 28 ml Medium)
– nach 24 Stunden Ernte der Zellen
– 2* waschen in PBS
– Trypsinisieren
– 3* waschen in PBS
– Überstand abnehmen
– trockenes Pellet in flüssigen Stickstoff, anschließend bei -80 ° C lagern

(iii) 21 Tage-Behandlung der Nierenzellkarzinomzelllinien mit G250
Zellen werden nicht gesplittet, Medium-Wechsel nach folgendem Plan
Tag 1: Zellaussaat, Medium + G250
Tag 4: Zugabe G250
Tag 8: Mediumwechsel + G250
Tag 11: Zugabe von G250
Tag 14: Zugabe von G250
Tag 15: Mediumwechsel + G250
Tag 19: Zugabe von G250
Tag 22: Zugabe von G250
Tag 23: Ernte
G250: Zugabe von 30 μl einer 5 mg/ml Lösung auf 25 ml Medium in T175-Flasche
Zellen werden gesplittet
Tag 1: 5 × 106 Zellen/T125 Flasche ± G250
Tag 4: Zugabe G250
Tag 8: Mediumwechsel + G250 / splitten
Tag 11: Zugabe von G250
Tag 14: Zugabe von G250
Tag 15: Mediumwechsel + G250/splitten
Tag 19: Zugabe von G250
Tag 22: Zugabe von G250/splitten
Tag 23: Ernte
G250: Zugabe von 30 μl einer 5 mg/ml Lösung auf 25 ml Medium in T175-Flasche
Probenmaterial
Als Probenmaterial dienen behandelte bzw unbehandelte Nierenkazinomzelllinien, z.B. MZ 1846RC. Zur statistischen Absicherung werden von jeder Probe fünf 2D-Gel-Replikate angefertigt, welche anschließend computerdensitometrisch vergleichend ausgewertet werden.
Probenaufbereitung
Das Zellpellet wird in flüssigem Stickstoff mit einem Mörser fein gemahlen. 3 mg werden hieraus in 200 μL Lysispuffer gelöst. Mit dem Ultraschallstab wird unter Eiswasserbadkühlung die Suspension behandelt (10 × 0,5 s). Nun wird mit 800 μl Lysispuffer verdünnt und 30 Minuten bei Raumtemperatur geschüttelt. Zum Schluss wird 10 Minuten bei 20 ° C und 14000 xg zentrifugiert, der Überstand abgenommen und portioniert bei –80 ° C eingefroren. Die Proteinkonzentration wird mittels der Bradfordmethode bestimmt.
Beispiel 2 (Tabelle 2):
Tumormarker des Nierenzellkarzinoms, welche in Nierenzellkarzinomzellen und normalen Nierenzellen differenziell exprimiert werden
Probenmaterial
Es wird Nierengewebe von sechs Patienten verglichen, von denen drei Nierentumor-negativ und drei Nierentumor-positiv waren. Für die statistische Absicherung werden von jeder Probe fünf Proteomexponate angefertigt, welche anschließend computerdensitometrisch vergleichend ausgewertet werden.
Probenaufbereitung
Das Nierengewebe wird in flüssigem Stickstoff mit einem Mörser fein gemahlen. 3 mg werden hieraus in 200 μL Lysispuffer gelöst. Mit dem Ultraschallstab wird unter Eiswasserbadkühlung die Suspension behandelt (10 × 0,5 s). Nun wird mit 800 μl Lysispuffer 1 verdünnt und 30 Minuten bei Raumtemperatur geschüttelt. Zum Schluss wird 10 Minuten bei 20 ° C und 14000 xg zentrifugiert, der Überstand abgenommen und portioniert bei –80 ° C eingefroren. Die Proteinkonzentration wird mittels der Bradfordmethode bestimmt.
Beispiel 3
Proteomanalyse
Rehydration der Fokussierungsstreifen (Immobiline Dry Strips)
Die Fokussierungsstreifen (T = 4 %, C = 3 %, pH 4–7) werden im getrockneten und gefrorenen Zustand geliefert. Für den Gebrauch werden sie über Nacht in einem Reswelling Tray in Rehydratisierungspuffer gequollen. Für einen 18 cm lange Streifen verwendet man 400 μL Rehydratisierungspuffer.
Fokussierung (erste Dimension)
Die Kühlung der Fokussierungsapparatur wird auf 20 ° C eingestellt. Die über Nacht rehydrierten Streifen werden nach der Quellung kurz in bidestilliertes Wasser getaucht und auf einem feuchten Elektrodenpapier abgelegt, das wiederum auf einem trockenen Filterpapier liegt. Auf den Streifen legt man nun ein weiteres feuchtes Filterpapier und ein trockenes Filterpapier. Nun übt man leichten Druck aus, um die überschüssige Feuchtigkeit aus dem Streifen zu entfernen. Nach dem Auflegen der Fokussierungsstreifen in die Fokussierungskammer wird die Probe auf das Gel appliziert. Die Probelösungen werden mit Bromphenolblau gefärbt, um die Dichtigkeit der Applikationscups zu kontrollieren. Die Fokussierung läuft über Nacht und ist nach 38,7 kVh beendet. Fokussierungsprogramm für pH 4–7:
Guss der Gele für die zweite Dimension
Die 1,5 l Gellösung für den Gelguss wird am Vortag hergestellt und entgast. In einer verschlossenen Flasche wird die Lösung über Nacht in einem Kühlschrank auf ca. 4° C gekühlt. Das Reservoir der Gusskammer wird mit einem Trichter verschlossen und darin eine Glycerinlösung (500 ml) eingefüllt. Direkt vor dem Guss wird die vorbereitete Gellösung 3 aus dem Kühlschrank genommen und 72 μl TEMED bzw. 7,2 ml APS-Lösung eingerührt und diese Lösung durch einen Trichter in die Gusskammer gefüllt. Ist die gesamte Gellösung in der Kammer, nimmt man den Trichter weg und lässt die Glycerinlösung aus dem Reservoir einlaufen. Diese drückt die Gellösung aus den Einfüllschlauch und dem unteren Teil der Gusskammer, so dass sich die Gellösung nur noch in den Gusskassetten befindet. Möglichst schnell werden dann die Gele mit wassergesättigtem Butanol 7 überschichtet. Die Menge der Gellösung und der Glycerinlösung 6 richtet sich nach der Anzahl der eingesetzten Gusskassetten und ist auch abhängig vom Volumen der Gusskammer. Nach drei Stunden kann man die auspolymerisierten Gele aus der Kassette entnehmen.
Zweite Dimension
In der Hoefer Dalt-Kammer wird der Tankpuffer (20 l) angerührt und auf ca. 13 ° C gekühlt. Bis zum Gebrauch werden die Gele in ihren Kassetten mit bidestilliertem Wasser überschichtet. Auf die Oberseite eines jeden Gels wird ein kleiner Filterpapierstreifen mit 5 μL einer Proteinstandardlösung eingefügt (Marker). Die gefrorenen Fokussierungsstreifen werden zuerst in einem Reagenzglas mit 10 ml (für zwei Streifen in einem Reagenzglas) einer frischen DTT-Lösung 10 Minuten äquilibriert. Danach wird die Lösung gegen 10 ml einer frischen bromphenolblaugefärbten lodacetamidlösung ausgetauscht und wieder 10 Minuten geschüttelt.
Das Wasser in den Gusskassetten wird abgegossen, die fokussierten IPG Streifen kurz in den Tankpuffer getaucht, und horizontal auf das Gel appliziert.
Marker und IPG Streifen werden nun mit einer heißen Agaroselösung überschichtet. Sobald die Agarose fest geworden ist, können die Gele in ihren Kassetten in die Hoefer Dalt-Kammer eingebaut werden. Überschüssiger Tankpuffer wird entfernt und das Elektrophoreseprogramm gestartet. Die Einlaufphase (Schritt 1) läuft 50 Vh. Die Hauptphase (Schritt 2) läuft solange, bis die Bromphenolblaufront das untere Ende des Gels erreicht hat. Die Gele werden nun aus den Kassetten entnommen und durch bidestilliertes Wasser gezogen. Elektrophoreseprogramm:
Färbung der Gele
Jedes Gel wird in einer eigenen Schale gefärbt. Zuerst wird mit 330 ml eines Ethanol/Essigsäure-Gemischs 30 Minuten fixiert. Danach wird drei Stunden der SyproRuby-Lösung (330 μl) unter Lichtabschluss gefärbt. Mit 330 ml des Ethanol/Essigsäure-Gemischa wird dann der Hintergrund 30 Minuten unter Lichtabschluss entfärbt. Vor dem Scannen mit dem Fluoreszenzscanner wird das Gel zweimal durch bidestilliertes Wasser gezogen, um letzte Reste des Farbstoffs zu entfernen. Nach dem Scannen wird das Gel in einer kolloidalen Coomassiefärbelösung über Nacht geschüttelt. Am nächsten Tag werden die gefärbten Gele in bidestilliertem Wasser geschüttelt. Ist der Hintergrund entsprechend entfärbt, kann das Gel mit dem visuellen Scanner aufgenommen werden.
Computerdensitometrie der 2D Gele
Die Evaluierung der Gele wird mit der Bildauswerte-Software PD Quest (Version 6.2.1, Fa. Bio Rad) durchgeführt. Dafür werden jeweils 5 2D-Gele pro Gruppe gegeneinander gematched. Die Auflösung der Tiff-Files der Gele (16bit) beträgt 254 dpi. Es werden solche Spots als signifikant angesehen, die folgende Kriterien erfüllen:

– Standardabweichung ein- und desselben Spots innerhalb einer Gruppe ist ≤ 30 %
– parametrischer Signifikanztest (student T-Test) wird angewendet
– die Spotveränderung zwischen 2 Gruppen weist einen „confidence level" von ≤ 0,05 auf
– Regulationsfaktor eines Spots zwischen 2 Gruppen ist ≥ 1,5

Zusätzlich werden auch solche Spots als signifikant erachtet, die eine komplette Deregulierung zwischen 2 Gruppen aufweisen. Dabei werden innerhalb der Gruppe des vorhandenen Spots auch Standardabweichungen > 30 % zugelassen.
MALDI – TOF-Massenspektrometrie (MS) der Targetproteine
Die computerdensitometrisch detektierten Targetproteine werden nun aus dem Polyacrylamidgel ausgestochen und mit Trypsin verdaut. Die erhaltenen Peptide werden mit Acetonitril/0,1 % TFA aus dem Gel eluiert und sodann mit einer C18 ZipTip Säule entsaltzt. Diese Extrakte werden nun mit 2,5-Dihydroxybenzoesäure cokristallisiert und auf eine MALDI-MS-Targetplatte pipettiert.
Diese kristallisierten Peptide werden anschließend im MALDI-TOF-Massenspektrometer (Voyager STR, Applied Biosystems) mit einem N2-Laser (337 nm) ionisiert. Die Ionen werden durch Spannungen von 20–25 kV beschleunigt und zugleich deren Flugzeit, welche massenspezifisch ist, gemessen. Nach Auswertung der entstehenden Spektren lassen sich durch Datenbankrecherchen die einzelnen Proteine identifizieren.

Claims

Verfahren zur Charakterisierung oder/und Identifizierung von Nierenzellkarzinom spezifischen Proteinen, welches folgende Schritte umfasst: (a) Bereitstellen eines ersten und eines zweiten Extrakts, umfassend lösliche Proteine, worin zumindest der erste Extrakt aus Nierenzellkarzinomzellen gewonnen wird, (b) Auftrennen des ersten und zweiten Extrakts mittels zweidimensionaler Gelelektrophorese, wobei ein erstes und zweites Proteommuster, jeweils bestehend aus einer Vielzahl von Proteinspezies, erhalten wird, (c) Vergleichen des ersten und zweiten Proteommusters und (d) Charakterisierung oder/und Identifizierung von Nierenzellkarzinom spezifischen Proteinen.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der erste Extrakt aus Nierenzellkarzinomzellen, vorzugsweise aus Gewebebiopsien von Patienten, und der zweite Extrakt aus normalen Nierenzellen gewonnen wird.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der erste Extrakt aus unbehandelten und der zweite Extrakt aus behandelten Nierenzellkarzinomzellen gewonnen wird.
Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass zur Behandlung der Nierenzellkarzinomzellen polyklonale oder/und monoklonale Antikörper, Antikörperfragmente, single-chain, bispezifische, chimärisierte oder/und humanisierte Antikörper verwendet werden, die mindestens gegen ein nierenzellkarzinomspezifisches Antigen gerichtet sind.
Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass das spezifische Antigen G250 ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die zur Behandlung verwendeten Antikörper gegen das Antigen G250 gerichtet sind.
Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass der Antikörper der chimäre monoklonale Antikörper cG250 ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, worin die zweidimensionale Gelelektrophorese folgende Schritte umfasst: (a) Auftrennung der Extrakte in einer ersten Dimension entsprechend des isoelektrischen Punkts, (b) gefolgt von einer Auftrennung in einer zweiten Dimension entsprechend der Größe.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, worin Nierenzellkarzinom spezifische Proteinspezies ausgewählt werden, die (a) an verschiedenen Positionen auf den zweidimensionalen Gelen, die von dem ersten bzw. zweiten Extrakt erhalten werden, lokalisiert sind oder/und (b) unterschiedliche Intensitäten auf den zweidimensionalen Gelen des ersten und zweiten Extrakts besitzen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Proteinspezies durch Peptid-Fingerprinting charakterisiert werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Proteinspezies durch Massenspektroskopie charakterisiert werden oder/und wenigstens teilweise sequenziert werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 1 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Zellen, aus denen die Extrakte gewonnen werden, Säugerzellen sind.
Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass die verwendeten Zellen humane Zellen sind.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, worin die Nierenzellkarzinom spezifischen Proteinspezies ausgewählt werden aus Serumproteinen, Strukturproteinen, Signalübertragungsproteinen, Proteasom-Untereinheiten, Stressfaktoren, Tumorantigenen, Onkogenen, Apoptose- und Profliferations assoziierten Proteinen, Transporterproteinen, Adhäsionsproteinen oder/und Metabolismus- und Proteinprozessierungs assoziierten Proteinen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, welches den zusätzlichen Schritt umfasst: (e) Charakterisierung oder/und Identifizierung von Nierenzellkarzinom spezifischen Proteinen bei einem an Nierenzellkarzinom erkrankten Patienten.
Proteom einer Nierenzellkarzinomzelle, bestehend aus einem Muster von individuellen Proteinen, welches über ein Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15 erhältlich ist.
Proteom nach Anspruch 16, enthaltend wenigstens einen Teil der in Tabelle 1, 2 oder 3 dargestellten Proteine.
Nierenzellkarzinom assoziierte Proteine oder/und modifizierte Proteine, ausgewählt aus der Gruppe Serumproteine, Strukturproteine, Signalübertragungsproteine, Proteasom-Untereinheiten, Stressfaktoren, Tumorantigene, Onkogene, Apoptose- und Profliferations assoziierte Proteine, Transporterproteine, Adhäsionsproteine oder/und Metabolismus- und Proteinprozessierungs assoziierte Proteine.
Nierenzellkarzinom assoziierte Proteine oder/und modifizierte Proteine, wie in Tabelle 1, 2 oder 3 angegeben oder proteolytische Fragmente davon.
Antikörper, gerichtet gegen ein Protein nach einem der Ansprüche 18 oder 19.
Verwendung eines Proteoms nach Anspruch 16 oder 17 oder/und eines Proteins nach einem der Ansprüche 18 oder 19 oder/und eines Antikörpers nach Anspruch 20 für die Diagnose, Prognose, Prävention oder Therapie von Nierenzellkarzinom.
Verwendung eines Proteoms von Anspruch 1'6 oder 17 oder/und eines Proteins nach einem der Ansprüche 18 oder 19 oder/und eines Antikörpers nach Anspruch 20 für die Identifizierung von pharmakologisch aktiven Substanzen.
Verwendung der kodierenden Nukleinsäuresequenz oder/und einer Variante davon eines Proteins nach einem der Ansprüche 18 oder 19 für die Diagnose, Prognose, Prävention, Therapie von Nierenzellkarzinom oder/und die Identifizierung von pharmakologisch aktiven Substanzen.
Verwendung nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure eine DNA oder RNA, vorzugsweise eine DNA, insbesondere eine doppelsträngige DNA, ist.
Verwendung nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure ihre antisense Sequenz aufweist.
Verwendung von mindestens einem der Proteine nach einem der Ansprüche 18 oder 19 oder/und mindestens eines Antikörpers nach Anspruch 20 zur Herstellung eines Protein-chip-assays für die Diagnose oder/und Prognose von Nierenzellkarzinom, insbesondere zum Monitoren von Patienten.
Proteinchip, erhältlich nach Anspruch 26.
Verwendung von mindestens einer kodierenden Nukleinsäuresequenz oder/und einer Variante davon eines Proteins nach einem der Ansprüche 18 oder 19 zur Herstellung eines Nukleinsäure-Chip-assays, insbesondere eines DNA-chip-assays, für die Diagnose oder/und Prognose von Nierenzellkarzinom, insbesondere zum Monitoren von Patienten.
Nukleinsäure-Chip, erhältlich nach Anspruch 28.
Verwendung von Antikörpern gegen eines der Proteine aus einem der Ansprüche 18 oder 19 zur Herstellung eines Immunoassays für die Diagnose oder/und Prognose von Nierenzellkarzinom, insbesondere zum Monitoren von Patienten.
Verwendung von Antikörpern gegen wenigstens eines der Proteine aus einem der Ansprüche 18 oder 19 zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung von Nierenzellkarzinom.
Verwendung von polyklonalen Antikörpern, monoklonalen Antikörpern, F(ab')₂, Fab' oder Fab Antikörperfragmenten, single-chain Antikörpern, bispezifischen Antikörpern, chimärisierten Antikörpern oder/und teilweise oder vollständig humanisierten Antikörpern gegen eines der Proteine nach einem der Ansprüche 18 oder 19 zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung in Kombination mit Zytokinen, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: Interleukinen IL-2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1 1, 12, 13, 14, und 15, Interferonen IFN-α, IFN-β und IFN-γ, Tumor nekrose Faktor TNF-α, TNF-β, nerve growth factor (NGF), Liganden von CD40, FAS, CD 27 und CD 30, Macropphage inhibiting protein (MIP), Rantes, aktive Fragmente hiervon oder/und pharmazeutisch geeignete Analoga und Derivate sowie geeignete Kombinationen zur Behandlung von an Nierenzellkarzinom erkrankten Patienten.
Verwendung von Antikörpern, monoklonalen Antikörpern, F(ab')₂, Fab' oder Fab Antikörperfragmenten, single-chain Antikörpern, bispezifischen Antikörpern, chimärisierten Antikörpern oder/und teilweise oder vollständig humanisierten Antikörpern gegen eines der Proteine nach einem der Ansprüche 18 oder 19 zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung in Kombination mit niedermolekularen Wirkstoffen (Molekulargewicht ≤ 2000 Da) zur Behandlung von an Nierenzellkarzinom erkrankten Patienten.
Verwendung von Antikörpern, monoklonalen Antikörpern, F(ab')₂, Fab' oder Fab Antikörperfragmenten, single-chain Antikörpern, bispezifischen Antikörpern, chimärisierten Antikörpern oder/und teilweise oder vollständig humanisierten Antikörpern gegen eines der Proteine aus einem der Ansprüche 18 oder 19, dadurch gekennzeichnet, dass diese in Form von Konjugaten mit einer Markierungsgruppe und/oder cytotoxischen Gruppe vorliegen.
Verwendung nach Anspruch 34, dadurch gekennzeichnet, dass die cytotoxische Gruppe ausgewählt wird aus Radionukliden und Toxinen.
Pharmazeutische Zusammensetzung, dadurch gekennzeichnet, dass sie als wirksame Komponente umfasst: (a) einen Antikörper, monoklonalen Antikörper, F(ab')₂, Fab' oder Fab Antikörperfragment, single-chain (Einzelketten-) Antikörper, bispezifischen Antikörper, chimärisierten Antikörper oder/und teilweise oder vollständig humanisierten Antikörper, der gegen das Antigen G250 gerichtet ist und (b) zusätzlich einen Wirkstoff, insbesondere einen weiteren Antikörper oder/und einen niedermolekularen Wirkstoff, der wenigstens ein Protein aus Tabelle 1 derart beeinflusst, dass die pharmazeutische Zusammensetzung die therapeutische Wirkung eines ersten Antikörpers oder Derivats davon alleine, positiv beeinflusst (verstärkt).
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 35 bis 36, dadurch gekennzeichnet, dass der verwendete Antikörper cG250 ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 36 oder 37, durch gekennzeichnet, dass der weitere Wirkstoff das Major vault protein (MVP) beeinflusst.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 36 oder 37, dadurch gekennzeichnet, dass der weitere Wirkstoff Proteine, ausgewählt aus Tabelle 3a oder 3b, beeinflusst.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 36 bis 39, dadurch gekennzeichnet, dass der weitere Wirkstoff wenigstens eines der Proteine Major vault protein (MVP, Vimentin (NCBI 3402191, Moesin (NCBI 4505257), Heat shock 27 kD Protein 1 (NCBI 4504517), Heat shock 90kD Protein 1 beta (NCBI 6680307) oder Aldehyde Reductase (NCBI 1633300) beeinflusst.
Verfahren zum Auffinden von niedermolekularen Wirkstoffen, welche Nierenzellkarzinomzellen beeinflussen, dadurch gekennzeichnet, dass man zur Bestimmung der niedermolekularen Wirkstoffe ein Proteom nach Anspruch 16 oder 17 oder/und ein Protein nach einem der Ansprüche 18 oder 19 oder/und einen Antikörper nach Anspruch 20 verwendet.
Synthetische DNA, kodierend für ein Protein nach einem der Ansprüche 18 oder 19.
Protein nach Anspruch 18 oder 19, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um ein rekombinant hergestelltes Protein handelt.
Verwendung nach eines Proteins nach Anspruch 18 oder 19 oder eines rekombinanten Peptids nach Anspruch 43 zur Herstellung von gegen diese Proteine gerichteten Antikörpern.
Verwendung eines Antikörpers nach Anspruch 44 zur Herstellung eines diagnostischen oder/und therapeutischen Mittels zur Behandlung von Nierenzellkarzinomen.