DE3879684T2

DE3879684T2 - Von protein ps2 abgeleitete peptide.

Info

Publication number: DE3879684T2
Application number: DE8888910051T
Authority: DE
Inventors: Jean-Pierre Bellocq; Pierre Chambon; Marie-Christine Rio
Original assignee: Aderegem
Current assignee: Aderegem
Priority date: 1987-10-30
Filing date: 1988-10-28
Publication date: 1993-08-19
Anticipated expiration: 2008-10-29
Also published as: JP2648952B2; FR2622700B1; JPH02501746A; DE3879684D1; FR2622700A1; EP0345315A1; ATE87316T1; EP0345315B1; WO1989003845A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Identifizierung der Sequenz des sezernierten Proteins pS2 in verschiedenen menschlichen Geweben und humoralen Flüssigkeiten sowie die Peptidfragmente dieses Proteins. Die vorliegende Erfindung betrifft ebenso polyclonale und monoclonale Anti-pS2-Antikörper sowie Anti-Peptidfragmente des Proteins pS2 und die Verwendungen dieses Proteins dieser Peptide und dieser Antikörper zur Diagnose und zum Nachweis verschiedener pathologischer Zustände und insbesondere von hormonabhängigen Bbrustkrebsformen, Magenkrebs oder Magengeschwüren.
Die Hormonabhängigkeit von Brustkrebs ist eine seit 1896 bekannte Tatsache, als Beatson [Lancet (1986), 2, 104-107] zwei Beobachtungen von Regression von inoperierbaren Tumoren nach Ovariectomie bei Frauen, die noch ihre Periode hatten, beschrieb. Es ist nun eine etablierte Tatsache, daß etwa ein Drittel der Brustkrebsformen auf Hormone ansprechen und nach verschiedenen hormonalen Manipulationen Regression zeigen
Bis in den letzten Jahren gab es keinen biochemischen Test, um die Frauen, die von hormonabhängigem Krebs befallen waren, zu identifizieren und die somit von einer endocrinen Therapie profitieren könnten. 1971 haben Jensen und Mitarbeiter [NATL CANCER INSTI. MONOGR. (1971) 34, 55-70] als erste gezeigt, daß die Messung der Östrogenrezeptoren in einem Tumorabstrich zur Vorhersage einer Antwort auf die Entfernung der Nebennieren nützlich sein könnnte. Diese Beobachtung wurde seither reichlich bestätigt, da 50 bis 65% der Frauen, deren Tumore Östrogenrezeptoren (RE) enthalten, auf eine endocrine Therapie ansprechen, während diejenigen, deren Tumore keine Rezeptoren enthalten, bestenfalls nur eine 10%ige Chance durch eine Hormonbehandlung geheilt zu werden, besitzen.
In der Tat, wenn die Krebszellen Stellen mit einer starken Affinität für ein Hormon besitzen (d.h. einen Rezeptor), Stellen die normalerweise in der Brustdrüse vorhanden sind, kann ihr Wachstum, wie das der normalen Zellen, durch die hormonale Umgebung reguliert werden. Im Gegensatz dazu, wenn die Krebszellen ihre Rezeptoren im Verlauf der malignen Transformation verlieren, werden sie nicht mehr als Zielzellen erkannt. Indes gestattet das Ergebnis der Bestimmung der Östrogenrezeptoren (RE) keine perfekte Vorhersage des Ansprechens auf eine Hormontherapie, da nur 55 bis 65% der Frauen, deren Tumore Rezeptoren besitzen, günstig auf eine Hormonbehandlung ansprechen. Eine der Erklärungen liegt in der Tatsache, daß im Verlauf der Entdifferenzierung bestimmte Tumore ihre Östrogenrezeptoren verlieren können. Wenn diejenigen überleben, können sie die Fähigkeit, Östrogen zu binden, beibehalten, aber sie können nicht die letzten Schritte der Östrogenwirkung nachvollziehen. Es handelt sich in den beiden Fällen um Tumore, die hormonmäßig autonom oder hormonresistent sind. Um diese zuletzt genannte Hypothese zu verifizieren, ist man bis zum Anfangsschritt gegangen, d.h. bis zur Bindung an den Cytosolrezeptor und hat Endprodukte der intracellulären Östrogenwirkung gesucht. Das ist beispielsweise der Fall bei dem Progesteronrezeptor (RP), da seine Synthese unter Wirkung von Östrogenen in den MCF-7-Zellen (Zellinie abgeleitet von einem menschlichen Brustkrebs) stattfindet und wahrscheinlich in den menschlichen Brustkrebszellen in vivo. In der Tat, wenn man den Gehalt der Progesteronrezeptoren berücksichtigt, liegt der Gehalt an Remission bei Krebsarten unter Hormonbehandlung in der Größenordnung von 65%. Zahlreiche klinische Tests haben festgestellt, daß 80% der Frauen, deren Tumore, die zwei Rezeptoren besitzen, auf eine Hormontherapie ansprechen. Im Gegensatz, wenn der Tumor Östrogenrezeptoren aber keine Progesteronrezeptoren enthält, entspricht die Wahrscheinlichkeit des Ansprechens nur einem Drittel der Fälle. Die Progesteronrezeptoren (RP) fügen somit der Vorhersage des therapeutischen Ansprechens eine Zusatzinformation hinzu.
Die östrogene stimulierende Synthese einer großen Anzahl von Proteinen, die in dem Inkubationmedium von Zellinien, wie MCF-7, freigesetzt werden. Die meisten sezernierten Proteine werden in dem Inkubationsmilieu mit oder ohne Östradiol detektiert, aber ihre Aktivität wird sehr deutlich in Gegenwart dieses Hormons erhöht. Sie entsprechen Molekulargewichten von 37 000, 46 000, 54 000, 60 000 M [MAIRESSE et al. in RECENT RESULTS IN CANCER RESEARCH, G. LECLERCQ, S. TOMA, R. PARIDAENS, J.C. HEUSEN, Bd. 91, (1984) 301-306]. Bestimmte von ihnen (46 000, 54 000 und 60 000 M) sind mit Cytosolproteinen identisch. Ein Protein mit 50 000 M ist in dem Inkubationsmilieu, das durch Östradiol behandelt wird, reichlicher vorhanden, aber die Arbeiten von MAIRESSE zeigen, daß es sich um eine Stimulierung der Sekretion dieses Proteins unter der Wirkung eines Hormons eher als um eine Induktion handelt. Außerdem liegen die stimulierten Proteine in gleicher Weise im Inkubationsmilieu der MCF-7-Zellen vor und sind ebenso im Inkubationsmilieu der östrogenunabhängigen Evsa-T-Zellen vorhanden, aber Östradiol hat in diesem zuletzt genannten Milieu keine Wirkung auf die Synthesen und/oder ihre Sekretion. Es handelt sich dennoch nicht um eine Induktion eines neuen Produkts unter dem Einfluß eines Hormons, sondern nur um eine Erhöhung der Konzentration eines vorhandenen Produkts.
ROCHEFORT (gleiche Publikation wie vorstehend, Seiten 289-294) wies einen erhöhten Gehalt an Protein 52 K im Inkubationsmedium nach und zeigte, daß die Induktion dieses Proteins für die Östradiolwirkung bei physiologischen Konzentrationen spezifisch war, während Progesteron und Dexamethason inaktiv waren. Tamoxifen, das das Zellwachstum hemmt, induziert keine Sekretion des Proteins 52 K und verhindert die Östradiolwirkung in einem Molverhältnis von 10. Einer seiner Metaboliten, Monohydroxy-Tamoxifen, ist zweihundert Mal wirksamer als Tamoxifen, hinsichlich der Blockierung des Zellwachstums und der Sekretion von 52 K in den MCF-7-Zellen. Jüngst konnte die gleiche Gruppe bestätigen, daß eine Variante der MCF-7-Zellen, die R-27-Zellen, die RE und RP besitzen, deren Wachstum aber nicht der Wirkung der Antiöstrogene gehorcht, das Protein 52 K in Gegenwart von Tamoxifen oder Monohydroxy-Tamoxifen weiter sezerniert wird.
Eine Gruppe von Forschern, unter denen sich einige Erfinder der vorliegenden Anmeldung befinden, hat sich die Expression spezifischer Gene zum Ziel gesetzt. Ausgehend von einer cDNA-Bank, die von MCF-7-Zellen, die durch Östradiol induziert waren, konstruiert wurde, war es möglich, differential cDNAs entsprechend mRNAs, die in Gegenwart dieses Hormons synthetisiert wurden, zu clonieren. Mit Hilfe einer cDNA-Sonde, die ausgehend von Zellen, die in Gegenwart und Abwesenheit des Hormons wachsen, konnte ein cDNA-Clon, der einer mRNA entspricht, die nur in Gegenwart von Östradiol gezüchteten MCF-7-Zellen vorhanden ist, isoliert werden. Er wurde pS2 genannt. Die Autoren haben die Bestimmung der Nukleotidsequenz der clonierten cDNA abgeleitet, bei der es sich um ein Protein aus 84 Aminosäuren mit niedrigen Molekulargewicht, 9140 Dalton, handelt [JAKOWLEW et al. NUCLEIC ACIDS RES, (1984) 12, 2861-2878]. Die hormonale Regulation, die über das pS2-Gen abläuft, findet auf der Ebene der Transkription statt. Das Gen wird in Abwesenheit von Östradiol nicht transkribiert, obwohl die Anhäufung der mRNA acht Stunden nach Zugabe des Hormons zu dem Kulturmilieu einen Nettowert erreicht. Die Autoren haben indes noch nicht das pS2-Protein isoliert. Das Absuchen der cDNA-Bank, die ausgehend von MCF-7-Zellen, die durch Östradiol induziert wurden, konstruiert wurde, gestattete ebenso die Isolierung von zwei anderen Clonen 36 B4 und 3 A5. Keine hormonale Regulation wird auf der Transkriptionsebene ihres entsprechenden Gens ausgeübt. Diese zwei Clone wurden als konstante Clone bezeichnet. Die Sonden 36 B4 und 3 A5 können so zur Abschätzung der Menge der vorhandenen gesamten mRNA verwendet werden, während die pS2-Sonde einer spezifischen Östragen-induzierten RNA der MCF-7- Zellen entspricht. Die pS2-RNA ist in dem RNA-Extrakt der menschlichen Brustkrebszellen T 47 D nicht vorhanden, die gleichzeitig die Östrogen- und Progesteronrezeptoren enthalten, aber in denen das Vorliegen des letzteren Rezeptors konstitutiv ist. Umgekehrt ist die RNA 36 B4 in den T-47-D-Zellen vorhanden.
JELTSCH et al. [NUCLEIC ACID RES, (1987), 15, S 1401-1414] haben schließlich das menschliche pS2-Gen, ausgehend von DNA von Placenta-Zellen und Zellen der Zellinie MCF-7 cloniert und haben seine Struktur studiert und haben die Nukleotidsequenz des pS2-Gens, ausgehend von den Clons pS2M, erhalten aus der Zellinie und aus dem Clon pS2P, erhalten aus Placenta-Zellen, aufgestellt und schließlich bestätigt.
Die Beobachtung, daß die pS2-RNA in der Zellinie MCF-7, die von einem menschlichen Brustkrebs abgeleitet ist, exprimiert wird, aber nicht in der Zellinie T 47 D, zeigt einen Weg zur Identifizierung von hormonabhängigen Brustkrebsarten an. Aus diesem Grund versuchten die Erfinder zu verifizieren, ob die Expression des Gens pS2 einen supplementären Marker zum Screening auf hormonabhängige Brustkrebse darstellen kann.
Jüngst [RIO et al., SCIENCE (1988), 241, S. 705-707] wurde das Protein pS2 in Zellen aus dem Schleim des Magenepithels nachgewiesen. Das in den Magensaft sezernierte Protein zeigt eine elektrophoretische Wanderung, die derjenigen, die für das durch die MCF-7-Zellen sezernierte Protein beobachtet wurde, und die in dem vorstehend zitierten Artikel zusammengetragenen Arbeiten zeigen, daß die Größe und die Sequenz der aus den zwei Geweben isolierten mRNAs streng identisch sind.
Es ist daran zu erinnern, daß die Sequenz (I), die für das Protein pS2 aus mRNA bestimmt wurde, 84 Aminosäuren besitzt, ein Molekulargewicht in der Größenordnung von 9140 Dalton besitzt und wie folgt lautet:
Auch konnten die Erfinder feststellen, daß es sich nicht um die Sekretionsform des Peptids pS2 handelt.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist folglich die Identifizierung der vollständigen tatsächlichen Primärsequenz des Peptids pS2, sezerniert in verschiedene Gewebe, seine Erzeugung auf genetischem Weg, insbesondere durch Synthese in einem Vektor und einem geeigneten Wirt und die Erzeugung von verwendbaren Antikörpern, unter anderem zum Screening bzw. Nachweis und der Diagnose pathologischer Zustände.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Peptid, das dadurch gekennzeichnet ist, daß es aus einem Fragment, das 60 Aminosäuren des Proteins der vorstehend identifizierten Sequenz (I) entspricht, besteht, daß dieses Peptid der Sekretionsform entspricht, und daß es durch die Sequenz GLU - ALA - GLN beginnt, wobei GLU sich in der 25. Position nach dem N-terminalen MET des Proteins der anfangs identifizierten Sequenz (I) befindet und daß sein Molekulargewicht etwa 6600 Da beträgt.
Erfindungsgemäß besitzt das Peptid pS2 aus 60 Aminosäuren die folgende Sequenz (D):
Ebenso erfindungsgemäß umfaßt das Peptid der Sequenz (D) vier Trypsinspaltstellen, die nach den basischen Aminosäuren Arg&sub3;&sub6;, Arg&sub3;&sub8;, Lys&sub5;&sub4; und Arg&sub6;&sub3; angeordnet sind.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind auch Peptide mit der Bezeichnung "tryptische Peptide", die durch tryptische Spaltung des Peptids der Sequenz (D) an den Trypsinspaltstellen erhalten wurden.
Unter diesen tryptischen Peptiden umfaßt die Erfindung insbesondere:
- ein tryptisches Peptid entsprechend den 12 N-terminalen Aminosäuren des Peptids der Sequenz (D)
- ein tryptisches Peptid entsprechend der Sequenz der Aminosäuren von GLN&sub3;&sub9; bis LYS&sub5;&sub4;
- ein tryptisches Peptid entsprechend der Aminosäuresequenz von GLY&sub5;&sub5; bis ARG&sub6;&sub3;
- ein tryptisches Peptid entsprechend den 21 C-terminalen Aminosäuren des Peptids.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch ein Peptid, das dadurch gekennzeichnet ist, daß es aus einem Signalpeptid zur Sekretion des Proteins pS2 besteht, insbesondere im Fall von Brustkrebs und pathologischen Zuständen des Magens, und die 24 N-terminalen Aminosäuren des Proteins pS2 umfaßt.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist unter anderem ein Peptid, das dadurch gekennzeichnet ist, daß es aus einem Fragment, das den 31 C-terminalen Aminosäuren des Peptids der Sequenz (D) entspricht, und daß sein Molekulargewicht etwa 3450 Da beträgt.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist weiterhin ein Peptid, das dadurch gekennzeichnet ist, daß es aus einem Fragment, das den 30 N-terminalen Aminosäuren des Peptids der Sequenz (D) besteht, und daß sein Molekulargewicht etwa 3300 Da beträgt.
Weiterhin ist Gegenstand der vorliegenden Erfindung ein Peptid, das dadurch gekennzeichnet ist, daß es aus einem Fragment, das den 28 Aminosäuren des C-terminalen Endes des Peptids der Sequenz (D) entspricht, und daß sein Molekulargewicht etwa 3100 Da beträgt.
Erfindungsgemäß zeigt das Signalpeptid die folgende Aminosäuresequenz (G):
Erfindungsgemäß entsprechen die Peptidfragmente mit der Bezeichnung "tryptische Peptide" den Aminosäuresequenzen (H), (J), (K) und (L), die nachstehend aufgeführt sind:
Erfindungsgemäß ist die Zusammensetzung (C) des Peptids aus 31 Aminosäuren die folgende:
Erfindungsgemäß ist die Zusammensetzung (E) des Peptids aus 30 Aminosäuren die folgende:
Erfindungsgemäß ist die Zusammensetzung (F) des Peptids aus 28 Aminosäuren die folgende:
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind auch polyclonale Anti- pS2-Antikörper, die dadurch gekennzeichnet sind, daß sie durch Immunisierung von Kaninchen oder anderen geeigneten Tieren gegen das Protein pS2 und seine Fragmente erhalten wurden.
Des weiteren sind Gegenstand der vorliegenden Erfindung monoclonale Anti-pS2-Antikörper, die dadurch gekennzeichnet sind, daß sie durch Clonieren von Hybridomen, erhalten durch Fusion von Milzzellen von in geeigneter Weise durch entsprechende Injektionen des Proteins pS2 oder desssen Fragmenten immunisierten Säugetieren mit Zellen eines geeigneten Myeloms, erhalten worden sind.
Es versteht sich von selbst, daß jedes andere Verfahren zum Erhalt von monoclonalen Antikörpern unter die vorliegende Erfindung fällt, mit der Maßgabe, daß es den Erhalt von monoclonalen Anti-pS2-Antikörpern gestattet, die durch den Umfang der vorliegenden Erfindung geschützt sind.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch ein Verfahren zur Gewinnung des Peptids der Formel (D), das aus einer Flüssigkeit biologischen Ursprungs gereinigt wurde, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man die in dieser Flüssigkeit erhaltenen Proteine mit Aceton bei einer tiefen Temperatur, insbesondere bei etwa -20ºC, fällt, den das Peptid enthaltenden Niederschlag chromatographisch reinigt, um die peptidhaltigen Fraktionen zu gewinnen, welche gegebenenfalls eingefroren und/oder konzentriert werden.
Gemäß einer anderen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Gewinnung des Peptids der Formel (D) werden vor der Reinigung der Flüssigkeit biologischen Ursprungs die MCF-7-Zellen, die in Gegenwart von Östradiol in Kultur gegeben wurden, abgetrennt, der Überstand der Kultur wird gewonnen und von seinen wesentlichen Zelltrümmern, die er enthält, befreit, anschließend dem nachstehend genannten Reinigungsverfahren unterworfen.
Gemäß einer anderen Durchführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Gewinnung des Peptids der Formel (D) ist die verwendete biologische Flüssigkeit Magensaft, die das durch die Magengewebe sezernierte Peptid enthält, das durch einen geeigneten Puffer bei einem pH-Wert von etwa 9,6 vor dem genannten Reinigungsverfahren neutralisiert wird.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Gewinnung des Peptids der Formel (D) wird letzteres mittels Immunreinigung aus biologischen Flüssigkeiten oder Zellextrakten, die das Peptid enthalten, mit Hilfe von Antikörpern gegen das Protein pS2 oder gegen dessen Fragmente isoliert.
Des weiteren ist Gegenstand der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Herstellung des Proteins pS2 und von Fragmenten davon auf synthetischem Weg, insbesondere durch chemische Synthese oder durch Biosynthese.
Insbesondere kann man das Festphasenverfahren, das von MERRIFIELD entwickelt wurde, verwenden (das MERRIFIELD-Verfahren ist in "Special Methods in peptide synthesis", veröffentlicht 1980 von E. GROSS und J. MEIENHOPER in "THE PEPTIDES: Analysis, synthesis, biology", Bd. 2, Teil A, S. 1- 254, Academic Press, New York beschrieben), oder ein ganz anderes Syntheseverfahren (insbesondere Biosynthese auf gentechnischem Weg) kann verwendet werden.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch ein Verfahren zum Nachweis bzw. zum Screening und zur Diagnose des pathologischen Zustands eines Organs, der die Expression des Peptids der Formel (D) oder seiner Vorläufer oder seiner Fragmente durch dieses Organ hervorruft, dadurch gekennzeichnet, daß das Vorliegen eines dieser Peptide durch ein immunologisches Verfahren in biologischen Proben mit Hilfe von Antikörpern, die gegen eines dieser Peptide gerichtet sind, bestimmt wird.
Gemäß einer anderen Durchführungsform der Erfindung wird der Nachweis und die Diagnose an Körperflüssigkeiten vorgenommen.
Gemäß einer bevorzugten Durchführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens zum Nachweis und zur Diagnose wird die Expression des Gens pS2 immuncytochemisch bestimmt.
Gemäß einer anderen bevorzugten Durchführungsform des Detektionsverfahrens wird die Detektion des Gens pS2 in Tumorproben bzw. Tumorabstrichen bestimmt.
Gemäß einer anderen bevorzugten Durchführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens zum Nachweis und zur Diagnose können die verwendeten Tumorproben unter anderem histologische Schnitte oder Cytosole sein.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform dieser Durchführungsform sind die verwendeten Tumorproben histologische Schnitte, die durch Einbettung in Paraffin konserviert und stabilisiert wurden und mit Formalin fixiert wurden, die dem Diagnoseverfahren eine sehr große Empfindlichkeit, ein schwaches Untergrundrauschen verleihen und die histopathologische Struktur erhalten.
Gemäß einer anderen bevorzugten Durchführungsform des Nachweises und der Diagnose gemäß vorliegender Erfindung wird beispielsweise das immuncytochemische Verfahren durch Inkubation der Proben mit Kaninchen-Antikörpern oder von einem geeigneten anderen Tier, mit poly- oder monoclonalen Anti-pS2-Antifragmenten von pS2 durchgeführt, wobei eine Inkubation mit einem Schafserum (oder einem anderen geeigneten Tier) vorausgeht, um die unspezifischen Anfärbungen zu verringern und sich eine Vielzahl von anschliessenden Inkubationen mit Schaf-Anti-Kaninchen-IgGs anschließt und anschliessend ein Markierungs- und Detektionssystem, das für den Antikörper geeignet ist, sich anschließt.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung kann das System zur Markierung und zum Nachweis von Antikörpern ein PAP-System (Peroxidase-Antiperoxidase) von Kaninchen enthalten, mit dem die Proben dann inkubiert werden, wonach sie mit DAB (3,3'-Diaminobenzidinchlorhydrat) inkubiert werden, wobei sich an diese Arbeitsschritte gegebenenfalls eine Anfärbung des Schnitts durch Hematoxylin oder ein Analogon davon anschließt, wobei die erhaltene Färbung auf einer Farbintensitätsskala abgeschätzt wird und der Anteil der gefärbten Tumorzellen in Prozent der Gesamttumorzellen (1-100%) bestimmt wird, während der Farbindex durch Multiplizieren des Prozentsatzes der gemäß Farbskalapunkten gefärbten Zellen (1-300) erhalten wird.
Gegenstand der Erfindung ist auch ein verwendungsbereites Kit zum Nachweis und zur Diagnose des pathologischen Zustands eines Organs durch immunologische Bestimmung, dadurch gekennzeichnet, daß es umfaßt:
- geeignete Mengen an polyclonalen oder monoclonalen Antikörpern gegen das Protein pS2 und/oder seine Fragmente;
- geeigente Mengen des Proteins pS2 und/oder seiner Fragmente, gegen die die verwendeten Antikörper gerichtet sind;
- geeignete Mengen an Anti-Immunglobulin-Antikörpern von Kaninchen (oder eines anderen geeigneten Säugetiers);
- ein enzymatisches System (wie das PAP-System, insbesondere Peroxidase-Antiperoxidase) zum Nachweis der Antigen-Antikörper-Reaktion gerichtet sind;
- geeignete Mengen an Anti-Immunglobulin-Antikörpern von Kaninchen (oder eines anderen geeigneten Säugetiers);
- ein enzymatisches System (wie das PAP-System, insbesondere Peroxidase-Antiperoxidase) zum Nachweis der Antikörper-Antigen-Reaktion;
- ein Substrat zum Nachweis der enzymatischen Reaktion, wie insbesondere DAB;
- gegebenenfalls eine Substanz zum Anfärben der Tumorzellen, wenn die biologische Probe aus histologischen Schnitten besteht und wenn ihre Anfärbung gewünscht ist;
- nützliche Mengen an geeigneten Puffern zur Durchführung des Tests, zum Nachweis und zur Diagnose.
Man kann natürlich auch ein ganz anderes System zur geeigneten Markierung und zum Nachweis von Antikörpern verwenden, mittels eines direkten oder indirekten Verfahrens (insbesondere nach dem Sandwich-Verfahren, den Systemen zur Markierung mit Avidin und Biotin, mit Fluorescenz, Phosphorescenz, Protein A, RIA, ELISA etc. ..).
Obwohl die Hormonabhängigkeit bestimmter Brustkrebsarten gut bekannt ist, besitzen die meisten Patientinnen Tumore, die RE (Östrogenrezeptoren) enthalten, aber nicht alle können von einer Hormonbehandlung profitieren. Andererseits wurde die Tatsache, daß 30 bis 40% der Patientinnen mit Krebsarten, die an RE reich sind, negativ auf eine Hormonbehandlung ansprechen, entweder auf die Heterogenität des Tumors oder auf die Tatsache, daß die RE nicht-funktionierend sein könnten, zurückgeführt. Es wurde unter anderem vorgeschlagen, daß die Bestimmung des RP-Gehalts (Progesteronrezeptoren), deren Expression als östrogenabhängig in normalen reproduzierenden Geweben und in der Zellinie MCF-7, die sich von Brustkrebs ableitet, bekannt ist, die Identifizierung der Tumore, die funktionierende Rezeptoren tragen, gestatten könnte. In der Tat sprechen nicht alle RE(+) und RP(+) Brustkrebsarten auf eine Hormontherapie an (nur 80% sprechen an), was die Notwendigkeit der Bereitstellung zusätzlicher Marker für ein Ansprechen auf eine Hormontherapie, um eine leichtere Identifikation der Brustkrebsarten, die von einer Hormontherapie profitieren könnten, zu gestatten, zeigt.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahren zum Nachweis und zur Diagnose werden die zum Nachweis eines Brustkrebses verwendeten biologischen Proben einer gleichzeitigen immunologischen Detektion auf RE, RP und das Protein pS2 oder eines seiner Fragmente unterworfen, was einerseits eine zusätzliche funktionelle Heterogenität der RE(+)-Krebsarten (wobei nur etwa 60% der RE(+)-Tumore auch auf RP und die Expression des Gens pS2 positiv sind) zeigt, andererseits eine große Homogenität der RE(-)-Krebsarten zeigt, was die RP und die Expression des Gens pS2 betrifft (wobei zu etwa 96% die Expression dieser beiden durch Östrogene induzierbaren Gene fehlt).
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform dieses Durchführungsverfahrens sind die Tests zum immunologischen Nachweis von RE und RP immuncytochemische Tests, die an bei -180ºC, bevorzugt in Isopentan-gefrorenenen histologischen Schnitten, durchgeführt werden.
Die zum immunologischen Nachweis von RE und RP verwendeten Techniken sind bekannt und in der Literatur beschrieben.
Gemäß einem anderen Verfahren zur Durchführung der Erfindung wird der Nachweis und die Diagnose pathologischer Zustände des Magens, insbesondere von Krebsen und Geschwüren, durchgeführt.
In der Tat wiesen die Erfinder das Vorliegen des Peptids der Sequenz (D) in Tumoren bei Magenkrebs nach.
Diese Beobachtung gestattet insbesondere das Aufspüren und die Diagnose von Magenkrebsarten und die Bestimmung des Ursprungs von Metastasen.
Erfindungsgemäß wird das Verfahren zum Nachweis und zur Diagnose auf die in-vivo-Bestimmung mittels Immunscintigraphie mit Hilfe von erfindungsgemäßen Antikörpern von pathologischen Zuständen eines Organs angewandt.
Gegenstand der Erfindung sind auch therapeutische Mittel, die dadurch gekennzeichnet sind, daß sie einen oder mehrere erfindungsgemäße Antikörper enthalten. Erfindungsgemäß können die Antikörper mit einem anderen therapeutischen Mittel kombiniert werden.
Die vorliegende Erfindung gestattet die Durchführung einer quantitativen Bestimmung des Proteins pS2 dank des Erhalts von monoclonalen Antikörpern gegen das Peptid der Synthese (D) sowie gegen das native Protein, das aus verschiedenen Milieus erfindungsgemäß extrahiert wurde.
Außer den nachstehenden Ausführungsformen umfaßt die Erfindung noch andere Ausführungsformen, die aus der nachstehenden Beschreibung hervorgehen. Die Erfindung wird besser anhand der nachfolgenden Beschreibungsergänzung verstanden, die sich auf Ausführungsbeispiele der Gegenstände der Erfindung bezieht, aber in keiner Weise eine Beschränkung darstellen soll.
Es ist jedoch jedenfalls zu verstehen, daß die Durchführungsbeispiele nur als Erläuterung der Gegenstände der Erfindung angegeben sind und in keiner Weise eine Beschränkung darstellen.

Beispiel 1 - Reinigung des von MCF-7-Zellen produzierten Peptids (D)

Die MCF-7-Zellen werden in Gegenwart von 10&supmin;&sup9; M Östradiol 4 Tage lang gezüchtet.
Der an Peptid (D), das in das Kulturmilieu von den Zellen ausgeschieden wurde, angereicherte Kulturüberstand wird gewonnen und nacheinander der Wirkung von
- Aceton (IV) bei -20ºC zum Ausfällen der Proteine mit hohem Molekulargewicht,
- von 12N HCl (etwa bei pH 1) zur Ausfällung der bei diesem pH-Wert unlöslichen Proteine unterworfen.
Es werden schrittweise die zwei Präzipitate zentrifugiert, um die Rückstände zu entfernen und nur die Überstände, die das Peptid (D) enthalten, zu erhalten. Dieser Überstand wird mit 4 Volumina Aceton bei -20ºC zur Ausfällung der anderen vorhandenen Proteine behandelt, worunter sich das Peptid (D) befindet. Es wird zentrifugiert, der Überstand entfernt, der Niederschlag, der das Peptid (D) enthält, gewonnen.
Der Niederschlag wird lyophilisiert, das Lyophilisat wird mit 3 ml KCl-Puffer, 50 mM EDTA versetzt,; er wird mittels HPLC auf G 3000 und anschließend auf einer Umkehrphase chromatographiert.
Es werden 120 Fraktionen zu je 150 ml gewonnen, die einem Western- Blotting (Immunabdruck) unterworfen werden. Die Fraktionen, die das Peptid (D) enthalten, werden mit Hilfe von polyclonalen Kaninchen-Antikörpern gegen ein synthetisiertes Peptid, das den 31 C-terminalen Aminosäuren des Peptids (D) entspricht, identifiziert.
Die positiven Fraktionen werden vereinigt und einer zweiten HPLC- Chromatographie mit Umkehrphasen vom Typ BROWNLEE-AQUAPORE RP 300 unterworfen, anschließend bei -20ºC eingefroren oder durch Vakuum-Zentrifugation eingeengt. Die Probe wird auf einem SDS-PAGE-Gel kontrolliert, durch Anfärben der Proteine mit Silbernitrat detektiert. Es wird reines Peptid (D) in einer Ausbeute von 80% isoliert.

Beispiel 2 - Reinigung des Peptids (D), das durch die Zellen der Magenschleimhaut sezerniert wurde, aus dem Magensaft.

Es wird Magensaft von nüchternen Personen (pH 1) entnommen, der durch einen Carbonat/Bicarbonatpuffer mit pH-Wert 9,6 neutralisiert wird und zentrifugiert wird, um die Zelltrümmer zu entfernen. Der Überstand wird der Wirkung von
- Aceton bei -20ºC in vier Volumina Aceton pro Volumen Überstand unterworfen.
Es wird zentrifugiert, der Überstand entfernt und der Niederschlag gewonnen, der das Peptid (D) enthält und der lyophilisiert wird.
Der Niederschlag wird einer HPLC-Chromatographie unterworfen. Die gewonnenen Fraktionen werden mittels Western-Blotting identifiziert, und die positiven Fraktionen werden vereinigt und durch Vakuum-Zentrifugation konzentriert. Sie werden anschließend einer zweiten HPLC-Chromatographie auf Umkehrphasen vom Typ BROWNLEE-AQUAPORE RP 300 unterworfen, und die positiven Fraktionen werden durch einen Dot-Blot identifiziert und durch Vakuum-Zentrifugation rekonzentriert.

Beispiel 3- Synthese des Proteins der Formel I und seiner Fragmente, insbesondere der Peptide der Formeln (C), (D), (E), (F).

Die Synthese jeder dieser Substanzen wird durch Durchführen des MERRIFIELD-Festphasenverfahrens durchgeführt. Nach Lyophilisation werden das synthetisierte Protein oder die synthetisierten Peptide jeweils in Gegenwart eines Gemisches aus Harnstoff/β-Mercaptoethanol reduziert, verdünnt, um die Salze zu entfernen, relyophilisiert und ihre Aminosäurezusammensetzung wird festgestellt.

Beispiel 4 - Herstellung von polyclonalen Antikörpern mit Hilfe des Peptids der Formel (C)

Das Peptid (C) aus 31 C-terminalen Aminosäuren des Proteins (I), das gemäß Beispiel 3 synthetisiert wurde, wird subkutan Kaninchen dreimal mit 2wöchigen Intervallen in einer Menge von 200 ug, gemischt mit vollständigem Freundschem Adjuvans für die ersten zwei Injektionen injiziert. Das Serum wird zwei Wochen nach der letzten Injektion gewonnen und in einer geeigneten Verdünnung verwendet. Nach dem gleichen Verfahren werden polyclonale Antikörper, ausgehend von allen Fragmenten des Proteins (I) und insbesondere ausgehend von Peptiden der Formeln (D), (E), (F) hergestellt.

Beispiel 5 - Herstellung von spezifischen monoclonalen Antikörpern

(A) Immunisierung von Mäusen mit dem synthetisierten Peptid (F)

Biozzi-Mäuse wurden mit dem synthetisierten Peptid der Sequenz (F), das den 28 C-terminalen Aminosäuren des Proteins pS2 entspricht, immunisiert.
Die zwei ersten Injektionen wurden mit dem Peptid (F) (100 ug) in Kopplung an Ovalbumin oder mittels Glutaraldehyd (F-OVA néosystem laboratoire) durchgeführt. Der erhaltene Kupplungsgrad beträgt 25 mol Peptid (F) auf 1 mol Ovalbumin. Die Injektionen wurden anschließend mit dem Peptid (F) allein (100 ug) durchgeführt. Die Injektionen wurden alle 15 Tage durchgeführt und wurden alle intraperitoneal unter Hinzufügung von vollständigem Freundschem Adjuvans für die erste und unter Hinzufügung von unvollständigem Freunschem Adjuvans für die zweiten und dritten Injektionen durchgeführt. 10 Tage nach der dritten Injektion wird ein Tropfen Blut aus dem Auge des Tieres entnommen und das nach Coagulation erhaltende Serum wird mittels RIA gegen das gereinigte und iodierte Peptid (D) getestet [vergleiche ausführliche Beschreibung des RIA-Detektionsverfahrens in dem vorstehenden Beispiel 5, nachstehendes Kapitel C]. Wenn der Gehalt des Serums richtig ist, wird die Maus zweimal erneut injiziert, zwei und vier Tage vor der Fusion.
Wenn der Gehalt des Serums nicht entspricht, werden die Mäuse alle drei Wochen injiziert, bis der Test positiv ist.

B) Gewinnung von Hybridomen

Die Fusion wurde in Gegenwart von PEG mit Myelom-X63-Zellen im Verhältnis von zwei Milzzellen auf eine Myelomzelle durchgeführt. Die erhaltenen Hybridomzellen wurden auf drei Platten zu 24 Cavitäten verteilt. Die Zugabe von HAT zu dem Kulturmilieu vier Stunden nach der Fusion gestattet die Selektion von Hybridomen. Die Kulturen wurden in Gegenwart von Makrophagen weitergezüchtet. Die ersten Tests der Kulturüberstands wurden etwa 8 Tage nach der Fusion unternommen. Die Tests entsprechen denen, die an den Seren durchgeführt wurden, nämlich mittels RIA-Technik und gegen das native Protein [vergleiche bezüglich einer ausführlichen Beschreibung des RIA-Detektionsverfahrens das vorliegende Beispiel 5, nachstehendes Kapitel C]. Die Klasse der erzeugten Antikörper wurde auch mittels ELISA-Technik unter Verwendung der zweiten Antikörper, die streng gegen die Unterklasse gerichtet waren, bestimmt.
13 Cavitäten, die ein oder mehrere Hybridome enthielten, wurden so ausgewählt: 4 unter ihnen wurden cloniert: CIB3, CIB6, CIC4, CIIID5. Nach der ersten Clonierung wurden die Clone CIC4-12 ebenso CIIID5-20, alle zwei im RIA positiv, ein zweites Mal cloniert. Als Ergebnis dieser zweiten Clonierung enthielten 10 der 12 Kolonien, die aus CIIID5-20 vereinzelt wurden, Anti-Peptid(F)-Antikörper. Darunter wurde CIIID5-20-9(p28&sub1;O&sub2;) nach den Kulturkriterien gewählt. Die andere Clonierung erbrachte nur 3 positive Clone auf 12 und eine dritte Clonierung wurde durchgeführt, bei der sich 11 von 12 Kolonien als positiv erwiesen. Wie vorstehend wurde eine unter ihnen, nämlich CIC4-12-4-7(p28&sub2;0&sub3;) ausgewählt.
Bestimmte der erhaltenen Clone gestatten einen ausgezeichneten immunhistochemischen Nachweis des Peptids der Sequenz (D) auf Schnitten von Brustkrebs-Biopsien, die in allen Punkten mit denen identisch sind, die früher mit polyclonalen Antikörpern gegen die synthetisierten Peptide und insbesondere gegen das Peptid (C) erhalten wurden.

C) RIA-Test (Radio-Immunoassay) zum Nachweis von Antikörpern gegen das Peptid (D) verwendet in den vorstehenden Stufen (A) und (B)

Der zum Nachweis der Vorliegens des Peptids (D) und zur Auswahl der Hybridome verwendete RIA-Test wurde wie folgt durchgeführt.
Das Peptid (D) wurde aus einem Milieu der Kultur MCF-7 extrahiert und anschließend durch aufeinanderfolgende HPLC-Chromatographien teilgereinigt. So wird eine Fraktion, die 80% des Peptids (D) enthält, erhalten. Diese angereicherte Fraktion wird anschließend mit Iod 125 (ORIS Lapam) nach dem Chloramin-T-Verfahren markiert. Die Ausbeute der Markierung liegt in der Größenordnung von 2000 Ci/mmol.
Das iodierte Peptid (D) wird anschließend von freiem Iod durch Passage über eine Affinitätssäule, bei der ein polyclonaler Kaninchen-Antikörper auf Sepharose CN4B gekoppelt ist, abgetrennt. Das Peptid wird durch Abspaltung in einem Medium aus Glycin-HCl, pH 2,8 gewonnen. Es wird anschließend in Aliquote eingeteilt und ist zur Verwendung bereit.
Der Test besteht aus der Zugabe von
20 ul 0,3% PBS-BSA
100 ul eines ¹²&sup5;I Tracers (D) (etwa 30 000 cpm)
100 ul Milieu aus dem zu testenden Antikörper
Es wird geschüttelt und eine Nacht bei Raumtemperatur stehengelassen.
Am nächsten Tag werden hinzugesetzt:
50 ul NHS (normales Humanserum)
50 ul SMAS (Schaf-Anti-Maus-Serum)
Es wird gerührt und 15 Minuten bei Raumtemperatur stehengelassen.
Es wird 15 Minuten lang bei 3000 UpM (Jouan) zentrifugiert, und der Rückstand wird in einem Gamma-Zähler gemessen.
Für jede Testreihe wird eingesetzt:
- ein Reagensglas (T), das nur das iodierte Peptid enthält, was einen Maximalwert von cpm für die verwendete Menge ergibt (etwa 30 000 cpm);
- ein Reagensglas (NBS), dem keine Anti-D-Antikörper-Lösung zugesetzt wurde, was den Untergrund des Arbeitsschrittes ergibt (etwa 600 cpm). Die zu testenden Seren werden auf 1/100 und 1/1000 verdünnt.

Beispiel 6 - Charakterisierung des Peptids der Sequenz (D)

70 bis 90% der zusammenfließenden einzelligen Schichten der in Gegenwart von Östradiol gezüchteten MCF-7-Zellen wurden mittels ³&sup5;S-Cystein (vergleiche beigefügte Figur 1) oder mittels ³&sup5;S-Methionin (vergleiche beigefügte Figur 2) markiert, und das Milieu sowie die Zellextrakte wurden zu bestimmten Intervallen gewonnen. Aliquote wurden mittels pS2-Antiserum immunpräzipitiert und auf einem Gradienten aus 15 bis 25% SDS-PAGE-Gel analysiert. Das Auftragen der Zeit, bezogen auf die ³&sup5;S-Cysteinkonzentration (Figur 1, A und B) zeigt das Vorliegen einer einzigen Bande, die bei etwa 7 KD liegt. Im Zellextrakt (Teil B der Figur 1) ist das Signal noch nach 15minütiger Markierung sichtbar. Wenn Proben des Mediums entsprechend identischen Aliquoten des Gesamtkulturmediums analysiert wurden (Teil A der Figur 1), wird das Signal im Verlauf einer Stunde Markierung sichtbar, was eine bestimmte Verzögerung im Sekretionsprozeß nahelegt. In Figur 1C erwies sich die Immunpräzipitation des Peptids (D) in das Medium (Spalte 2) als spezifisch angesichts der Bande des Peptids (D) und in Kompetition mit dem synthetischen Peptid (C) (Spalte 1).
Im Gegensatz dazu konnte keine der Größenordnung des Peptids (D) entsprechende Bande in keinem Moment des Zeitablaufs erhalten werden, sowohl im Medium als auch im Zellextrakt nach Markierung durch ³&sup5;S-Methionin und Immunpräzipitation mittels Antiserum (vergleiche Figur 2, Teil A)). Das Schema der in dem oberen Teil des Gels vorhandenen Bande bleib nach Verwendung eines nicht-immunisierenden Testserums erhalten (Spalten 7 und 15) und trat nicht in Kompetition durch Zugabe des synthetischen Peptids (C) in der Immunpräzipitationsreaktion (Spalten 8 und 16), was anzeigt, daß es einer nicht-spezifischen Adsorption entspricht.
Das Kulturmedium und die Zellextrakte wurden auch ohne Immunpräzipitation nach der Markierung durch ³&sup5;S-Cystein (vergleiche Figur 2B, Spalten 1 und 4) oder durch ³&sup5;S-Methionin (Spalte 5) analysiert. Eine Bande (markiert), die mit Cystein markiert war (Spalte 1), aber nicht mit Methionin (Spalte 2) war klar in dem Kulturmedium sichtbar, und sie wanderte auf gleiche Höhe wie das immunpräzipitierte Peptid (D) (Spalte 3). Im Gegensatz dazu gab es keine differentielle Markierung im Gesamtzellextrakt, was anzeigt, daß die Gesamtheit der Proteine, die auf diese Höhe wandert, nicht dem Peptid (D) entspricht.
Diese soeben erwähnten Ergebnisse stützen die Hypothese, nach der die 3 Methioninreste am aminoterminalen Ende der Sequenz des Proteins pS2, abgeleitet von cDNA zu einem Signalpeptid gehören, das rasch gespalten wird.
Die Figur 1 zeigt den Ablauf in der Zeit der Markierung des Peptids (D) durch ³&sup5;S-Cystein. Die Teile (A) und (B) zeigen jeweils in Gegenwart von Östradiol gezüchteten und mit Phenolrot markierte MCF-7-Zellen, bezogen auf unterschiedliche Zeiten an ³&sup5;S-Cystein: 15 Minuten, 30 Minuten, 1 Stunde, 2 Stunden, 4 Stunden und 6 Stunden, jeweils in den Spalten 1 bis 6. Aliquote des Mediums (200 ul ) (Teil A) und der Zellextrakte (25 ul) (Teil B), entsprechend identischen Fraktionen der Gesamtkultur wurden immunpräzipitiert, anschließend in einem Gradienten von 15 bis 25% eines SDS-PAGE-Gels und mittels eines Fluorographs analysiert. M bezeichnet die Molekulargewichtsmarker. Der Teil C entspricht einer 16stündigen Markierung durch ³&sup5;S- Cystein; Spalte 2 dem Präzipitat eines Aliquotmediums; Spalte 1 : gleich Spalte 2 aber in Gegenwart des kompetitiven synthetischen Peptids (C).
Figur 2, Teil A, zeigt einen Versuch der Markierung des Peptids (D) durch ³&sup5;S-Methionin (D) durch ³&sup5;S-Methionin in Medium (Spalten 1 bis 8) und in Zellextrakt (Spalten 9 bis 16). Gleicher Versuch wie in Figur 1, aber in Gegenwart von ³&sup5;S-Methionin. Die Spalte 0 ist identisch mit der Spalte 5 der Figur 1A, wobei die Markierungsdauer 15 Minuten, 30 Minuten, 1 Stunde, 2 Stunden, 3 Stunden, 4 Stunden und 6 Stunden, wie angegeben, beträgt. Die Immunpräzipitation wurde mit nicht-immunisierendem Serum (Spalte 7 für das Medium und 15 für den Zellextrakt) oder in Gegenwart von Immunserum und des kompetitiven synthetischen Peptids (C) (Spalten 8 für das Medium und 16 für den Zellextrakt) durchgeführt. M bezeichnet die Molekulargewichtsmarker.
Teil B: das Peptid (D) kann direkt in dem Medium nachgewiesen werden. Die Synthese des Proteins durch die MCF-7-Zellen wurde in Gegenwart von ³&sup5;S-Cystein (Spalten 1 und 4) oder ³&sup5;S-Methionin (Spalten 2 und 5) durchgeführt. Die Zellen wurden in Gegenwart von Phenolrot und Östradiol gezüchtet und für eine Zeitdauer von 6 Stunden markiert. Aliquote des Mediums und der Zellextrakte, die die gleiche Anzahl an mit TCA präzipitierbaren Einheiten enthielten, wurden direkt auf einem 15 bis 25%igen Gradienten auf einem SDS- PAGE-Gel analysiert. Spalten 1 und 2: Kulturmedium; Spalten 4 und 5: Zellextrakte. Spalte 3 und die Kennzeichnung: immunpräzipitiertes Protein pS2 in vivo durch ³&sup5;S-Cystein markiert.
Teil C: Versuch, das Peptid (D) mit ¹&sup4;C-Leucin zu markieren. In Gegenwart von Östradiol und Phenolrot gezüchtete MCF-7-Zellen wurden für eine Zeitdauer von 6 Stunden durch ¹&sup4;C-Leucin markiert. Aliquote zu 200 ul Kulturmedium (Spalte 2) oder Zellextrakte (Spalte 3) wurden wie in den Figuren 1 und 2a immunpräzipitiert. Die Spalte 1 und die Pfeilmarkierung geben die Position des immunpräzipitierten in vivo durch ³&sup5;S-Cystein markierten Peptids (D) an. Exposition des Films: zwei Monate.

Beispiel 7 - Sequenzierung des aus MCF-7-Zellen isolierten Peptids (D) (pS2M).

Nach Reduktion und Alkylierung der Cysteine in Form von S-β-(4-Pyridylethyl)cystein nach dem FRIEDMANN-Verfahren und anschließendem Abbau durch Trypsin erhält man sechs größere Peptide, die auf C8-Umkehrphasenchromatographie getrennt werden.
Die Cysteine sind in dem Protein so verteilt, daß jedes durch tryptischen Abbau erhaltene Peptid mindestens ein S-β-(4-Pyridylethyl)cystein enthält, was bei einer Wellenlänge von 254 nm nachgewiesen wird.
Es werden 6 tryptische Fragmente mit der Bezeichnung T1 bis T6 (Figur 5, obere Kurve) erhalten.
Die Figur 5 zeigt die Fraktionierung der tryptischen Peptide des Peptids (D), das aus Magensaft (pS2G) und aus MCF-7-Zellen (pS2M) isoliert wurde, welches S-β-(4-Pyridylethyl)cysteinreste trägt, durch Chromatographie auf einer Mikrobore Aquapore Brownlee RP300-Säule (7uC8/2,1 x 30 mm), equilibriert durch einen Puffer aus einer 0,1%igen TFA-Lösung (Trifluor-essigsäure pH 2). Die Säulen werden in 60 Minuten in einem Gradienten aus 0 bis 80% Puffer B, der aus Acetonitril einschließlich 0,1% TFA besteht, eluiert. Der Säulendurchfluß beträgt 0,1 ml/min und die unterschiedlichen Peptide werden durch ihre Absorption bei 254 nm als Funktion der Zeit ihres Erscheinens detektiert.
Diese tryptischen Peptide wurden sequenziert, und es wird die Karte des aus MCF-7-Zellen isolierten Peptids (D) (figur 6) erhalten.
Die Figur 6 zeigt die Sequenz des Proteins pS2, wobei die Spaltstellen durch die Signalpeptidase , die das Peptid (D) erzeugt, die Spaltstellen durch Trypsin ( ) und die Spaltstellen, die von diesen beiden Enzymen nicht angenommen werden, (Δ) gezeigt sind.
Die Sequenzierung dieses Peptids gestattet die Definition von vier Trypsinspaltstellen, die nach den basischen Aminosäuren Arg&sub3;&sub6;, Arg&sub3;&sub8;, Lys&sub5;&sub4; und Arg&sub6;&sub3; vorhanden sind.
Die Wirkung von Trypsin hätte somit die folgenden 5 Peptide erzeugen müssen: GLU&sub2;&sub5; - ARG&sub3;&sub6;, GLU&sub3;&sub7; - ARG&sub3;&sub8;, GLN&sub3;&sub9; - LYS&sub5;&sub4;, GLY&sub5;&sub5; - ARG&sub6;&sub3; und GLY&sub6;&sub4; - PHE&sub8;&sub4;.
In der Tat entsprechen unter den 6 beobachteten Peaks nur T1, T3 und T4 den vorgesehenen tryptischen Peptiden, nämlich GLU&sub2;&sub5; - ARG&sub3;&sub6;, GLY&sub5;&sub5; ARG&sub6;&sub3; und GLN&sub3;&sub9; - LYS&sub5;&sub4;.
Die anderen Peaks (T2, T5 und T6) kommen von ungeplanten Spaltungen:
- die Spaltung zwischen TRP&sub6;&sub7; und CYS&sub6;&sub8; betrifft nur 30% pS2M-Moleküle und stammt von einer chymotryptischen Verunreinigung des Trypsin-Präparats;
- die Spaltungen zwischen ASN&sub7;&sub2; und THR&sub7;&sub3; stammen weder von Trypsin noch von Chymotrypsin und sind das Werk einer Peptidase, die entweder gleichzeitig sezerniert wurde oder eine Verunreinigung von Trypsin ist.
Unter anderem wird das Dipeptid GLU&sub3;&sub7; ARG&sub3;&sub8;, das zu klein ist, um auf der Säule zurückgehalten zu werden, auch nicht detektiert, und sein Vorhandensein wurde von der nichtmodifizierten Proteinsequenz abgeleitet.
Der Vergleich der durch Aneinanderreihen dieser tryptischen Peptide erhaltenen Sequenz und der nicht-modifizierten Proteinsequenz aus 84 Aminosäuren zeigt, daß die Signalpeptidase das anfängliche Protein nach dem ALA-Rest in Position 24 nach dem N-terminalen Methionin spaltet. Die sezernierte Form beginnt somit durch die Sequenz GLU - ALA - GLN.

Beispiel 8 - Sequenzierung des Peptids (D), das aus dem Magensaft isoliert wurde (pS2G).

Das Protokoll zur Reduktion und Alkylierung der Cysteine und anschließend der verwendeten Trypsin-Lyse zur Sequenzierung des Peptids (D), das aus dem Magensaft (pS2G) isoliert wurde, ist das gleiche wie das, das bei der Sequenzierung von pS2M verwendet wurde.
Die Chromatographie des erhaltenen Lysats zeigt eine Spur, die einige Unterschiede im Vergleich zu derjenigen, die im Falle von pS2M erhalten wurde, zeigt.
- Die Fragmente T1, T3 und T4 und T6 wurden sequenziert und sind in beiden Fällen identisch
- die Sequenzen, die T2 und T5 entsprechen, wurden nicht wiedergefunden
- keine Sequenz konnte aus dem zusätzlichen Peak T7 erhalten werden.
Das Fehlen des Peptids T2 im Vergleich zu dem pS2M-Präparat ist nicht überraschend, da dieses Peptid aus einer Verunreinigung stammt.
Die Spaltstelle der Signalpeptidase ist somit für das aus den zwei verschiedenen Zelltypen isolierte Peptid identisch.
Es wird ein Unterschied zwischen pS2M und pS2G, was den GLU-Rest am N-terminalen Ende des Proteins betrifft, beobachtet. In der Tat, im Falle von pS2G ist diese Aminosäure in Form von pyro-GLU cyclisiert, was die Erstellung der Sequenz aus der nicht-modifizierten Form verhindert. In der Tat konnte das N-terminale tryptische Peptid sequenziert werden, was eine Deblockierung dieses N-terminalen Endes anzeigt.

Beispiel 9 - Immuncytochemische Detektion des Peptids (D)

1) Herstellung von histologischen Schnitten

Eine chirurgische Probe wurde in feine Lamellen geschnitten, die zur immuncytochemischen Detektion von RE, RP und des Peptids (D) verwendet wurden. Die zur immuncytochemischen Detektion von RE und RP vorgesehenen Proben wurden in Isopentan bei -180ºC gefroren, während die für die immuncytochemische Detektion des Peptids (D) vorgesehenen Proben in Paraffin eingebettet wurden und durch 10%iges Formal in 24 Stunden lang fixiert wurden.

2) Immuncytochemische Färbung des Peptids (D)

Die in Paraffin eingebetteten und mit Formal in fixierten Proben wurden aufgeschnitten, von Paraffin mit Hilfe von Toluol befreit und gründlich mit absolutem Ethanol gespült. Nach Waschen mit Wasser und PBS wurden die Schnitte mit Schafserum inkubiert (2,5%) in PBS, das 0,5% Rinder-Gammaglobuline enthielt, um die nicht-spezifischen Färbungen zu reduzieren. Nach Inkubation mit polyclonalen Kaninchen-Antipeptid-Antikörpern (in einer Konzentration von 1:640) wurden die Schnitte schrittweise mit IgG von Schaf-Anti-Kaninchen anschließend mit einem Peroxidase-Antiperoxidase von Kaninchen in einer Konzentration von 1:10 für die IgGs, und 1:50 für das System Peroxidase-Antiperoxidase inkubiert. Auf jede Inkubation folgte eine Waschung mit PBS. Nach dem abschließenden Spülen mit PBS wurden die Schnitte mit DAB inkubiert und mit Hematoxilin in einer Konzentration von 1:10 inkubiert. Die immuncytochemischen Bestimmungen von RE und RP wurden an den gefrorenen Schnitten durchgeführt, indem die monoclonalen Antikörpern Kits von Abbot bzw. Transbio, entsprechend dem von den Herstellern empfohlenen Verfahren, verwendet wurden. Die Farbintensität wurde an einer Probe anhand einer Skala von 4 Punkten (0 bis 3+) abgeschätzt, und der Anteil der positiv gefärbten Tumorzellen wurde als Prozentsatz der gesamten Tumorzellen (1 bis 100%) bestimmt. Der Farbindex wurde durch Multiplizieren des Prozentsatzes der gefärbten Zellen gemäß der Farbskala (1 bis 300) erhalten.
3) Der Test zum Anfärben des Peptids (D) erwies sich als cytoplasmatisch ebenso wie für die Schnitte der Brustkrebszellen als auch die Schnitte der metastatischen Knoten (vergleiche Figur 3, Teile A, E, F). Jedenfalls war die cytoplasmatische Verteilung der Färbung häufig nicht einer perinukleären Kondensation entsprechend (vergleiche Pfeil in Figur 3 Teil F), was dem GOLGI-Apparat entsprechen könnte, da sozusagen das Peptid (D) sezerniert wird. Unter anderem erwies sich die Farbintensität von einer Zelle zur anderen selbst im Inneren einer durch einen Schnitt gegebenen Oberfläche variabel (vergleiche Figur 3A und F). Sie war auch für die RE- spezifische Kernfärbung gleich (Figur 3B). Jedenfalls haben sich nicht alle Brustkrebsarten als positiv auf die für das Peptid (D) spezifische Färbung erwiesen (Figur 3D). Die Färbung erwies sich als spezifisch für das Peptid (D), wie seine Suppression gezeigt hat, wenn man es in Kompetition mit einem der synthetischen Peptide, die zur Realisation von Antikörpern verwendet wurden, das im vorliegenden Fall das Peptid (C) aus 31 Aminosäuren war, setzte (Figur 3, Teil C). Unter anderen wurden die Zellen des normalen Duktusepithels ("N" in Figur 3) und der gutartigen Brustkrebsarten nicht gefärbt.
Eine gute Korrelation wurde zwischen dem Farbindex des Peptids (D) und der Intensitätsskala von mRNA pS2, die ausgehend aus der Northern-Blot- Analyse von RNA, die früher in der Literatur beschrieben wurde, beobachtet, was anzeigt, daß das Vorhandensein des Peptids (D) sehr wahrscheinlich eine erhöhte Transkription widerspiegelt, was bereits früher in der Literatur unter Verwendung der Brustkrebs-Zellinie MCF-7 gezeigt wurde. Die Tatsache, daß diese Induktion RE-unabhängig ist, wird stark durch die gute Korrelation, die zwischen dem Farbindex des Peptids (D) und dem Farbindex von RE existiert, gezeigt (vergleiche die beigefügte Figur 4 und Tabelle I) Man kann daraus schließen, daß die Expression des pS2-Gens in Brustkrebs sehr wahrscheinlich östrogenabhängig ist, wie es bei der Zellinie MCF-7 der Fall ist.

Beispiel 10 - Vergleichende Expression des Gens pS2 mit der der Östrogen- und Progesteronrezeptoren und des Oncogens erbB-2.

Die beigefügte Tabelle 1 zeigt eine Zusammenfassung der Ergebnisse, die an 180 Brustkrebsproben erhalten wurden, an denen alle Parameter mit wenigen Ausnahmen nichtübereinstimmend bestimmt wurden, mit kleinen Ausnahmen, was die Expression von RE (Östrogenrezeptoren), RP (Progesteronrezeptoren), des Gens pS2 (pS2) und des Oncogens erbB-2 betrifft. Die Gehalte an RE und RP wurden unter gleichzeitiger Verwendung der RE-DCC-, RP-DCC-, RE-ICA- und RP-ICA-Tests mit Ausnahme von 2 der 7 RE(+)-, RP(-)- und pS2(+)- Fälle bestimmt, für die RP nur durch den RP-DCC-Test bestimmt wurde /DCC = "dextran-coated charcoal steroide binding assay" (Test zur Fixierung von Steroiden durch Dextrankohle); ICA = Immuncytochemischer Test/. Die Expression des pS2-Gens wurde ebenso unter Verwendung der Analyse mit Hilfe von pS2-mRNA als auch durch den pS2-ICA-Test bestimmt. Der Überschuß an Expression (Positivität) und die Expressionsgehalte, die nicht nachweisbar oder sehr schwach (negativ) bezüglich des erbB-2-Gens waren, wurden durch Analyse mit Hilfe von mRNA bestimmt. Die Verteilung der Metastasen der axillären Lymphknoten (ALN) ist in der letzten Spalte rechts der Tabelle I angegeben. RE(+) und RP(+) entsprechen Proben, die sich unter Verwendung mindestens eines der RE- und RP-Tests als positiv erwiesen; pS2(+) entspricht positiven Proben in Tests, bei denen pS2-mRNA verwendet wird und/oder im immuncytochemischen Test auf pS2 (und üblicherweise für beide), und ein Überschuß an Expression für erbB-2-(+) wurde durch Analyse mit Hilfe von mRNA bestimmt. Tabelle I Expression von pS2, erbB-2, RE und RP in 180 Brustkrebsbiopsien
ALN(+) zeigt das Vorliegen mindestens eines Metastaseknotens an.
Die in Klammern angegebenen Prozentangaben beziehen sich auf die Gesamttumorzahl (180 Fälle), wohingegen die Prozentangaben in Kästen sich entweder auf die RE(+)-Tumore (129 Fälle, oberer Teil der Tabelle I) oder auf die RE(-)-Tumore (51 Fälle, unterer Teil der Tabelle I) beziehen.
Alle Brustkrebsarten können in 6 Unterklassen unterschiedlicher Bedeutung klassifiziert werden, wie die Tabelle I zeigt. 72% der Tumore sind RE(+), wovon 88% RP(+) und 12% RP(-) sind. Indes sind nicht alle RP(+)- Krebsarten pS2(+) und alle RP(-)-Krebsarten sind nicht pS2(-). In der Tat nur 62% der RE(+)-Tumore erwiesen sich ebenso für die Expression von RP als auch pS2 positiv, während 26% der RE(+)-Tumore sich als RP(+) und pS2(-) erwiesen. Es hat sich auch bestätigt, daß einige RP(+)-, RP(-)-Tumore entweder pS2(+) oder pS2(-) waren. Diese Beobachtungen bieten ein großes Interesse angesichts der Tatsache, daß die Transkription sowohl des RP-Gens als auch des pS2-Gens durch Östrogen in den MCF-7-Zellen induziert werden kann. So führt die gleichzeitige Bestimmung der Expression RE-, RP- und pS2-Gene zu einer funktionellen zusätzlichen Heterogenität in RE(+)-Brustkrebsarten. Das kann entweder eine Heterogenität an RE selbst, die sowohl die RP-Gene als auch das pS2-Gen oder keines von beiden induzieren könnte, als auch eine Heterogenität in der Eignung auf das Ansprechen auf Östrogene der Gene RP und pS2 widerspiegeln. Andererseits erscheinen die RE(-)-Krebsarten sehr homogen, was die Expression von RP und pS2 betrifft, angesichts der Tatsache, daß 96% von ihnen keines der beiden durch Östrogen induzierbaren Gene exprimieren. Der Überschuß an Expression von erbB-2 war zwischen den verschiedenen Unterklassen gleichmäßig verteilt. Es ist zu unterstreichen, daß die Bestimmung von RE, RP und des Peptids (D) auf immuncytochemischem Weg eine große Nützlichkeit zur Untersuchung der Heterogenität der Tumore, was ihr Ansprechen auf Östrogene betrifft, besitzt und folglich die Eignung zur Behandlung von Brustkrebsarten durch Hormontherapie zeigt.

Beispiel 11 - Bestimmung des Peptids (D) im Cytosol

Das Cytosol wurde ausgehend von Brusttumorproben durch Biopunktion oder Zerkleinern des Gewebes hergestellt und die Proben wurden in einem 10 mM Tris-Puffer, der 1,5 mM EDTA, 10 mM Monothioglyerin, 10 mM Natriummolybdat, pH 7,4, wie er für die Bestimmung der Hormonrezeptoren beschrieben wurde, gefroren, was ein spezifisches Cytosol-Präparat vermeidet und die Bestimmung des Peptids (D) zu den bereits routinemäßig bestimmten Rezeptoren gestattet.
Ebenso folgt aus den aus den vorausgehenden Ausführungen, daß sich die Erfindung in keiner Weise auf diese Ausführungsformen, Formen der Durchführung, Anwendung, die soeben ausführlicher beschrieben wurde, beschränkt. Sie umfaßt im Gegensatz alle Varianten, die dem Geist eines Fachmanns entspringen können, ohne vom Umfang oder Gehalt der vorliegenden Erfindung abzuweichen.

Claims

1. Peptid, dadurch gekennzeichnet, daß es als die Sekretionsform des Proteins pS2 identifiziert ist, es aus einem Fragment entsprechend 60 Aminosäuren des Proteins ps2 besteht, es mit der Sequenz GLU - ALA - GLN beginnt, wobei das GLU an der 25. Position nach dem N-terminalen MET des Proteins pS2 angeordnet ist, und daß sein Molekulargewicht etwa 6 600 Dalton beträgt, wobei das Peptid als "Peptid PS2" bezeichnet wird.

2. Peptid nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es die folgende Aminosäuresequenz (D) besitzt:

3. Peptid nach einem der Ansprüche 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß es vier Trypsin-Spaltstellen besitzt, die nach den basischen Aminosäuren Arg&sub3;&sub6;, Arg&sub3;&sub8;, Lys&sub5;&sub4; und Arg&sub6;&sub3; angeordnet sind.

4. Peptid, dadurch gekennzeichnet, daß es 12 N-terminalen Aminosäuren des Peptids der Sequenz (D) nach Anspruch 2 entspricht.

5. Peptid, dadurch gekennzeichnet, daß es der Aminosäuresequenz von GLN&sub3;&sub9; bis LYS&sub5;&sub4; des Peptids der Sequenz (D) nach Anspruch 2 entspricht.

6. Peptid, dadurch gekennzeichnet, daß es der Aminosäuresequenz von GLY&sub5;&sub5; bis ARG&sub6;&sub3; des Peptids der Sequenz (D) nach Anspruch 2 entspricht.

7. Peptid, dadurch gekennzeichnet, daß es den 21 C-terminalen Aminosäuren des Peptids der Sequenz (D) nach Anspruch 2 entspricht.

8. Peptid, dadurch gekennzeichnet, daß es aus einem Fragment entsprechend den 31 C-terminalen Aminosäuren des Peptids pS2 nach Anspruch 2 besteht und daß es ein Molekulargewicht von etwa 3 450 Da besitzt.

9. Peptid, dadurch gekennzeichnet, daß es aus einem Fragment entsprechend den 30 N-terminalen Aminosäuren des Peptids pS2 nach Anspruch 2 besteht und daß es ein Molekulargewicht von etwa 3 300 Da besitzt.

10. Peptid nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß es die folgende Aminosäurezusammensetzung (H) besitzt:

11. Peptid nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß es die folgende Aminosäurezusammensetzung (J) besitzt:

12. Peptid nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß es die folgende Aminosäurezusammensetzung (R) besitzt:

13. Peptid nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß es die folgende Aminosäurezusammensetzung (L) besitzt:

14. Peptid nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß es die folgende Aminosäurezusammensetzung (E) besitzt:

15. Peptid, dadurch gekennzeichnet, daß es aus einem Fragment entsprechend den 28 Aminosäuren des C- terminalen Endes von Peptid (D) nach Anspruch 2 besteht, es ein Molekulargewicht von etwa 3 100 Da besitzt, es die folgende Aminosäurezusammensetzung (F) besitzt:

es einem Teil der endogenen sekretierten Form des Peptids der Sequenz (D) entspricht und daß es die Detektion des Peptids der Formel (D), das gegebenenfalls in einem Organ, das einem Aufspüren oder einer Diagnose unterworfen ist, vorhanden ist, gestattet.

16. Polyclonale Anti-ps2-Antikörper, dadurch gekennzeichnet, daß sie durch Immunisieren von Kaninchen oder anderen geeigneten Tieren,gegen das Protein pS2 oder seine Fragmente nach einem der Ansprüche 1 bis 15 erhalten worden sind.

17. Monoclonale Anti-pS2-Antikörper, dadurch gekennzeichnet, daß sie durch Clonieren von Hybridomen die aus der Fusion von Milzzellen von geeigneten Säugetieren, die mit geeigneten Injektionen des Proteins pS2 oder dessen Fragmenten nach einem der Ansprüche 1 bis 15 immunisiert worden sind, mit geeigneten Myelomazellen,erhalten worden sind.

18. Verfahren zur Gewinnung des Peptids der Formel (D), dadurch gekennzeichnet, daß man die in einer biologischen Flüssigkeit enthaltenen Proteine mit Aceton bei einer tiefen Temperatur ausfällt, den das Peptid enthaltenden Niederschlag chromatographisch reinigt, um die peptidhaltigen Fraktionen zu gewinnen, welche gegebenenfalls eingefroren und/oder konzentriert werden.

19. Verfahren zur Gewinnung des Peptids der Formel (D), nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß man vor der Reinigung der biologischen Ausgangsflüssigkeit von MCF-7-Zellen ausgeht, die in Gegenwart von Östradiol gezüchtet werden, der Kulturüberstand gewonnen wird, anschließend einem Reinigungsverfahren nach Anspruch 18 unterworfen wird.

20. Verfahren zur Gewinnung des Peptids der Formel (D) nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß die verwendete biologische Flüssigkeit Magensaft ist, der das von den Magengeweben sekretierte Peptid enthält, der durch einen geeigneten Reinigungspuffer bei einem pH- Wert von etwa 9,6 neutralisiert wird vor dem Reiningungsverfahren nach Anspruch 18.

21. Verfahren nach einem der Ansprüche 18 bis 20, dadurch gekennzeichnet, daß das Peptid der Formel (D) durch Immun-Reinigung aus biologischen Flüssigkeiten oder Zellextrakten mit Hilfe von Antikörpern gegen das Protein pS2 oder gegen dessen Fragmente nach einem der Ansprüche 1 bis 15,isoliert wird.

22. Verfahren zur Herstellung des Proteins pS2 und dessen Fragmente nach einem der Ansprüche 1 bis 15 mittels Synthese, insbesondere mittels chemischer Synthese oder Biosynthese.

23. Verfahren zum Aufspüren und zur Diagnose des pathologischen Zustands eines Organs, der die Expression des Peptids der Formel (D) oder seiner Vorläufer oder seiner Fragmente durch dieses Organ hervorruft, dadurch gekennzeichnet, daß das Vorliegen eines dieser Peptide mittels eines immunologischen Verfahrens in entnommenen biologischen Proben mit Hilfe der Antikörper nach einem der Ansprüche 16 und 17 bestimmt wird.

24. Verfahren zum Aufspüren und zur Diagnose nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, daß das Vorliegen des Peptids (D) mit Hilfe von Antikörpern gegen das Peptid (F) detektiert wird.

25. Verfahren nach Anspruch 23 oder 24, dadurch gekennzeichnet, daß man das Aufspüren und die Diagnose an Körperflüssigkeiten vornimmt.

26. Verfahren nach Anspruch 23 oder 24, dadurch gekennzeichnet, daß die Expression des pS2-Gens immuncytochemisch bestimmt wird.

27. Verfahren nach Anspruch 23 oder 24, dadurch gekennzeichnet, daß die Expression des pS2-Gens in Abstrichen von Tumoren bestimmt wird.

28. Verfahren zur Detektion und zur Diagnose nach Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, daß die verwendeten Abstriche von Tumoren histologische Schnitte sind.

29. Verfahren nach Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet,daß die verwendeten Abstriche von Tumoren durch Einbettung in Paraffin konservierte und stabilisierte und in Formalin fixierte histologische Schnitte sind.

30. Verfahren nach Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, daß die verwendeten Abstriche von Tumoren Cytosole sind.

31. Verfahren nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, daß das immuncytochemische Verfahren durch Inkubation dieser Abstriche mit poly- oder monoclonalen Anti-pS2-Antikörpern oder Anti-fragmenten von pS2, eines Kaninchens oder eines anderen geeigneten Tieres und anschließend mit einem geeigneten Markierungs- and Detektionssystem auf den Antikörper durchgeführt wird.

32. Verfahren nach einem der Ansprüche 23 bis 31, dadurch gekennzeichnet, daß die zur Detektion eines Brustkrebses verwendeten biologischen Abstrichen einer gleichzeitigen immunologischen Detektion auf RE, auf RP und das Protein pS2 oder eines seiner Fragmente unterworfen werden, was einerseits eine zusätzliche funktionelle Heterogenität in den Brustkrebsen RE(+) (wobei nur etwa 60% der RE(+)-Tumore ebenso auf RP als auch auf die Expression des pS2-Gens positiv sind) und andererseits eine große Homogenität der RE(-)-Krebsarten betreffend die RP und die Expression des pS2-Gens (mit etwa 96% Abwesenheit der Fxpression dieser beiden durch Östrogene induzierbaren Gene), zeigt.

33. Verfahren zum Aufspüren und zur Diagnose nach einem der Ansprüche 23 bis 32, dadurch gekennzeichnet, daß es auf die Detektion pathologischer Zustände des Magens angewandt wird.

34. Verfahren zum Aufspüren und Diagnose nach einem der Ansprüche 23 bis 33, dadurch gekennzeichnet, daß die Expression des pS2-Gens szintigraphisch mit Hilfe mindestens eines Antikörpers nach einem der Ansprüche 16 und 17 bestimmt wird.

35. Kit, bereit zur Verwendung bei dem Aufspüren und der Diagnose nach einem der Ansprüche 23 bis 26 und 28 bis 34 eines pathologischen Zustands eines Organs durch immunologische Bestimmung in Tumorabstrichen, wie histologischen Schnitten oder Cytosolen, oder in Körperflüssigkeiten, wie insbesondere Urin, dadurch gekennzeichnet, daß es

- geeignete Mengen an polyclonalen oder monoclonalen Antikörpern gegen das Protein pS2 und/oder seine Fragmente;

- geeignete Mengen des Proteins pS2 und/oder diejenigen seiner Fragmente gegen die die verwendeten Antikörper gerichtet sind;

- geeignete Mengen an Anti-Immunglobulin-Antikörpern von Kaninchen (oder einem anderen geeigneten Säugetier), die geeignet markiert sind;

- ein System zur Entwicklung der Antikörper-Antigen- Reaktion, das aus einem zweiten Antikörper, der gegen ein Epitop des Proteins pS2 gerichtet ist und geeigneterweise markiert ist, besteht;

- gegebenenfalls eine Substanz zum Anfärben der Tumorzellen, wenn der biologische Abstrich aus histologischen Schnitten besteht und wenn deren Anfärbung gewünscht ist;

- nützliche Mengen an geeigneten Puffern zur Durchführung des Tests zur Untersuchung und zur Diagnose umfaßt.

36. Therapeutische Mittel, dadurch gekennzeichnet, daß sie einen oder mehrere Antikörper nach einem der Ansprüche 17 und 18 umfassen.

37. Therapeutische Mittel nach Anspruch 36, dadurch gekennzeichnet, daß sie zusammen mit einem anderen therapeutischen Mittel vorliegen.