DE102018110208A1

DE102018110208A1 - Gentechnisch veränderte Pestiviren und deren Verwendung als Markerimpfstoff

Info

Publication number: DE102018110208A1
Application number: DE102018110208.9A
Authority: DE
Inventors: Paul Becher; Alexander Postel
Original assignee: STIFTUNG TIERAERZTLICHE HOCHSCHULE HANNOVER; STIFTUNG TIERARZTLICHE HOCHSCHULE HANNOVER
Current assignee: STIFTUNG TIERAERZTLICHE HOCHSCHULE HANNOVER; STIFTUNG TIERARZTLICHE HOCHSCHULE HANNOVER
Priority date: 2018-04-27
Filing date: 2018-04-27
Publication date: 2019-10-31
Also published as: WO2019207095A1; CN112020509A

Abstract

In einem ersten Aspekt richtet sich die vorliegende Erfindung auf ein gentechnisch modifiziertes Pestivirus, dieses zeichnet sich dadurch aus, dass es derart modifiziert ist, dass zumindest der für das E^rns Peptid kodierende Genabschnitt aus einem entfernt verwandten Pestivirus oder aus mehreren Pestiviren stammt, die entfernt verwandt zu dem gentechnisch modifizierten Pestivirus sind. In einem weiteren Aspekt wird eine infizierte Wirtszelle oder ihr Zellkulturüberstand, ein erfindungsgemäß gentechnisch modifiziertes Pestivirus enthaltend, beschrieben. Darüber hinaus richtet sich die vorliegende Erfindung auf eine Vakzine und deren Verwendung sowie die Verwendung der gentechnisch modifizierten Pestiviren als Vakzine, insbesondere als Vakzine für Tiere sowie als Vakzine gegen die Klassische Schweinepest (KSP), die Bovine Virus Diarrhöe (BVD), die Border Disease (BD) sowie andere durch Pestiviren verursachte Erkrankungen. Weiterhin wird ein rekombinantes chimäres E^rns Peptid beschrieben sowie Nachweissysteme zum Nachweis von Pestiviren oder den von ihnen induzierten Antikörpern, insbesondere zur Differenzierung zwischen geimpften Tieren und Tieren nach einer natürlichen Infektion mit Pestiviren. Schließlich wird ein Verfahren zur Bestimmung beschrieben, inwieweit ein Tier mit einem erfindungsgemäßen Vakzin vakziniert wurde sowie diagnostische Kits hierfür und Verfahren zur Kontrolle einer Infektion mit einem Pestivirus in einer Population von Tieren aus der Ordnung der Artiodactyla.

Description

In einem ersten Aspekt richtet sich die vorliegende Erfindung auf ein gentechnisch modifiziertes Pestivirus, dieses zeichnet sich dadurch aus, dass es derart modifiziert ist, dass zumindest der für das E^rns Protein kodierende Genabschnitt aus einem entfernt verwandten Pestivirus oder aus mehreren Pestiviren stammt, die entfernt verwandt zu dem gentechnisch modifizierten Pestivirus sind. In einem weiteren Aspekt wird eine infizierte Wirtszelle oder ihr Zellkulturüberstand, ein erfindungsgemäß gentechnisch modifiziertes Pestivirus enthaltend, beschrieben. Darüber hinaus richtet sich die vorliegende Erfindung auf eine Vakzine und deren Verwendung sowie die Verwendung der gentechnisch modifizierten Pestiviren als Vakzine, insbesondere als Vakzine für Tiere sowie als Vakzine gegen die Klassische Schweinepest (KSP), die Bovine Virus Diarrhöe (BVD), die Border Disease (BD) sowie andere durch Pestiviren verursachte Erkrankungen. Weiterhin wird ein rekombinantes chimäres E^rns Polypeptid beschrieben sowie Nachweissysteme zum Nachweis von Pestiviren oder den von ihnen induzierten Antikörpern, insbesondere zur Differenzierung zwischen geimpften Tieren und Tieren nach einer natürlichen Infektion mit Pestiviren. Schließlich wird ein Verfahren zur Bestimmung beschrieben, inwieweit ein Tier mit einem erfindungsgemäßen Vakzin vakziniert wurde sowie diagnostische Kits hierfür und Verfahren zur Kontrolle einer Infektion mit einem Pestivirus in einer Population von Tieren aus der Ordnung der Artiodactyla.
Stand der Technik
Die Klassische Schweinepest (KSP) wird verursacht durch ein RNA-Virus (Virus der Klassischen Schweinepest; KSPV), dieses gehört zu der Gattung der Pestiviren innerhalb der Familie der Flaviviridae. Es stellt eines der weltweit bedeutendsten Tierseuchenerreger dar. Eine Impfung mit attenuierten KSPV Isolaten führt zu einer schnellen und lang anhaltenden Immunität. Das Goldstandard-Vakzin, das weltweit am häufigsten eingesetzt wird, basiert auf Varianten des sogenannten „C-Stamm“-Impfvirus. Eine serologische Unterscheidung der Immunantwort nach Impfung bzw. nach überstandener Feldinfektion ist jedoch nicht möglich. Diese Tatsache erschwert zum einen die Bekämpfung der KSP, da serologische Methoden in einer geimpften Population nicht eingesetzt werden können, zum anderen hat dies auch gravierende wirtschaftliche Konsequenzen, da geimpfte Tiere nicht oder schlechter vermarktungsfähig sind und weitreichende Handelsrestriktionen auferlegt werden. Impfstoffe, die eine Unterscheidung zwischen geimpften Tieren und Tieren mit/ nach natürlichen Infektionen (Feldinfektionen) ermöglichen, könnten diese Probleme lösen. Solche Impfstoffe werden auch als Marker- oder DIVA-Impfstoffe (DIVA: differentiation infected from vaccinates animals) bezeichnet. Für eine weitere wirtschaftlich relevante Tierseuche beim Rind, die Bovine Virus Diarrhöe (BVD) ist die Situation vergleichbar. Sie wird ebenfalls durch ein Pestivirus, das Virus der Bovinen Virusdiarrhöe (BVDV) ausgelöst, und auch hier könnten Marker-Impfstoffe eine Möglichkeit bieten, zwischen geimpften und infizierten Rindern mittels serologischer Methoden zu unterscheiden.
Üblicherweise wird bei einer pestiviralen Infektion, z. B. mit KSPV oder BVDV, eine Immunantwort gegen die glykosylierten Hüllproteine E2 und E^rns, sowie gegen das Nichtstruktur-Protein NS3 induziert. Insbesondere die Virus-neutralisierenden E2-spezifischen Antikörper spielen eine Schlüsselfunktion in der protektiven Immunantwort und bilden daher die Grundlage für die Entwicklung von entsprechenden Markerimpfstoffen gegen KSP, BVD und andere durch Pestiviren verursachte Erkrankungen. Das DIVA-Prinzip beruht meist auf dem Nachweis von Antikörpern gegen das pestivirale E^rns. Mit einem E2 basierten Markerimpfstoff immunisierte Tiere bilden eine protektive E2 spezifische Immunantwort aus und sind E^rns Antikörper negativ. Dieses Prinzip gilt gleichermaßen für unterschiedliche Pestiviren wie BVDV und KSPV. Diese Strategie umfasst somit die Herstellung von Markerimpfstoffen mittels gentechnischer Herstellung chimärer Pestiviren. Hierzu wird der für eines der drei oben genannten Proteine kodierende Genombereich durch homologe Sequenzen eines verwandten Pestivirus ausgetauscht. Eine Vielzahl unterschiedlicher chimärer Pestiviren wurde in der Vergangenheit erzeugt und zum Teil auf ihre Eignung als Marker-Impfstoff hin untersucht. Beispielhaft wird hier auf die WO 2016/176624 A2 und WO 2016/097245 A1 verwiesen.
Insbesondere die Abwesenheit von E^rns kodierenden Sequenzen oder deren Austausch durch homologe Sequenzen anderer Pestiviren ist eine vielversprechende Strategie, um einen serologischen Negativmarker zu entwickeln. Für die Herstellung von Lebendimpfstoffen ist die Deletion der von E^rns-kodierenden Sequenzen allerdings nicht möglich, da es sich um ein für Pestiviren essentielles Protein handelt. Vor kurzem wurde durch die europäische Arzneimittelagentur (EMA) weltweit erstmals ein chimäres Pestivirus als KSP-Marker Impfstoff zugelassen, hierzu handelt es sich um Suvaxyn® CSF Marker, Zoetis, Deutschland. Es handelt sich hierbei ebenfalls um die Strategie eines serologischen Negativmarkers, basierend auf dem Ausbleiben der Immunantworten gegen das E^rns Protein von KSPV. Hier wurde das Bovine Virus Diarrhoe Virus (BVDV) Isolat dahingehend verändert, dass das E2 Gen von BVDV durch das E2 Gen eines Schweinepestvirusisolates ersetzt wurde, so dass das chimäre Pestivirus protektive Antikörper gegen das KSPV E2 Protein induziert, siehe auch Reimann et al., 2004, Virology, 322, 143-157. Es zeigte sich in mehreren Studien, dass zwar eine sehr gute Schutzwirkung erzielt werden kann, jedoch in unterschiedlichen serologischen Tests eine relativ hohe Rate an falsch positiven Ergebnissen zu beobachten ist, so dass Feldinfektionen in geimpften Populationen nur eingeschränkt erkannt werden können, siehe z. B. Meyer et al., 2017, Transbound Emerg Dis, 64(6): 2013-2022 und Meyer et al., 2018, Transbound Emerg Dis, 65(2): e505-e508. Die beobachteten falsch-positiven Reaktionen sind wahrscheinlich verursacht durch serologische Kreuzreaktivität, da BVDV und KSPV genetisch und antigenetisch eng miteinander verwandt sind. Neben den falsch-positiven Resultaten bereitet auch die tierseuchenrechtlich bedeutende Unterscheidung von Infektionen bei Schweinen mit KSPV gegenüber Infektionen mit ruminanten Pestiviren (Pestiviren der Wiederkäuer), wie BVDV oder Border Disease virus (BDV), bei Anwendung von Suvaxyn® Probleme, da der Impfstoff auf dem BVDV Isolat „CP7“ beruht.
Für BVD ist bislang kein Markerimpfstoff zugelassen. Ein chimäres BVD-Virus, welches die E^rns-Sequenz des Pronghorn-Pestivirus trägt, ist beschrieben (Luo, et al, 2012). Eine Verwendung des Pronghorn E^rns im Kontext eines CSFV-Vakzins sowie experimentelle Daten zur Erzeugung einer KSPV-Chimäre und zur Immunantwort gegen ein solches Impfvirus in der Tierart Schwein sind bislang nicht beschrieben.
Das E^rns Protein (Anzahl an Aminosäuren: 227) zählt neben dem E2 zu den immunogenen Strukturproteinen des KSPV und weist unter anderem folgende Eigenschaften auf:

• E^rns besitzt eine Ribonukleaseaktivität;
• die Hälfte der molekularen Masse des E^rns ist auf Glykosylierung zurückzuführen;
• die Membranassoziation erfolgt über eine C-terminale amphipathische Helix;
• die molekulare Struktur vom glykosylierten Hüllprotein E^rns wurde erstmals von Langedijk J.P., J Virol, 2002, 76, 10383-10392, beschrieben;
• die Antigenstruktur des E^rns wurde mittels Epitope Mapping Studien näher charakterisiert. Die Epitope des E^rns liegen dabei vermehrt diskontinuierlichvor.

Ein grundlegendes Problem bisheriger chimärer Pestiviren im Hinblick auf ein robustes DIVA-Konzept ist die serologische Kreuzreaktivität zwischen Antikörpern gegen die klassischen ruminanten Pestiviren, wie BVDV und BDV, und KSPV-spezifischen Antikörpern. Es besteht ein hoher Grad von serologischer Kreuzreaktivität bei genetisch eng verwandten Pestiviren.
In den letzten Jahren wurden mehrere neue „atypische“ Pestiviren entdeckt, die sich genetisch stärker von klassischen, oben genannten Pestiviren (wie z.B. KSPV, BVDV, BDV und HoBi-like Pestiviren) unterscheiden. Die in WO 2017/114778 A1 beschriebene Pestivirus Marker Vakzine zeichnet sich dadurch aus, dass das E^rns Protein ein chimäres E^rns Protein ist, wobei das dafür kodierende Gen im 5' Bereich von einem Pestivirus stammt, das genetisch nur sehr wenig mit dem veränderten Pestivirus verwandt ist und am 3' Ende einen entsprechenden Genabschnitt eines E^rns Gens aufweist, der von einem mit dem veränderten Pestivirus eng verwandten Pestivirus stammt. Hierzu wird in dieser Schrift weiter ausgeführt, dass ein vollständiger Austausch des originalen E^rns in dem Pestivirus durch ein heterologes E^rns von einem genetisch entfernt verwandten Pestivirus die Replikation des erhaltenen chimären Pestivirus entweder stark reduziert oder sogar stoppt. Dieses Dokument lehrt, dass ein vollständiger Austausch des E^rns Gen des zu modifizierendes Pestivirus durch ein E^rns Gen aus einem entfernt verwandten Pestivirus in Bezug auf die virale Replikation und damit die Herstellung und Vermehrung eines Lebendimpfstoffes sehr nachteilig ist. Insbesondere E^rns Sequenzen von entfernt verwandten Pestiviren würden die oben erwähnten Probleme einer serologischen Kreuzreaktivität minimieren und damit eine Anwendung als serologischer Negativmarker in der Tierseuchenbekämpfung maßgeblich verbessern.
Beschreibung der Erfindung
Aufgabe ist die Bereitstellung von Pestiviren, die als Marker Vakzine geeignet sind, und eine bezogen auf das E^rns Protein geringere serologische Kreuzreaktivität mit klassischen Pestiviren (z.B. KSPV, BVDV, BDV) aufweisen.
In einem ersten Aspekt bezieht sich die folgende Erfindung auf ein gentechnisch modifiziertes Pestivirus, wobei das für E^rns kodierende Gen des Pestivirus derart modifiziert ist, dass zumindest der für das E^rns-Protein kodierende Genomabschnitt aus einem Pestivirus stammt, das nur entfernt verwandt zu dem gentechnisch modifizierten Pestivirus ist.
Unter dem Ausdruck „Gen“ oder „Genabschnitt“ oder „Genomabschnitt“ wird vorliegend verstanden, dass eine Nukleinsäure-Sequenz oder eine genomische Region kodierend für ein spezifisches Protein bzw.Teil eines Proteins (im Folgenden auch allgemein als Peptid oder Polypeptid bezeichnet) genannt wird.
Unter dem Ausdruck „gentechnisch modifiziertes Pestivirus“ wird vorliegend verstanden, ein Pestivirus, das durch gentechnische Verfahren ein für E^rns kodierendes Gen aufweist, das zumindest teilweise aus einem anderen Pestivirus stammt, als das gentechnisch modifizierte Pestivirus. D. h., der ursprüngliche E^rns kodierende Genomabschnitt ist zumindest teilweise durch einen entsprechenden E^rns Genabschnitt eines heterologen, zu dem gentechnisch modifizierten Pestivirus entfernt verwandten Pestivirus ersetzt.
Es zeigte sich nun überraschend, dass einerseits die so gentechnisch modifizierten Pestiviren unter Beibehaltung der Replikationsfähigkeit als Vakzine, z.B. Marker Vakzine, geeignet sind und darüber hinaus eine deutlich verringerte Kreuzreaktivität aufweisen. Gezeigt werden konnte dies bei einem gentechnisch modifizierten Pestivirus, bei dem Teilbereiche der E^rns kodierenden Sequenz von zwei unterschiedlichen jeweils entfernt verwandten Pestiviren miteinander kombiniert wurden. Zusätzlich wird durch den Austausch von E^rns-Sequenzen je nach verwendeter Sequenz ein unterschiedlicher Grad der Attenuierung erreicht.
Ob ein Pestivirus mit einem anderen Pestivirus eng verwandt oder entfernt verwandt ist, wird erfindungsgemäß bestimmt durch das Niveau der Identität der Nukleotidsequenzen des E^rns Gens des ursprünglichen Pestivirus und der Sequenz des eingebrachten E^rns Gens eines anderen Pestivirus. Im Falle eines KSPV als gentechnisch modifiziertes Pestivirus wird das E^rns des KSPV als ursprüngliches E^rns Gen verglichen mit dem eingebrachten Genabschnitt des entfernt verwandten Pestivirus, z. B. mit dem für das E^rns kodierenden Genabschnitt des Pestivirus aus der Ratte.
Bei der Herstellung von Lebendimpfstoffen in Form von chimären Pestiviren, ist es von Bedeutung, dass die ausgetauschten Sequenzen unterschiedlich genug sind, um eine Nutzung als serologischen Negativmarker zu erlauben, andererseits müssen die neu kombinierten Sequenzen biologisch kompatibel sein und nach Möglichkeit eine effiziente Vermehrung des Impfvirus erlauben.
Hierbei wird differenziert zwischen „eng verwandt“ und „entfernt verwandt“ auf Basis der Identität zwischen den entsprechenden E^rns kodierenden Sequenzen. Von „entfernt verwandt“ wird gesprochen, wenn die auf Basis der Anzahl an identischen oder verschiedenen Nukleinsäurebausteinen ermittelte Identität im Vergleich zum gentechnisch modifizierten Pestivirus (z.B. KSPV, BVDV) kleiner als 65 % ist. Ist die Identität größer oder gleich 65 %, so wird von einer „nahen bzw. engen Verwandtschaft“ gesprochen.
In einer Ausführungsform ist das erfindungsgemäß gentechnisch modifizierte Pestivirus dadurch gekennzeichnet, dass der E^rns Genabschnitt aus dem Pestivirus, das genetisch entfernt verwandt ist, ein E^rns Genabschnitt von einem Pestivirus ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Pronghorn-Pestivirus, Bungowannah-Virus; LINDA-Virus, Ratten-Pestivirus, Atypisches Porzines-Pestivirus (APPV) und Fledermaus-Pestivirus ist.
In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das gentechnisch modifizierte Pestivirus eines, wobei der das E^rns Protein kodierende Genabschnitt ein chimärer E^rns Genabschnitt ist, mit einem 5' Anteil bestehend aus dem entsprechenden Anteil eines E^rns Genabschnitts eines ersten entfernt verwandten Pestivirus und einem zweiten Anteil, der 3' angeordnet ist, ebenfalls stammend von einem E^rns Genabschnitt eines zweiten entfernt verwandten Pestivirus, wobei der erste und der zweite Genabschnitt von unterschiedlichen Pestiviren stammen.
In dieser Ausführungsform ist somit der Genabschnitt, der in dem gentechnisch modifizierten Pestivirus das E^rns Gen betreffend ausgetauscht wurde, einer der aus zwei Abschnitten besteht, wobei diese Abschnitte aus zwei unterschiedlichen Pestivirus-Spezies stammen. Beispielhaft sei hier genannt, dass ein Genabschnitt aus dem Pestivirus der Ratte stammt, während der andere Genabschnitt aus dem Pestivirus der Pronghorn-Antilope (Gabelbock) stammt. Weitere Beispiele schließen ein, dass ein Genabschnitt aus dem Ratten-Pestivirus stammt, während der andere aus APPV stammt oder ein Genabschnitt aus APPV und der andere aus dem Pronghorn-Pestivirus, sowie andere Kombinationen solange beide Genabschnitte entfernt verwandt sind zu dem E^rns Genabschnitt des Ziel-Pestivirus.
In einer Ausführungsform ist dabei das gentechnisch modifizierte Pestivirus, also das Ausgangs-Pestivirus (oder Ziel-Pestivirus), ein Pestivirus, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus dem Bovinen Virusdiarrhöe Virus (BVDV); Klassischen Schweinepest Virus (KSPV), „Hobi-like“ Pestiviren und Border Disease Virus (BDV).
In einer Ausführungsform ist dabei das gentechnisch modifizierte Pestivirus eines, das einen chimären E^rns Genabschnitt aufweist, wobei dieser chimäre E^rns Genabschnitt einer ist mit einem Teil aus dem E^rns Genabschnitt des Ratten-Pestivirus und einem weiteren Teil aus dem E^rns Genabschnitt des Pronghorn-Pestivirus. Die E^rns Gene dieser beiden Pestiviren sind die Genabschnitte gemäß SEQ ID Nr. 3 und 4.
In einer Ausführungsform ist dabei der E^rns Genabschnitt, der in das gentechnisch zu modifizierende Pestivirus eingebracht wird, einer mit einem 5' Anteil entsprechend dem 5' Abschnitt des E^rns Gens aus dem Ratten-Pestivirus und einem 3' Abschnitt entsprechend dem 3' Abschnitt aus dem E^rns Gen des Pronghorn-Pestivirus. In einer Ausführungsform ist dabei der E^rns Genabschnitt einer mit einer Sequenz gemäß SEQ ID Nr. 1. Das chimäre E^rns Gen, zusammengesetzt aus dem 5' Abschnitt des E^rns Gens des Ratten-Pestivirus und dem 3' Abschnitt des E^rns Gens des Pronghorn-Pestivirus,, kann dabei eines sein, das mindestens eine Sequenzidentität von 90 %, wie 95 %, insbesondere 99 % gegenüber der Sequenz gemäß SEQ ID Nr. 1 aufweist. Dabei erfüllen diese beiden E^rns Genabschnitte die Anforderungen dahingehend, dass sie weniger als 65 % Identität mit den entsprechenden E^rns Genabschnitten des zu modifizierenden Pestivirus aufweisen.
Die E^rns kodierende Sequenz aus dem Ratten-Pestivirus ist beschrieben in Firth et. al., 2014, MBio, 5(5): e01933-14, entsprechend den Positionen 1618-2298 der GenBank Accession No. NC025677. Die für E^rns kodierende Sequenz des Pronghorn-Pestivirus ist eine mit 681 Nukleotiden, entsprechend den Positionen 1165-1845 gemäß GenBank Nr. NC024018 und beschrieben in Neill et al., 2014, Genome Announc. 2014 Jun 12;2(3).
In einem Aspekt der vorliegenden Erfindung ist das gentechnisch modifizierte Pestivirus eines, das attenuiert ist. Unter dem Ausdruck „attenuiert“ wird vorliegend verstanden, dass das Virus eine reduzierte Virulenz aufweist.
In einer Ausführungsform ist das gentechnisch modifizierte Pestivirus ein gentechnisch modifiziertes KSPV. Dieses gentechnisch modifizierte KSPV enthält dabei einen E^rns Genabschnitt, zusammengesetzt aus einem 5' Abschnitt des E^rns kodierenden Genabschnitts aus dem Ratten-Pestivirus und einem 3' Genabschnitt entsprechend dem 3' Genabschnitt kodierend für E^rns aus dem Pronghorn-Pestivirus.
Die Genabschnitte, wie der 5' Genabschnitt und der 3' Genabschnitt umfassen dabei jeweils mindestens 20 Nukleotide, wie jeweils 25 Nukleotide, wie jeweils 30 Nukleotide des jeweiligen E^rns Genabschnitts des Pestivirus.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung eine Wirtszelle, die ein erfindungsgemäß gentechnisch modifiziertes Pestivirus enthält.
Geeignete Wirtszellen für die Replikation der Pestiviren sind allgemein bekannt und sind entsprechend aus Publikationen etc. entnehmbar und frei erhältlich. Beispiele für geeignete Wirtszellen schließen Zelllinien ein wie Schweinezelllinien einschließlich PK15, SK6, oder STE bei einem gentechnisch modifizierten KSPV Virus, bovine Zelllinien, wie MDBK bei einem gentechnisch modifizierten BVDV, aber auch andere beschriebene geeignete Wirtszellen einschließlich ovine Zellen wie zum Beispiel SFT-R.
Darüber hinaus richtet sich die vorliegende Erfindung auf eine Zusammensetzung umfassend erfindungsgemäße Wirtszellen oder erfindungsgemäße gentechnisch modifizierte Pestiviren oder Bestandteile hiervon mindestens umfassend ein E^rns Genabschnitt wie in der vorliegenden Anmeldung definiert oder ein Polypeptid kodiert durch einen dieser E^rns Genabschnitte. Diese Bestandteile umfassen den E^rns Genabschnitt oder das Polypeptid kodiert durch diesen E^rns Genabschnitt und können dabei in entsprechenden Zellkulturmedien oder in anderen Formen vorliegen. Die Zusammensetzung kann ebenfalls in Form von Zelllysaten eingesetzt werden. Natürlich kann die Zusammensetzung auch Kombinationen dieser einzelnen Bestandteile aufweisen.
In einem weiteren Aspekt richtet sich die vorliegende Erfindung auf Vakzine für Tiere, insbesondere Schweine aber auch Wiederkäuer wie Rinder und allgemein für Tiere der Ordnung der Artiodactyla. Diese Vakzine umfassen ein erfindungsgemäßes gentechnisch modifiziertes Pestivirus oder eine erfindungsgemäße Wirtszelle oder eine Kombination hiervon und ein pharmazeutisch annehmbares Trägermaterial.
Dem Fachmann sind geeignete Materialien für das Vakzin bekannt, insbesondere sind die weiteren Bestandteile der Vakzine derart, dass sie eine Verabreichung über den entsprechend geeigneten Verabreichungsweg erlauben. Geeignete Verabreichungswege für das Vakzin schließen ein: orale, nasale, mukosale, kutane, subkutane, intramuskuläre oder intravenöse Applikation.
Unter dem Ausdruck „Tiere“, für die das erfindungsgemäße Vakzin geeignet ist, werden Tiere verstanden, die für eine Infektion mit mindestens einem Pestivirus empfänglich sind. Dieses sind überwiegend Säugetiere und sind meist Mitglieder der Ordnung der Artiodactyla. Mögliche Tiere für die erfindungsgemäße Vakzinierung sind Schweine inklusive Wildschweine und Wiederkäuer, wie zum Beispiel Rinder, Schafe, Ziegen oder andere Wiederkäuer einschließlich Wildwiederkäuer (wie zum Beispiel Rehe, Hirsche, Antilopen) oder Kameliden (wie zum Beispiel Dromedare, zweihöckrige Kamele und Neuwelt-Kameliden wie zum Beispiel Alpakas und Vikunjas).
Das erfindungsgemäße Vakzin kann dabei eine Kombination von mehr als einem gentechnisch modifizierten Pestivirus aufweisen, wie z.B. zwei unterschiedliche gentechnisch modifizierte Pestiviren.
Die enthaltenen Pestiviren können dabei lebende, attenuierte oder inaktivierte Pestiviren sein. Die Attenuierung kann dabei durch die Chimärisierung der E^rns Sequenzen bestimmt werden oder es erfolgt eine Kombination der beschriebenen Erfindung mit weiteren genetischen Veränderungen zur Attenuierung des Virus oder in Kombination mit einem natürlicher Weise in der Zieltierart attenuierten Pestivirus. Dem Fachmann sind die geeigneten Variationen bekannt.
In einer Ausführungsform handelt es sich dabei um eine Lebendvakzine, z.B. solche mit attenuierten Markervakzinen, wie erfindungsgemäß beschrieben.
Diese Lebendvakzine liegen üblicherweise in gefriergetrockneter Form vor. Entsprechend können die erfindungsgemäßen Vakzine ausgebildet sein. Dem Fachmann sind entsprechende Verfahren zur Gefriertrocknung und zur anschließenden Rekonstitution bekannt.
In einer Ausführungsform können diese Vakzine Teil eines Kits sein, nämlich eines Kits oder Systeme mit mehreren Behältnissen, wobei einer dieser Behältnisse das gefriergetrocknete Vakzin umfasst und ein anderes Behältnis entsprechende Mittel zum Rekonstruieren dieses gefriergetrockneten Vakzins.
Der Ausdruck „pharmazeutisch annehmbare Träger“ beinhaltet entsprechend geeignete Lösungsmittel und Flüssigkeiten, wie Wasser, physiologische Salzlösungen oder phosphatgepufferte Salzlösungen genauso wie gegebenenfalls weitere Stabilisatoren und Konservierungsmittel.
Darüber hinaus können diese Vakzine Adjuvanzien enthalten, dem Fachmann sind geeignete Adjuvanzien bekannt.
Gegebenenfalls kann das erfindungsgemäße Vakzin mit weiteren Antigenen oder entsprechenden Pestiviren, die weitere Antigene exprimieren, verabreicht werden, als sogenanntes Kombinationsvakzin.
In einem weiteren Aspekt richtet sich die vorliegende Erfindung auf die Verwendung der gentechnisch modifizierten Pestiviren oder der erfindungsgemäßen Wirtszellen oder des erfindungsgemäßen chimären rekombinanten E^rns Polyeptids allein oder in Kombination zur Vorbeugung oder Reduktion einer Infektion mit dem Pestivirus oder entsprechender Anzeichen einer von einem Pestivirus induzierten Erkrankung in diesen Tieren.
In einem weiteren Aspekt wird ein Verfahren zum Vakzinieren von Tieren bereitgestellt umfassend den Schritt des Verabreichens des erfindungsgemäßen Vakzins. Insbesondere ist dieses Vakzin geeignet z.B. im Rahmen eines entsprechenden Behandlungsverfahrens, prophylaktisch oder therapeutisch eingesetzt zu werden, um die Infektion oder das Ausbreiten einer Infektion mit Pestiviren zu verhindern In einem weiteren Aspekt wird ein rekombinantes chimäres E^rns Polypeptid mit einem N-terminalen Abschnitt und einem C-terminalen Abschnitt bereitgestellt, wobei sowohl der N-terminale Abschnitt als auch der C-terminale Abschnitt aus zu KSPV und BVDV entfernt verwandten Pestiviren stammen, wobei diese entfernt verwandten Pestiviren unterschiedliche Pestiviren, insbesondere aus der Gruppe bestehend aus Pronghorn-Pestivirus, Bungowannah-Virus, LINDA-Virus, Ratten-Pestivirus, Atypisches Porzines-Pestivirus (APPV) und Fledermaus-Pestivirus sind.
Das erfindungsgemäße rekombinante chimäre E^rns Polypeptid ist in einer Ausführungsform dadurch gekennzeichnet, dass dieses einen N-terminalen E^rns Anteil, der vom Ratten-Pestivirus kodiert wird, und einen C-terminalen E^rns Anteil, der vom Pronghorn-Virus kodiert wird, insbesondere dass dieses Polypeptid die Sequenz gemäß SEQ Nr. 2 umfasst. In einer Ausführungsform umfasst dabei die das Polypeptid kodierende Sequenz auch homologe Sequenzen der Sequenz gemäß SEQ ID Nr. 2, wobei diese eine Identität auf Aminosäureebene von mindestens 90, 95 % aufweist.
In einem weiteren Aspekt wird ein Nachweissystem zum Nachweis von Pestiviren oder Pestivirus spezifischen Antikörpern bereitgestellt. Dieses zeichnet sich dadurch aus, dass es ein rekombinantes E^rns Polypeptid gemäß der vorliegenden Erfindung als Antigen aufweist. In einer Ausführungsform beinhaltet das Nachweissystem ein nicht-chimäres rekombinantes E^rns Polypeptid als Antigen. In einer Ausführungsform kann dieses Nachweissystem einerseits das erfindungsgemäße rekombinante Polypeptid als Antigen aufweisen und in einer weiteren Ausführungsform weist dieses Nachweissystem das oben genannte erfindungsgemäße Polypeptid auf und darüber hinaus ein zweites Polypeptid, das dem spezifischen Nachweis einer Feldinfektion mit dem Pestivirus, insbesondere KSPV oder BVDV dient. In einer Ausführungsform ist das erfindungsgemäße Nachweissystem eines, das einen differenzierten serologischen Nachweis einer Vakzinierung des Tieres mit erfindungsgemäßem gentechnisch modifiziertem Pestivirus gegenüber einer Infektion des Tieres mit nicht gentechnisch modifiziertem Pestivirus erlaubt. Während die vakzinierten Tiere keine Antikörper gegen das E^rns der nicht gentechnisch modifizierten, die Feldinfektion ausgelösten Pestiviren aufweisen, können entsprechende Antikörper gegen das vom Vakzin kodierte E^rns auftreten. In einer Ausführungsform ist das Nachweissystem eines zum differenzierten Nachweis einer Vakzinierung eines Tieres mit einem erfindungsgemäßen Vakzin, insbesondere ein KSPV oder BVDV Vakzin, wobei dieses Nachweissystem gekennzeichnet ist dadurch, dass es ein rekombinantes E^rns Polypeptid als Antigen, wie es vorliegend beschrieben wird, aufweist, nämlich ein nicht chimäres E^rns Polypeptid aus im Vergleich zu KSPV und BVDV entfernt verwandten Pestiviren stammend, wobei diese entfernt verwandten Pestiviren insbesondere aus der Gruppe bestehend aus Pronghorn-Pestivirus, Bungowannah-Virus, LINDA-Virus, Ratten-Pestivirus, Atypisches Porzines-Pestivirus (APPV) und Fledermaus-Pestivirus sind.
Entsprechend ist das erfindungsgemäße Nachweissystem insbesondere geeignet, eine entsprechende Unterscheidung von vakzinierten Tieren und natürlich infizierten Tieren zu erlauben. In einer entsprechenden Ausführungsform betrifft somit die vorliegende Erfindung die Verwendung des rekombinanten chimären E^rns Peptids zum Nachweis von Antikörpern gegen ein erfindungsgemäßes gentechnisch modifizierten Pestivirus, das insbesondere ein gentechnisch modifiziertes Virus der Klassischen Schweinepest (KSPV) oder Virus der Bovinen Virusdiarrhöe (BVDV) ist. Eine Ausführungsform ist dabei die Verwendung zur Differenzierung einer natürlichen Infektion mit KSPV, BVDV oder anderen Pestiviren und einer Vakzinierung mit einem erfindungsgemäßen gentechnisch modifizierten Pestivirus. Diese Verwendung erfolgt dabei z.B. in Form eines DIVA ELISA.
In einer Ausführungsform ist die erfindungsgemäße Verwendung eine Verwendung des erfindungsgemäßen rekombinanten chimären E^rns Polypeptids oder die Verwendung eines nicht chimären E^rns Polypeptids aus zu KSPV und BVDV entfernt verwandten Pestiviren, wobei diese entfernt verwandten Pestiviren, insbesondere aus der Gruppe bestehend aus Pronghorn-Pestivirus, Bungowannah-Virus, LINDA-Virus, Ratten-Pestivirus, Atypisches Porzines-Pestivirus (APPV) und Fledermaus-Pestivirus sind.
Darüber hinaus betrifft die vorliegende Erfindung ein diagnostisches Kit umfassend ein erfindungsgemäßes, gentechnisch modifiziertes Pestivirus und/oder ein erfindungsgemäßes rekombinantes chimäres E^rns Polyeptid oder Teile hiervon wie hierin definiert.
Schließlich wird ein Verfahren zur Kontrolle einer Infektion mit einem Pestivirus in einer Population von Tieren der Ordnung der Artiodactyla unter Verwendung eines erfindungsgemäßen Vakzins oder eines erfindungsgemäßen diagnostischen Testkits oder eines erfindungsgemäßen gentechnisch modifizierten Pestivirus oder eines rekombinanten chimären E^rns Polypeptid oder einer erfindungsgemäßen Zelle, oder einer erfindungsgemäßen Zusammensetzung, oder eines E^rns Polypeptids von nicht chimären E^rns Peptid aus zu KSPV und BVDV entfernt verwandten Pestiviren, wobei diese entfernt verwandten Pestiviren Pestiviren insbesondere aus der Gruppe bestehend aus Pronghorn-Pestivirus, Bungowannah-Virus, LINDA-Virus, Ratten-Pestivirus, Atypisches Prozines-Pestivirus (APPV) und Fledermaus-Pestivirus sind.
Das erfindungsgemäße Nachweissystem und die erfindungsgemäßen Verfahren können dabei ein übliches, dem Fachmann bekanntes Nachweissystem oder Verfahren, insbesondere immunologische Verfahren und immunologische Nachweissysteme beinhalten.
Dem Fachmann sind geeignete Verfahren und Nachweissysteme, insbesondere immunologische Verfahren und immunologische Nachweissysteme bekannt. Diese Nachweissysteme und Verfahren beruhen insbesondere auf dem Nachweis von Antikörpern des Wirtes, gerichtet gegen das Virus bzw. das Vakzin.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren und dem erfindungsgemäßen Nachweissystem kann es sich insbesondere um ein ELISA-System handeln. In einer Ausführungsform kann dieses System als DIVA- (differentiation of infected from vaccinated animals) ELISA verwendet werden.
Das erfindungsgemäße Nachweissystem bzw. das erfindungsgemäße diagnostische Testkit kann dabei weitere übliche Bestandteile enthalten, wie Waschpuffer, Blockierungspuffer sowie Substrate zum Nachweis gebildeter Komplexe aus Antigen/Antikörpern. Ggf. können weitere Sekundärantikörper zum Nachweis gebundener Antikörper eingesetzt werden. Dem Fachmann sind geeignete Bestandteile, insbesondere auch geeignete Sekundärantikörper mit entsprechenden Markern bekannt. Diese Marker sind insbesondere solche, die eine enzymatische Reaktion erlauben oder andere Marker, wie Farbstoffe.
Die Abbildungen zeigen:

1: Genetische Identitäten der kompletten E^rns kodierenden Nukleotidsequenzen ausgewählter Pestiviren. Für die Ermittlung der genetischen Identitäten wurden E^rns kodierende Sequenzen von klassischen Pestiviren (z.B. KSPV und BVDV) bzw. von den zu diesen klassischen Pestiviren entfernt verwandten Pestiviren (z.B. Pestiviren „Ratte“ und „Pronghorn“) verwendet, sowie die chimäre E^rns Sequenz „RaPro“. Die Identitäten wurden jeweils zwischen zwei miteinander verglichenen Sequenzen mittels MUSCLE, Clustal W (Version Clustal 2.1, default Einstellungen) bestimmt.
2: Gezeigt sind die Charakteristika der verwendeten Schweinepestviren und Vakzin-Prototypen.
3: 3 zeigt die viralen Genomlasten im Blut, Speichel und Kot in den ersten 28 Tagen nach Impfung.
4: 4 zeigt die Bestimmung der Induktion neutralisierender Antikörper.
5: Gezeigt sind die DIVA Eigenschaften der Marker-Impfstoffprototypen.

Die Erfindung wird im Folgenden anhand von Beispielen näher erläutert. Ohne auf diese beschränkt zu sein.
Beispiele
Über gerichtete Mutation und Klonierung von Nukleinsäure-Fragmenten wurden rekombinante Pestiviren auf Basis eines cDNA Klons des KSPV Isolates „Alfort-Tübingen“ (Genotyp 2.3) erzeugt (Meyers et al, 1996, J Virol. 70(3): 1588-95). Dabei wurde die komplette E^rns kodierende Sequenz von KSPV Alfort-Tübingen durch die entsprechenden Bereiche des Pronghorn-Pestivirus, des Ratten-Pestivirus und einer Kombination aus Ratten-und Pronghorn-Pestivirus ersetzt. Ausgehend von RNA des Pronghorn-Pestivirus Isolates bzw. ausgehend von einer auf Basis der veröffentlichten Sequenz synthetisierten Nukleinsäure beim Ratten-Pestivirus, wurden die entsprechenden E^rns Genabschnitte, zu diesem Zweck mittels PCR amplifiziert. Über die Primer wurde an beide Enden des Amplikons etwa 20 Nukleotide fusioniert, die komplementär zu den Sequenzabschnitten waren, die unmittelbar stromaufwärts und stromabwärts des zu ersetzen Genom-Bereichs angrenzten. Über die Methode der „target-primed Plasmid-Amplifikation“ wurden die Pronghorn- bzw. Ratten-Pestivirus Sequenzen in das Ziel-Plasmid eingeführt, welches lediglich Teile der Pestiviralen cDNA enthielt. Nach Zerstörung des Ursprungsplasmids durch Dpnl-Verdau, Vermehrung des neu erzeugten Plasmids in E. coli und Bestätigung der erfolgreichen genetischen Manipulation über Nukleinsäuresequenzierung wurde die modifizierte E^rns-Sequenz über einen Xhol-Bg/ll- Restriktionsverdau aus dem Plasmid herausgeschnitten und über die gleichen Schnittstellen in den eigentlichen infektiösen cDNA Klon umgesetzt. Mittels gerichteter Mutagenese wurden alle Smal Restriktionsschnittstellen entfernt, bis auf eine künstlich eingeführte, die das 3'Ende des Pestivirusgenoms definiert. Die so hergestellten Plasmide wurden mittels Smal-Restriktion linearisiert und anschließend mittels Sp6 DNA-abhängiger RNA-Polymerase in RNA umgeschrieben. Die auf diese Weise hergestellte chimäre Pestivirus-RNA wurde über Elektroporation in porzine Schweinenierenzellen transfiziert und anschließend in unterschiedlichen Zelllinien passagiert. Die erfolgreiche Virusreplikation wurde durch Immunfluoreszenzfärbung mit dem Pestivirus-spezifischen monoklonalen Antikörper C16 nachgewiesen. Schließlich wurden rekombinante chimäre Pestiviren nach einem Gefrier-Tau-Zyklus infizierter Zellkulturen geerntet, titriert und die kompletten Genomsequenzen wurden mittels Hochdurchsatzsequenzierung bestimmt.
Die drei chimären Pestiviren wurden ihren Virustitern entsprechend verdünnt, um sie anschließend mit einer einheitlichen Dosis von etwa 10⁵ TCID₅₀/Schwein zu applizieren. Die Dosis wurde nach Applikation in die Schweine anhand einer Rückstellprobe über Rücktitration bestätigt.
Die drei Impfstoff-Prototypen mit unterschiedlichem Wachstumsverhalten in Zellkultur wurden nachfolgend für eine Impfstudie bei 10 Wochen alten Ferkeln eingesetzt. Hierzu wurden die Impfviren auf gleiche Titer eingestellt und jeweils einer Gruppe von 5 Ferkeln intramuskulär verabreicht. Eine weitere Gruppe von 5 Ferkeln erhielt eine gleiche Dosis des parentalen KSP Wildtypvirus „Alfort-Tübingen“ („AlfT“, Genotyp 2.3), aus dem die gentechnisch erzeugten Impfviren hervorgegangen sind, um die mögliche Abschwächung der Virulenzeigenschaften zu bestimmen (Kontrolle Attenuierung). Nach 28 Tagen erfolgte eine orale Belastungsinfektion mit einer sehr hohen Dosis (2×10^6,0 TCID₅₀) eines hoch virulenten, genetisch heterologen KSPV (Isolat „Koslov“, Genotyp 1.1). Zur Überprüfung der Belastungsinfektion wurde außerdem eine nicht-geimpfte Gruppe bestehend aus 3 Ferkeln mit der gleichen Dosis infiziert (Kontrolle Belastungsinfektion).
Für die Beurteilung der Tiere während des Impfversuches wurden fortlaufend klinische Untersuchungen durchgeführt. Zur Beurteilung der klinischen Schwere von KSPV spezifischen Symptomen wurde ein nach Mittelholzer et al., 2000, Vet Microbiol., 74(4): 293-308 modifiziertes Punkteschema angewandt. Des Weiteren wurde die rektale Körpertemperatur aufgezeichnet. Des Weiteren wurden im Abstand von drei bis sieben Tagen Probenentnahmen (EDTA-Blut, Serum, oraler Tupfer, Kot-Tupfer) für weiterführende Laboranalysen durchgeführt. Nach Belastungsinfektion und einem anschließenden Beobachtungs- und Beprobungszeitraum von weiteren 12 bzw. 13 Tagen wurden die geimpften Schweine getötet, pathologisch untersucht und Organproben entnommen.
Die molekularbiologischen Untersuchungen erfolgten nach Präparation der Nukleinsäuren aus Körperflüssigkeiten mittels QIAamp® Viral RNA Mini Kit (Qiagen). Hierzu wurden die Speichel- und Kottupfer zuvor in einem Milliliter Zellkulturmedium ausgedrückt und das Material aus dem Tupfer in Suspension gebracht. Für die PCR Untersuchungen zur Virämie wurde als Material nach Gefrier-Tau-Zyklus lysiertes EDTA-Blut eingesetzt. Die Präparation von Nukleinsäuren aus Organmaterial erfolgte mittels NucleoSpin^® RNA Kit (Macherey und Nagel), ausgehend von einem Erbsengroßen Organstück. Zur Quantifizierung von Genomlasten wurde eine quantitative Taqman-basierte real-time RT-PCR durchgeführt. Hierzu wurde das QuantiTect Probe RT-PCR Kit (Qiagen) eingesetzt unter Verwendung von Primern und Sonden nach Hoffmann et al., 2005, J Virol Methods, 130(1-2): 36-44. Die Diskriminierung von Impfviren und Challenge-Virus in den Organproben erfolge durch Vergleich von 150 Nukleotiden großen Sequenzfragmenten in der 5' nicht translatierten Region und anschließender Zuordnung zum KSPV Genotyp 1.1 (Challenge-Virus) bzw. 2.3 (Impfviren).
Die hämatologischen und serologischen Untersuchungen erfolgten an EDTA-Blut bzw. Serum-Proben. Die Bestimmung von weißen Blutzellen erfolgte ausgehend von frischem EDTA-Blut mit Hilfe eines Blutanalysegerätes (Abacus Junior Vet) nach Herstellerempfehlungen. Für die Bestimmung neutralisierender Antikörper wurden je Serum-Probe drei Virusneutralisationstests (VNTs) durchgeführt. Die Titer-Bestimmung erfolgte dabei nach Testung und Auswertung von Quadruplikaten jeder Serumverdünnungsstufe, zum einem getestet mit dem gentechnisch unveränderten Wildtypvirus „AlfT“ (Genotyp 2.3), zum anderen mit dem genetisch heterologen KSPV („Koslov“, Genotyp 1.1). Des Weiteren wurde zur Untersuchung des DIVA Prinzips die Verlaufsseren aller Schweine in einem E2 basierten kommerziellen ELISA (IDEXX CSFV Ab Test) und in einem E^rns Antikörper-ELISA (PIGTYPE® CSFV Ab, Qiagen) nach Herstellerangaben getestet.
Die wesentlichen Ergebnisse werden im Folgenden zusammengefasst.
In der 1 ist dargestellt, wie ein Identitätsvergleich zwischen Pestivirus-Sequenzen erfolgt. Die Identitäten zwischen E^rns kodierenden Sequenzen aus KSPV Isolat „Alfort-Tübingen“ („AlfT“), BVDV Isolat CP7, einem entfernt verwandten Pestivirus aus der Ratte und einem entfernt verwandten Pestivirus aus einer Pronghorn-Antilope sowie aus dem chimären Pestivirus „RaPro“ sind dargestellt für den kompletten E^rns kodierenden Bereich. Die Identitäten wurden jeweils zwischen zwei miteinander verglichenen Sequenzen mittels MUSCLE, Clustal W (Version Clustal 2.1, default Einstellungen) bestimmt.
Die 2 zeigt eine Übersicht über die Charakteristika der drei hergestellten Marker-Impfstoffprototypen „Pronghorn“, „Ratte“ und „RaPro“ bei denen ausgehend vom KSPV „Alfort-Tübingen“ („AlfT“, Genotyp 2.3) die E^rns Sequenzen durch entsprechende homologe E^rns Sequenzen entfernt verwandter Pestiviren ausgetauscht worden sind. Der Prototyp „Pronghorn“ zeigte bezüglich Replikation und Ausbreitung in Zellkultur überraschender Weise keine Unterschiede zu KSPV „AlfT“ und konnte zu ähnlichen Virustitern vermehrt werden (Titer 10^6,0 TCID₅₀/ml). Des Weiteren zeigte es sich, dass auch der Austausch von KSPV E^rns mit dem E^rns von einem entfernt verwandten Ratten-Pestivirus zu einem replikationsfähigen rekombinanten Virus führte. Dabei wies der Impfstoff-Prototyp „Ratte“ eine vergleichsweise reduzierte Replikation auf (Titer 10^4,4 TCID₅₀/ml). Die sehr guten replikativen Eigenschaften des Impfstoffkandidaten „Pronghorn“ sollten genutzt werden, um ein Impfvirus mit einem chimären E^rns herzustellen, welches verbesserte Replikationseigenschaften besitzt. Das chimärisierte E^rns enthält dabei den antigen wirksamen Bereich des E^rns Proteins vom Ratten-Pestivirus (N-terminal lokalisiert) sowie einen C-terminal lokalisierten Anteil des E^rns vom Pronghorn-Pestivirus. Eine Kombination von den beiden E^rns Sequenzen führte in Zellkultur tatsächlich zu einem intermediären Phänotyp des Prototyps „Ra-Pro“. Das Impfvirus „RaPro“ zeigte keinen durchgängig infizierten Zellrasen wie nach Infektion mit dem Impfvirus „Pronghorn“, jedoch im Vergleich zum Impfvirus „Ratte“ deutlich größere Foki infizierter Zellen. Dementsprechend konnte für „RaPro“ im Vergleich zum Impfvirus „Ratte“ durch die Chimärisierung des E^rns eine Steigerung des Titers auf etwa 10^5,3 TCID₅₀/ml erreicht werden (2).
Im Impfversuch mit Belastungsinfektion zeigten nur die Kontroll-Gruppen (Kontrollgruppe Attenuierung: intramuskulär infiziert mit KSPV „AlfT“, ungeimpfte Kontrollgruppe: oral infiziert mit KSPV „Koslov“) Symptome der KSP. In der Kontrollgruppe Attenuierung mussten am Tag 18 des Versuchs drei Tiere aufgrund schwerer Erkrankung aus Tierschutzgründen euthanasiert werden, ebenso die ungeimpften Tiere sechs Tage nach Belastungsinfektion. Die geimpften Tiere zeigten auch 12-13 Tage nach Belastungsinfektion keine Symptome einer KSP oder andere gesundheitliche Beeinträchtigungen. In der Gruppe „Pronghorn“ zeigten einige Tiere etwa ab dem 3.-4. Tag nach Impfung leichtes Fieber (mehr als 40°C über mehr als zwei Tage). Eine leichte Erhöhung der Körpertemperatur (kein Fieber) wiesen zwei Tiere der Impf-Gruppe „Ratte“ etwa 3-4 Tage nach der Belastungsinfektion auf. Damit zeigten alle gentechnisch modifizierten Pestiviren eine deutliche Attenuierung im Vergleich zum Wildtyp KSPV „AlfT“, wenn auch in unterschiedlichem Maße. Die Daten lassen die Schlussfolgerung zu, dass im Kontext eines mäßig virulenten KSPV Isolates wie „AlfT“ bei Einführung der E^rns Sequenz aus dem Pronghorn Pestivirus eine zusätzliche Attenuierung oder Verwendung eines an sich weniger bzw. nicht virulenten Isolates erforderlich ist. Eine Schutzwirkung gegen klinische Symptome einer KSP nach heterologer Belastungsinfektion konnte durch alle Marker-Impfstoffprototypen erreicht werden.
Blutzellparameter, wie die Leukozytenzahl und die Thrombozytenzahl, sind geeignet, um die Schwere einer KSPV Infektion zu beurteilen. Beide Zelltypen sind nach KSPV Infektion deutlich herabgesetzt (Leukopenie, Thrombozytopenie). Beide Kontrollgruppen zeigen eine ausgeprägte Leukopenie wenige Tage nach der Infektion. In der Impfgruppe „Pronghorn“ kam es bei drei von fünf Schweinen zu einer transienten (vorübergehenden) Leukopenie. Bei den anderen Impfgruppen „Ratte“ und „RaPro“ bewegten sich die Leukozytenzahlen im erwarten Referenzbereich, wobei jeweils ein Tier für einige Tage Werte im unteren Grenzbereich aufwies. Die Leukozytenzahlen bestätigen eine Attenuierung aller Impfstoff-Prototypen im Vergleich zum Ursprungsvirus „AlfT“. Ein vergleichbares Bild zeigt sich bei den Thrombozytenzahlen. Das „Pronghorn“ Impf-Virus zeigt sich wiederum am wenigsten attenuiert, so dass eine Korrelation zur Replikation und zum Wachstumsverhalten in Zellkultur festzustellen ist (2). Der Impfstoff-Prototyp „RaPro“ weist im Vergleich zu den Viren „Pronghorn“ und „Ratte“ wiederum einen intermediären Phänotyp auf.
Untersuchungen von Voll-Blut, Speichel und Kotproben wurden durchgeführt um festzustellen, in wieweit sich die Impfviren und das KSPV nach Belastungsinfektion durch das Blut (Virämie) im Organismus ausbreiten können und in welchem Ausmaß eine Virusausscheidung erfolgt (3). Nach Verabreichung des „Pronghorn“ Impfvirus kam es bei zwei von fünf Schweinen zu einer lang anhaltenden Virämie bis zum Zeitpunkt der Belastungsinfektion an Tag 28 nach Impfung. Diese Tiere waren die einzigen, die Impfvirus auch mit dem Kot ausschieden. Darüber hinaus schieden alle Tiere der „Pronghorn“ Impf-Gruppe das Impfvirus für einige Tage auch mit dem Speichel aus. In der Impfgruppe „RaPro“ zeigte sich bei drei von fünf Tieren eine kurze Virämie mit niedrigen Genomlasten, zu keinem Zeitpunkt jedoch eine Ausscheidung von Impfvirus Genom über Kot oder Speichel. Genome des Impfvirus „Ratte“ konnten zu keinem Zeitpunkt im Blut, Kot oder Speichel nachgewiesen werden (3). Damit bestätigen diese Analysen eine Abschwächung der Virulenz im Schwein analog zu den Beobachtungen in Zellkultur, wobei das Impfvirus „Pronghorn“ am wenigsten attenuiert ist, das Impfvirus „Ratte“ hingegen eine sehr starke und „RaPro“ eine intermediäre Attenuierung aufweist.
Nach der Belastungsinfektion mit einem hochvirulenten KSPV konnte bei keinem der geimpften Tiere, mit Ausnahme der zwei Schweine aus der „Pronghorn“-Impfgruppe, die anhaltend virämisch waren, KSPV Genom im Blut nachgewiesen werden. Auch eine Ausscheidung über den Kot war nicht nachweisbar. Ein Genomnachweis im Speichel war aufgrund der oro-nasalen Applikation bei der Belastungsinfektion zunächst möglich, wobei die Genomlasten schnell sanken und am Versuchsende keine KSPV Genome mehr nachweisbar waren. Die Daten lassen die Schlussfolgerung zu, dass trotz hoher Virusmengen bei der Belastungsinfektion mit einem hochvirulenten Virus-Isolat in allen Impfgruppen die Schutzwirkung so gut war, dass eine Ausbreitung von KSPV im Organismus und nachfolgend eine Ausscheidung wirksam unterbunden wurde.
Die Induktion von Virus-neutralisierenden Antikörpern wurde anhand von Serumproben in Virusneutralisationstests (VNT) bestimmt (4). Es zeigte sich, dass der intermediäre Phänotyp des Impfstoffprototypen „RaPro“, im Vergleich zu dem stark attenuierten „Ratten“-Impfvirus und dem wenig attenuierten „Pronghorn“-Impfvirus am besten neutralisierende Antikörper zu induzieren vermag. Diese Beobachtung deckt sich mit Wissen, das ein Mindestmaß an viraler Replikation erforderlich ist, um eine gute Schutzwirkung durch einen Impfstoff zu erzielen, sowie mit der Tatsache, dass virulente Pestiviren in der Lage sind, die Immunantwort des Wirtes zu unterdrücken und damit auch die effiziente Induktion neutralisierender Antikörper.
Neben der effizienten Induktion neutralisierender Antikörper, ist ein maßgeblicher Aspekt der Erfindung eine sichere Unterscheidung geimpfter Tiere von infizierten Tieren (DIVA Prinzip). Während die Schweine der ungeimpften Gruppe (Kontrolle Belastungsinfektion) vor der Induktion einer humoralen Immunantwort verstarben und das Wildtypvirus „AlfT“ (Kontrolle Attenuierung), die Induktion von Antikörpern teilweise hemmte, haben alle geimpften Tiere hohe Antikörpertiter gegen das E2 Antigen gebildet, unabhängig vom verwendeten Impfstoff-Prototyp (5, oben). Damit ist ein diagnostischer Nachweis KSPV E2-spezifischer Antikörper eindeutig dokumentiert. Dieselben Serum-Proben der geimpften Tiere zeigten vor der Belastungsinfektion, unabhängig vom Zeitpunkt nach Impfung, keine Reaktivität in einem E^rns Antikörper-ELISA (pigtype ELISA, Qiagen), so dass das Marker-Prinzip eines serologischen Negativmarkers für alle eingeführten E^rns Antigene bei den unterschiedlichen Marker-Impfstoffkandidaten gut funktionierte. Erst eine Woche nach Belastungsinfektion wurden im DIVA-ELISA erste Anstiege der E^rns-spezifischen Antikörper bei einigen Schweinen beobachtet (5, unten). Insbesondere E^rns Antigene von genetisch entfernt verwandten Pestiviren sind für ein robustes DIVA-Konzept sehr vielversprechend, da hier mit verminderter oder im Idealfall mit einer komplett ausbleibenden Kreuz-Reaktivität zu rechnen ist. Vor diesem Hintergrund erscheinen die Impfstoff-Kandidaten „RaPro“ und „Ratte“ besonders geeignet.
Nachdem alle Kontrolltiere aufgrund schwerer KSP Symptome euthanasiert werden mussten und alle geimpften Tiere frei von klinischen Symptomen geblieben sind, wurde der Versuch 12 bzw. 13 Tage nach Belastungsinfektion beendet. Alle Tiere wurden einer pathologischen Untersuchung unterzogen, wobei sich bei keinem der geimpften Tiere Veränderungen im Sinne einer KSP feststellen ließen. Es wurden im Bereich des Kopfes Proben von lymphatischem Gewebe (Tonsille, Lymphonodus mandibularis) gewonnen, um sie auf Anwesenheit von KSPV- oder Impfvirusgenom zu untersuchen. Des Weiteren wurde die Parotis (Speicheldrüse), Milz und Niere auf Anwesenheit von Virusgenom untersucht, um eine eventuelle Viruspersistenz nach virämischer Ausbreitung zu überprüfen. Bei den zwei Tieren aus der Gruppe, die mit dem Impfstoffprototyp „Pronghorn“ geimpft wurden und daraufhin eine langanhaltende Virämie entwickelten, waren in der Milz und Niere Impfvirusgenom bzw. KSPV Genom nachweisbar. Das Impfvirus konnte zum Versuchsende darüber hinaus lediglich bei Tieren der „Pronghorn“-Gruppe in den Tonsillen nachgewiesen werden. Alle anderen geimpften Tiere lieferten keinen Hinweis auf eine systemische Ausbreitung von Impfvirus oder KSPV und es war auch lokal in den lymphatischen Geweben des Kopfes kein Genom von Impfvirus mehr nachweisbar. Lokal waren bei mehreren Tieren noch geringe Mengen KSPV Genom zu detektieren (Tonsille und Ln. mandibularis), wobei bei drei Schweinen in der Gruppe „RaPro“ bereits kein Virusgenom mehr nachweisbar war. Dies bestätigt die Beobachtung, dass die Schutzwirkung des Impfstoff-Prototyps „RaPro“ am besten war und die Belastungsinfektion effektiv unterbunden werden konnte.
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
Zitierte Patentliteratur

WO 2016/176624 A2 [0003]
WO 2016/097245 A1 [0003]
WO 2017/114778 A1 [0008]

Claims

Gentechnisch modifiziertes Pestivirus, wobei das für E^rns kodierende Gen des Pestivirus derart modifiziert ist, dass zumindest der für das E^rns-Protein kodierende Genabschnitt aus mindestens einem Pestivirus stammt, das entfernt verwandt zu dem gentechnisch modifizierten Pestivirus ist.
Gentechnisch modifiziertes Pestivirus nach Anspruch 1, wobei der das E^rns Protein kodierende Genabschnitt ein chimärer E^rns Genabschnitt ist, der aus zwei oder mehr E^rns Genabschnitten unterschiedlicher Pestiviren besteht, die entfernt verwandt zu dem gentechnisch modifizierten Pestivirus sind.
Gentechnisch modifiziertes Pestivirus nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das gentechnisch modifizierte Pestivirus ein Pestivirus ist ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Bovines Virusdiarrhöe Virus (BVDV); Klassisches Schweinepest Virus (KSPV), Hobi-like Pestiviren und Border Disease Virus (BDV).
Gentechnisch modifiziertes Pestivirus nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der E^rns Genabschnitt aus dem Pestivirus, das gentechnisch entfernt verwandt ist, ein E^rns Genabschnitt von einem Pestivirus ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Pronghorn-Pestivirus, Bungowannah-Virus; LINDA-Virus, Ratten-Pestivirus, Atypisches Porzines-Pestivirus (APPV) und Fledermaus-Pestivirus ist.
Gentechnisch modifiziertes Pestivirus nach Anspruch 4, wobei dieses eines ist ausgewählt aus KSPV und BVDV.
Gentechnisch modifiziertes Pestivirus nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der chimäre E^rns Genabschnitt mit einem Teil aus dem E^rns Genabschnitt des Ratten-Pestivirus und einem Teil aus dem E^rns Genabschnitt des Pronghorn-Pestivirus hergestellt wurde, insbesondere wobei der E^rns Genabschnitt des Pronghorn-Pestivirus am 3'-Ende lokalisiert ist.
Gentechnisch modifiziertes Pestivirus nach Anspruch 6 enthaltend einen chimären E^rns Genabschnitt mit einem 5' Genabschnitt entsprechend dem 5' Genabschnitt des E^rns Genabschnitts aus dem Ratten-Pestivirus und einem 3' Genabschnitt entsprechend dem 3' Genabschnitt des E^rns Genabschnitts aus dem Pronghorn-Virus, insbesondere ein E^rns Genabschnitt mit einer Sequenz gemäß Seq. ID. NO. 1.
Gentechnisch modifiziertes Pestivirus nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass dieses gentechnisch modifizierte Pestivirus ein attenuiertes Pestivirus ist.
Wirtszelle, umfassend ein gentechnisch modifiziertes Pestivirus nach einem der Ansprüche 1 bis 8.
Zusammensetzung umfassend eine Wirtszelle nach Anspruch 9 oder ein gentechnisch modifiziertes Pestivirus nach einem der Ansprüche 1 bis 8, oder Bestandteile hiervon mindestens umfassend einen E^rns Genabschnitt wie in einem der Ansprüche 1 bis 8 definiert oder ein Polypeptid kodiert durch diesen E^rns Genabschnitt.
Vakzine für Tiere, insbesondere Paarhufer wie Schweine oder Rinder, umfassend ein gentechnisch modifiziertes Pestivirus nach einem der Ansprüche 1 bis 8 oder eine Wirtszelle nach Anspruch 9, oder eine Zusammensetzung nach Anspruch 10 oder eine Kombination hiervon, und einem pharmazeutisch annehmbaren Trägermaterial.
Gentechnisch modifiziertes Pestivirus nach einem der Ansprüche 1 bis 8 zur Verwendung zur Vorbeugung oder zur Reduktion einer Infektion mit einem Pestivirus oder zur Reduktion entsprechender Anzeichen einer von einem Pestivirus induzierten Erkrankung in diesen Tieren.
Rekombinantes chimäres E^rns Polypeptid mit einem N-terminalen Abschnitt und einem C-terminalen Abschnitt, wobei sowohl der N-terminale Abschnitt als auch der C-terminale Abschnitt aus zu KSPV und BVDV entfernt verwandten Pestiviren stammen, wobei diese entfernt verwandten Pestiviren unterschiedliche Pestiviren, insbesondere aus der Gruppe bestehend aus Pronghorn-Pestivirus, Bungowannah-Virus, LINDA-Virus, Ratten-Pestivirus, Atypisches Porzines-Pestivirus (APPV) und Fledermaus-Pestivirus sind.
Rekombinantes chimäres E^rns Polypeptid nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass dieses einen N-terminalen E^rns Genabschnitt aus dem Ratten-Pestivirus und einen C-terminalen E^rns Genabschnitt aus dem Pronghorn-Virus aufweist, insbesondere dass dieses Polypeptid die Sequenz gemäß SEQ Nr. 2 umfasst.
Nachweissystem zum Nachweis von Pestiviren oder Pestivirus-spezifischen Antikörpern, insbesondere von KSPV und BVDV, dadurch gekennzeichnet, dass dieses Nachweissystem ein rekombinantes chimäres E^rns Polypeptid als Antigen nach einem der Ansprüche 13 bis 14 aufweist.
Nachweissystem zum differenzierten Nachweis einer Vakzinierung eines Tieres mit einem Vakzin nach Anspruch 11, insbesondere ein KSPV oder BVDV Vakzin, dadurch gekennzeichnet, dass dieses Nachweissystem ein rekombinantes E^rns Polypeptid als Antigen nach einem der Ansprüche 13 oder 14 aufweist oder ein nicht-chimäres Ems Polypeptid, das aus zu KSPV und BVDV entfernt verwandten Pestiviren stammt, wobei diese entfernt verwandten Pestiviren, insbesondere aus der Gruppe bestehend aus Pronghorn-Pestivirus, Bungowannah-Virus, LINDA-Virus, Ratten-Pestivirus, Atypisches Porzines-Pestivirus (APPV) und Fledermaus-Pestivirus sind.
Verwendung des rekombinanten chimären E^rns Polypeptides nach Anspruch 13 oder 14 oder Verwendung eines nicht-chimären Ems Polypeptides wie in Anspruch 16 definiert zum Nachweis von Antikörpern gegen ein Vakzin nach Anspruch 11 zur Differenzierung einer natürlichen Infektion mit KSPV oder BVDV und einer Vakzinierung mit einem gentechnisch modifizierten Pestivirus, das insbesondere ein KSPV oder BVDV ist, insbesondere in Form eines DIVA ELI-SAs.
Diagnostisches Test Kit umfassend ein gentechnisch modifiziertes Pestivirus nach einem der Ansprüche 1 bis 8 oder ein rekombinantes E^rns Polypeptid nach einem der Ansprüche 13 oder 14 oder ein nicht-chimäres E^rns Polypeptid wie in Anspruch 16 definiert.
Verfahren zur Kontrolle einer Infektion mit einem Pestivirus in einer Population von Tieren aus der Ordnung der Artiodactyla unter Verwendung eines Vakzins nach Anspruch 11 oder eines diagnostischen Test Kits nach Anspruch 18 oder eines gentechnisch modifizierten Pestivirus nach einem der Ansprüche 1 bis 8, oder eines rekombinanten chimären Polypeptids nach einem der Ansprüche 13 oder 14, oder eines nicht-chimären E^rns Polypeptids wie in Anspruch 16 definiert, oder einer Wirtszelle nach Anspruch 9 oder einer Zusammensetzung nach Anspruch 10.