DE102007051452A1

DE102007051452A1 - Fermentative Gewinnung von α-Ketoglutarsäure aus erneuerbaren Rohstoffen unter erhöhter Stickstoffzufuhr

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Publication number: DE102007051452A1
Application number: DE102007051452A
Authority: DE
Inventors: Stefan Dr. Verseck; Andreas Dr. Karau; Mitra Weber
Original assignee: Evonik Degussa GmbH
Current assignee: Evonik Operations GmbH
Priority date: 2007-10-27
Filing date: 2007-10-27
Publication date: 2009-04-30

Abstract

Gegenstand der Erfindung sind rekombinante mikrobielle Organismen, die durch eine Inaktivierung der Glutamat-Dehydrogenase (EC 1.4.1.2; GDH) und weitere beschriebene Maßnahmen in der Lage sind, verstärkt α-Ketoglutarsäure (2-Oxoglutarsäure, 2-Oxopentandisäure, AKG) fermentativ aus einer C-Quelle, z. B. aus erneuerbaren Rohstoffen, wie Glucose, Saccharose, Melasse, Öle, Fettsäuren etc., zu bilden. Weiterhin wird ein fermentatives Verfahren zur Herstellung von α-Ketoglutarsäure mittels derartiger Mikroorganismen beschrieben.

Description

Gegenstand der Erfindung ist eine mikrobielles Reaktionssystem, mit dem man durch Einsatz eines Mikroorganismus mit einer inaktiven Glutamat Dehydrogenase (EC 1.4.1.2; GDH) und weiterer beschriebener Maßnahmen in die Lage versetzt wird, verstärkt α-Ketoglutarsäure (2-Oxoglutarsäure, 2-Oxopentandisäure, AKG) fermentativ aus einer C-Quelle, z. B. aus erneuerbaren Rohstoffen, wie Glucose, Saccharose, Melasse, Öle, Fettsäuren etc. zu bilden. Weiterhin wird ein fermentatives Verfahren zur Herstellung von α-Ketoglutarsäure mittels derartiger Mikroorganismen beschrieben. Ebenfalls sind Gegenstand der vorliegenden Erfindung neue Mikroorganismen, Primersequenzen und Plasmide zur Ausführung der Erfindung.
α-Ketoglutarsäure ist als Zwischenprodukt für die chemische Synthese und als Nahrungsergänzungsmittel oder als Bestandteil parenteral zu verabreichender Nahrungsmittelkompositionen von Bedeutung.
α-Ketoglutarsäure ist ein Zwischenprodukt des Citratzyklus. Beim aeroben Abbau über den Citratzyklus erfolgt eine vollständige Oxidation der Glucosederivate zu CO₂. Aus dem in der Glycolyse gebildeten Pyruvat wird durch oxidative Decarboxylierung, die von dem Pyruvat-Dehydrogenase-Komplex (PDHC) katalysiert wird, das Acetyl-Coenzym A (Acetyl-CoA) gebildet. Acetyl-CoA ist das gemeinsame Zwischenprodukt des Katabolismus der Brennstoffmoleküle wie Aminosäuren, Fettsäuren und Kohlenhydrate, das in den Citratzyklus eintritt. Oxalacetat kondensiert mit der Acetyleinheit des Acetyl-CoA unter der Bildung von Citrat. Anschließend wird ein Isomer des Citrats oxidativ decarboxyliert und α-Ketoglutarat (AKG) entsteht. Durch eine weitere Umwandlung mittels oxidativer Decarboxylierung, die durch den α-Ketoglutarat-Dehydrogenasekomplex synonym für 2-Oxoglutarat-Dehydrogenase-Komplex (ODHC) katalysiert wird, liegt Succinyl-CoA vor. Die C₄-Einheit erfährt mehrere Umsetzungen bis erneut Oxalacetat für ein neues Durchlaufen des Zykluses zur Verfügung steht.

Tabelle 1 führt die Enzyme des Citratzyklus auf, die entstehenden Zwischenprodukte sind in der 1 dargestellt. Tab. 1: Enzyme des Citratzykluses und ihre Reaktionstypen

Schritt	Enzym	Reaktionstyp
1	Citrat-Synthase	Kondensation
2	Aconitase	Dehydratisierung
3	Aconitase	Hydratisierung
4	Isocitrat-Dehydrogenese	Decarboxylierung Oxidation
₅	α-Ketoglutarat-Dehydrogenase-Komplex (ODHC)	Decarboxylierung Oxidation
6	Succinyl-CoA-Synthetase	Substratkettenphosphorylierung
7	Succinat-Dehydrogenase	Oxidation
8	Fumarase	Hydratisierung
9	Malat-Dehydrogenase	Oxidation

Eine weitere Aufgabe des Citratzyklusses, zusätzlich zu der Energieerzeugung, ist das Bereitstellen verschiedener Vorstufen für die Synthese von Zellbestandteilen. So leiten sich viele Aminosäuren z. B. aus Oxalacetat oder AKG ab (siehe 2 – Vorstufen für die Synthese verschiedener Aminosäuren ausgehend vom Citratzyklus; s. a. Berg, J. M., Tymoczko, J. L., Stryer, L. (2003): Biochemie (5. Auflage), Spektrum Verlag, ISBN 3-8274-1303-6).
Durch Isomerisierung des Citrats im Citratzyklus wird die Vorstufe von α-Ketoglutarat, das Isocitrat gebildet. Dieses wird von der Isocitrat-Dehydrogenase (IDH) oxidativ decarboxyliert und α-Ketoglutarat liegt vor.
Die Folgereaktion im Citratzyklus sorgt für einen Abbau des gebildeten AKGs. Eine weitere oxidative Decarboxylierung, die vom ODHC katalyisiert wird, wandelt AKG in Succinyl-CoA um.
Das Succinyl-CoA wird über die Zwischenprodukte Succinat, Fumarat, Malat wieder zu Oxalacetat und der Citratzyklus kann erneut durchlaufen werden.
Für die Synthese von Biomolekülen wie z. B. Aminosäuren ist Stickstoff notwendig. Seine Assimilation kann in Form von NH₄ ⁺ in Aminosäuren erfolgen. Von Bedeutung sind hierbei die Aminosäuren Glutamat und Glutamin. Viele Aminosäuren erhalten ihre α-Aminogruppe durch Transaminierung der α-Aminogruppe des Glutamats oder Glutamins. Die Glutamatdehydrogenase (GDH) katalysiert die Reaktion zur Bildung von Glutamat aus AKG, das im Citratzyklus entsteht. AKG bildet mit Ammonium eine Schiff-Base. Diese Base wird anschließend protoniert wobei NADPH reduziert wird (3 – Bildung von Glutamat aus α-Ketoglutarat mit dem Zwischenprodukt einer Schiff-Base katalysiert durch das Enzym GDH).
NADPH dient bei der Biosynthese von Glutamat als Reduktionsmittel. Unter der katalytischen Wirkung der Glutamin-Synthetase (GS) und den Verbrauch von ALP wird ein weiteres Ammoniumion zur Amidierung des Glutamats verwendet und auf diese Weise Glutamin synthetisiert.
Aus Glutamin kann in einer umgekehrten Reaktion, die durch Glutamat-Synthase (Glutamin-2-Oxoglutarat-Aminotransferase, GOGAT) katalysiert wird, erneut Glutamat entstehen. AKG wird durch die Glutamat-Synthase reduktiv aminiert, wobei Glutamin als N-Donor fungiert.
Bei niedriger Ammonium-Konzentration erfolgt die Bildung von Glutamat überwiegend durch die aufeinander folgenden Wirkungen der Glutamin-Synthetase (GS) und der Glutamat-Synthase (GOGAT).
Die Bildung von Glutamat verläuft über diesen Reaktionsweg, wenn niedrige Ammoniumkonzentrationen vorliegen. Ursache ist der hohe K_m-Wert der GDH für NH₄ ⁺ von ca. 1 mM. Bei niedrigen Konzentrationen an Ammonium ist die GDH nicht abgesättigt. Die GS besitzt eine sehr große Affinität zu NH₄ ⁺, daher kann bei einer Limitierung die Aufnahme von Ammoniak unter ATP-Verbrauch stattfinden.
Die Aktivitäten der GDH und des GS/GOGAT-Systems, die abhängig von der Ammonium-Konzentration sind, verhalten sich reziprok. Bei hohen Ammonium-Konzentrationen besitzt die GDH eine hohe Aktivität, beim GS/GOGAT-Systems ist sie jedoch vermindert. Im entgegen gesetzten Fall, bei niedrigen Konzentrationen an NH₄ ⁺, dominiert die Aktivität des GS/GOGAT-Systems über der GDH-Aktivität (4 – Bildung und Umwandlung von α-Ketoglutarat; Kimura, E. (2002): Metabolic Engineering of Glutamat Production, Advances in biochemical engineering biotechnology Vol. 79, Microbial Production of L-Amino Acids, Springer Verlag, ISBN 3-540-43383-x: 37–57; Berg, J. M., Tymoczko, J. L., Stryer, L. (2003): Biochemie (5. Auflage), Spektrum Verlag, ISBN 3-8274-1303-6).
Das bisher gängige Verfahren zur technischen Herstellung von α-Ketoglutarat (AKG) basiert auf einer chemischen Transaminierung mit Glyoxalsäure plus Natrium-Glutamat und einem Kupfer-Katalysator. Bei dieser Reaktion entstehen α-Ketoglutarsäure und Glycin als Hauptprodukte in Lösung, sowie eine Reihe von organischen Säuren als Nebenprodukte.
Dieser synthetische Prozess hat den Nachteil, dass er nicht selektiv genug erfolgt und viele Nebenprodukte, wie z. B. Glycin und andere organische Säuren gebildet werden. Auch die Beschaffung bzw. Entsorgung des Kupfer-Katalysators macht ein anderes ggf. biotechnologisches Verfahren ökologisch und ökonomisch attraktiv.
Im Hinblick auf die fermentative Herstellung von α-Ketoglutarsäure werden die höchsten Titer und Produktivitäten mit Mikroorganismen (Bakterien und Hefen) erzielt, die n-Paraffin als Kohlenstoffquelle nutzen. Der Metabolismus von n-Alkanen vollzieht sich über die Oxidation durch Hydroxylasen und ist in Watkins und Morgan (Biodegradation 1990, 1(2–3), 79–92) detailliert beschrieben.
Nachteilig ist bei der Nutzung von n-Parffin als Kohlenstoffquelle, dass die Produktivität der Mikroorganismen mit der eingesetzten Kettenlänge der n-Alkane schwankt und dass häufig Nebenprodukte wie Glutamin gebildet werden.
Weitere Bakterielle Naturisolate, die in der Lage sind 2-Oxoglutarat zu bilden, wie Arthrobacter paraffineus, Corynebacterium hydrocarboclastus, Micrococcus paraffinolyticus, Corynebacterium alkanolitecum oder Brevibacterium ketoglutamicum sind in DE 14 42 259 (Kyowa Hakko) als auch in JP 49011080 (Takeda) beschrieben.
Bei den Hefen sind als natürliche α-Ketoglutarat-Bildner Yarrowia lipolytica ( DD 267 999 ) und Candida lipolytica ( DE 23 58 312 ) zu nennen.
Es ist nur eine Arbeit aus dem Jahre 1955 von Asai et al. (Asai, T.; Aida, K.; Sugisaki, Z.; Yakeishi, N., Journal of General and Applied Microbiology 1955, 1 308–46) bekannt, welche die Bildung von α-Ketoglutarsäure durch Bakterien aus Glukose beschreibt. Dabei wurden folgende Naturisolate eingesetzt: Pseudomonaden, Escherichia coli, Serratia marcescens, Bacillus megatherium, Bacillus natto, Bacterium succinium und Gluconobacter cerinium. Die hier erzielten Produktivitäten sind für ein technisches Verfahren allerdings nicht ausreichend.
Daher besteht immer noch die Forderung ein fermentatives Verfahren zur Herstellung von α-Ketoglutarsäure bereitzustellen, welches insbesondere anstelle von Glutamat und Glyoxalsäure von erneuerbaren Rohstoffen ausgeht. Dieses Verfahren sollte im technischen Maßstab einsetzbar und daher den im Stand der Technik beschriebenen vom ökonomischen wie ökologischen Standpunkt aus gesehen überlegen sein. Insbesondere bestand eine Aufgaben darin, die fermentative Bildung von α-Ketoglutarat durch den Einsatz biotechnologischer Maßnahmen zu erhöhen.
Eine solche Aufgabe wird durch ein Verfahren bzw. den Einsatz eines erfindungsgemäßen Reaktionssystems gemäß den vorliegenden Ansprüchen gelöst.
Gegenstand der Erfindung ist somit ein mikrobielles Reaktionssystem aufweisend einen rekombinanten Mikroorganismus zur fermentativen Herstellung von α-Ketoglutarsäure und ein Reaktionsmedium, was sich dadurch auszeichnet, dass im Mikroorganismus eine Inaktivierung der Glutamatdehydrogenase (GDH) vorliegt und das Reaktionsmedium dergestalt angepasst ist, dass es einen Überschuss an Ammoniumionen in Form von für den Organismus verwertbaren Stickstoff enthält. Mit den beschriebenen Maßnahmen ist es überraschenderweise möglich einen lebensfähigen Organismus in einem geeigneten Medium dazu zu bringen, mehr als das 10fache an AKG verglichen mit dem Ausgangsstamm zu synthetisieren. Die enorme Steigerung in der Raum/Zeitausbeute an AKG einerseits und die Tatsache, dass ein derart modifizierter Organismus unter den gegebenen und technisch besonders einfach zu realisierenden Bedingungen ausreichend lebensfähig ist, kann als goldener Griff gewertet werden, der die erfindungsgemäße Kombination der angewandten Merkmale vor dem Hintergrund des Standes der Technik klar als erfinderisch erscheinen lässt.
Die Inaktivierung der GDH des ins Auge gefassten Mikroorganismus kann nach dem Fachmann bekannten Maßnahmen erfolgen. Wichtig ist, dass eine Inaktivierung zumindest zu einer verminderten Aktivität der GDH im Zielstamm verglichen mit dem Ausgangsstamm führt. Als Maßnahmen kommen vorteilhafterweise solche ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:

– (Teil) Deletion (s. u.)
– Geringere Promotoraktivität
– Anti-sens DNA oder RNA

ed. Eggeling, L., Bott, M. (2005), CRC Press

Biotechnologische Methoden zur Herstellung der entsprechenden Mutanten sind dem Fachmann hinreichend geläufig (Pühler et al. Bio/Technology 9, 84–87 (1991), Peters-Wendisch et al. (Microbiology 144, 915–927 (1998)). Dabei kann es sich um in-vivo oder in-vitro Methoden handeln.
Für die Mutagenese können klassische in vivo Mutageneseverfahren unter Verwendung mutagener Stoffe wie beispielsweise N-Methyl-N'-Nitro-N-Nitrosoguanidin oder ultraviolettes Licht verwendet werden.
Weiterhin können für die Mutagenese in-vitro Methoden wie beispielsweise eine Behandlung mit Hydroxylamin (Miller, J. H.: A Short Course in Bacterial Genetics. A Laboratory Manual and Handbook for Escherichia coli and Related Bacteria, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, 1992) oder mutagene Oligonukleotide (T. A. Brown: Gentechnologie für Einsteiger, Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, 1993) oder die Polymerasekettenreaktion (PCR), wie sie im Handbuch von Newton und Graham (PCR, Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, 1994) beschrieben ist, verwendet werden.
Weitere Anleitungen zur Erzeugung von Mutationen können dem Stand der Technik und bekannten Lehrbüchern der Genetik und Molekularbiologie wie z. B. dem Lehrbuch von Knippers („Molekulare Genetik", 6. Auflage, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Deutschland, 1995), dem von Winnacker („Gene und Klone", VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim, Deutschland, 1990) oder dem von Hagemann („Allgemeine Genetik", Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1986) entnommen werden.
Bei Verwendung von in-vitro Methoden wird das im Stand der Technik beschriebene GDH Gen ausgehend von isolierter Gesamt-DNA eines Wildtypstammes mit Hilfe der Polymerasekettenreaktion amplifiziert, gegebenenfalls in geeignete Plasmidvektoren kloniert. Anleitungen zur Amplifikation von DNA-Sequenzen mit Hilfe der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) findet der Fachmann unter anderem im Handbuch von Gait: Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach (IRL Press, Oxford, UK, 1984) und bei Newton und Graham: PCR (Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Deutschland, 1994). In gleicher Weise können auch Methoden der in-vitro Mutagenese verwendet werden wie sie beispielsweise in dem bekannten Handbuch von Sambrook et al. (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, USA, 1989) beschrieben sind.
Entsprechende Methoden sind auch kommerziell in Form sogenannter „kits" wie beispielsweise der von Papworth et al. (Strategies 9(3), 3–4 (1996)) beschriebene „QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit" der Firma Stratagene (La Jolla, USA) verfügbar. Die GDH-Deletion kann durch das Verfahren des Genaustausches („gene replacement"), wie es bei Schwarzer und Pühler (Bio/Technology 9, 84–87 (1991)) oder Peters-Wendisch et al. (Microbiology 144, 915–927 (1998)) beschrieben ist, in geeignete Stämme eingeführt werden. Das entsprechende verkürzte GDH Allel wird hierbei in einen für C. glutamicum nicht replikativen Vektor wie beispielsweise pK18mobsacB oder pK19mobsacB (Jäger et al., Journal of Bacteriology 174: 5462–65 (1992)) oder pCR^®Blunt (Firma Invitrogen, Groningen, Niederlande; Bernard et al., Journal of Molecular Biology, 234: 534–541 (1993)) kloniert und dieser anschließend durch Transformation oder Konjugation in den gewünschten Wirt von C. glutamicum überführt. Nach homologer Rekombination mittels eines ersten, Integration bewirkenden "cross-over"-Ereignisses und eines geeigneten zweiten, eine Exzision bewirkenden "cross-over"-Ereignisses im Zielgen bzw. in der Zielsequenz erreicht man den Einbau der Mutation.
Zur Erreichung des gesetzten Zieles kann unter zur Hilfenahme des Vektors pK18mobsacB – wie beschrieben – in verschiedenen Corynebacterien eine Deletion des GDH-Gens im Chromosom der Bakterienzellen eingeführt werden, die eine Aufhebung der Aktivität der Glutamatdehydrogenase zur Folge hat. Die Geninaktivierung wurde durch Sequenzierung und Ermittlung der spezifischen Enzymaktivitäten der Glutamatdehydrogenase der verwendeten Stämme bestätigt.
Das Reaktionsmedium muss einen Überschuss an für den Organismus verwertbaren Stickstoff, z. B. in Form von Ammoniumionen enthalten. Unter Überschuss ist gemeint, dass das Reaktionsmedium eine solche Konzentration an Ammoniumionen in Form von für den Organismus verwertbaren Stickstoffs aufweist, so dass das GS/GOGAT-System gehemmt wird. Eine Hemmung des GS/GOGAT-Systems durch Ammoniumionen (Inhibitorische Konzentration) kann nachgewiesen werden durch die Messung der verminderten Glutamat-Bildung (durch das GS/GOGAT-System) in einer GDH Deletionsmutante in Abhängigkeit verschiedener NH₄ ⁺ Konzentrationen. Eine Hemmung liegt vor, sobald die Glutamat-Bildung bei weiter fortschreitender Erhöhung der Ammoniumionenkonzentration eine verminderte Bildung an Glutamat bedingt. Diese Konzentration bildet die Untergrenze der einzusetzenden Ammoniumionen.
Die tatsächliche Konzentration an Ammoniumionen ist von Organismus zu Organismus verschieden, kann jedoch vom Fachmann nach seinem Können durch Routineexperimente bestimmt werden. Eine Obergrenze bildet sicherlich die Löslichkeit der Ammoniumsalze sowie die Wirtschaftlichkeit oder auch die Praktikabilität des Verfahrens insgesamt. Hier hat der Fachmann unter ökonomischen Gesichtspunkten abzuwägen, ob ein weiterer Zusatz an Ammoniumionen zum Reaktionsmedium noch einen verwertbaren Effekt – sprich eine weitere Erhöhung der AKG-Bildung – erzeugt.
In der Regel wird die Konzentration an Ammoniumionen in Form von für den Organismus verwertbaren Stickstoffs im Reaktionsmedium bei 5–70 g/L, bevorzugt bei 10–50 g/L liegt. In der Regel wird sich die Konzentration um 20 g/L liegen. Als Stickstoffquelle können organische stickstoffhaltige Verbindungen wie Peptone, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Malzextrakt, Maisquellwasser, Sojabohnenmehl und Harnstoff oder anorganische Verbindungen wie Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumphosphat, Ammoniumcarbonat und Ammoniumnitrat verwendet werden. Die Stickstoffquellen können einzeln oder als Mischung verwendet werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist es angezeigt, zusätzlich zu den oben beschriebenen Maßnahmen, die GS/GOGAT-Enzyme des Organismus zu inhibieren. Dazu werden geeignete Inhibitor-Verbindungen dem Reaktionsmedium zugefügt (Inhibition of homocysteine sulfonamide of glutamate synthase purified from Saccharomyces cerevisiae DS Masters Jr and A Meister J. Biol. Chem., Vol. 257, Issue 15, 8711–8715, 08, 1982; Glutamine-Einding Subunit of Glutamate Synthase and Partial Reactions Catalyzed by this Glutamine Amidotransferase Paul P. Trotta, Karen E. B. Platzer, Rudy H. Haschemeyer, Alton Meister Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, Vol. 71, No. 11 (Nov., 1974), pp. 4607–4611). Als solche kommen insbesondere die der folgenden Gruppe in Frage: D-Glutamin, Ethionine Sulfon, L-Albizziin, Homocystein-Sulfonamide, Methionin-Sulfone, Methionin-Sulfoximine und Methionin-Sulfoxide.
Beispielsweise kann zur Beeinflussung des GS/GOGAT-Systems der Inhibitor Methioninsulfoximin dem Reaktionsmedium zugesetzt werden. Es zeigt sich, dass hierdurch eine weitere Erhöhung der Produktivität der Organismen bei der Herstellung von AKG eintritt.
In einer weiteren Ausgestaltung ist das Reaktionsmedium für die fermentative Herstellung von AKG dergestalt aufgebaut, dass eine limitierte Versorgung des Mikroorganismus mit Biotin vorliegt. Es zeigt sich, dass vermutlich dadurch der ODHC-Komplex in seiner Aktivität gehemmt wird, was wiederum zu einer Anreicherung von AKG führt. Der Fachmann ist im Prinzip frei in der Wahl der Biotinkonzentration im Medium, doch darf die Biotinkonzentration nicht unter einen bestimmten Wert sinken, da dann der für den Organismus essentielle Zitronensäurezyklus derart empfindlich gestört wird, dass die Zelle nicht mehr lebensfähig wäre. Eine Obergrenze an Biotin wird dadurch gebildet, dass eine Verminderung der ODHC-Aktivität vorliegen muss. Der Fachmann wird die Konzentration an Biotin innerhalb dieser Grenzen an wirtschaftlichen Erwägungen ableiten. Die Konzentration des Biotins im Reaktionsmedium sollte vorzugsweise zwischen 0,1–0,0005 g/L, bevorzugt bei 0,01–0,001 g/L liegen. In der Regel wird ein Wert von ca. 2–5 μg/L optimal sein.
Zusätzlich kann es für die verbesserte Produktion von α-Ketoglutarat vorteilhaft sein, in den auf die beschriebene Weise hergestellten Organismen eines oder mehrere Enzyme des jeweiligen Biosyntheseweges, der Glykolyse, der Anaplerotik, des Pentosephosphat-Zyklus, des Ketosäure-Exports und gegebenenfalls regulatorische Proteine überzuexprimieren, um die α-Ketoglutarat Bildung in den beanspruchten Organismen zu erhöhen. Die Verwendung endogener Gene wird ebenso wie bei den beschriebenen Maßnahmen der Abschwächung im Allgemeinen bevorzugt.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch ein Verfahren zur Herstellung von AKG, bei dem ein wie eben beschriebenes erfindungsgemäßes Reaktionssystem zum Einsatz kommt. Die für das Reaktionssystem beschriebenen bevorzugten Ausführungsformen gelten für das Verfahren entsprechend. Ganz besonders bevorzugt ist daher ein Verfahren, bei dem alle oben beschriebenen Maßnahmen kumulativ vorliegen. Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren geht man bevorzugt dergestalt vor, dass man in einem geeigneten Reaktionsgefäß eine wie beschriebene Fermentationsbrühe mit den veränderten Bakterien anzieht und anschließend eine Anreicherung des AKG in der Brühe zulässt. Das AKG kann anschließend nach bekannten Methoden aus der Brühe isoliert werden oder zusammen mit der Brühe konzentriert und dergestalt mit Bestandteilen aus der Fermentationsbrühe und/oder der Biomasse (> 0 bis 100%) weiterverarbeitet werden.
Das Verfahren kann kontinuierlich oder diskontinuierlich im batch – Verfahren (Satzkultivierung) oder im fed batch (Zulaufverfahren) oder repeated fed batch Verfahren (repetitives Zulaufverfahren) oder im Perfusionsverfahren ( WO 9501214 ) zum Zwecke der Produktion von α-Ketoglutarat durchgeführt werden. Eine Zusammenfassung über bekannte Kultivierungsmethoden ist im Lehrbuch von Chmiel (Bioprozesstechnik 1. Einführung in die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)) oder im Lehrbuch von Storhas (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994)) beschrieben.
Das zu verwendende Kulturmedium muss unter den oben genannten Randbedingungen in geeigneter Weise den Ansprüchen der jeweiligen Organismen genügen. Beschreibungen von Kulturmedien verschiedener Mikroorganismen sind im Handbuch „Manual of Methods for General Bacteriology„ der American Society for Bacteriology (Washington D. C., USA, 1981) enthalten.
Als Kohlenstoffquelle können Zucker und Kohlehydrate wie z. B. Glucose, Saccharose, Lactose, Fructose, Maltose, Melasse, Stärke und Cellulose, Öle und Fette, wie zum Beispiel Sojaöl, Sonnenblumenöl, Erdnußöl und Kokosfett, Fettsäuren, wie zum Beispiel Palmitinsäure, Stearinsäure und Linolsäure, Alkohole wie zum Beispiel Glycerin und Ethanol und organische Säuren, wie zum Beispiel Essigsäure verwendet werden. Diese Stoffe können einzeln oder als Mischung verwendet werden.
Als Phosphorquelle können Phosphorsäure, Kaliumdihydrogenphosphat oder Dikaliumhydrogenphosphat oder die entsprechenden Natrium-haltigen Salze verwendet werden. Das Kulturmedium muss weiterhin Salze von Metallen enthalten, wie zum Beispiel Magnesiumsulfat oder Eisensulfat, die für das Wachstum notwendig sind. Schließlich können essentielle Wuchsstoffe wie Aminosäuren und Vitamine zusätzlich zu den oben genannten Stoffen eingesetzt werden. Dem Kulturmedium können überdies geeignete Vorstufen zugesetzt werden. Die genannten Einsatzstoffe können zur Kultur in Form eines einmaligen Ansatzes hinzugegeben oder in geeigneter Weise während der Kultivierung zugefüttert werden.
Zur pH-Kontrolle der Kultur werden basische Verbindungen wie Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Ammoniak beziehungsweise Ammoniakwasser oder saure Verbindungen wie Phosphorsäure oder Schwefelsäure in geeigneter Weise eingesetzt. Zur Kontrolle der Schaumentwicklung können Antischaummittel, wie zum Beispiel Fettsäurepolyglykolester eingesetzt werden. Zur Aufrechterhaltung der Stabilität von Plasmiden können dem Medium geeignete selektiv wirkende Stoffe, wie zum Beispiel Antibiotika hinzugefügt werden. Um aerobe Bedingungen aufrechtzuerhalten, werden Sauerstoff oder Sauerstoff-haltige Gasmischungen, wie zum Beispiel Luft in die Kultur eingetragen. Die Temperatur der Kultur liegt normalerweise bei 20°C bis 45°C und vorzugsweise bei 25°C bis 40°C. Die Kultur wird solange fortgesetzt, bis sich ein Maximum an α-Ketoglutarat gebildet hat, beziehungsweise die Ausbeute oder Produktivität einen gewünschten optimalen Wert erreicht hat. Dieses Ziel wird normalerweise innerhalb von 10 Stunden bis 160 Stunden erreicht.
Das auf diese Weise hergestellte α-Ketoglutarat wird wie beschrieben anschließend gesammelt und isoliert und gegebenenfalls gereinigt.
Einen weiteren Gegenstand der vorliegenden Erfindung bilden die für die Herstellung der erfindungsgemäß einzusetzenden Mutanten benötigten Zwischenprodukte. Dies sind im Einzelnen Primersequenzen zur Amplifizierung des GDH-gens. Insbesondere sind dies die Sequenzen auweisend die Seq. ID No: 1 oder 2.
Weiterhin sind unter dieser Rubrik Plasmide zu nennen, mit denen das deletierte Genkonstrukt in den Organismus transfiziert und ins Genom des Organismus integriert werden kann, wodurch die gewünschte doppelte homologe Rekombination stattfinden kann. Dafür eigenen sich solche Plasmide, welche im betrachteten Mikroorganismus nicht repliziert werden und eine für eine funktionsunfähige GDH codierende Sequenz aufweisen und welche jedoch nach Klonierung in den Mikroorganismus zu einer doppelten homologen Rekombination und damit zur Inaktivierung der GDH im Mikroorganismus führen. Ganz besonders bevorzugt ist das Plasmid laut 5 – Plasmidkarte von pK18mobsacB_ΔGDH (Seq. ID NO: 3). Die ganz bevorzugte Deletionsregion ist eine solche im GDH-Gen, welche sich zwischen zwei Eco0109I-Schnittstellen befindet. Ein solches bevorzugtes zur Inaktivität führendes GDH-Gen ist in Seq. ID NO: 4 aufgeführt.
Als Ausgangsorganismus kann jeder dem Fachmann hierfür in Frage kommende Organismus herangezogen werden. Vorzugsweise kommen Organismen zum Zuge, welche schon eine erhöhte AKG Porduktion von Natur aus mitbringen. Besonders bevorzugt sind solche aus der Gruppe bestehend aus den Gattungen Corynebacterium, Brevibacterium, Escherichia coli, Rhodococcus, Saccharomyces, Pichia, Yarowia, Bacillus, Aspergillus. Besonders bevorzugt ist hier die Gattung Corynebacterium zu nennen, insbesondere die in der Fachwelt bekannte Art Corynebacterium glutamicum. Bekannte Wildtypstämme der Art Corynebacterium glutamicum sind beispielsweise
Corynebacterium glutamicum ATCC 13032
Corynebacterium glutamicum DSM 20411
Corynebacterium glutamicum DSM 20412
Corynebacterium glutamicum DSM 20598
Corynebacterium acetoglutamicum ATCC 15806
Corynebacterium acetoacidophilum ATCC 13870
Corynebacterium melassecola ATCC 17965
Corynebacterium thermoaminogenes FERM BP-1539
Brevibacterium flavum ATCC 14067
Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869 und
Brevibacterium divaricatum ATCC 14020.
Angaben zur taxonomischen Einordnung von Stämmen dieser Gruppe von Bakterien findet man unter anderem bei Kämpfer und Kroppenstedt (Canadian Journal of Microbiology 42, 989–1005 (1996)) und in der US-A-5,250,434 . Seit einigen Jahren (Liebl et al., International Journal of Systematic Bacteriology 41(2), 255-260 (1991)) werden coryneforme Bakterien mit Artbezeichnung „Brevibacterium flavum", „Brevibacterium lactofermentum" und „Brevibacterium divaricatum" in die Art Corynebacterium glutamicum eingeordnet. Coryneforme Bakterien mit Artbezeichnung „Corynebacterium melassecola" gehören ebenfalls zur Art Corynebacterium glutamicum.
Gegenstand der Erfindung ist ein Produktionsstamm zur fermentativen Gewinnung von α-Ketoglutarat, bevorzugt Corynebacterium glutamicum, welcher eine Voll- oder Teildeletion im Allel der GDH besitzt. Ganz besonders bevorzugt ist ein Stamm ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: ATCC13032_ΔGDH, DSM20411_ΔGDH.
Die Ergebnisse der Versuche zeigen, dass die Beeinflussung der α-Ketoglutarat-Konzentration insbesondere bei den Deletionsmutanten durch oben genannte Faktoren möglich ist. Es konnte eine 76fache Steigerung bezüglich der Bildung von α-Ketoglutarat durch Erhöhung der Ammoniumkonzentration, die Zugabe von 5 mM Methioninsulfoximin und die Verringerung der Biotinkonzentration auf 5 μg/L im Minimalmedium im Stamm Corynebacterium glutamicum DSM 20411 ΔGDH im Vergleich zum Stamm ATCC 13032 ohne GDH-Deletion erreicht werden. Dagegen sind bisher keine Publikationen oder Patente bekannt, die die gezielte Entwicklung eines α-Ketoglutarat-Produzenten mittels Abschwächung des Abflusses von AKG in Richtung Glutamat durch Deletion der Glutamat Dehydrogenase, und gleichzeitiger Abschwächung des Abflusses von AKG über den Citrat-Zyklus, als auch über das GS/GOGAT-System (Glutamin Synthetase/Glutamin-2-Oxoglutarat-Aminotransferase System; Stryer, Lubert; Biochemistry, 3rd edition) beschreiben. Vor dem Hintergrund des Standes der Technik ist die vorliegende Lehre daher erfinderisch.
Beispiele
Die Anreicherung des Stoffwechselproduktes AKG zur fermentativen Gewinnung kann durch Beeinflussung der Biosynthesewege erfolgen (siehe Beschreibung der Erfindung).
Zur Untersuchung der Auswirkung der Hemmung bzw. der Blockade der einzelnen Stoffwechselwege mit dem Ziel der AKG-Anhäufung wird eine GDH-Deletionsmutante von Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 und eine GDH-Deletionsmutante von Corynebacterium glutamicum DSM 20411, bei dem es sich um einen Glutamatüberproduzenten handelt, konstruiert.
Die Beeinflussung einzelner oder mehrere Stoffwechselwege durch die Umgebungsbedingung der Zellen, verursacht durch die Medienbestandteile wurde getestet.
Anschließend wurde die Akkumulation von AKG zwischen der Deletionsmutante des C. glutamicum ATCC 13032 und dem Wildtyp ATCC 13032, sowie der Deletionsmutante des Corynebacterium glutamicum DSM 20411 und des Ursprungsstammes Corynebacterium glutamicum DSM 20411 verglichen.
Generelle Techniken
Für DNA Manipulationen wurden Standardtechniken benutzt wie sie zum Beispiel in Sambrook, J. et al. (1989), Molecular Cloning: a laboratory manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, angegeben sind. DNA Amplifikationen wurden mit der Taq-DNA Polymerase (Quiagen, Hilden, Germany) durchgeführt. Wenn nicht anders angegeben wurde die Polymerasen entsprechend den Angaben der Hersteller benutzt. Oligonukleotide für die PCR Amplifikationen und die Einführung von Restriktionsschnittstellen wurden von MWG-Biotech (Ebersberg, Germany) erhalten. Der Nachweis konstruierter Stämme erfolgte durch Kolonie-PCR mit der Taq Polymerase READYMIX (Quiagen, Hilden, Germany), sowie Plasmidpräparationen. DNA Fragmente wurden mit dem MinElute Gel Extraction Kit (Quiagen, Hilden, Germany) nach Angaben des Herstellers gereinigt und gewonnen. Plasmid DNA wurde mittels des Qiaprep sein Miniprep Kits (Quiagen, Hilden, Germany) isoliert. Alle konstruierten Plasmide wurden durch Restriktionsanalyse mit nachfolgender Sequenzierung verifiziert.
Beispiel 1: Konstruktion der Deletionsmutanten von C. glutamicum ATCC 13032 und DSM 20411
Das Genom des C. glutamicum ATCC 13032 wurde bereits vollständig bestimmt und ist im Internet in entsprechenden Datenbanken frei zugänglich (Kalinowski, J., Bathe, B., Bartels, D., Bischoff, N., Bott, M., Burkovski, A., Dusch, N., Eggeling, L., Eikmanns, B. J., Gaigalat, L., Goesmann, A., Hartmann, M., Huthmacher, K., Krämer, R., Linke, B., McHardy, A. C., Meyer, F., Möckel, B., Pfefferte, W., Pühler, A., Rey, D. A., Rückert, C., Rupp, O., Sahm, H., Wendisch, V. F., Wiegräbe, I., Tauch, A. (2003): The complete Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 genome sequence and its impact an the production of L-B. flavumartate-derived amino acids and vitamins, Journal of Biotechnology 104: 5–25).
Die Ermittlung der GDH-Gensequenz, welche die Glutamatdehydrogenase codiert, erfolgte über die NCBI-Datenbank. Die DNA-Sequenz ist unter Genbank X59404, X72855, BA000036 und BX927154 und die Proteinsequenz unter PIR S32227 abgelegt. Um die Deletionsmutanten zu erhalten, wurde zunächst das GDH-Gen aus C. glutamicum ATCC 13032 amplifiziert und in das Plasmid pK18mobsacB (Schäfer, A., Tauch, A., Jäger, W., Kalinowski, J., Thierbach, G., Pühler, A. (1994), Small mobilizable multipurpose cloning vectors derived form the Escherichia coli plasmids pK18 and pK19: selection of defined deletions in the chromosome of Corynebacterium glutamicum, Gene 145: 69–73) kloniert. Ausgehend von diesem Plasmid (pK18mobsacB_GDH) wurde dann die Deletion im GDH-Gen eingeführt. Dieses Plasmid (pK18mobsacB_ΔGDH) mit dem verkürzten Gen wurde in den Zielorganismus transformiert. Anschließend wurden die Transformaten selektioniert und auf das deletierte Enzym hin getestet.
Das ca. 2 kb große DNA-Fragment mit der Sequenz der Glutamat Dehydrogenase wurde mit folgenden Primern amplifiziert:

GDH forw. (EcoRI): CCATTTGAGGGCGCTCGAATTCGTGGCC Seq. ID No. 1
GDH rev. (SalI): GATGAAGCCAGTCGACCCAGCCACCAAGAT Seq. ID No. 2

Die aufgereinigte DNA mit einer Länge von 2037 bp wurden einem Restriktionsverdau mit den Enzymen EcoRI und SalI unterzogen (Seq. ID NO: 4) und in den ebenfalls mit diesen Enzymen geschnittenen Vektor pK18mobsacB kloniert (siehe 6 – Plasmidkarte von pK18mobsacB GDH).
Für die abschließende Konstruktion des Plasmides pK18mobsacB_ΔGDH (Seq. ID NO: 3) wurde das Plasmid pK18mobsacB_GDH mit dem Enzym EcoO109I inkubiert. Die entstandenen Enden wurden anschließend mittels T₄-DNA-Ligase wieder religiert. Der resultierende Vektor pK18mobsacB_ΔGDH trägt ein verkürztes GDH-Gen, das nach einer Transkription und Translation nicht mehr zu einem aktiven GDH-Enzym führt (5).
Das Plasmid wurde in C. glutamicum-Zellen ATCC 13032 und DSM 20411 mittels Elektroporation transferiert. Da der Vektor in C. glutamicum nicht repliziert werden konnte, waren nur Koloniebildungen der Zellen im Medium mit Kanamycin möglich, die mittels homologer Rekombination den Vektor ins Chromosom integriert hatten.
Die Integration des Vektors sorgt für ein zweifaches Vorliegen der flankierenden Bereiche des zu deletierenden Gens im Genom dieser Mutanten. Im neu eingeführten Bereich fehlt jedoch die deletierte Sequenz innerhalb des Gens. Durch eine zweite homologe Rekombination kann der integrierte Vektor zusammen mit einer der beiden identischen Sequenzbereiche wieder aus dem Genom gespalten werden. Abhängig davon welcher der beiden DNA-Bereiche das Genom verlässt, wird die Deletion im Genom etabliert (zu 55%) oder der native Zustand wieder hergestellt (zu 45%). Die Kolonien werden um den Verlust des Vektors zu begünstigen im Medium ohne Selektionsdruck angezogen und anschließend auf Nährböden, die 10% Saccharose enthalten, ausplattiert. Die Selektion des zweiten homologen Rekombinationsereignisses kann durchgeführt werden, da sich auf dem Vektor pK18mobsacB das modifizierte sacB-Gen befindet. Durch die Anwesenheit von Saccharose kommt es in Zellen, die den Vektor beinhalten, zur Bildung des Enzym Levansucrase. Die Umsetzung von Saccharose zu Levan verleiht diesen Zellen eine Saccharose-Sensitivität. Zellen, die auf Saccharose haltigen, aber nicht auf Kanamycin haltigen Nährböden wachsen können, haben den Vektor verloren.
Beispiel 2: Nachweis der Inaktivierung der Glutamatdehydrogenase in C. glutamicum ATCC 13032_ΔGDH und DSM 20411_ΔGDH
Der Nachweis der Inaktivierung der Glutamat Dehydrogenase durch die Gendeletion wurde durch Aktivitätstests durchgeführt. Ein intaktes Gen ist für ein vollständig aktives Enzym notwendig. Durch die Deletion der ca. 500 bp liegt eine starke Veränderung der Sequenz vor, die sich auf die dreidimensionale Struktur des daraus exprimierten Enzymes auswirkt. Die gebildete Struktur kann aufgrund der fehlenden AS nicht mit der ursprünglichen Form übereinstimmen. Aufgrund dieser Veränderungen wird die Enzymaktivität beeinflusst.
Für den vergleichenden Enzymtest wurden zunächst die Corynebacterium-Zellen in Kaliumphosphat-Puffer so gelöst, dass in jeweils 800 μL Zellsuspension eine OD₆₀₀ von 45 vorlag. Anschließend wurden die Zellsuspensionen mittels Kugelmühle oder Ultraschall aufgeschlossen. NADPH dient als Co-Faktor des Enzymes GDH. Für jedes gebildete Glutamat-Molekül wird eine Molekül NADPH oxidiert. Bei 340 nm liegt das Absorptionsmaximum von NADPH, NADP⁺ zeigt in diesem Wellenlängenbereich keine Absorption.
Zur Bestimmung der spezifischen Enzymaktivität der GDH bzw. ΔGDH wurde die Absorptionsabnahme bei λ = 340 nm aufgrund der Umsetzung von NADPH zu NADP⁺ photometrisch verfolgt. Die Messung erfolgte über einen Zeitraum von 5 min bei 30°C.
Die Ergebnisse des Enzymtests sind in Tabelle 2 zusammengefasst. Tab. 2: Vergleich der Spezifische GDH-Aktivitäten von Corynebacterium glutamicum ATCC 13032, DSM 20411 und deren GDH Deletionsmutanten.

Stamm spezifische Aktivität in μmol·mg^–1min^–1

ATCC 13032 2,76

ATCC 13032_ΔGDH -

DSM 20411 1,99

DSM 20411_ΔGDH -
Die spezifische Aktivität des Stammes ATCC 13032 lag bei 2,76 μmol·mg^–1·min^–1, die spezifische Aktivität DSM 20411 war etwas geringer (1,99 μmol·mg^–1·min^–1).
Die beiden Deletionsmutanten zeigten keine erkennbaren Aktivitäten. Die Werte bestätigen die Inaktivierung der Glutamat Dehydrogenase durch die Deletion des GDH-Gens.
Beispiel 3: Untersuchung der Verhaltens von ATCC 13032 und ATCC 13032_ΔGDH in Standard-Corynebacterium Standardmedium

Für einen Vergleich des Wachstumsverhaltens der beiden Stämme in einer Flüssigkultur über einen längeren Zeitraum, sowie der Gewinnung erster Werte über die Beeinflussung der AKG Bildung durch die Deletion wurden die Stämme ATCC 13032 und ATCC 13032_ΔGDH in Corynebacterium-Standardmedium kultiviert. Standardmedium

Saccharose	100 g
(NH₄)₂SO₄	10 g
MgSO₄·7 H₂O	1 g
KH₂PO₄	2 g
CSL	15 g
Zitronensäure	1,0000 g
L-Isoleucin	0,150 g
FeSO₄·7 H₂O	0,02 g
MnSO₄·5 H₂O	0,01 g
ZnSO₄·7 H₂O	0,032 g
CuSO₄·5 H₂O	0,0010 g
Calcium-D-Pantothenat	0,001 g
Betain Base	0,50 g
myo-Inositol	0,10 g
Nicotinsäure	0,0005 g
MOPS	10 g
CaCO₃	15 g
D-(+)-Biotin	0,00050 g
Thiamin-HCl	0,0010 g
Wasser	ad 1 L

Hierfür wurden vier 500 mL Kolben jeweils mit 50 mL Produktionsmedium befüllt. Zu je zwei der Kolben wurde 5 mM Glutaminsäure hinzugegeben. Je zwei unterschiedliche Kolben wurden mit einem der beiden Stämme inokuliert.

Es erfolgten Probennahmen bei 0 h, 7 h, 24 h und 30 h Endprobe), die auf die Bildung α-Ketoglutarat (AKG) hin untersucht wurden. Tab. 3: Quantitative Bestimmung von AKG in den Proben des Standardmediums: +: mit 5 mM Glutaminsäure-Zusatz, –: ohne Zusatz von Glutaminsäure.

Probe	AKG in g/L
ATCC 13032 0 h –	<< 0,03
ATCC 13032 0 h +	<< 0,03
ATCC 13032 7 h –	< 0,03
ATCC 13032 7 h +	<< 0,03
ATCC 13032 24 h –	0,2
ATCC 13032 24 h +	0,2
ATCC 13032 30 h –	0,4
ATCC 13032 30 h +	0,4
ATCC 13032_ΔGDH 0 h –	<< 0,03
ATCC 13032_ΔGDH 0 h +	<< 0,03
ATCC 13032_ΔGDH 7 h –	< 0,03
ATCC 13032_ΔGDH 7 h +	<< 0,03
ATCC 13032_ΔGDH 24 h –	0,2
ATCC 13032_ΔGDH 24 h +	0,2
ATCC 13032_ΔGDH 30 h –	0,5
ATCC 13032_ΔGDH 30 h +	0,4

Aus den ermittelten Werten (siehe Tabelle 3) ist zu erkennen, dass die gefundene Menge an AKG äußerst gering waren. Die Proben selbst unterschieden sich unabhängig von dem Zusetzen der Glutaminsäure kaum in ihrer AKG-Konzentration. Die Deletionsmutante zeigte ebenfalls im Vergleich zum Ursprungsstamm keine AKG-Anreicherung. Die bloße Deletion des GDH-Gens führte demnach nicht zu einer Akkumulation des AKGs.
Beispiel 3: Vergleich der α-Ketoglutarat-Bildung von C. glutamicum ATCC 13032 und ATCC 13032_ΔGDH bzw. DSM 20411 und DSM 20411_ΔGDH in Minimalmedium
Minimalmedium

– Spurenelemente-Lösung

FeSO₄·7 H₂O	28,5 g
MnSO₄·H₂O	16,5 g
ZnSO₄·7 H₂O	6,4 g
CuSO₄·5 H₂O	0,764 g
CoCl₂·6 H₂O	0,129 g
NiCl₂·6 H₂O	0,044 g
H₃BO₃	0,048 g
Wasser	ad 1 L

Lösen der Spurenelemente durch Ansäuerung mit H₂SO₄ auf pH 1.

– 100 mM CaCl₂-Lösung
– 1 M MgSO₄-Lösung
– 50% D-(+)-Glucose-Lösung
– Grundbestandteile des CgC-Mediums

MOPS	42 g
(NH₄)₂SO₄	20 g
Harnstoff	5 g
KH₂PO₄	0,5 g
K₂HPO₄	0,25 g
Wasser	ad 1 L

Die Grundbestandteile wurden in ca. 300 mL Wasser gelöst, der pH-Wert auf 7,0 mit NaOH eingestellt und die Medien autoklaviert. Anschließend wurden die fehlenden Bestandteile so ergänzt, dass ein Endvolumen von 1 L vorlag.

CaCl₂-Lösung 10 mL

MgSO₄-Lösung 10 mL

D-(+)-Glucose-Lösung 50 mL

Spurenelemente-Lösung 1 mL

Biotin 200 mg
Im Vergleich zum Standardmedium war bereits durch den Einsatz des Minimalmediums eine unterschiedliche Akkumulation von AKG zu erkennen (siehe 7 – Vergleich der AKG-Akkumulation der Ausgangsstämme C. glutamicum ATCC 13032 und DSM 20411 sowie der Deletionsmutanten ATTC 13032_ΔGDH und DSM 20411_ΔGDH im Minimalmedium). Die jeweiligen Deletionsmutanten verzeichnen einen höheren AKG-Gehalt im Vergleich zu ihren Ursprungstämmen. Corynebacterium glutamicum DSM 20411_ΔGDH wies im Vergleich zu den anderen Stämmen eine mehr als 10 mal so hohe Konzentration an AKG auf. Nach 30 h hatte in etwa eine Verdoppelung des 20 h Wertes stattgefunden.
Beispiel 4: Vergleich der α-Ketoglutarat-Bildung von C. glutamicum ATCC 13032 und ATCC 13032_ΔGDH bzw. DSM 20411 und DSM 20411_ΔGDH in Minimalmedium mit reduzierter Biotion-Konzentration
Dieses Medium enthielt Biotin in einer verminderten Konzentration (5 μg/L) gegenüber dem oben beschriebenen Minimalmedium. Die Aktivität des ODHC (Oxoglutarat-Dehydrogenase-Komplexes) wird dadurch reduziert und der Abfluss von AKG im Citrat-Zyklus (siehe 2) vermindert (8 – Vergleich der AKG-Akkumulation der Ausgangsstämme C. glutamicum ATCC 13032 und DSM 20411 sowie der Deletionsmutanten ATTC 13032_ΔGDH und DSM 20411_ΔGDH im Minimalmedium mit 5 μg/L Biotin).
Beispiel 5: Vergleich der α-Ketoglutarat-Bildung von C. glutamicum ATCC 13032 und ATCC 13032_ΔGDH bzw. DSM 20411 und DSM 20411_ΔGDH in Minimalmedium mit Zusatz des Hemmers der Glutaminsynthetase Methioninesulfoximin (MSX)
Diesem Minimalmedium wurde sowohl 5 mM des Inhibitors der Glutaminsynthetase MSX (Methioninesulfoximin) zugesetzt, als auch die auf Biotin-Konzentration auf 5 μg/L vermindert. Die Kombination hatte das Ziel die Aktivität des ODHC zu vermindern und das GS/GOGAT-System zu deaktivieren. Inhibitoren wie Methioninsulfoximin (MSX) können in bestimmten Systemen als Glutamat-Antagonisten wirken und z. B. die Glutamin-Synthetase inhibieren. Die Inhibition der Glutaminsynthetase durch MSX ist irreversibel (9 – Vergleich der AKG-Akkumulation der Ausgangsstämme C. glutamicum ATCC 13032 und DSM 20411 sowie der Deletionsmutanten ATTC 13032_ΔGDH und DSM 20411_ΔGDH im Minimalmedium mit 5 μg/L Biotin und 5 mM MSX.).
Beispiel 6: Vergleich der α-Ketoglutarat-Bildung von C. glutamicum ATCC 13032 und ATCC 13032_ΔGDH bzw. DSM 20411 und DSM 20411_ΔGDH in Minimalmedium mit Zusatz von 1 M Ammoniumsulfat als einzige Stickstoffquelle
Dieses abgewandelte Minimalmedium enthielt 1 M (NH₄)₂SO₄ als einzige Stickstoffquelle. Eine erhöhte Ammonium-Konzentration im Medium vermindert die Aktivität des GS/GOGAT-Systems. Die Aktivität der GDH, die sich reziprok zur GS/GOGAT-Aktivität verhält, sollte daher ansteigen. Als Folge der Deletion der GDH wird der Abbau des AKG durch dieses Enzym verhindert und auch die Umwandlung durch das GS/GOGAT-System vermindert (10 – Vergleich der AKG-Akkumulation der Ausgangsstämme C. glutamicum ATCC 13032 und DSM 20411 sowie der Deletionsmutanten ATTC 13032_ΔGDH und DSM 20411_ΔGDH im Minimalmedium mit 1 M Ammoniumsulfat als einzige Stickstoffquelle).

Es folgt ein Sequenzprotokoll nach WIPO St. 25. Dieses kann von der amtlichen Veröffentlichungsplattform des DPMA heruntergeladen werden.

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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- JP 49011080 [0019]
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Claims

Mikrobielles Reaktionssystem aufweisend einen rekombinanten Mikroorganismus zur fermentativen Herstellung von a-Ketoglutarsäure und ein Reaktionsmedium, dadurch gekennzeichnet, dass im Mikroorganismus eine Inaktivierung der Glutamatdehydrogenase (GDH) vorliegt und das Reaktionsmedium dergestalt angepasst ist, dass es einen Überschuss an Ammoniumionen in Form von für den Organismus verwertbaren Stickstoff enthält.
Mikrobielles Reaktionssystem nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Inaktivierung der GDH durch Deletion erfolgt.
Mikrobielles Reaktionssystem nach Anspruch 1 bis 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Konzentration des für den Mikroorganismus in Form von Ammoniumionen verwertbaren Stickstoffs im Medium bei 5–70 g/L liegt.
Mikrobielles Reaktionssystem nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Reaktionsmedium einen oder mehrere auf das GS/GOGAT-System inhibitorisch wirkende Verbindungen aufweist.
Mikrobielles Reaktionssystem nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass das Reaktionsmedium Inhibitoren ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus D-Glutamin, Ethionine Sulfon, L-Albizziin, Homocystein-Sulfonamide, Methionin-Sulfone, Methionin-Sulfoximine und Methionin-Sulfoxide aufweist.
Mikrobielles Reaktionssystem nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass zusätzlich eine limitierte Versorgung des Mikroorganismus mit Biotin vorliegt.
Mikrobielles Reaktionssystem nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Konzentration des Biotins im Reaktionsmedium bei 0,1– 0,0005 g/L liegt.
Mikrobielles Reaktionssystem nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Mikroorganismus um einen der Gattung Corynebacterium glutamicum handelt.
Verfahren zur fermentativen Herstellung von α-Ketoglutarsäure unter Einsatz eines Reaktionssystems nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 6.
Primersequenz gemäß Seq. ID No: 1 bzw. Seq. ID No: 2.
Plasmid, welches im betrachteten Mikroorganismus nicht repliziert wird und eine für eine funktionsunfähige GDH codierende Sequenz aufweist und welches jedoch nach Klonierung in den Mikroorganismus zu einer doppelten homologen Rekombination und damit zur Inaktivierung der GDH im Mikroorganismus führt.
Mikroorganismus ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus ATCC13032_ΔGDH und DSM20411_ΔGDH,