-
Die
vorliegende Erfindung betrifft neue Biokatalysatoren aus Pflanzen
der Gattungen Pastinaca, Petroselinum, Anethum oder Levisticum zur
Herstellung von optisch aktiven Hydroxyverhindungen. Die Biokatalysatoren
können als vegetative Teile der Pflanzen oder als isolierte
Enzyme zum Einsatz kommen. Die optisch aktiven Hydroxyverbindungen
werden aus den entsprechenden prochiralen Ketonen hergestellt.
-
Die
enantioselektive Synthese chiraler Verbindungen hat in den vergangenen
Jahren weiter an Bedeutung gewonnen. Optisch aktive Hydroxyverbindungen
sind wichtige chirale Vorstufen für die Entwicklungen in der
Pharmazie, in der Katalysatorherstellung und in der Agrochemie.
[R. N. PATEL: „Biocatalytic Synthesis of Chiral
Pharmaceutical Intermediates", Food Technol. Biotechnol. 42 (4)
305–325 (2004)].
-
Die
Herstellung optisch aktiver Hydroxyverbindungen erfolgt in verschiedenen
chemischen und biokatalytischen Verfahren (Faber et al. „Biotransformations
in Organic Chemistry", 5th ed. 2004, Springer Verlag Berlin Heidelberg
New York). Chemische Synthesen haben oft niedrige Ausbeuten
oder ergeben geringe optische Reinheiten. Hohe Enantiomerenüberschüsse
sind meist nur durch Einsatz teurer Katalysatoren oder unter extremen
Reaktionsbedingungen möglich.
-
In
biokatalytischen Verfahren wird lebendes biologisches Material wie
Mikroorganismen, pflanzliche oder tierische Zellkulturen zur Ganzzellbiotransformation
bzw. Enzyme, die aus dem biologischen Material gewonnen werden zur
enzymatischen Biotransformation eingesetzt. Diese Systeme können
auch für die Reduktion von prochiralen Ketonen zu optisch
aktiven Hydroxyverbindungen verwendet werden. Die große
Anzahl an Veröffentlichungen und Patenten steht dabei im
Gegensatz zu den bisher umgesetzten industriellen Verfahren (Wandreg
et al. „Industrial Biotransformations", Wiley-VCH Verlag
GmbH Weinheim, 2000). Ursache dafür sind die oftmals
hohen Verfahrenskosten, verursacht durch Cofaktoren und Enzyme sowie
das eingeschränkte Substratspektrum der verwendeten Biokatalysatoren.
-
Die
meisten Veröffentlichungen zur Verwendung von Biokatalysatoren
zur Herstellung von optisch aktiven Hydroxyverbindungen beschreiben
den Einsatz von Mikroorganismen oder mikrobiell hergestellter Enzyme.
Das schnelle Wachstum, die hohen erreichbaren Zelldichten und die
Steuerbarkeit der Biotransformationsprozesse sind Vorteile des Einsatzes
von Mikroorganismen. Allerdings müssen Mikroorganismen
unter sterilen Bedingungen gezüchtet, die Enzyme aufwendig
isoliert und die Biotransformationen in abgeschlossenen Reaktoren
durchgeführt werden.
-
Der
Einsatz von Biokatalysatoren aus pflanzlichen Quellen ermöglicht
eine einfach einzusetzende Biotransformation ohne hohen apparativen
Aufwand. Dazu wurden in den letzen Jahren viele Untersuchungen durchgeführt
(Nakajiama et al., „Biotransformations using plant
cultured cells", J. Molecular Catalysis B: Enz. 23 (2003) 145–170).
So wurden von Marioni et. al. (J. Molecular Catalysis B:
Enz. 11 (2000) 55–58) Untersuchungen zur präparativen
Synthese von Reduktio nen mit Daucus carota Wurzeln durchgeführt.
Von Mironowicz et al. (Tetrahedron Asymmetry 13 (2002) 2299–2302)
wurden Untersuchungen zur enantioselektiven Reduktion von Ketonen
mittels Karotten, Sellerie und Meerrettich durchgeführt.
-
Yadav
et. al. der in Tetrahedron: Asymmetry 12 (2001) 3381–3385 und
J.
Org. Chem. 2002, 67, 3900–3903 die Verwendung
von Daucus carota Wurzeln für die Reduktion von Ketonen
beschreibt, hat das Verfahren in den USA zum US-Patent angemeldet.
Die Anmeldung wurde als
US 2004/0082043 A1 veröffentlicht.
-
Die
ständig weltweit laufenden Untersuchungen unterstreichen
die Arbeiten an der Universität von Sao Paulo, BRA von
Leandroh et. al. (J. Molecular Cat. B: Enz. 38 (2006) 84–90)
zur Bioreduktion von aromatischen Ketonen mit verschiedenen Pflanzenarten.
Viele der verwendeten Pflanzenarten haben jedoch bei teilweise guter
Enantioselektivität nur eine geringe Umsetzung.
-
Aufgabe
der Erfindung war es demnach, neuartige enantioselektive Biokatalysatoren
zu finden, die günstig zur Verfügung stehen und
einfach eingesetzt werden können und zur Herstellung von
optisch aktiven Hydroxyverbindungen aus den entsprechenden prochiralen
Ketonen geeignet sind.
-
Erfindungsgemäß wurde
die Aufgabe durch Biokatalysatoren aus Pflanzen der Gattungen Pastinaca, Petroselinum,
Anethum oder Levisticum gelöst, welche durch Zerkleinern
dieser Pflanzen oder Teilen davon und gegebenenfalls weitere Verarbeitungsschritte
hergestellt worden sind.
-
Zwar
gehören die genannten Pflanzen wie die einleitend erwähnten
Möhren zur Familie der Doldenblütler. Die Familie
der Doldenblüter beinhaltet ein breites Spektrum verschie denster
Pflanzenarten, die durch unterschiedlichen Wuchs und Fruchtform
stark variieren. Diese Pflanzenarten wurden neben verschiedenen Pflanzen
aus anderen Familien untersucht, wobei nur wenige Arten verwertbare
Ergebnisse lieferten. Die überraschende Eignung der genannten
Pflanzen ergab sich somit erst anhand langwieriger Untersuchungen.
-
Der
pflanzliche Biokatalysator kommt in vegetativer Form als Pflanze
oder Pflanzenteil, als Rohextrakt der homogenisierten Pflanzenteile
oder als isoliertes Enzym der Pflanze zum Einsatz.
-
Bevorzugt
werden die erfindungsgemäßen Biokatalysatoren
aus Pflanzen der Gattung Pastinaca oder Petroselinum hergestellt.
-
Es
ist bevorzugt, dass die Biokatalysatoren aus vegetativen Pflanzen
oder Pflanzenteilen hergestellt werden. Insbesondere werden die
erfindungsgemäßen Biokatalysatoren aus Stengeln
und/oder Wurzeln dieser Pflanzen hergestellt.
-
Besonders
bevorzugt ist es, sie aus Pflanzenwurzeln von Pflanzen der Gattung
Pastinaca herzustellen.
-
In
einer bevorzugten Ausführungsform sind die erfindungsgemäßen
Biokatalysatoren dadurch gekennzeichnet, dass sie durch Isolation
der in den Pflanzen enthaltenen Enzyme hergestellt worden sind.
Dabei ist es bevorzugt, dass sie durch Enzymrohextraktion hergestellt
worden sind.
-
Die
erfindungsgemäßen Biokatalysatoren sind zur Herstellung
von optisch aktiven Hydroxyverbindungen aus den entsprechenden prochiralen
Ketonen geeignet.
-
Die
Erfindung betrifft daher ebenfalls die Verwendung von Biokatalysatoren
aus Pflanzen der Gattungen Pastinaca, Petroselinum, Anethum oder
Levisticum, welche durch Zerkleinern dieser Pflanzen oder Teilen davon
und gegebenenfalls weitere Verarbeitungsschritte hergestellt worden
sind, zur Herstellung von optisch aktiven Hydroxyverbindungen aus
prochiralen Ketonen.
-
In
einer bevorzugten Ausführungsform werden Pflanzen der Gattung
Pastinaca oder Petroselinum eingesetzt. Die erfindungsgemäße
Verwendung ist insbesondere dadurch gekennzeichnet, dass vegetative
Pflanzen oder Pflanzenteile eingesetzt werden. Bevorzugt werden
Stengel und/oder Wurzeln dieser Pflanzen verwendet. Besonders bevorzugt
ist es, Pflanzenwurzeln von Pflanzen der Gattung Pastinaca einzusetzen.
-
In
einer bevorzugten Ausführungsform werden aus den Pflanzen
isolierte Enzyme verwendet. Es ist besonders bevorzugt, Enzymrohextrakte
einzusetzen.
-
Als
prochirale Ketone werden dabei aromatische und aliphatische organische
Verbindungen der allgemeinen Formel (I) verwendet
wobei die Substituenten R
1 und R
2 ausgewählt
sind aus der Gruppe der
Alkylreste,
Alkenylreste,
Alkinylreste,
Cycloalkylreste,
Cycloalkenylreste,
Arylreste,
Aralkylreste,
Cycloalkylalkylreste,
Aryloxyalkylreste
und
Heteroarylreste,
wobei vorhandene Kohlenstoffketten geradlinig
oder verzweigt sind und
wobei es sich bei den cyclischen und
aromatischen Systemen um eingliedrige Ringe oder mehrgliedrige annelierte
Ringe handelt
und gegebenenfalls mindestens ein weiterer Substituenten
an den Substituenten R
1, R
2 vorhanden
ist und wobei R
1 und R
2 gleich-
oder verschiedenartig sind.
-
Bevorzugt
sind die Substituenten R1 und R2 ausgewählt
aus der Gruppe von C1-C14-Alkylrest, C3-C14-Alkenylrest,
C3-C14-Alkinylrest,
C3-C14-Cycloalkylrest,
C3-C14-Cycloalkenylrest,
C6H5-Arylrest (Phenylrest),
C6H5-Aryl-C1-C5-Alkylrest, C3-C14-Cycloalkyl-C1-C5-Alkylrest, C6H5-Aryl-O-C1-C5-Alkylrest, oder C4-C10-Heteroarylrest,
welcher mindestens ein Stickstoff-, Schwefel- oder Sauerstoffatom
aufweist.
-
Es
ist besonders bevorzugt, dass die Substituenten R1 und
R2 ausgewählt sind aus der Gruppe
von
C1-C8-Alkylrest,
C3-C5-Alkenylrest,
C3-C5-Alkinylrest,
C3-C6-Cycloalkylrest,
C3-C6-Cycloalkenylrest,
C6H5-Aryl-C1-C3-Alkylrest,
C3-C6-Cycloalkyl-C1-C3-Alkylrest,
C6H5-Aryl-O-C1-C3-Alkylrest oder
C4-C10-Heteroarylreste
aus der Gruppe
der 5-Ringsysteme,
der 6-Ringsysteme oder
der
mehrgliedrigen Ringsysteme, welche mindestens ein Stickstoff-, Schwefel-
oder Sauerstoffatom aufweisen.
-
Als
geeignete 5-Ringsysteme sind beispielsweise Pyrrol, Furan, Thiophen
und Imidazol zu nennen. Im Rahmen der 6-Ringsysteme können
beispielsweise Pyrazin, Pyridin, Pyrimidin und die Pyrrimidinbasen
genannt werden. Bevorzugte mehrgliedrige Ringsysteme sind beispielsweise
Indol, Purin oder die Purinbasen.
-
Bevorzugt
weisen die Substituenten R1 und R2 mindestens einen weiteren Substituenten
aus der Gruppe
der Halogene,
der stickstoffhaltigen Substituenten,
der
phosphorhaltigen Substituenten,
der sauerstoffhaltigen Substituenten
oder
der schwefelhaltigen Substituenten auf, wobei im Falle
mehrerer weiterer Substituenten diese gleich oder verschieden sind.
-
Vorzugsweise
ist der mindestens eine weitere Substituent ausgewählt
aus der Gruppe von Fluor, Chlor, Brom, Iod, Aminogruppe oder Nitrogruppe,
Phosphatgruppe,
Hydroxygruppe,
C1-C5-Alkyloxygruppe
insbesondere Methoxygruppe oder Ethoxygruppe, Carboxylgruppe, Carboxyl-C1-C5- Alkylestergruppe,
oder
So3 –-Gruppe
und So4 2–Gruppe.
-
Nachfolgend
ist ein allgemeines Schema für den Ablauf einer Ketonreduktion
mittels enzymatischer Prozesse dargestellt.
-
-
Mit
den erfindungsgemäßen Biokatalysatoren werden
aus den Ketonen die korrespondierenden Alkohole hergestellt.
-
Überraschenderweise
wurde festgestellt, dass die Arten Pastinaca sativa (Pastinake),
Petroselinum crispum (Petersilienwurzel), Anethum graveolens (Dill)
und Levisticum officinale (Liebstöckel) aus der Familie der
Doldenblütler jeweils die S-Form der Alkohole in hoher
Selektivität herstellen.
-
Bei
einem Vergleich der einzelnen Pflanzenteile wurden unterschiedliche
Ergebnisse für Wurzeln und Stengel erzielt. Überraschend
hat sich für Pastinaca sativa (Pastinake) und Petroselinum
crispum (Petersilienwurzel) eine deutlich bessere Umsetzung und
Enantioselektivität mit den frischen Pflanzenwurzeln gezeigt.
Im Gegensatz dazu erwiesen sich bei Anethum graveolens (Dill) und
Levisticum officinale (Liebstöckel) die Triebe bzw. Stengel
als gut für die Umsetzung geeignet.
-
Entscheidend
ist der Unterschied bei dem verfügbaren Produkt und somit
der entsprechende Nutzungsschwerpunkt: die Knolle von Pastinake
oder Wurzelpetersilie oder das Kraut von Liebstöckel oder
Dill. Liebstöckel- oder Dillwurzeln sind kaum verfügbar
und sehr klein, Pastinaken- oder Wurzelpetersilienkraut ist auch
schwer erhältlich. Im Fall von Liebstöckel werden
dicke Wurzeln, die sich für Biotransformationen einsetzen
lassen erst nach mehreren Jahren Wachstum in Freilandkultur gebildet.
Als mögliche Quelle kommt beispielsweise Gartenliebstöckel
in Frage, welcher aber keine kommerziell verwertbare Ressource darstellt.
-
Bei
Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens können
beispielsweise mit Pastinaca sativa (Pastinake) Enantiomeren-Überschüsse
(ee) von mehr als 60%, bevorzugt von mehr als 65%, höchst
bevorzugt von mehr als 95% erzielt werden.
-
Im
Falle von Wurzeln von Petroselinum crispum (Petersilienwurzel) ergeben
sich ee-Werte von mehr als 50%, bevorzugt von mehr als 80%, höchst
bevorzugt von mehr als 90%.
-
Für
die Stengel von Anethum graveolens (Dill) lassen sich ee-Werte von
mehr als 80%, bevorzugt von mehr als 90%, höchst bevorzugt
von mehr als 95% erzielen.
-
In
diesem Sinne ermöglicht die Verwendung von Stengeln von
Levisticum officinale (Liebstöckel, Jungpflanze) ee-Werte
von mehr als 80%, bevorzugt von mehr als 90%.
-
Bei
Liebstöckel ist die Verfügbarkeit von frischen
Pflanzen für die Umsetzung wichtig. Mit jungen Stengeln
wurden Umsetzungen mit einem ee von 97–98% erreicht. Dicke
Wurzeln, die sich für Biotransformationen einsetzen lassen
werden, wie oben bereits erwähnt, von Liebstöckel
erst nach mehreren Jahren Wachstum in Freilandkultur gebildet. Diese
Wur zeln sind dann auch gut für Umsetzungen geeignet, sind
aber nicht für den präparativen Einsatz geeignet,
da Sie nicht auf dem Markt verfügbar sind. Theoretisch
könnte bei Liebstöckel mit beidem, d. h. den Stengeln
von Jungpflanzen oder den Wurzeln der mehrjährigen Pflanzen,
gearbeitet werden.
-
Mit
dem erfindungsgemäßen Verfahren kann beispielsweise
eine vollständige Umsetzung von Acetophenon zu (S)-1-Phenylethanol
durch geschnittene Pflanzenteile in Wasser mit einer Acetophenonkonzentration
von 1 g/l in hoher Enantiomerenreinheit durchgeführt werden.
-
Die
Pflanzen können unter den üblichen Bedingungen
angebaut und geerntet werden. Es können handelsübliche
Sorten verwendet werden.
-
Die
Pflanzen werden für das Verfahren gereinigt und gleichmäßig
geschnitten. Für eine Isolierung des Enzyms als Rohextrakt
oder Reinstenzym werden die Pflanzen homogenisiert und der enzymhaltige
Rohextrakt gewonnen. Durch weitere Schritte kann das Enzym stabilisiert
und isoliert werden.
-
Geschnittene
Pflanzen sollten in Stückgrößen von 0,1
bis 5 cm, vorzugsweise 0,2 bis 2 cm eingesetzt werden. Als Menge
sollten 10 bis 1000 g/l vorzugsweise 100 bis 500 g/l eingesetzt
werden.
-
Zur
Durchführung des Prozesses können Cofaktoren wie
NAD oder NADP und zur Regenerierung der Cofaktoren Cosubstrate wie
2-Propanol zugegeben werden.
-
Die
Reaktion kann in Wasser ohne Puffer durchgeführt werden.
-
Allerdings
kann die Reaktion ebenso in Wasser bei einem pH-Wert von 2–10
unter Einsatz von Puffern aus der Gruppe von Acetatpuffer, Phosphatpuffer,
Trispuffer oder Phosphat-Citrat-Puffer durchgeführt werden. Bevorzugt
wird die Reaktion dann in Wasser bei einem pH-Wert von 6–8
unter Einsatz von Puffern aus der Gruppe von Acetatpuffer, Phosphatpuffer,
Trispuffer oder Phosphat-Citrat-Puffer durchgeführt. Besonders
bevorzugt ist die Reaktion in Wasser bei einem pH-Wert von 7 unter
Einsatz von Puffern aus der Gruppe von Acetatpuffer, Phosphatpuffer,
Trispuffer oder Phosphat-Citrat-Puffer.
-
Die
Pufferkonzentration beträgt im Allgemeinen 0,001 bis 5,0
M. Bevorzugt wird eine Pufferkonzentration von 0,01 bis 0,3 M verwendet.
Höchst bevorzugt ist die Verwendung einer Pufferkonzentration
von 0,1 M.
-
Die
Reaktion wird im Allgemeinen bei 5°C bis 40°C
durchgeführt. Bevorzugt ist die Reaktionsführung bei
15°C bis 30°C. Höchst bevorzugt wird
die Reaktion bei 25°C durchgeführt.
-
Die
Umsetzung wird in einem Zeitraum zwischen 5 und 100 Stunden durchgeführt.
Vorzugsweise erfolgt die Umsetzung in einem Zeitraum zwischen 24
und 72 Stunden.
-
Die
Konzentrationen der prochiralen Ketone liegen zwischen 0,1 und 10%
(w/v), vorzugsweise zwischen 0,2 und 5,0% (w/v).
-
Als
Reaktoren können einfache mischbare Rührbehälter
und Schüttelkolben eingesetzt werden. Alternativ dazu ist
auch der Einsatz von Festbettreaktoren möglich. Wichtig
ist ein gleichmäßiger Kontakt des Biokatalysators
mit dem Reaktionsmedium.
-
Nachfolgend
wird die Erfindung anhand von Beispielen näher erläutert.
-
BEISPIELE
-
Beispiel 1: Herstellung von pflanzlichen
Biokatalysatoren aus Pflanzen von Pastinaca sativa und Petroselinum crispum
-
Die
Wurzeln der Pflanzen Pastinaca sativa (Pastinaken) und Petroselinum
crispum (Petersilienwurzel) werden gewaschen und geschält.
Nachfolgend werden die Wurzeln in Würfel mit 1 cm Kantenlänge
geschnitten. Die geschnittenen Würfel werden mit sterilem
Wasser gewaschen.
-
Nach
dieser Behandlung ist der pflanzliche Biokatalysator für
einen Einsatz im Verfahren zur katalytischen Herstellung von optisch
aktiven Hydroxyverbindungen bereit.
-
Beispiel 2: Herstellung von pflanzlichen
Biokatalysatoren aus Pflanzen von Anethum graveolens und Levisticum
officinale
-
Die
Stengel und Blätter der Pflanzen Anethum graveolens (Dill)
und Levisticum officinale (Liebstöckel) werden gewaschen.
Nachfolgend werden die Stengel und Blätter in mit 1 cm
Länge geschnitten. Die geschnittenen Stücke werden
mit sterilem Wasser gewaschen.
-
Nach
dieser Behandlung ist der pflanzliche Biokatalysator für
einen Einsatz im Verfahren zur katalytischen Herstellung von optisch
aktiven Hydroxyverbindungen bereit.
-
Beispiel 3: Herstellung von (S)-1-Phenylethanol
aus Acetophenon durch Reduktion mit pflanzlichen Biokatalysatoren
aus Pflanzen von Petroselinum crispum
-
Wurzeln
von Petroselinum crispum (Petersilienwurzel) wurden wie in Beispiel
1 beschrieben frisch vorbereitet. Nach dem Waschen des Pflanzenmaterials
mit sterilem Wasser wurde der Ansatz in einem Schüttelkolben
folgendermaßen hergestellt:
| Ansatz: | 30 g | Pflanzenmaterial
von Petroselinum crispum (Petersilienwurzel) |
| |
| | 100
ml | steriles
Wasser |
| | 100 μl | Acetophenon |
-
Der
Ansatz im Schüttelkolben wurde mit einem gasdurchlässigen
Stopfen versehen und auf einem Schüttler bei 25°C
und 100 U/min inkubiert.
-
Es
wurde nach 24 h und 48 h jeweils eine Probe entnommen, Ausgangsstoff
und Produkt extrahiert und mittels Gaschromatographie analysiert.
Die Analysen wurden auf einer chiralen Trennsäule durchgeführt, wodurch
sowohl die Gehalte an noch nicht umgesetzten Ausgangsstoff als auch
die gebildeten Enantiomere (S)-1-Phenylethanol und (R)-1-Phenylethanol
bestimmt werden konnten.
-
Bedingungen für die Analytik
mit der Gaschromatographie (GC):
-
Es
wurde eine Säule vom Typ β-DEX 225 mit 30 m Länge
und 0,25 mm Innendurchmesser (Fa. Supelco) eingesetzt. Als Trägergas
wurde Helium verwendet. Die Einstellungen an der GC waren: Injektortemperatur:
230°C; FID: 230°C; Injektionsvolumen 1 μl;
Säulentemperatur 120°C.
-
In 1 ist
die Umsetzung von Acetophenon zu den Enantiomeren (S)-1-Phenylethanol
und (R)-1-Phenylethanol dargestellt.
-
Wie
in 1 zu erkennen ist, wurde das Acetophenon sehr
selektiv in 48 h zu 94% zu 1-Phenylethanol mit einem Enantiomerenverhältnis
von 99% S zu 1% R umgesetzt.
-
Beispiel 4: Herstellung von (S)-1-Phenylethanol
aus Acetophenon durch Reduktion mit pflanzlichen Biokatalysatoren
aus Pflanzen von Pastinaca sativa (Pastinaken)
-
Wie
in Beispiel 1 beschrieben wurden Wurzeln von Pastinaca sativa (Pastinaken)
gewaschen, geschält und geschnitten. Der Ansatz wurde in
einem Schüttelkolben wie folgt hergestellt:
| Ansatz: | 30 g | Pflanzenmaterial
von Pastinaca sativa (Pastinaken) |
| |
| | 100
ml | steriles
Wasser |
| | 100 μl | Acetophenon |
-
Auf
einem Schüttler bei 25°C und 100 U/min wurde der
Ansatz für 48 h inkubiert. Nach 24 h und 48 h wurde jeweils
eine Probe entnommen, Ausgangsstoff und Produkt extrahiert und mittels
Gaschromatographie wie im Beispiel 2 analysiert. Der Verlauf der
Umsetzung ist in 2 dargestellt.
-
Das
Acetophenon wurde mit 91% zu 1-Phenylethanol selektiv (R/S, 1,3:98,7)
umgesetzt.
-
Beispiel 5: Vergleich der Aktivität
und Enantioselektivität von Wurzel und Stengel der Pflanze
Levisticum officinale (Liebstöckel)
-
Wie
in Beispiel 1 (Wurzel) und 2 (Stengel) beschrieben wurden die gesamten
Pflanzen Levisticum officinale (Liebstöckel) gewaschen
und geschnitten. Der Ansatz wurde in einem Schüttelkolben
für Wurzel und Stengel wie folgt hergestellt:
| Ansatz: | 30 g | Pflanzenmaterial
von Levisticum |
| | officinale
(Liebstöckel) |
| | 100
ml | steriles
Wasser |
| | 100 μl | Acetophenon |
-
Auf
einem Schüttler bei 25°C und 100 U/min wurde der
Ansatz für 48 h inkubiert. Nach 24 h und 48 h wurde jeweils
eine Probe entnommen, Ausgangsstoff und Produkt extrahiert und mittels
Gaschromatographie wie im Beispiel 2 analysiert. Die Ergebnisse
der Umsetzung nach 48 h sind in Tabelle 1 dargestellt. Tabelle 1: Umsetzung von Acetophenon zu
(R/S)-1-Phenylethanol mit Levisticum officinale (Stengel/Wurzel)
| Pflanzenteil | Acetophenon
[Anteil GC %] | (R/S)-1-Phenylethanol [Anteil
GC %] | ee.
[%] |
| Stengel
Jungpflanze (Topf) | 27,9 | 72,1 | 94,6
(S) |
| Wurzel
Gartenliebstöckel (mehrjährig) | 4,9 | 95,1 | 97,1
(S) |
-
Die
Ergebnisse von Tabelle 1 zeigen eine gute bzw. sehr gute Umsetzung
(72,1% und 95,1%) von Acetophenon zu 1-Phenylethanol bei sehr guter
Enantioselektivität (ee. von 94,6 bzw. 97,1 (S)) für
die Stengel von Jungpflanzen bzw. die Wurzeln von Gartenliebstöckel.
-
Beispiel 6: Umsetzung verschiedener Substrate
mit den Pflanzen Pastinaca sativa (Pastinake), Petroselinum crispum
(Petersilienwurzel), Anethum graveolens (Dill) und Levisticum officinale
(Liebstöckel)
-
Wie
in Beispiel 1 (Wurzel) und 2 (Stengel) beschrieben wurden die gesamten
Pflanzen Pastinaca sativa (Pastinake), Petroselinum crispum (Petersilienwurzel),
Anethum graveolens (Dill) und Levisticum officinale (Liebstöckel)
gewaschen und geschnitten. Der Ansatz wurde in einem Schüttelkolben
für Wurzel und Stengel wie folgt hergestellt:
| Ansatz: | 30
g | Pflanzenmaterial |
| | 100
ml | steriles
Wasser |
| | 100 μl | Substanz |
-
Auf
einem Schüttler bei 25°C und 100 U/min wurde der
Ansatz für 48 h inkubiert. Nach 24 h und 48 h wurde jeweils
eine Probe entnommen, Ausgangsstoff und Produkt extrahiert und mittels
Gaschromatographie wie im Beispiel 2 analysiert. Die Ergebnisse
der Umsetzung nach 24/48 h sind in Tabelle 2 dargestellt. Tabelle 2: Umsetzung verschiedener Substanzen
mit pflanzlichen Biokatalysatoren als Wurzel (W) und als Stengel
(S) nach 24/48 h
| Pflanze | Substanz
Edukt/Produkt | Umsetzung
[Anteil GC %] | ee.
[%] |
| Pastinaca
sativa (Wurzel) | Acetophenon/Phenylethanol | 90,0
(48 h) | 98,8
(S) |
| Pastinaca
sativa (Wurzel) | 2-Octanon/2-Octanol | 97,8
(24 h) | 88,6
(S) |
| Pastinaca
sativa (Wurzel) | Ethylacetoacetat/3-Hydoxybuttersäure | 98,2
(24 h) | 96,7
(S) |
| Pastinaca
sativa (Wurzel) | 4-Hydoxy-2-Butanon/1,3-Butandiol | 3,9
(24 h) | 64,1
(S) |
| Petroselinum
crispum (Wurzel) | Acetophenon/Phenylethanol | 94,3
(48 h) | 98,7
(S) |
| Petroselinum
crispum (Wurzel) | 2-Octanon/2-Octanol | 99,9
(24 h) | 88,9
(S) |
| Petroselinum
crispum (Wurzel) | Ethylacetoacetat/3-Hydoxybuttersäure | 92,5
(24 h) | 91,7
(S) |
| Petroselinum
crispum (Wurzel) | 4-Hydoxy-2-Butanon/1,3-Butandiol | 2,3
(24 h) | 52,2
(S) |
| Anethum
graveolens (Stengel) | Acetophenon/Phenylethanol | 86,4
(48 h) | 98,0
(S) |
| Anethum
graveolens (Stengel) | 2-Octanon/2-Octanol | 91,4
(24 h) | 93,4
(S) |
| Anethum
graveolens (Stengel) | Ethylacetoacetat/3-Hydoxybuttersäure | 95,9
(24 h) | 93,3
(S) |
| Anethum
graveolens (Stengel) | 4-Hydoxy-2-Butanon/1,3-Butandiol | 3,6
(24 h) | 10
(S) |
| Levisticum
officinale (Wurzel, mehrjährige Pflanze) | Acetophenon/Phenylethanol | 95,1
(48 h) | 97,1
(S) |
| Levisticum
officinale (Stengel, Jungpflanze) | 2-Octanon/2-Octanol | 92,5
(24 h) | 88,7
(S) |
| Levisticum
officinale (Wurzel, mehrjährige Pflanze) | Ethylacetoacetat/3-Hydoxybuttersäure | 89,3
(24 h) | 86,7
(S) |
-
Beispiel 7: Herstellung Enzymrohextrakt
aus Pflanzen von Petroselinum crispum
-
Wie
in Beispiel 1 beschrieben wurde 1 kg Wurzeln von Petroselinum crispum
(Petersilienwurzel) gewaschen, geschält und geschnitten.
Die Pflanzenstücke wurden in einem Zerkleinerer homogenisiert
und der Saft von den Faserbestandteilen abgetrennt. Durch nachfolgende
Zentrifugation (3000 g, 20 min, 4°C) wurden Zelltrümmer
abgetrennt. Die so gewonnenen 0,5 Liter Rohextrakt wurden über
einen Membranfilter mit 0,45 μm filtriert und können
als Rohextrakt für Umsetzungen eingesetzt werden.
-
Beschreibung der Abbildungen
-
1:
Umsetzung von Acetophenon zu (R/S)-1-Phenylethanol mit Petroselinum
crispum (Wurzeln)
-
2:
Umsetzung von Acetophenon zu (R/S)-1-Phenylethanol mit Pastinaca
sativa (Wurzeln)
-
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
-
Diese Liste
der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert
erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information
des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen
Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt
keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
-
Zitierte Patentliteratur
-
- - US 2004/0082043
A1 [0007]
-
Zitierte Nicht-Patentliteratur
-
- - R. N. PATEL: „Biocatalytic
Synthesis of Chiral Pharmaceutical Intermediates", Food Technol.
Biotechnol. 42 (4) 305–325 (2004) [0002]
- - Faber et al. „Biotransformations in Organic Chemistry",
5th ed. 2004, Springer Verlag Berlin Heidelberg New York [0003]
- - Wandreg et al. „Industrial Biotransformations", Wiley-VCH
Verlag GmbH Weinheim, 2000 [0004]
- - Nakajiama et al., „Biotransformations using plant
cultured cells", J. Molecular Catalysis B: Enz. 23 (2003) 145–170 [0006]
- - J. Molecular Catalysis B: Enz. 11 (2000) 55–58 [0006]
- - Tetrahedron Asymmetry 13 (2002) 2299–2302 [0006]
- - Yadav et. al. der in Tetrahedron: Asymmetry 12 (2001) 3381–3385 [0007]
- - J. Org. Chem. 2002, 67, 3900–3903 [0007]
- - J. Molecular Cat. B: Enz. 38 (2006) 84–90 [0008]