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Die Erfindung betrifft ein Mikrodissektionsgerät und ein in vitro Verfahren zum Entfernen von Zellen eines vorbestimmten Zelltyps aus mindestens einer Gewebeprobe.
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Die molekulare Pathologie ist einer der am schnellsten wachsenden Teilmärkte des In-vitro-Diagnostik-Marktes. Dies ist unter anderem bedingt durch eine steigende Nachfrage nach personalisierter Medizin auf dem Gebiet der Krebstherapie, in der teure zielgerichtete Therapien gegen Tumor-aktivierte Moleküle in Krebszellen gerichtet sind. Die Wirkung eines Arzneimittels ist hauptsächlich abhängig von der Präsenz oder Abwesenheit von Tumor-spezifischen Mutationen in sogenannten „Treibergenen“ oder „Schlüsselgenen“. Dies kann zur Zulassung molekularer „Companion Diagnostic“-Tests führen, die mit einer vorgegebenen, zielgerichteten Therapie verbunden sind (z.B. Mutationen in dem Gen kRAS für Cetuximab oder Panitumumab, EGFR für Erlotinib und Gefitinib und BRAF für Vemurafinib).
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Die Qualität, Genauigkeit und Geschwindigkeit der Mutationsanalyse sind für einen Krebspatienten, der sich oft bereits in einem metastasierten und einem lebensbedrohlichen Zustand befindet, der Schlüssel zum Erhalt einer richtigen und leistungsfähigen Therapie. Qualität, Genauigkeit und Geschwindigkeit der Mutationsanalyse sind aber ebenso für Kosteneinsparung und Effizienz im Gesundheitssystem wichtig, um eine Verschreibung einer zielgerichteten Therapie mit hohen Kosten (bis zu 60.000 Euro pro Therapie und Patient) nur denjenigen zukommen zu lassen, die auch davon profitieren können.
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Die Laborroutine der molekularen Pathologie umfasst den Arbeitsablauf des Mutationstests, der derzeit durch die folgenden Schritte gekennzeichnet ist:
- a) Resektionieren des Tumors in einer Radiologie oder einem Operationsraum,
- b) Fixieren des Tumors unter Beibehalten der Morphologie durch eine Formalin-Fixierung (etwa z.B. 16 Stunden Dauer),
- c) Einbetten des Tumors in Paraffin in Gewebekassetten, was zu einem sogenannten Formalin-fixierten, in Paraffin eingebetteten „FFPE-Block“ führt,
- d) Schneiden des Tumorblocks in mehrere ca. 5 bis 10 Mikrometer dicke Replikate (also Gewebeschnittpräparate) durch ein Mikrotom, wobei meistens ein oder seltener mehrere Replikate auf einem Objektträger aufgebracht werden,
- e) Färben eines repräsentativen Schnittreplikates auf dem Objektträger durch z.B. Hämatoxylin-Eosin-Färbung („HE-Färbung“) als Referenzschnitt,
- f) mikroskopische Analyse der HE-Sektion durch den Pathologen, bei der in einem Gewebeausschnitt von Interesse allgemeine pathologische Gewebeausschnitte oder speziell mit Tumorzellen bestückte Gewebeausschnitte identifiziert und relevante Gewebeareale mit einem Stift oder Markierstift auf einem Deckglas über der Referenzprobe markiert werden,
- g) manuelles Ausschneiden (Ernten) des Gewebeausschnitts von Interesse durch einen Techniker, aus paraffinisierten, ungefärbten (oder alternativ aus deparaffinisierten, gefärbten) konsekutiven Replikatsektionen aus dem FFPE-Block auf Objektträgern, wobei die HE-gefärbte Referenzprobe als Vorlage dient; diese sogenannte „Mikrodissektion“ gewährleistet das Anreichern von Tumorzellen, wobei ein Schwellenwert des prozentualen Anteils an Tumorzellen durch Richtlinien für nachfolgende molekulare Analysen festgelegt ist,
- h) Überführen der Gewebeausschnitte in Probengefäße (22, 46) aus Plastik,
- i) Extrahieren von Nukleinsäuren (bisher meist manuell),
- j) Mutationsanalyse auf DNA-Ebene (oder zunehmend auch RNA-Ebene), wobei hierfür eine Vielzahl von Assaytechnologien zum Analysieren von Mutationen zur Verfügung stehen, die auf aus FFPE-Gewebe extrahierter DNA basieren und verschiedene Sequenziertechnologien, wie z.B. Sanger-Sequenzierung, Pyro-Sequenzierung, „Deep-Sequencing“ oder Real-Time-PCR-Methoden, die entweder Allel-spezifische PCR oder Schmelzkurven-Analyse umfassen oder Massenspektrometrie, verwendet werden,
- k) Empfehlung des Pathologen hinsichtlich eines zielgerichteten Therapievorschlags durch Bewertung der morphologischen (HE-Schnitt) und molekularen Analyse.
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Diese Schritte nehmen einen signifikanten Teil der täglichen Routine und der Arbeitslast in der molekularen Pathologie ein, wobei täglich bis zu mehreren hundert Tumorproben bearbeitet werden. Die Analysedauer eines solchen Prozesses beträgt normalerweise mehrere Tage, wird zu einem Großteil von Hand durchgeführt und ist nur geringfügig standardisiert.
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Dieses Prinzip kann jedoch auch außerhalb der Krebsforschung angewendet werden, also auf allen Gebieten, in denen bestimmte Zellen aus histologischen Gewebeschnitten für nachfolgende molekulare Analysen isoliert werden.
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Genauigkeit, Schnelligkeit, Arbeitsablauf und Standardisierung der Mutationsanalyse sind der Schlüssel zu einer effizienten prädiktiven und zielgerichteten Therapieentscheidung. Die Genauigkeit wird sowohl durch falsch positive als auch falsch negative Ergebnisse der Mutationsanalyse beeinflusst, genauer gesagt durch die oben genannten Arbeitsschritte f) bis j). Bisherige Verfahren zum Isolieren und dadurch dem Anreichern von spezifischen Gewebearealen von Objektträgern verlaufen komplett manuell und dadurch sehr subjektiv und sind sehr fehleranfällig.
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Um falsch negative und falsch positive Ergebnisse zu vermeiden, kann Laborpersonal trainiert werden, aber auch hier kann die Qualität von Labor zu Labor variieren. Die Qualitätssicherung zwischen Labors wird bisher durch Testen der Fertigkeiten des Personals und Ringstudien zu gewährleisten versucht. Ein wesentlicher Erfolgsfaktor wäre eine zunehmende Automatisierung des Prozesses unter Einbeziehung des Pathologen.
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Falsch negative Ergebnisse können bei einer analytischen undetektierten „verborgenen“ Tumor-DNA-Mutation auftreten. Wird zuviel gesundes Gewebe mit dem Gewebeausschnitt entfernt, kann eine Mutation z.B. mittels der klassischen Sanger-Sequenzierung, die eine Sensitivität von nur etwa 30% (Verhältnis mutiertes Allel zu gesundem Allel) aufweist, nicht mehr detektiert werden. Diese falsch negativen Ergebnisse ergeben sich meist aus ungenügender oder ungenauer und subjektiver Mikrodissektion oder ungenauem manuellen Überführen von Gewebeausschnitten in das Probengefäß zur Nukleinsäureextraktion. Falsch positive Ergebnisse können sich besonders durch Kontamination einer Probe mit flüssigem oder gekratzten Tumormaterial in einer Umgebung der operativen Mikrodissektion ergeben, indem unentdeckterweise Mutations-positive Gewebestücke auf Mutation-negative Gewebestücke überführt und später detektiert werden. In beiden Fällen würden bestimmte Krebspatienten ggf. falsch therapeutisch behandelt werden.
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Eine der Erfindung zugrundeliegende Aufgabe ist die Erhöhung der Effizienz und Genauigkeit einer Mikrodissektion durch Automatisierung, die zudem eine Verbesserung der Arbeitsgeschwindigkeit und des Durchsatzes (schnelleres Ergebnis) als auch eine Standardisierung des Arbeitsablaufes mit verbesserter Reproduzierbarkeit ermöglicht.
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Die Aufgabe wird gelöst von einem erfindungsgemäßen Mikrodissektionsgerät gemäß dem Patentanspruch 1. Die gestellte Aufgabe wird ebenfalls gelöst von einem erfindungsgemäßen Verfahren gemäß dem Patentanspruch 7. Vorteilhafte Weiterbildungen der Erfindung sind durch die Unteransprüche gegeben.
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Die Erfindung basiert auf der Idee, die kritischen Arbeitschritte in einem geschlossenen System zu automatisieren. Das erfindungsgemäße Mikrodissektionsgerät zum Isolieren von Zellen eines vorbestimmten Zelltyps aus mindestens einer Gewebeprobe und das erfindungsgemäße Verfahren ermöglichen eine schnellere, genauere und standardisierte Durchführung einer Mikrodissektion.
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Das erfindungsgemäße Mikrodissektionsgerät umfasst eine Mikrodissektionseinrichtung zum Entfernen eines ausgewählten Gewebeausschnitts der mindestens einen Gewebeprobe mittels mindestens eines Schneidelements, z.B. mittels eines Lasers oder Ultraschall-basierter Techniken. Das Mikrodissektionsgerät ist durch eine Bildaufnahmeeinrichtung, eine Analyseeinrichtung und eine Steuereinrichtung gekennzeichnet.
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Die Bildaufnahmeeinrichtung, z.B. eine Kamera, nimmt mindestens ein Bild, insbesondere ein digitales Bild, zumindest eines Teils der mindestens einen Gewebeprobe auf. Dabei kann ein Bild eines Teils einer Gewebeprobe und/oder einer Teilmenge mehrerer Gewebeproben aufgenommen werden. Das mindestens eine Bild kann zum Vorbestimmen des zu entfernenden Gewebeausschnitts herangezogen werden und/oder, z.B. als Kontrollbild, in z.B. einem Datenspeicher oder einem Labor-Informationssystem archiviert werden.
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Die Analyseeinrichtung, die zum Auswählen eines Gewebeausschnitts aus der Gewebeprobe in zumindest einem Bild eingerichtet ist, kann beispielsweise in einem Mikroprozessor des Mikrodissektionsgerät realisiert sein. Die Analyseeinrichtung kann dazu eingerichtet sein, ein Bild z.B. einer gefärbten Gewebeprobe als Referenzprobe auf z.B. Tumorzellen zu analysieren und einen Gewebeausschnitt der Referenzprobe, der z.B. Tumorzellen umfasst, auszuwählen und damit zu lokalisieren und/oder vorzubestimmen. Die Definition und/oder Lokalisation von z.B. bestimmten Gewebearealen oder Gewebeauschnitten auf dem Referenzschnitt kann dabei z.B. durch einen oder mehrere komplexe Bilderkennungsalgorithmen, besonders Tumorerkennenden Algorithmen, aber auch z.B. durch die komplexe Analytik des menschlichen Auges und Gehirns eines Pathologen erfolgen.
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Die Steuereinrichtung, die zum Ausrichten des mindestens einen Schneidelements der Mikrodissektionseinrichtung in Abhängigkeit von der Auswahl eingerichtet ist, kann ebenfalls z.B. in einem Mikroprozessor verwirklicht sein.
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Das Mikrodissektionsgerät liegt dadurch in einem geschlossenen System vor, d.h. die genannten Einrichtungen sind innerhalb eines Gerätegehäuses verbaut und miteinander gekoppelt. Ein Benutzer, z.B. ein Pathologe oder Laborant, gibt z.B. mehrere der Gewebeproben bzw. Replikatschnitte und eine Referenzprobe auf jeweils einem Probenträger, z.B. einem Objektträger, in das Gerät ein und kann dann mit einfachen Bedienhandlungen die Gewebeproben, insbesondere die anschauen, Ausschnitte hiervon auswählen und das Gerät dazu veranlassen, z.B. einen ausgewählten Gewebeschnitt von der Gewebeprobe auf mindestens einem der geladenen Replikatschnitte zu entfernen.
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Das erfindungsgemäße Verfahren zum Isolieren von Zellen eines vorbestimmten Zelltyps aus mindestens einer vorbestimmten Gewebeprobe auf jeweils einem Probenträger in einem erfindungsgemäßen Mikrodissektionsgerät umfasst dementsprechend die Schritte:
- – Bereitstellen eines Bildes von einer ersten Gewebeprobe als Referenzprobe durch die Bildaufnahmeeinrichtung,
- – Erzeugen eines Auswahlsignals durch die Analyseeinrichtung, wobei das Auswahlsignal Koordinaten von mindestens einer Begrenzung eines Gewebeausschnitts auf dem Probenträger mit der Referenzprobe beschreibt,
- – in Abhängigkeit von dem Auswahlsignal Ausrichten des mindestens einen Schneidelements gemäß der mindestens einen Begrenzung jeweils in der Referenzprobe und/oder mindestens einer weiteren Gewebeprobe als vorbestimmte Gewebeprobe und hierdurch Entfernen des ausgewählten Gewebeausschnitts durch das mindestens eine Schneidelement aus der mindestens einen vorbestimmten Gewebeprobe.
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Eine Begrenzung eines Gewebeausschnitts umfasst dabei einen Konturverlauf des Gewebeausschnitts. Unter dem Ausrichten des mindestens einen Schneidelements ist dabei das Einstellen des Schneidelements auf den Konturverlauf des Gewebeausschnitts auf dem Bild zu verstehen.
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Der Vorgang der Mikrodissektion verläuft somit zu einem erheblich größeren Anteil automatisch. Subjektive Abweichungen zwischen unterschiedlichen z.B. Mutationstests durch z.B. unterschiedliche Qualifikationen und Erfahrungen verschiedener Labortechniker und ungenaue Dissektionen werden vermieden. Ebenso erfolgt eine Standardisierung unterschiedlicher Labors. Durch Vermeiden der manuellen Arbeitsschritte wird eine Kontamination durch falsch positive Ergebnisse vermieden. Das Verfahren spart zudem Zeit, wodurch z.B. ein krebskranker Patient früher therapiert werden kann.
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In einer bevorzugten Ausführungsform kann das Mikrodissektionsgerät eine Anzeigeeinrichtung der Analyseeinrichtung, z.B. einen Bildschirm oder eine andere Einrichtung zum Anzeigen des mindestens einen Bilds, und/oder eine Bedieneinrichtung der Analyseeinrichtung zum Auswählen des mindestens einen Gewebeausschnitts durch den Benutzer umfassen.
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Die Bildaufnahmeeinrichtung kann gemäß dieser Ausführungsform das Bild der Referenzprobe an die Anzeigeeinrichtung der Analyseeinrichtung übertragen, die das Bild anzeigt. Eine Bedieneinrichtung ist dabei eine Einrichtung, die eine Bedienhandlung des Benutzers empfangen und in Abhängigkeit von der Bedienhandlung das Auswahlsignal erzeugen kann, wie z.B. eine Benutzerschnittstelle mit einem daran gekoppelten Touch-Screen.
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Dies ermöglicht z.B. dem Pathologen, selbst die Gewebeproben zu sichten und eine sinnvolle Entscheidung über den zu entfernenden Gewebeausschnitt zu treffen.
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Alternativ oder zusätzlich kann die Analyseeinrichtung dazu eingerichtet sein, das Bild einer Referenzprobe mit einem vorgegebenen Bild des vorbestimmten Zelltyps, insbesondere eines digitalen Bildes des vorbestimmten Zelltyps, zu vergleichen und in Abhängigkeit eines Ergebnisses des Vergleichs den Gewebeausschnitt aus der mindestens einen Gewebeprobe auszuwählen. Die Referenzprobe ist dabei eine Gewebeprobe, deren Zellen z.B. durch eine Hämatoxylin-Eosin-Färbung („HE-Färbung“) markiert sind. Dadurch wird eine vollautomatische Mikrodissektion ermöglicht. Durch einen entsprechenden Verfahrensschritt in dem erfindungsgemäßen Vefahren wird dem Benutzer des Mikrodissektionsgeräts somit ein Vorschlag einer möglichen Begrenzung des zu entfernenden Gewebeausschnitts unterbreitet, den der Benutzer z.B. annehmen oder ändern kann. Dies beschleunigt das Verfahren und unterstützt den Benutzer bei schlechten Färbungen.
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Es hat sich als besonders vorteilhaft erwiesen, wenn das Mikrodissektionsgerät eine Überführungseinrichtung zum Überführen oder Übertragen eines oder mehrerer entfernter Gewebeausschnitte in ein Probengefäß, z.B. ein Plastikröhrchen oder ein Reaktionsgefäß aus Plastik, umfasst. Dadurch wird einem Verlust von Zellen, wie er bei einem manuellen Überführen des ausgeschnittenen Gewebeausschnitts auftreten kann, vorgebeugt. Hierdurch ergibt sich vorteilhaft ein Vermeiden falsch negativer Ergebnisse und eine Verbesserung der Qualität bei einem einer Mutationsanalyse nachfolgenden Erstellen eines personalisierten Medikaments. Das Überführen des mindestens einen entfernten Gewebeausschnitts in ein Probengefäß durch die Überführungseinrichtung kann z.B. durch eine Anordnung des Probengefäßes unter dem Objektträger, also mittels Gravitation, oder z.B. durch Aufnehmen des entfernten Gewebeausschnittes auf z.B. einen kleinen, durch z.B. die Steuereinrichtung gesteuerten Spatel und Abstreifen des entfernten Gewebeausschnittes am Probengefäß erfolgen. Dadurch werden Zellen des gewünschten Zelltyps angereichert.
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Umfasst eine Gewebeprobe auf einem Probenträger z.B. mehrere übereinander liegende Mikrotomschnitte eines Gewebes, kann sich das Problem ergeben, dass die einzelnen Gewebeschnitte nicht exakt aufeinander liegen und gegeneinander verdreht oder verschoben sind (also eine sogenannte „Drift“ aufweisen). Ebenfalls kann es passieren, dass verschiedene Gewebeproben, die auf verschiedenen Probenträger fixiert sind, nicht exakt in der gleichen Position angebracht sein. In beiden Fällen würde ein Entfernen eines Gewebeausschnittes unter Umständen zu einem nicht exakten Entfernen des ausgewählten Gewebeausschnittes erfolgen. Um eine solche „Drift“ zu korrigieren, hat es sich als besonders vorteilhaft erwiesen, wenn, gemäß einer weiteren Ausführungsform, das erfindungsgemäße Mikrodissektionsgeräts eine Abtasteinrichtung umfasst, die dazu ausgelegt ist, eine Abweichung einer relativen Lage zweier voneinander getrennten Schichten der Gewebeprobe oder einer Abweichung einer Lage zweier Gewebeproben auf unterschiedlichen Probenträgern zu erfassen. Eine beispielhafte Abtasteinrichtung ist dabei ein Scanner.
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In der entsprechenden Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens umfasst das Verfahren die Schritte:
- – Abtasten der mindestens einen vorbestimmten Gewebeprobe durch die Abtasteinrichtung und dadurch Ermitteln einer Abweichung einer relativen Lage zweier Gewebeprobenschichten derselben vorbestimmten Gewebeprobe und/oder einer relativen Lage der mindestens einen vorbestimmten Gewebeprobe zu der Referenzprobe auf dem jeweiligen Probenträger, und
- – in Abhängigkeit von dem Auswahlsignal und der ermittelten Abweichung Korrigieren der Ausrichtung des mindestens einen Schneidelements für jede Gewebeschicht derselben vorbestimmten Gewebeprobe und/oder Korrigieren der Ausrichtung des mindestens einen Schneidelements für die jeweilige vorbestimmte Gewebeprobe.
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Zur Erhöhung des Durchsatzes an Gewebeproben, z.B. einer Vielzahl an Gewebeproben unterschiedlicher Patienten, und zum Ermöglichen einer Dokumentation des Verfahrensverlaufs, hat sich ein erfindungsgemäßes Mikrodissektionsgerät gemäß einer weiteren Ausführungsform als vorteilhaft erwiesen, das eine Identifikationscodeleseeinrichtung und/oder eine Identifikationscodeschreibeeinrichtung umfasst. Eine Identifikationscodeleseeinrichtung ist eine Einrichtung zum Erfassen und Erkennen eines Identifikationscodes, z.B. eines Barcodes auf einem Probenträger, sodass eine Gewebeprobe auf dem Probenträger z.B. einem Patienten zugeordnet und z.B. das Bild der Gewebeprobe in die Akte des Patienten gespeichert wird. Eine Identifikationscodeschreibeeinrichtung ist eine Einrichtung zum Erstellen eines Identifikationscodes, z.B. zum Erstellen eines Barcodes auf einem Probengefäß, in das der entfernte Gewebeausschnitt (oder die entfernten Gewebeausschnitte) des jeweiligen Patienten übertragen werden. Dadurch ist bei einer zufälligen Reihenfolge der Eingabe von Probenträgern in das Mikrodissektionsgerät, die den allgemeinen Messvorgang von Gewebeproben vieler verschiedener Patienten beschleunigt, gewährleistet, dass jede Gewebeprobe und jeder entfernte Gewebeausschnitt dem richtigen Patienten zugeordnet werden kann.
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Das erfindungsgemäße Verfahren kann dementsprechend in einer weiteren Ausführungsform das Auslesen eines Identifikationscodes eines Probenträgers durch eine Identifikationscodeleseeinrichtung und/oder das Erstellen eines Identifikationscodes auf einem Probenträger durch die Identifikationscodeschreibeeinrichtung umfassen.
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In einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist der Schritt des Extrahierens mindestens eines Biopolymers, z.B. einer Nukleinsäure, des entfernten Gewebeausschnitts in dem Mikrodissektionsgerät umfasst. Eine entsprechende Einrichtung, die dies ermöglicht, ist dabei vorzugsweise in das Mikrodissektionsgerät integriert.
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Eine weitergehende Automatisierung einer Mutationsanalyse kann in einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens durch einen Schritt des Amplifizierens des extrahierten Biopolymers und/oder des Sequenzierens des extrahierten Biopolymers ermöglicht werden. Eine entsprechende Einrichtung zum Amplifizieren z.B. einer Nukleinsäure, z.B. ein Thermocycler, und/oder eine entsprechende Sequenziereinrichtung sind dabei bevorzugt in das Mikrodissektionsgerät integriert.
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Die Erfindung wird anhand der beigefügten Zeichnungen noch einmal durch konkrete Ausführungsbeispiele näher erläutert. Die gezeigten Beispiele stellen bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung dar. Funktionsgleiche Elemente weisen in den Figuren dieselben Bezugszeichen auf. Es zeigt:
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1 eine Skizze zu einer erfindungsgemäßen Mikrodissektionsgeräts gemäß einem Ausführungsform veranschaulicht, und
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2 eine Skizze zu einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens und eine weitere Ausführungsform eines erfindungsgemäßen Mikrodissektionsgeräts.
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In dem in der 1 dargestellten Beispiel ist das einem erfindungsgemäßen Mikrodissektionsgerät 10 zugrunde liegende Prinzip veranschaulicht:
Das erfindungsgemäße Mikrodissektionsgeräts 10 umfasst eine Bildaufnahmeeinrichtung 12 und eine Mikrodissektionseinrichtung 14. Das Mikrodissektionsgerät 10 umfasst weiterhin eine Analyseeinrichtung 20, z.B. einen Mikroprozessor, der zum Auswählen eines Gewebeausschnittes aus einer oder mehreren Gewebeproben in zumindest einem Bild der Bildaufnahmeeinrichtung 12 eingerichtet ist. Die Analyseeinrichtung 20 kann weiterhin eine Bedieneinrichtung und/oder eine Anzeigeeinrichtung umfassen, über die, wie im der 1 veranschaulicht, ein Benutzer, z.B. ein Pathologe, ein Bild anschauen, analysieren und über eine Bedienhandlung, wie z.B. ein Bewegen und Klicken mit einer Computermaus, einen Gewebeausschnitt auswählen kann.
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Die Bildaufnahmeeinrichtung 12, die Mikrodissektionseinrichtung 14 und die Analyseeinrichtung 20 liegen in dem Gerät 10 in einem geschlossenen System vor. Das Mikrodissektionsgerät 10 kann also Gewebeproben 18 auf Probenträger 16 empfangen und stellt als Ergebnis eines durchgeführten erfindungsgemäßen Verfahrens einen oder mehrere Gewebeausschnitte, die vollautomatisch oder von einem Benutzer als relevante Gewebeausschnitte ausgewählt und damit vorbestimmt werden, bereit. Die Einrichtungen des Mikrodissektionsgeräts 10 kommunizieren dabei über gängige Kommunikationsprotokolle mittels drahtlosen oder drahtgebundenen Kommunikationsverbindungen. Das Mikrodissektionsgerät 10 kann ebenfalls eine Überführungseinrichtung (in der 1 nicht gezeigt) umfassen, die den oder die entfernten Gewebeausschnitte in ein Probengefäß 22 überführt.
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Die 1 zeigt ebenfalls einen Probenträger 16, z.B. einen Objektträger oder eine Mikrotiterplatte, auf dem eine Gewebeprobe 18 fest gelagert ist, z.B. eine Probe eines histologischen Schnittes z.B. menschlichen, tierischen oder pflanzlichen Gewebes. Die Gewebeprobe 18 kann auch mehrere, z.B. aufeinandergelegte histologische Replikate, also mehrere Gewebeschnitte, umfassen. Die Gewebeprobe kann z.B. auch eine gefärbte Referenzprobe 18’ umfassen.
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In einem beispielsweise separaten Aufreinigungssystem 24, z.B. einem Gerät zur automatischen Extraktion von z.B. mindestens einem Protein oder mindestens einer Nukleinsäure (wie z.B. DNS, RNS oder Polynukleotid) kann eine Extraktion des jeweiligen Biopolymers erfolgen (S11). Das so aufgereinigte mindestens eine Biopolymer, z.B. eine Nukleinsäure, des oder der entfernten Gewebeausschnitte können anschließend durch z.B. einen dem Fachmann bekannten Thermocycler (in der 1 nicht gezeigt) amplifiziert und/oder durch eine Sequenzieranordnung 26, z.B. einem Sanger-Sequenziergerät, sequenziert werden (S12). Alternativ kann das Mikrodissektionsgerät 10 entsprechende Einrichtungen 24, 26 zum Extrahieren, Amplifizieren oder Sequenzieren umfassen.
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Die 2 veranschaulicht ein Ausführungsbeispiel eines erfindungsgemäßen Verfahrens in einem beispielhaften erfindungsgemäßen Mikrodissektionsgerät 10. Der Benutzer beabsichtigt z.B. das Isolieren und Anreichern von Tumorzellen, um die Präsenz oder Absenz einer Mutation eines Treibergens, wie z.B. bRAF, EGFR oder KRAS zum Erstellen einer personalisierten Therapie nachzuweisen.
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Eine erste Gewebeprobe 18, z.B. ein histologischer Schnitt eines aus einem Patientenkörper operativ entfernten Gewebes, auf einem ersten Probenträger 16 kann durch eine Probenaufnahmeeinrichtung 28 des Mikrodissektionsgeräts 10 von dem Mikrodissektionsgerät 10 empfangen werden (Verfahrensschritt S1). Im Beispiel der 2 empfängt das Mikrodissektionsgerät 10 zusätzlich einen weiteren Probenträger 16 mit einer weiteren Gewebeprobe 18’ desselben Gewebes, die z.B. eine Referenzprobe 18’ umfasst, bei der das Gewebe durch z.B. eine Hämatoxylin-Eosin-Färbung („HE-Färbung“) oder Paragon-Färbung gefärbt wurde.
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Die Bildaufnahmeeinrichtung 12, die z.B. eine Digitalkamera, ein (Digital-)Mikroskop oder einen Scanner (wie z.B. einen HE-Scanner) umfasst, nimmt ein Bild 30, insbesondere ein digitales Bild (30, S2) der Referenzprobe 18’ auf (S2) und überträgt das Bild an die Analyseeinrichtung 20 (S3). Die Bildaufnahmeeinrichtung 12 kann nach Entfernen des Gewebeausschnitts 36 (S7) noch einmal ein Bild 30 der Gewebeprobe 18 als Kontrollbild 30 aufnehmen. Ein Bild 30 oder mehrere Bilder 30 können in einem Datenspeicher z.B. zu einer elektronischen Patientenakte gespeichert werden.
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Im vorliegenden Beispiel ist die Analyseeinrichtung 20 beispielsweise in einem Mikroprozessor des Mikrodissektionsgeräts 10 verwirklicht. Die Analyseeinrichtung 20 zeigt beispielsweise das Bild 30 durch eine Anzeigeeinrichtung 32, z.B. einem Bildschirm oder Touch-Screen, an. Das Bild 30 in der 2 zeigt beispielsweise einen vergrößerten Bereich der Referenzprobe 18’ mit mehreren Zellen, von denen die schraffiert dargestellten Zellen z.B. gefärbte Tumorzellen darstellen. Der Benutzer kann mittels einer Bedieneinrichtung 34 des Mikrodissektionsgeräts 10, z.B. einer Benutzerschnittstelle der Analyseeinrichtung 20, die z.B. eine Maus oder ein Touch-Screen umfasst, einen zu entfernenden Gewebeausschnitt 36 auf dem Bild 30 markieren (S5). Die Bedieneinrichtung 34 kann dazu eingerichtet sein, die Anzeige des Bildes 30 zu ändern, also z.B. in das Bild 30 hineinzuzoomen, herauszuzoomen oder es zu verschieben. Das Auswählen oder Vorbestimmen des Gewebeausschnitts 36 umfasst dabei lediglich das Markieren des Gewebeausschnitts 36 auf dem Bild 30, umfasst also keine Online-Steuerung des mindestens einen Schneidelements 38 der Mikrodissektionseinrichtung 14.
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Zusätzlich oder alternativ kann die Analyseeinrichtung 20 das Bild 30 der Referenzprobe 18’ mit z.B. einem vorgegebenen Bild des vorbestimmten Zelltyps vergleichen, wobei das vorgegebene Bild z.B. in einem Datenspeicher des Mikrodissektionsgeräts gespeichert sein kann und z.B. Bilddaten, die ein typisches Färbungsmuster von z.B. Tumorzellen beschreiben, umfasst. In Abhängigkeit eines Ergebnisses des Vergleichs, der z.B. über einen gängigen Bildanalysealgorithmus durchgeführt werden kann, kann die Analyseeinrichtung 20 einen Gewebeausschnitt 36 auf dem Bild 30 markieren und auf der Anzeigeeinrichtung 32 anzeigen, hierdurch also einen Gewebeausschnitt 36 „vorschlagen“.
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Im vorliegenden Beispiel wählt der Benutzer die auf dem Bild 30 schraffiert dargestellten Zellen aus. Die Analyseeinrichtung 20 erfasst die Bedienhandlung und ermittelt in Abhängigkeit der Bedienhandlung diejenigen Koordinaten auf dem Probenträger 16, die die Lage des Gewebeausschnittes 36 beschreiben. Die Koordinaten sind dabei Koordinaten eines zwei- oder dreidimensionslen Koordinatensystems auf dem jeweiligen Probenträger 16.
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Alternativ kann die Analyseeinrichtung 20 den Gewebeausschnitt 36 vollautomatisch auswählen, indem sie das Bild 30 auf vorgegebene Strukturen der Färbung analysiert und, wie bereits oben beschrieben, diese mit vorgegebenen Bilddaten vergleicht. Bei Übereinstimmung eines Färbemusters in einem Ausschnitt der Gewebeprobe 18 kann die Analyseeinrichtung 20 diesen Gewebeausschnitt 36 auswählen und damit vorbestimmen.
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Die Analyseeinrichtung 20 erzeugt in Abhängigkeit des ausgewählten Gewebeausschnitts 36 ein Auswahlsignal, das die Koordinaten, also einen Konturverlauf, mindestens einer Begrenzung des vorbestimmten Gewebeausschnitts 36 auf dem Probenträger 16 beschreibt. In Abhängigkeit von dem Auswahlsignal richtet eine Steuereinrichtung 40, die das Auswahlsignal empfängt (S4), mindestens ein Schneidelement 38 gemäß der mindestens einen Begrenzung jeweils in der Referenzprobe 18’ und/oder mindestens einer weiteren Gewebeprobe 18 als vorbestimmte Gewebeprobe 18 aus (S6). Ein Schneidelement 38 umfasst ein Instrument oder Instrumententeil, das ein Gewebe zerteilen oder zerschneiden kann, z.B. ein Laser oder ein Skalpell. Das Schneidelement 38 ist vorzugsweise ein Bestandteil der Mikrodissektionseinrichtung 14, die vorzugsweise ein „Laser-Capture-Microdissection“-System oder ein „Laser-Microbeam-Microdissection“-System umfasst.
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Das von der Steuereinrichtung 40 an der mindestens einen Begrenzung entlang gesteuerte Schneidelement 38 entfernt den vorbestimmten Gewebeausschnitt 36 aus der Gewebeprobe 18 und/oder der Referenzprobe 18’ (S7). Es besteht mit dem erfindungsgemäßen Verfahren die Möglichkeit, mehrere dem ausgewählten Gewebeausschnitt 36 entsprechende Gewebeausschnitte 36 aus einer Vielzahl von Gewebeproben 18 und/oder Replikaten zu entfernen. Dazu werden die ermittelten Koordinaten von der Analyseeinrichtung 20 jeweils auf die entsprechenden Koordinaten des jeweiligen Probenträgers 16 übertragen.
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Das Mikrodissektionsgerät 10 kann eine Abtasteinrichtung 42, vorzugsweise einen Scanner, umfassen, der eine relative räumliche Lage der Gewebeprobe 18’, 18 auf dem Probenträger 16 erfasst (S9). Dies kann das Abtasten der mindestens einen vorbestimmten Gewebeprobe 18 und dadurch Ermitteln einer Abweichung einer relativen Lage zweier Gewebeprobenschichten derselben vorbestimmten Gewebeprobe 18, wenn also z.B. eine Gewebeprobe 18 mehrere aufeinandergelegte histologische Schnitte umfasst. Ist beispielsweise eine erste Gewebeschicht, also z.B. ein erster histologischer Gewebeschnitt, gegenüber einer darüber liegenden Gewebeschicht um 90° gedreht, erfasst die Abtasteinrichtung 42 diese Abweichung und korrigiert in Abhängigkeit von dem Auswahlsignal und/oder der ermittelten Abweichung die Ausrichtung des mindestens einen Schneidelements 38 für das Entfernen des vorbestimmten Gewebeausschnitts 36 aus der ersten Gewebeschicht derselben vorbestimmten Gewebeprobe 18.
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Die Abtasteinrichtung 42 kann auch eine Abweichung der relativen Lage der mindestens einen vorbestimmten Gewebeprobe 18 zu der Referenzprobe 18’ auf dem jeweiligen Probenträger 16 ermitteln und in Abhängigkeit von dem Auswahlsignal und der ermittelten Abweichung die Ausrichtung des mindestens einen Schneidelements 38 für die jeweilige vorbestimmte Gewebeprobe 18 korrigieren (S10).
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Der oder die Probenträger 16 können während des Verfahrens innerhalb des Geräts auf z.B. einer Ablagefläche eines Bodens des Mikrodissektionsgeräts 10 gelagert sein. Dabei können beispielsweise mehrere Probenträger 16 nebeneinander gelagert sein, während des Verfahrens gegeneinander ausgetauscht werden oder mittels eines bewegbaren Bands zwischen den verschiedenen Einrichtungen des Geräts bewegt werden.
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Das Mikrodissektionsgerät 10 kann zusätzlich eine Überführungseinrichtung 44 umfassen, z.B. eine Anordnung, bei der der entfernte Gewebeausschnitt 36 unter dem Einfluss der Schwerkraft in ein Probengefäß 46 fällt oder durch z.B. eine Anordnung mit einer Feder, die den entfernten Gewebeausschnitt in das Probengefäß 46 katapultiert (S8). Alternativ kann z.B. auch eine thermoplastische Membran des Reaktionsgefäßes 46 mit dem entfernten Gewebeausschnitt 36 durch die Überführungseinrichtung 44 verbunden werden. Die Überführungseinrichtung 44 kann von der Steuereinrichtung gesteuert werden (S8).
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Das erfindungsgemäße Verfahren kann einen Identifikationscode 48 des Probenträgers 16, z.B. einen Barcode, durch eine optionale Identifikationscodeleseeinrichtung des Mikrodissektionsgeräts 10 auslesen und/oder einen solchen Identifikationscode durch eine optionale Identifikationscodeschreibeeinrichtung des Mikrodissektionsgeräts 10 auf z.B. dem Probengefäß 46 erstellen. Der Identifikationscode kann dabei z.B. Patientendaten umfassen. Das Mikrodissektionsgerät 10 kann so z.B. Patientendaten und/oder ein oder mehrere Bilder 30 des oder der Gewebeproben 18 miteinander verbinden und/oder z.B. über eine drahtlose oder drahtgebundene Kommunikationsverbindung an ein Labor-Informationssystem übertragen.
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Die fakultativen Verfahrensschritte des Extrahierens eines Biopolymers (S11), z.B. einer Nukleinsäure, des Amplifizieren des Biopolymers und/oder des Sequenzierens des Biopolymers (S12) sind in der 2 nicht dargestellt, können jedoch ebenfalls dem unten beschriebenen Verfahren durch entsprechende Einrichtungen 24, 26 des Mikrodissektionsgeräts 10 oder durch separate Geräte folgen.
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Die oben beschriebenen Ausführungsbeispiele veranschaulichen das Prinzip der vorliegenden Erfindung, die kritischen Arbeitsschritte zu automatisieren.
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Das erfindungsgemäße Mikrodissektionsgerät 10 kann beispielsweise als ein „integrierten und automatisierten Bildanalyseeinheit mit einem Gewebe-Mikrodissektor und einem Pathologen-Cockpit“ realisiert werden. Es beschreibt die Integration und Automatisierung der oben aufgeführten kritischen Arbeitsschritte f), g) und h), die bisher komplett manuell, subjektiv und fehleranfällig sind. Es kann z.B. vollautomatisch ausgestaltet sein und die anfangs beschriebenen Arbeitsschritte f), g) und h) integrieren.
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Ein solches Mikrodissektionssystem kann eine oder mehrere der folgenden Module umfassen:
- – Probenaufnahmeeinrichtung 28 zum z.B. zufälligen „Beladen“ des Geräts 10 mit Gewebeproben 18 auf Probenträgern;
- – z.B. eine digitale Kamera als Bildaufnahmeeinrichtung 12 und/oder einer Abtasteinrichtung 42, um ein z.B. hochauflösendes digitales Farbbild z.B. einer Referenzprobe 18’ zu gewinnen;
- – Graphische Bedienoberfläche („Cockpit“) als Bedieneinrichtung 34 und Anzeigeeinrichtung 32 für z.B. einen Pathologen, um z.B. die Referenzprobe 18’ zu „screenen“ oder überprüfen, einen Gewebeausschnitt 36 von Interesse zu identifizieren und/oder diese zu markieren, z.B. mithilfe einer dem Fachmann bekannten Bildanalysesoftware, und/oder um X-, Y- und/oder Z-Koordinaten von z.B. Gewebe und Paraffin zu bestimmen;
- – Datenspeicher, z.B. Festplatte, zum Speichern und/oder Archivieren der Bilddaten von der z.B. HE-gefärbten Referenzprobe 18’ und/oder ungefärbte Sektionen weiterer Replikate 18 (vor und/oder nach dem Entfernen des Gewebeausschnitts 36) und/oder der gewählten X-, Y- und/oder Z-Koordinaten;
- – Labor-Informations-System und/oder Kommunikationsverbindung zu einem Labor-Informations-System
- – Identifikationscodeleseeinrichtung, z.B. Barcodeleseeinrichtung für z.B. 2D-Barcodes auf einem Objektträger 16;
- – Mikrodissektionseinrichtung 14, z.B. ein „Laser-Capture-Microdissection“-System oder ein Schwerkraft-assoziiertes Mikrodissektionstechnologie-System, das den Gewebeausschnitt 36 von Interesse aus z.B. einen oder mehreren paraffinisierten, ungefärbten Sektionsreplikat oder Sektionsreplikaten auf z.B. einem Objektträger aufnimmt, wobei z.B. die X- und Y-Position einer Referenzprobe 18’ verwendet wird; und/oder
- – Überführungseinrichtung 44 zum Überführen des Gewebeausschnitts 36 in ein Probengefäß 46 (z.B. 1,5 Milliliter Sarstedt-Röhrchen).