DE10116197A1

DE10116197A1 - Neue Methylprednisolonderivate mit therapeutischer Wirkung

Info

Publication number: DE10116197A1
Application number: DE10116197A
Authority: DE
Inventors: Bernhard Tewes; Martin Hagen; Uwe Marx
Original assignee: Bernina Biosystems GmbH
Current assignee: Bernina Biosystems GmbH
Priority date: 2001-03-30
Filing date: 2001-03-30
Publication date: 2002-10-17
Also published as: WO2002094282A3; WO2002094282A2

Abstract

Die Erfindung betrifft neue Methylprednisolon(MPL)-Derivate mit therapeutischer Wirkung. Anwendungsgebiete sind die Medizin und die pharmazeutische Industrie. Ihr lag die Aufgabe zugrunde, lipidlösliche MPL-Derivate für alternative Darreichungsformen zu finden. DOLLAR A Gemäß der Erfindung wurden lipidlösliche Methylprednisolon-Derivate der allgemeinen Formel I entwickelt, DOLLAR F1 wobei R eine Monocarbonsäure mit einer unverzweigten Alkylkette der Länge C9 bis C19 ist. Bevorzugt ist eine Verbindung mir R = Palmitoyl.

Description

Die Erfindung betrifft neue Methylprednisolonderivate mit therapeutischer Wirkung. Anwendungsgebiete sind die Medizin und die pharmazeutische Industrie.

Methylprednisolon (MPL) ist ein Glucocorticoid, das mit dem Dexamethason und dem Hydrocortison verwandt ist. Therapeutische Anwendungsgebiete für MPL sind die Hemmung von Entzündungsreaktionen und die Immunsuppression (z. B. nach Transplantationen). Die Verbindung ist Bestandteil von mehreren Präparaten, die bereits auf dem Markt sind. Darüber hinaus gibt es Derivate von MPL, die ebenfalls Teil von pharmazeutischen Präparaten sind. Im einzelnen sind dies MPL-21-acetat, MPL-21-phosphate und MPL-21-succinat. Diese Verbindungen konnten bisher noch nicht liposomal verkapselt werden. In US-PS 4,693,999 ist unter anderem die Palmitoylierung einer Reihe von Glucocorticoiden beschrieben, die dem Einbau in Liposomen dienen. Als Glucocorticoid ist Methylprednisolon nicht aufgeführt. Im US-PS 5,190,936 ist der Einbau von marktüblichen Derivaten von Glucocorticoiden in Liposomen beschrieben. Hier ist das Derivat MPL-21-acetat aufgeführt. Die Möglichkeit der Inkorporation in Beschichtungen ist in beiden Patenten nicht beschrieben.

Die bisherigen MPL-Formulierungen haben den Nachteil, dass sie schnell aus der Zirkulation entfernt werden (Clearance), in hohen Dosen schädliche Nebenwirkungen haben und potentiell cardiotoxisch sind. Die Cardiotoxizität beruht darauf, dass die relativ kleinen Moleküle (im Gegensatz zu Liposomen) in den Herzmuskel eindiffundieren können.

Der Erfindung lag die Aufgabe zugrunde, lipidlösliche MPL-Derivate für alternative Darreichungsformen zu finden.

Die Erfindung wird gemäß den Patentansprüchen realisiert. Gemäß der Erfindung wurden lipidlösliche Methylprednisolon-Derivate der allgemeinen Formel I entwickelt,

wobei R eine Monocarbonsäure mit einer unverzweigten Alkylkette der Länge C9 bis C19 ist. Bevorzugt ist eine Verbindung mit R=Palmitoyl.

Diese Verbindungen lassen sich (im Gegensatz zu MPL und seinen bekannten Derivaten) in Lipidschichten integrieren. Sinn der Lipidintegration der Verbindungen I sind neue Darreichungsformen für den Wirkstoff.

Zum Umfang der Erfindung gehören auch pharmazeutische Mittel, die aus einer liposomalen Formulierung der Verbindungen I zusammen mit einer oder mehreren Komponenten aus einer oder mehreren der folgenden Gruppen bestehen:

a) natürliche, halbsynthetische oder vollsynthetische Amphiphile
b) Cholesterin
c) Tetraetherlipid-Derivate
d) Lipide mit hydrophilen Polymeren als Kopfgruppe
e) Lipide, die einen Liganden für die Zielsteuerung des Liposoms enthalten.

Ein bevorzugtes Mittel enthält ein Mol-Verhältnis von I zu den Lipiden der Gruppen a)-e) von 1 : 100 bis 1 : 1.

Das Amphiphil der Gruppe a) ist bevorzugt ein Phospholipid wie z. B. Phosphatidylcholin, Phosphatidylethanolamin, Phosphatidylglycerol, Phosphatidsäure oder Sphingomyelin. Das Tetraetherlipid aus der Gruppe c) entspricht einer der folgenden Formeln:

mit S₁ und S₂ Kopfgruppen, die in der Deutschen Patentanmeldung 100 65 561.0 beschrieben sind.

Das Lipid der Gruppe d) ist bevorzugt ein Polyethylenglycol-Lipid (PEG-Lipid).

In einer besonderen Ausführungsform der Erfindung kann das Lipid der Gruppe e) mit einem Peptid gekoppelt sein.

Die Liposomen für die erfindungsgemäßen Mittel werden üblicherweise durch Homogenisierung, Extrusion, Detergenz-Dialyse, Beschallung, Dehydratisierung/ Rehydratisierung, oder Ethanol-Injektion hergestellt.

Sie weisen bevorzugt eine oder mehrere Lipiddoppelschichten auf und haben eine Partikel- Grösse zwischen 10 nm und 5 µm, bevorzugt zwischen 50 nm und 1 µm.

Eine Dehydratisierung der Liposomen erfolgt durch Lyophilisation oder eine andere Trocknungsmethode.

Das Verabreichen des Mittels erfolgt üblicherweise nach Zusatz von geeigneten Hilfsstoffen auf folgenden Wegen: oral, enteral, parenteral, intravenös, intraarteriell, intramuskulär, topisch, subcutan, pulmonal oder intraperitoneal.

Das pharmazeutische Mittel, kann auch aus einer Formulierung der Verbindungen I in einer Dispersion aus einer mit Wasser nicht mischbaren Flüssigkeit in einer kontinuierlichen Wasserphase bestehen. Die mit Wasser nicht mischbare Flüssigkeit ist bevorzugt ein natürliches oder synthetisches Öl. Zur Stabilisierung können ferner oberflächenaktive Substanzen zugesetzt werden.

Auch dieses letztgenannte Mittel kann nach Zusatz von geeigneten Hilfsstoffen auf folgenden Wegen verabreicht werden: oral, enteral, parenteral, intravenös, intraarteriell, intramuskulär, topisch, subcutan, pulmonal oder intraperitoneal.

Das pharmazeutische Mittel, bestehend aus einer Lipidschicht, in die die Verbindung I eingelagert ist, läßt sich vorteilhaft auch als Beschichtung auf medizinischen Geräten oder Implantaten einsetzen.

Die Verwendung der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Mittel erfolgt bevorzugt als antiinflammatorisches, als immunsupressives und/oder als antiallergisches Therapeutikum.

Die liposomalen Formulierungen der Verbindungen I sind dadurch gekennzeichnet, daß sie in die Matrix des Liposoms eingebaut werden. Durch den Einbau in Liposomen läßt sich die Halbwertszeit der Verbindung im Körper deutlich erhöhen. Darüber hinaus bietet die liposomale Formulierung der Verbindungen I eine Möglichkeit, die Freisetzung der Verbindungen zeitlich zu kontrollieren ("controlled release"), was lokale Überdosierungen vermeidet. So kann die cardiotoxische Wirkung der Verbindungen gemäß der Erfindung durch eine liposomale Formulierung vermieden werden. Des weiteren bieten Liposomen eine Möglichkeit der Zielsteuerung von Wirkstoffen ("Targeting").

Insgesamt liegen die Vorteile einer liposomalen Formulierung der Verbindungen I in der Steigerung der Effektivität des Medikaments, der längeren Wirksamkeit und der geringeren Nebenwirkung.

Eine weitere Anwendungsmöglichkeit der neuen Derivate besteht in der Inkorporation in Beschichtungen.

Implantate (Stents, Prothesen) bergen das Risiko von Entzündungs- und Abstoßungsreaktionen, zur Steigerung der Biokompatibilität können die Oberflächen mit Lipiden beschichtet werden. Gemäß der Erfindung wird das MPL-Palmitat in Beschichtungen, bestehend aus Lipiden, auf die Oberfläche von Implantaten integriert und kann vor Ort als entzündungshemmende Substanz wirken. Für Lipidschichten ist prinzipiell die gleiche Release-Charakteristik gegeben wie für Liposomen. Besonders vorteilhaft ist es, Tetraetherlipid-Derivate zu benutzen, da sie besonders stabile Schichten ausbilden und sich deshalb hervorragend für Beschichtungen eignen.

Die Erfindung soll nachfolgend durch Anwendungsbeispiele näher erläutert werden.

1. Synthese von Methylprednisolon-21-palmitat (MPL-P)

250 mg (668 µmol) MPL werden unter Stickstoff in 10 ml trockenem Pyridin gelöst und auf 0-4°C abgekühlt. Nach Zugabe von 182 µl (601 µmol) Palmitoylchlorid wird die Lösung 18 h bei 4°C gerührt. Das Lösungsmittel wird verdampft und der Rückstand mit 50 ml Ethanol/Wasser (4 : 1) aufgenommen und wieder einrotiert. Das Rohprodukt wird durch Chromatographie mit CHCl₃/EtOAc (1 : 1) gereinigt. Man erhält 262 mg MPL-P (71%). Analytik:

- MS (DEI⁺); m/z (%) [Fragment]: 613 (45) [M⁺], 357 (13) [M⁺-C₁₆H₃₂O₂ (Palmitinsäure)], 256 (51) [C₁₆H₃₂O₂ ⁺ (Palmitinsäure)], 136 (100), 135 (100).
- IR (Film): = 3400 cm^-1 (breit, OH, H₂O), 2923, 2853 (aliph. C-H), 1722 (C=O, Ester und gesättigte Ketogruppe), 1657 (C=O, α,β,α'β'-ungesättigt), 1613 (C=C, α,β,α'β'-ungesättigt)

2. Herstellung von Phosphatidylcholin-Liposomen, die MPL-P enthalten

MPLP wird mit Phosphatidylcholin (PC; aus Eiweiß) in wechselnden Verhältnissen gemischt und in 1 ml Chloroform : Methanol 1 : 1 (v/v) aufgenommen (CHCl₃ : MeOH). Die Gesamtlipidmenge (PC + MPLP) beträgt 8 mg, der MPLP-Anteil beträgt maximal 0,8 mg (10 Massen-Prozent). Nach Hinzufügen von einigen Glasperlen wird die Mischung in einem Glaskolben am Rotationsverdampfer eingedampft, so dass ein transparenter Lipidfilm entsteht. Nach Zugabe von 1 ml Puffer (10 mM HEPES, 150 mM NaCl, pH 7,4) wird der Lipidfilm unter Rotation des Glaskolbens über Nacht hydratisiert. Die Lipiddispersion wird kurz im Ultraschallbad beschallt und anschließend durch eine Polycarbonat-Membran extrudiert (Porengröße 200 nm). Dabei entstehen Liposomen mit einer mittleren Größe von ca. 200 nm (Messung durch quasi-elastische Lichtstreuung).

3. Analyse der Inkorporationseffizienz von MPL-P in Phosphatidylcholin-Liposomen

Um die Liposomen von nicht eingebautem MPL-P zu trennen werden sie einer Größenausschlußchromatographie an Sephadex G75 unterzogen und in 1 ml-Fraktionen aufgefangen (Laufpuffer: Liposomenpuffer, s. o.; Gelbett 1 cm ∅, 25 cm Länge). Der Gehalt an PC in den Fraktionen wird durch einen enzymatischen Cholin-Test bestimmt (PAP 150, Biomerieux GmbH, Nürtingen). Als Liposomen-enthaltende Fraktionen werden die Fraktionen angenommen, die den größten PC-Anteil aufweisen. Zur Bestimmung des MPL-P- Gehaltes werden von den Liposomen-enthaltenden Fraktionen jeweils 100 µl entnommen und mit dem 4-fachen-Volumen an CHCl₃ : MeOH 2 : 1 (w/v) extrahiert. Die Extrakte werden eingeengt und zusammen mit einer Eichreihe von MPL-P auf eine HPTLC-Platte (Merck, Darmstadt) aufgetragen. Die Entwicklung erfolgt im Laufmittel CHCl₃ : Ethylactat 1 : 1. Anschließend wird die Platte in eine Färbelösung gedippt (3% (w/v) Kupferacetat; 8% (v/v) Phosphorsäure) und 15 min bei 180°C erhitzt. Die HPTLC-Platte wird mit einem Computer- Scanner (Epson Perfection 610, Düsseldorf) eingescannt und die Banden werden einer Graustufenanalyse unterzogen. Der MPL-P-Gehalt der Proben ergibt sich aus dem Vergleich des Graustufenwertes seiner Bande mit den Banden der Eichreihe.

Aus der Zusammensetzung der Liposomen läßt sich der Gewichtsanteil des MPL-P im Liposom berechnen. Die Inkorporationseffizienz ergibt sich als Quotient des gefundenen durch den theoretischen MPL-P-Gehalt des Liposoms. In Abb. 1 ist der gefundene MPL-P- Gehalt in Abhängigkeit vom theoretischen MPL-P-Gehalt in verschiedenen nach 2.1. hergestellten Liposomen dargestellt. MPL-P läßt sich bei einem Massenverhältnis MPL-P : PC von 2 : 98 mit einer Inkorporationseffizienz von 100% in PC-Liposomen einbauen. Bei einem Massenverhältnis MPL-P : PC von 10 : 90 sinkt die Inkorporationseffizienz auf 55%. Es sind Liposomen aus PC darstellbar, die mindestens 5, 5 Massen-% MPL-P enthalten.

Durch Zusatz von Tetraetherlipid-Derivaten (5 Massen%)läßt sich die Inkorporationseffizienz bei einem MPL-P : PC-Verhältnis von 8 : 92 von 60% auf 85% steigern (siehe Abb. 1).

4. Biologische Wirksamkeit von MPL-P

Die Wirkung von MPL-P als immunsupressive Substanz wurde in einem Tierversuch überprüft. T-Lymphocyten lassen sich durch Glucocortcoide wie z. B. Dexamethason in die Apoptose führen. Männlichen C3H-Mäusen (4 Monate alt, ca. 20 g Gewicht) wurden 200 µg MPLP intraperitoneal appliziert. Das MPL-P lag in einer liposomalen Formulierung aus PC mit einem Gehalt von 3 mol% MPL-P vor und das Injektionsvolumen betrug 200 µl. Nach 48 h wurden die Mäuse getötet, die Thymus-Drüse entfernt und die Thymocyten isoliert. T-Lymphocyten wurden durch CD4- und CD8-spezifische Antikörper markiert und in einer FACS-Analyse gezählt (vgl. Sentman et al., Cell, 67, 879-888). Der Anteil der lebenden CD4/CD-8-positiven Zellen an den insgesamt gezählten Zellen ergibt die Überlebensrate der T-Lymphocyten. In Abb. 2 ist die Überlebensrate der T-Lymphocyten einer mit MPL-P- behandelten Maus dem Normalwert einer unbehandelten Maus gegenübergestellt. Das deutliche Herabsenken der T-Lymphocyten-Rate in der MPL-Pbehandelten Maus spiegelt deutlich den immunsupressiven Effekt von MPL-P wider (siehe Abb. 2).

Claims

1. Methylprednisolon-Derivat der Formel I
wobei R eine Monocarbonsäure mit einer unverzweigten Alkylkette der Länge C9 bis C19 ist.

2. Methylprednisolon-21-Palmitat der Formel Ia

3. Pharmazeutisches Mittel, bestehend aus einer liposomalen Formulierung der Verbindungen I oder Ia zusammen mit einer oder mehreren Komponenten aus einer oder mehreren der folgenden Gruppen:

4. Mittel nach Anspruch 3, bei dem das Mol-Verhältnis von I oder Ia zu den Lipiden der Gruppen a)-e) 1 : 100 bis 1 : 1 beträgt.

5. Mittel nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Amphiphil der Guppe a) ein Phospholipid wie z. B. Phosphatidylcholin, Phosphatidylethanolamin, Phosphatidylglycerol, Phosphatidsäure oder Sphingomyelin ist.

6. Mittel nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Tetraetherlipid aus der Gruppe c) einer der folgenden allgemeinen Formeln entspricht:
mit S₁ und S₂ Kopfgruppen, die in der Deutschen Patentanmeldung 100 65 561.0 beschrieben sind.

7. Mittel nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Lipid der Gruppe d) ein Polyethylenglycol-Lipid (PEG-Lipid) ist.

8. Mittel nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Lipid der Gruppe e) mit einem Peptid gekoppelt ist.

9. Mittel nach Anspruch 1-8, dadurch gekennzeichnet, dass die Liposomen durch Homogenisierung, Extrusion, Detergenz-Dialyse, Beschallung, Dehydratisierung/ Rehydratisierung oder Ethanol-Injektion hergestellt sind.

10. Mittel nach Anspruch 1-9, bei dem die Liposomen eine oder mehrere Lipiddoppelschichten aufweisen.

11. Mittel nach Anspruch 1-10, bei dem die Liposomen eine Partikel-Grösse zwischen 10 nm und 5 µm aufweisen.

12. Mittel nach Anspruch 1-11, bei dem die Liposomen eine Partikel-Grösse zwischen 50 nm und 1 µm aufweisen.

13. Mittel nach Anspruch 1-12, bei dem die Liposomen durch Lyophilisation oder eine andere Trocknungsmethode dehydratisiert werden.

14. Anwendung des Mittels nach Anspruch 1-12 nach Zusatz von geeigneten Hilfsstoffen durch orale, enterale, parenterale, intravenöse, intraarterielle, intramuskuläre, topische, subcutane, pulmonale oder intraperitoneale Verabreichung.

15. Pharmazeutisches Mittel, bestehend aus einer Formulierung der Verbindungen aus Anspruch 1 und 2 in einer Dispersion aus einer mit Wasser nicht mischbaren Flüssigkeit in einer kontinuierlichen Wasserphase.

16. Mittel nach Anspruch 15, bei dem die mit Wasser nicht mischbare Flüssigkeit ein natürliches oder synthetisches Öl ist.

17. Mittel nach Anspruch 15 und 16, dem zur Stabilisierung oberflächenaktive Substanzen zugesetzt sind.

18. Anwendung des Mittels nach Anspruch 15-17 nach Zusatz von geeigneten Hilfsstoffen durch orale, enterale, parenterale, intravenöse, intraarterielle, intramuskuläre, topische, subcutane, pulmonale oder intraperitoneale Verabreichung.

19. Pharmazeutisches Mittel, bestehend aus einer Lipidschicht, in die Verbindungen aus Anspruch 1 und 2 eingelagert sind, wobei die Beschichtung auf medizinische Geräte oder Implantate aufgebracht wird.

20. Mittel nach Anspruch 19, bei dem die Lipidschicht Tetraetherlipid-Derivate gemäß Anspruch 6 enthält.

21. Verwendung der pharmazeutischen Mittel aus den Ansprüchen 1-20 als antiinflammatorisches Therapeutikum.

22. Verwendung der pharmazeutischen Mittel aus den Ansprüchen 1-20 als immunsupressives Therapeutikum.

23. Verwendung der pharmazeutischen Mittel aus den Ansprüchen 1-20 als antiallergisches Therapeutikum.