DE10062889A1 - Labortemperiereinrichtung zur Temperierung auf unterschiedliche Temperaturen - Google Patents

Abstract

Eine Labortemperiereinrichtung zur gemeinsamen Temperierung von Reaktionsproben in mindestens zwei Schritten in jeweils angeordneten bestimmten Temperaturbereichen, welche als Schrittfolge wiederholt nacheinander ausgeführt werden, wobei die Labortemperiereinrichtung in einem beliebig ausgewählten ersten Schritt der Schrittfolge mehrere jeweils wenigstens eine Probe enthaltende erste Gruppen von Proben auf innerhalb der Gruppen gleiche und zwischen den Gruppen unterschiedliche Temperaturen innerhalb des dem ersten Schritt zugeordneten ersten Temperaturbereiches bringt, ist dadurch gekennzeichnet, daß in einem beliebig ausgewählten zweiten Schritt der Schrittfolge, wenn das Reaktionsprodukt bei den beiden Schritten hinsichtlich gleicher Auswertparameter beeinflußt wird, bei mindestens einer der ersten Gruppen wenigstens zwei der Proben verschiedenen zweiten Gruppen angehören, die auf innerhalb der Gruppen gleiche und zwischen den Gruppen unterschiedliche Temperaturen innerhalb des dem zweiten Schritt zugeordneten zweiten Temperaturbereiches gebracht sind, und wobei, wenn die Auswertparameter unterschiedlich sind, wenigstens zwei beliebige der Proben unterschiedlichen dritten Gruppen angehören, die auf innerhalb der Gruppen gleiche und zwischen den Gruppen unterschiedliche Temperaturen innerhalb des dem zweiten Schritt zugeordneten zweiten Temperaturbereiches gebracht sind.

Description

Die Erfindung betrifft eine Labortemperiereinrichtung der im Oberbegriff des Anspruches 1 bzw. des Anspruches 11 genannten Art.

Derartige Einrichtungen werden zum Temperieren von Reaktionsproben verwen­ det, die in Schritten einer Schrittfolge auf Temperaturen in unterschiedlichen Temperaturbereichen gebracht werden. Die Schrittfolge wird in einem Durchlauf zyklisch wiederholt. Solche Einrichtungen eignen sich zur Durchführung spezi­ eller chemischer Reaktionen, insbesondere von Enzymreaktionen. Das Hauptan­ wendungsgebiet ist die PCR (Polymerase Chain Reaction). Dabei werden in dem üblichen dreischrittigen Verfahren der Denaturierungschritt bei zirka 90°C, der Annealingschritt bei zirka 50°C und der Elongationsschritt bei zirka 60°C durch­ laufen.

Ein Problem ist dabei, insbesondere beim Annealingschritt, aber auch bei den anderen Schritten stets die Ermittlung der optimalen Temperatur. Dazu werden Versuche bei unterschiedlichen Temperaturen benötigt.

Um diese Versuche zur Auffindung der optimalen Temperatur eines Schrittes zu vereinfachen, wurden die gattungsgemäßen Labortemperiereinrichtungen entwic­ kelt, wie sie z. B. in US 6 054 263 sowie in DE 196 46 115 A1 beschrieben sind.

Beim gattungsgemäßen Stand der Technik wird in einem der Schritte, zumeist im Annealingschritt mit unterschiedlichen Temperaturen gearbeitet. Bei den anderen Schritten werden gleiche Temperaturen verwendet. Die Reaktionsproben sind nach dem Stand der Technik in einem Flächenarray in Reihen und Spalten ange­ ordnet. In dem Schritt, der unterschiedliche Temperaturen verwendet, wird in einer Richtung des Arrays, also beispielsweise in Richtung der Zeilen ein Tempe­ raturgradient angelegt. Dies führt dazu, das erste Gruppen von Proben von den Spalten gebildet werden, wobei innerhalb der Spalten gleiche Temperaturen, zwi­ schen den Spalten jedoch unterschiedliche Temperaturen anliegen.

Bei der Auswertung der Proben nach abgeschlossenem Temperierungsdurchlauf kann ermittelt werden, in welcher der Spalten das optimale Ergebnis vorliegt. Die zugehörige Temperatur ist dann die optimale Temperatur dieses Schrittes, z. B. des Annealingschritt.

Wird der Temperaturgradient auf den Annealingschritt angewendet und liegt bei diesem der Temperaturbereich z. B. bei 50°-60°C, so kann man z. B. in zehn Spalten die Temperaturen je ein Grad unterschiedlich anlegen und somit die op­ timale Temperatur ermitteln.

Will man auch bei den anderen Schritten der Schrittfolge die Temperaturen opti­ mieren, so muß derselbe Durchlauf wiederholt werden, wobei nun aber der Gra­ dient in einem anderen der Schritte angelegt wird. Will man bei dem üblichen dreischrittigen PCR-Verfahren alle drei Schritte optimieren, so müssen drei komplette Temperierdurchläufe nacheinander durchgeführt werden. Dazu ist ein er­ heblicher Zeitaufwand von zirka 1,5 h pro Durchlauf und ein erheblicher Ver­ brauch an zum Teil extrem teuren Proben erforderlich. Da die optimalen Tempe­ raturen der einzelnen Schritte in unterschiedlichen Durchläufen ermittelt werden, werden eventuelle Wechselwirkungen zwischen den Temperaturen der Schritte nicht berücksichtigt. Dies kann zur Ermittlung nichtoptimaler Temperaturen füh­ ren.

In der DE 196 46 115 A1 ist zu Fig. 5 eine zu Anspruch 11 gattungsgemäße Labortemperiereinrichtung beschrieben, die bei zwei Schritten der Schrittfolge Gradienten in unterschiedlichen Richtungen (X, Y) an das Array der Reaktions­ proben anlegt. Damit ist es möglich, in nur einem Durchlauf in zwei Temperatur­ bereichen die optimale Temperatur zu ermitteln.

Auch bei der letztgenannten Einrichtung ist ein weiter Durchlauf zur Optimie­ rung der dritten Temperatur erforderlich. Bei einer flächigen Arrayanordnung von Reaktionsproben stehen aber nur zwei Richtungen X und Y zur Verfügung. Für eine dritte Temperatur wäre eine dritte Richtung Z erforderlich, die bei einer zweidimensionalen Anordnung nicht vorhanden ist.

Dabei wurde es nach dem Stand der Technik für unabdingbar erforderlich gehal­ ten, Gradienten bei unterschiedlichen Schritten in unterschiedlichen Richtungen anzulegen, also z. B. beim einen Schritt in Richtung der Spalten und beim ande­ ren Schritt in Richtung der Zeilen, um bei der Ermittlung der Reaktionsergebnis­ se, die sich ergebenden Unterschiede eindeutig den Temperaturvariationen im einen Schritt und im andern Schritt zuordnen zu können.

Das Hauptanwendungsgebiet der gattungsgemäßen Labortemperiereinrichtungen liegt auf dem Gebiet der PCR. Diese verwendet üblicherweise drei Schritte. Es wäre sehr vorteilhaft, alle drei Schritte auf einfache Weise in einem einzigen Temperierdurchlauf optimieren zu können. Es sind auch Prozesse mit mehr als drei Schritten bekannt, bei denen dieselben Probleme bestehen. Es ist daher Auf­ gabe der vorliegenden Erfindung, eine Labortemperiereinrichtung zu schaffen, die den Arbeits- und Geräteaufwand bei der Ermittlung der optimalen Tempera­ turen aller Schritte der Schrittfolge verringert.

Diese Aufgabe wird mit den Merkmalen des Anspruches 1 sowie des Anspruches 11 gelöst.

Bei der Lösung des Anspruches 1 geht die Erfindung von der Erkenntnis aus, daß bei den meisten auf gattungsgemäßen Labortemperiereinrichtungen durchführba­ ren Prozessen und insbesondere bei dem üblichen dreischrittigen PCR-Prozess die Temperaturänderungen bei den einzelnen Schritten nicht immer denselben Auswertparameter beeinflussen. Bei dem üblichen PCR-Prozess beeinflussen Temperaturänderungen beim Annealingschritt und beim Elongationsschritt im wesentlichen denselben Parameter, nämlich die Spezifität, also das Verhältnis von korrekt amplifizierten DNA-Strängen der richtigen Länge zu falsch amplifi­ zierten Strängen abweichender Länge. Temperaturänderungen beim Denaturie­ rungschritt beeinflussen aber im wesentlichen einen anderen Parameter nämlich die Ausbeute, also die Menge gewonnenen amplifizierten DNA-Materiales. Diese beiden Parameter sind voneinander unabhängig am Reaktionprodukt bestimmbar. Wenn man beim einfachen Beispiel einer Temperiereinrichtung mit flächig in Zeilen und Spalten angeordneten Reaktionsproben bleibt, legt die Labortempe­ riereinrichtung also bei zwei Schritten, die denselben Parameter beeinflussen (z. B. Annealingschritt und Elongationsschritt), die Gradienten in unterschiedli­ chen Richtungen an und bei zwei Schritten (z. B. Annealingschritt und Denaturie­ rungschritt), die unterschiedliche Parameter beeinflussen, Gradienten in beliebi­ ger Richtung an. Im letztgenannten Fall können die Temperaturgradienten sogar in beiden Schritten derselben Richtungen angelegt werden. Da hierbei die Aus­ wertparameter bei den beiden Schritten unterschiedlich sind und unabhängig be­ stimmbar sind, können die optimalen Temperaturen für beide Schritte getrennt ermittelt werden. Es ergibt sich der enorme Vorteil, daß bei der mit Gradienten in X- und Y-Richtung arbeitenden Konstruktion der DE 196 46 115 A1 entgegen der bisherigen Erwartungen der Fachwelt doch alle drei Schritte des Standard PCR-Prozesses in einem Temperierdurchlauf optimiert werden können. Da die Temperaturen mehrerer Schritte in einem gemeinsamen Durchlauf ermittelt wer­ den, werden auch Wechselwirkungen zwischen den Schritten (Crosstalk) berück­ sichtigt, was z. B. bei Annealingschritt und Elongationsschritt der Fall ist.

Die Erfindung ist nicht auf zweidimensionale Array-Anordnungen der Reakti­ onsproben in Zeilen- und Spaltenausrichtung beschränkt. Die Reaktionsproben können auch in einer dreidimensionalen Anordnung vorgesehen sein. Dann lassen sich drei Schritte in unterschiedlichen Gradientenrichtungen optimieren. Die Er­ findung gibt dann den Vorteil, auch bei mehr als dreischrittigen Schrittfolgen, sofern bei wenigsten einem der Schritte ein unabhängiger Parameter beeinflußt wird, alle Schritte in einem Durchlauf optimieren zu können.

Bei der Optimierung eines Reaktionsprozesses, wie z. B. des PCR-Prozesses, kommt es nicht allein auf die Temperaturoptimierung bei den einzelnen Schritten an, sondern es kann auch erforderlich sein, die Reaktionsproben hinsichtlich an­ derer Parameter z. B. hinsichtlich der Verdünnung zu optimieren. Der Vorteil der Erfindung, Temperaturoptimierungen in mehr Schritten durchführen zu können als unabhängige Richtungen in der Probenanordnung vorhanden sind, bietet auch hierfür eine Lösung. In einer 3-dimensionalen Anordnung können z. B. mehrere Flächen in Ebenen übereinander gelegt werden, in denen Proben unterschiedli­ cher Verdünnung angeordnet sind. Da sich die Verdünnung auf dieselben Aus­ wertparameter auswirken kann, ist es vorteilhaft, die Richtung, in der unterschiedliche Verdünnungen vorliegen, nicht zum Anlegen unterschiedlicher Tem­ peraturen zu verwenden. Daher werden die Temperaturgradienten in den Ebenen angelegt. Es können also in einem Durchlauf alle drei Schritte des PCR-Prozesses hinsichtlich der Temperaturen und auch der Verdünnung optimiert werden.

Die Erfindung ist auch nicht beschränkt auf die übliche Anordnung der Reakti­ onsproben in einem wärmeleitenden Temperierblock, der z. B. an gegenüberlie­ genden Enden beheizt und gekühlt wird und auf diese Weise über den Block hinweg einen Temperaturgradienten erzeugt. Bei Verwendung von Einzeltempe­ riereinrichtungen für alle Reaktionsproben sind beliebige, auch zufällige Anord­ nungen der Reaktionsproben und der einzelnen Gradienten möglich. Es sind dann im ersten Schritt erste Gruppen von Reaktionsproben entsprechend zu temperie­ ren und im zweiten Schritt zweite Gruppen von Reaktionsproben entsprechend der Vorschrift des Anspruch 1 zu temperieren. Diese Gruppen können bei belie­ biger Anordnung der Reaktionsproben und/oder der Temperaturschritte zufällig über die Probenanordnung verteilt sein. Bei heutiger Computertechnik stellt die sich ergebende komplizierte Verknüpfung der Proben zu ersten und zweiten Gruppen kein Problem dar.

Sind die Auswertparameter zumindest weitgehend voneinander unabhängig, was wie erwähnt beim üblichen PCR-Prozeß z. B. bei dem Annealingschritt und dem Denaturierungsschritt der Fall ist, dann können, wie bereits erwähnt, die Proben der dritten Gruppen völlig beliebig gewählt werden, weil auf die Gruppenzu­ sammenstellung bei den anderen Schritten wegen der unabhängigen Parameter­ auswertung keine Rücksicht genommen werden muß.

Vorteilhaft sind dann die Merkmale des Anspruches 2 vorgesehen. Hierbei kön­ nen für die dritte Gruppenbildung das Schema der Gruppenbildung für die ersten Gruppen verwendet werden. Das vereinfacht die Temperiereinrichtung erheblich.

Bei dem bereits erwähnten Standardanwendungsfall einer flächigen Array­ anordung in Zeilen und Spalten können also z. B. die ersten Gruppen aus Zeilen bestehen und die dritten wiederum ebenfalls aus Zeilen. Es kann also für den zweiten Schritt die Ansteuerungsgeometrie des ersten Schrittes übernommen werden. Wird mit einem Temperaturgradienten in einem wärmeleitfähigem Block gearbeitet, so kann die Richtung des Gradient des zweiten Schrittes mit der des Gradienten des ersten Schrittes parallel oder antiparallel zusammenfallen. Unter anderem bedeutet dies, daß bei einer einfachen Labortemperiereinrichtung, die einen Gradienten in nur einer Richtung erzeugen kann, dennoch bei einem zwei­ schrittigen Verfahren beide Schritte optimiert werden können, sofern bei diesen beiden Schritten die Auswertparameter unterschiedlich sind.

Nach der Erfindung ist es ganz allgemein nur erforderlich, daß bei mindestens einer der ersten Gruppen wenigsten zwei der Proben verschiedenen zweiten Gruppen angehören. Damit lassen sich sehr einfache grob gerasterte Optimierun­ gen durchführen, die z. B. nur zwei unterschiedliche Temperaturen pro Schritt untersuchen. Vorteilhaft sind jedoch die Merkmale des Anspruches 3 vorgesehen, wonach z. B. auch bei größeren Gruppen jeweils alle Proben der zweiten Grup­ pen zu unterschiedlichen ersten Gruppen gehören. Bei einem flächigen Array mit Zeilen und Spalten würde dies bedeuten, daß z. B. im ersten Schritt die Tempe­ raturen zwischen den Spalten unterschiedliche sind und im zweiten Schritt zwi­ schen den Zeilen unterschiedlich sind, also alle Proben einer Spalte in unter­ schiedlichen Zeilen (zweiten Gruppen) liegen.

Wie bereits erwähnt, läßt sich die Erfindung auch mit sehr komplexer Anordnung der Reaktionsproben ausführen. Vorteilhaft sind jedoch die Merkmale des An­ spruches 4 vorgesehen. Dies erlaubt die Ausbildung der erfindungsgemäßen Labortemperiereinrichtung in üblicher Standardbauweise, wie z. B. aus einer der eingangs genannten Schriften bekannt. Vorteilhaft sind dabei auch die Merkmale des Anspruches 5 vorgesehen, wird also die übliche übersichtliche orthogonale Anordnung verwendet, die den Vorteil hat, daß von den orthogonalen Kanten eines Blockes her Gradienten in Zeilen- und Spaltenrichtung erzeugt werden können. Dann sind vorteilhaft die Gruppen gemäß Anspruch 6 den Zeilen und Spalten zugeordnet.

Gattungsgemäße Labortemperiereinrichtungen dienen nicht nur der Optimierung der Temperaturen der einzelnen Schritte, sondern sind insbesondere auch nach Ermittlung der optimalen Temperaturen zur Massenverarbeitung von Proben vor­ gesehen. Sie nehmen daher eine sehr große Zahl von Reaktionsproben auf, z. B. 384 Proben in 24 Spalten und 16 Zeilen.

Dabei sind vorteilhaft die Merkmale des Anspruches 7 vorgesehen. Wenn hier­ nach z. B. nur eine der ersten Gruppen mehrere Proben enthält, und auch nur eine der zweiten Gruppen mehrere Proben enthält, ergibt sich im Falle der Anordnung in einem zweidimensionalen Array mit Zeilen und Spalten z. B. nur bei einer Zeile und nur einer Spalte eine vollständige Besetzung mit Proben, also pro Richtung nur eine besetzte Reihe. Werden bei den Schritten Gradienten in Zei­ len- und Spaltenrichtung angelegt, so kann die Temperaturoptimierung mit sehr wenigen Proben, also mit sehr sparsamem Verbrauch der teuren Proben erfolgen. Dabei kann die Labortemperiereinrichtung durchaus zur Aufnahme einer sehr großen Probenzahl, z. B. 384 Proben ausgebildet sein. Die übrigen Probenplätze bleiben unbesetzt. Es kann jedoch auch ein Spezialgerät verwendet werden, das nur eine Probenspalte und ein Probenzeile aufweist und das speziell nur zur Op­ timierung vorgesehen ist und nicht für den Massendurchsatz. Selbstverständlich können pro Richtung auch mehr als eine besetzte Reihe verwendet werden, z. B. zwei parallele Reihen direkt nebeneinander oder auch im Abstand.

Dabei sind vorteilhaft die Merkmale des Anspruches 8 vorgesehen. Durch dieses Merkmal ist sichergestellt, daß jede Gruppe bei Schritten, bei denen ihre Proben auf gleicher Temperatur liegen, im mittleren Bereich des zugeordneten Tempe­ raturbereiches liegen. Es wird also z. B. beim Annealingschritt mit unterschiedli­ chen Temperaturen nach der optimalen Temperatur gesucht. Bei den anderen Schritten werden aber die mittleren Temperaturen des Temperaturbereiches ver­ wendet, um aussagekräftige Ergebnisse zu gewährleisten.

Wenn bei zwei Schritten unterschiedliche Auswertparameter beeinflußt werden, die ausgewerteten Ergebnisse also unabhängig sind, so können die dritten Grup­ pen beliebig gewählt werden. Sie können auch gemäß Anspruch 2 mit den ersten Gruppen zusammenfallen. Vorteilhaft können Sie auch gemäß Anspruch 9 ge­ wählt werden. Danach sind die dritten Gruppen bei einer zweidimensionalen Ar­ ray Anordnung der Reaktionsproben in zusammenhängende Flächen unterteilt, die nur mit jeweils Proben einer Gruppe besetzt sind. Dies ermöglicht eine be­ sonders einfache Auswertung. Bei einer Anordnung der Proben in der Tempe­ riereinrichtung in Zeilen und Spalten können die dritten Gruppen also abwei­ chend von den Zeilen und Spalten in Flächen, z. B. in vier Sektoren, angeordnet sein, vorausgesetzt, daß die Temperiereinrichtung ihrer Bauart nach dies zuläßt. Bei Einzeltemperierung der Reaktionsproben können die den dritten Gruppen zugeordneten Flächen beliebig gewählt werden. Man kann beispielsweise aus thermischen Gründen wärmere Gruppen in das Innere des Arrays und kältere Gruppen zum Rand hin legen.

Die Erfindung kann bei mehrschrittigen Schrittfolgen nur auf wenige der Schritte, z. B. auf zwei von drei Schritten angewendet werden, wobei dann der dritte Schritt ohne Temperaturoptimierung mit gleicher Temperatur aller Reaktionspro­ ben durchgeführt wird. Vorteilhaft sind jedoch die Merkmale des Anspruches 10 vorgesehen. Wie bereits erwähnt stellt die Temperaturoptimierung bei allen Schritten eines Prozesses einen erheblichen Vorteil dar.

Bei der Erfindung gemäß Anspruch 11 werden Reaktionsproben ersten, zweiten und dritten Gruppen zugeordnet, die jeweils für einen der Schritte in dem zuge­ hörigen Temperaturbereich zwischen den Gruppen unterschiedliche Temperatu­ ren, innerhalb der Gruppen jedoch gleiche Temperaturen aufweisen. Hiermit kann bei jedem Schritt in unterschiedlicher Gruppenaufteilung mit unterschiedli­ chen Temperaturen gearbeitet werden. In einem Durchlauf können somit bei allen drei Schritten des üblichen PCR-Prozesses die optimalen Temperaturen ermittelt werden.

Die Proben können 3-dimensional angeordnet sein, wodurch sich drei Dimensio­ nen, also bei regelmäßiger Anordnung z. B. Spalten, Zeilen und Ebenen ausbil­ den, nach denen in übersichtlicher Weise gruppiert werden kann. Wie bereits oben zu Anspruch 1 erwähnt, sind auch unregelmäßige 3-dimensionale Anord­ nungen mit entsprechend komplizierterer Gruppenunterteilung möglich, wenn Einzelheizungen der Reaktionsproben vorgesehen sind.

Vorteilhaft sind die Merkmale des Anspruches 12 vorgesehen. Bei dieser sehr einfachen Anordnung mit Temperaturgradienten in X-, Y- und Z-Richtung kann in einem üblichen wärmeleitenden Block gearbeitet werden, in dem die Reakti­ onsproben angeordnet sind. Gegenüber der bekannten Anordnung muß hier aller­ dings der Temperierblock 3-dimensional und beheizbar ausgebildet sein.

Vorteilhaft sind auch die Merkmale des Anspruches 13, wonach die Reaktions­ proben in einer Fläche angeordnet sind. Es können beispielsweise Teilflächen, die die übliche X-Y-Anordnung von Proben aufweisen und die den Ebenen einer 3-dimensionalen Anordnung entsprechen, zu mehreren z. B. nebeneinander in einer Fläche angeordnet sein. In dem die Labortemperiereinrichtung steuernden Computer kann zu Darstellungszwecken die etwas unübersichtliche 2- dimensionale Anordnung in die mit drei Koordinaten wohlgeordnete 3- dimensionale Anordnung umgerechnet werden.

Vorteilhaft sind die Merkmale des Anspruches 14 vorgesehen. In zwei Schritten werden jeweils in Teilflächen Gradienten entgegengesetzter Richtung angelegt, wobei sich die Teilflächen der beiden Schritte in Quadranten überlappen. Im dritten Schritt werden die gebildeten Quadranten auf unterschiedliche Temperatu­ ren gebracht. Auf diese Weise ist es ebenfalls sehr einfach möglich, in einer flä­ chigen Anordnung von Reaktionsproben in drei Schritten die Temperatur für alle Schritte in einem Durchgang zu optimieren.

Die Merkmale der Ansprüche 1 bis 10 sowie 11 bis 14 können in vorteilhafter Weise auch kombiniert werden.

In den Zeichnungen ist die Erfindung beispielsweise und schematisch dargestellt. Es zeigen:

Fig. 1 eine stark schematisierte erfindungsgemäße Labortemperiereinrich­ tung in Draufsicht auf ein nach Zeilen und Spalten geordnetes zwei­ dimensionales Array von Reaktionsproben mit einem in X-Richtung angelegten Temperaturgradienten für den Annealingschritt eines Standard PCR-Prozesses,

Fig. 2 die Ansicht nach Fig. 1 für den Elongationsschritt mit einem Tempe­ raturgradient in Y-Richtung,

Fig. 3 eine Ansicht nach Fig. 1 für den Denaturierungsschritt mit einem Temperaturgradienten ebenfalls in Y-Richtung,

Fig. 4 eine Ansicht nach Fig. 1 für den Denaturierungsschritt mit einer Aufteilung des Arrays in drei flächig gestaltete Gruppen,

Fig. 5 die schematische Darstellung eines nach Zeilen und Spalten geord­ neten Arrays von Reaktionsproben, die ersten Gruppen (Zahlen) und zweiten Gruppen (Buchstaben) zugeordnet sind,

Fig. 6 eine Darstellung entsprechend Fig. 5 mit anderer Anordnung der Re­ aktionsproben,

Fig. 7 eine stark schematisierte erfindungsgemäße Labortemperiereinrich­ tung mit 3-dimensionaler Anordnung von Reaktionsproben, wobei drei Ebenen der 3-dimensionalen Anordnung in der Figur übereinan­ der dargestellt sind,

Fig. 8 die Darstellung einer Anordnung der Proben der Ausführungsform der Fig. 7 in einem Flächenarray und

Fig. 9-11 zeigen eine weitere Ausführungsform der Labortemperiereinrichtung mit den jeweils eingestellten Temperaturen bei drei Schritten.

Fig. 1 zeigt eine Draufsicht auf ein Array von insgesamt 35 Reaktionsproben 1, die in einem zweidimensionalen Array in orthogonalen Zeilen und Spalten ange­ ordnet sind. Das Feld ist mit einem gestrichelt dargestellten Rand 2 umgrenzt. Es kann sich beispielsweise um einen üblichen, mit dem Rand 2 begrenzten Tempe­ rierblock 3 handeln, wie er z. B. in der DE 196 46 115 A1 zu Fig. 5 erläutert ist, mit der Möglichkeit, in Richtung der Zeilen oder in Richtung der Spalten einen Temperaturgradienten anzulegen. Zu den technischen Einzelheiten dazu wird auf die genannte Schrift ausdrücklich Bezug genommen.

In Fig. 1 ist die dargestellte Labortemperiereinrichtung zur Ausführung des An­ nealingschrittes des Standard PCR-Prozesses betrieben. Es ist in X-Richtung der mit in Zeilenrichtung laufendem Pfeil dargestellte Temperaturgradient angelegt, der dafür sorgt, daß alle Reaktionsproben 1 der ersten Spalte auf 40° liegen, alle Proben der letzten Spalte auf 60° und die der mittleren Spalte auf 50°. Die übri­ gen Spalten weisen dazwischen liegende Temperaturen auf.

Die dargestellten Reaktionsproben 1 sind somit in ersten Gruppen unterschiedlich temperiert, wobei die ersten Gruppen den Spalten der dargestellten Anordnung entsprechen. Innerhalb jeder ersten Gruppe (Spalte) weisen alle Reaktionsproben 1 gleiche Temperatur auf, zwischen den Spalten herrschen unterschiedliche Tem­ peraturen.

Fig. 2 zeigt die Temperiereinrichtung der Fig. 1 beim Elongationsschritt. Hier ist mit geeigneten, nicht dargestellten Einrichtungen ein Temperaturgradient im Sin­ ne des dargestellten Pfeiles in Y-Richtung angelegt. Die unterste Zeile liegt auf 70°, die oberste Zeile auf 76°. Die Zwischenzeilen haben entsprechende Zwi­ schentemperaturen. Hier sind also die Reaktionsproben in zweiten Gruppen auf unterschiedlichen Temperaturen gehalten, wobei die zweiten Gruppen den Zeilen entsprechen. Aus Vergleich der Fig. 1 und 2 ist ersichtlich, daß bei den bei­ den in Fig. 1 und 2 dargestellten Schritten jeweils alle Proben einer ersten Grup­ pe (Spalte) unterschiedlichen zweiten Gruppen (Zeilen) angehören und umge­ kehrt. In der flächigen Darstellung bedeutet dies, daß die Gruppen und ebenso die Temperaturgradienten orthogonal zueinander stehen.

Fig. 3 zeigt dieselbe Temperiereinrichtung bei der Ausführung eines dritten Schrittes, nämlich des Denaturierungsschrittes. Auch dieser Schritt soll auf die günstigste Temperatur optimiert werden und zwar in einem Temperaturbereich, der im dargestellten Beispiel bei 90°-96° liegt. Der Temperaturgradient wird hier in Y-Richtung angelegt.

Die drei Schritte Annealing, Elongation und Denaturierung bilden eine Schritt­ folge, die mehrfach wiederholt wird zur exponentiellen Amplifizierung.

Wie die Fig. 1-3 zeigen, wird bei allen Schritten in dem jeweils dem Schritt zugeordneten Temperaturbereich die Temperatur variiert. Gemäß Fig. 1 sind un­ terschiedliche erste Gruppen (Spalten) auf unterschiedlichen Temperaturen zwi­ schen 40°-60° gehalten. Gemäß Fig. 2 sind zweite Gruppen (Zeilen) auf unter­ schiedlichen Temperaturen im Temperaturbereich zwischen 70°-76° gehalten. Gemäß Fig. 3, beim Denaturierungsschritt, sind unterschiedliche dritte Gruppen (wiederum Zeilen) auf unterschiedlichen Temperaturen zwischen 90°-96° gehal­ ten. Bei allen drei Schritten werden unterschiedliche Temperaturen angelegt. Durch Auswertung des Reaktionsergebnisses nach abgeschlossenem Durchlauf kann ermittelt werden, welche Temperatur in welchem Schritt optimal ist. Das Reaktionsergebnis kann auch während des Durchlaufes laufend verfolgt werden (Onlinemonitoring).

Diese Auswertung stellt bei den beiden Schritten gemäß Fig. 1 und Fig. 2 kein Problem dar, da die Gradienten in X- und Y-Richtung, also orthogonal zueinan­ der stehen. Man braucht nur auszuwerten in welcher Reaktionsprobe das beste Ergebnis vorliegt und kann dann nach Zeile und Spalte ersehen, welches die be­ ste Annealingtemperatur (Fig. 1) und welches die beste Elongationstemperatur (Fig. 2) ist. Bei dem Denaturierungsschritt gemäß Fig. 3 fallen die dort unter­ schiedlich temperierten dritten Gruppen mit den in Fig. 2 unterschiedlich temperierten zweiten Gruppen zusammen. Bei beiden Gruppen handelt es sich um Zeilen.

Unterschiedliche Annealingtemperaturen beeinflussen im wesentlichen die Spezi­ fität des Reaktionsergebnisses. Mit Spezifität wird das Verhältnis der korrekt amplifizierten DNA-Stücke mit korrekter Länge zu nicht korrekt amplifizierten DNA-Stücken abweichender Länge bezeichnet. Die Elongationstemperatur beein­ flußt im wesentlichen denselben Auswertparameter, nämlich die Spezifität. Die Denaturierungstemperatur im Schritt gemäß Fig. 3 beeinflußt jedoch im wesentli­ chen die Ausbeute, also die Menge des erhaltenen Reaktionsmateriales.

Die Temperiereinrichtung ist daher so ausgebildet, daß sie bei den beiden Schrit­ ten Annealing (Fig. 1) und Elongation (Fig. 2), die den selben Auswertparameter beeinflussen, die Temperaturgradienten in unabhängiger Richtung X und Y an­ legt. Bei dem Schritt gemäß Fig. 3 (Denaturierung), der einen abweichenden Auswertparameter nämlich die Ausbeute beeinflußt, kann der Temperaturgradient in beliebiger Richtung gelegt werden. In dem in Fig. 3 dargestellten Ausführungs­ fall liegt er in Y-Richtung. Er kann jedoch auch in X-Richtung liegen.

Fig. 4 zeigt in einer Ausführungsvariante die Einrichtung der Fig. 1-3 beim De­ naturierungsschritt, also im Temperaturbereich zwischen 90°-96°. Die dritten Gruppen unterschiedlicher Temperatur sind hier jedoch nicht zeilenweise oder spaltenweise angeordnet, sondern in Form der drei dargestellten Flächenbereiche, die auf den drei Temperaturen 90°, 93° und 96° liegen. Die Flächenbereiche sind durch die dargestellten Bereichsgrenzen unterteilt.

Die Ausführungsform der Fig. 4 setzt eine etwas andere Konstruktion voraus. Ein gut wärmeleitender Block, der sich zur Anlegung von Temperaturgradienten in X- und Y-Richtung eignet, wie er für die Ausführungsform der Fig. 1-3 verwendbar ist, wäre zur Ausbildung gut abgegrenzter in sich gleichmäßig tempe­ rierter Flächen gemäß Fig. 4 nur schlecht geeignet. Sonderkonstruktionen können dies jedoch leisten, insbesondere Einrichtungen mit individueller Temperierung der einzelnen Reaktionsproben 1. Eine solche Konstruktion der Labortempe­ riereinrichtung kann dann selbstverständlich auch die in den Fig. 1-3 darge­ stellten Temperaturgradienten erzeugen.

Die Erfindung ist nicht beschränkt auf die in den Fig. 1-4 dargestellte Aus­ führungsform.

Fig. 5 zeigt noch einmal stark schematisiert eine flächige Arrayanordnung von Reaktionsproben, die in Zeilen und Spalten angeordnet sind. Jede Reaktionsprobe ist mit einer Zahl/Buchstabe-Kombination dargestellt. Dabei bedeuten die Zahlen die Spalten und die Buchstaben die Zeilen. Eine Reaktionsprobe in der zweiten Zeile und in der dritten Spalte ist also mit 3b dargestellt.

Fig. 6 zeigt dieselben Reaktionsproben, die in Fig. 5 dargestellt sind, jedoch in einer anderen, z. B. zufälligen Anordnung. Auch mit einer solchen Anordnung, die allerdings Einzeltemperierung der Reaktionsproben voraussetzt, kann eine Labortemperiereinrichtung erfindungsgemäß arbeiten. Sie muß z. B. mit Compu­ terunterstützung erste Gruppen (z. B. die Zahlen 1-4) ermitteln und bei einem ersten Schritt unterschiedlich aber in sich gleich temperieren und sie muß in ei­ nem zweiten Schritt zweite Gruppen (Buchstaben) gruppenweise unterschiedlich aber mit in sich gleichen Temperaturen temperieren. Wenn bei den beiden Schritten die Auswertparameter unterschiedlich sind, kann sie in den beiden Schritten beliebige Gruppen bilden und entsprechend temperieren.

In den dargestellten Ausführungsformen sind die Reaktionsproben in flächigen Arrays in Zeilen- und Spaltenanordnung sortiert. Dies erleichtert insbesondere die Verwendung herkömmlicher Temperierblocks, die nur zur Ausbildung von Temperaturgradienten in orthogonaler Richtung und zwar in Richtung der Spal­ ten bzw. Zeilen geeignet sind. Bei anderer Ausbildung der Einrichtung, insbe­ sondere, wenn diese mit Einzeltemperierung für die einzelnen Reaktionsproben ausgerüstet ist, können auch völlig willkürliche Anordnungen abweichend vom Zeilen- und Spaltenmuster gewählt werden.

Die Erfindung ist nicht auf Einrichtungen mit zweidimensionaler Anordnung der Reaktionsproben beschränkt. Die Reaktionsproben können auch dreidimensional angeordnet sein, z. B. in einem dreidimensionalen Gitter. Dann lassen sich drei Schritte gleichzeitig hinsichtlich ihrer Temperatur optimieren, die alle drei den­ selben Auswertparameter beeinflussen. Handelt es sich um einen Temperierungs­ prozeß, der mehr als drei Schritte aufweist, so können bei zusätzlichen Schritten die bereits verwendeten Richtungen erneut verwendet werden, sofern die Aus­ wertparameter unabhängig sind. Die erwähnte dreidimensionale Anordnung kann bei Einzelheizung der Proben auch, wie am zweidimensionalen Beispiel in den Fig. 5 und 6 erläutert, umsortiert werden. Dabei ist auch eine Anordnung in einer Ebene möglich, auf die die dreidimensionale Anordnung abgebildet ist.

Im Ausführungsbeispiel der Fig. 1 bis 3 ist ein Array von Proben 1 darge­ stellt, das 5 Zeilen und 7 Spalten ausbildet, also insgesamt 35 Proben aufweist. Um in einem Durchlauf die optimalen Temperaturen für die drei Schritte zu er­ mitteln, müssen somit 35 teure Proben eingesetzt werden.

Es ist eine Einsparung möglich, indem, wie in den Fig. 1 bis 3 dargestellt, nur eine Spalte und nur eine Zeile mit Proben besetzt wird. In den Fig. 1 bis 3 ist dies durch Unterstreichung der Proben in der 5. Spalte und in der 4. Zeile darge­ stellt.

Die sich ergebende Kreuzanordnung ermöglicht, die Auswirkung der angelegten Temperaturgradienten sowohl in X-Richtung als auch in Y-Richtung jeweils an einer Reihe von Proben zu ermitteln. Die nicht besetzten Probenplätze können leer bleiben. Die Labortemperatureinrichtung kann auch in Spezialausführung nur zu Zwecken der Temperaturoptimierung ausgebildet sein und dann nur die in den Fig. 1 bis 3 unterstrichen dargestellten Probenplätze aufweisen.

Fig. 7 zeigt eine weitere Ausführungsform einer Labortemperiereinrichtung, bei der die Reaktionsproben in einer orthogonal geordneten 3-dimensionalen Anord­ nung mit sechs Spalten, vier Zeilen und drei Ebenen angeordnet sind. Die drei Ebenen, die tatsächlich übereinander liegen, sind in Fig. 7 nebeneinander darge­ stellt, um die Übersicht zu vereinfachen. An den Plätzen der dargestellten Anord­ nung sind Reaktionsproben vorgesehen, die in Fig. 7 mit dreistelligen Zahlen dargestellt sind. Dabei bedeutet jeweils die erste Ziffer die Spalte, die zweite Zif­ fer die Zeile und die dritte Ziffer die Ebene. In der in Fig. 7 ganz unten liegen­ den Ebene enden daher alle Zahlen mit 3, weil dies die dritte Ebene ist.

Im Ausführungsbeispiel sind die Proben in einem 3-dimensionalen Block aus wärmeleitfähigem Material angeordnet. Nach aus dem Stand der Technik be­ kannter Weise können an diesem Block Gradienten in X-Richtung, Y-Richtung oder Z-Richtung angelegt werden. Wird ein Gradient in X-Richtung angelegt, so liegen Proben mit niedriger Spaltenzahl auf niedrigerer und Proben mit höherer Spaltenzahl auf höherer Temperatur. Wird der Gradient in Y-Richtung angelegt, so liegt er quer zu den Zeilen, bringt also diese auf unterschiedliche Temperatu­ ren. Liegt der Gradient in Z-Richtung an, so werden die Ebenen auf unterschied­ liche Temperatur gebracht. Dabei liegen jeweils die Zeilen, Spalten oder Ebenen, die quer zum jeweils angelegten Gradienten stehen, auf gleicher Temperatur.

Bei einem Prozeß mit einer dreischrittigen Schrittfolge können mit der darge­ stellten Labortemperiereinrichtung mit zyklisch wiederholter Schrittfolge, z. B. immer wieder im ersten Schritt ein Gradient in X-Richtung, in jedem zweiten Schritt ein Gradient in Y-Richtung und in jedem dritten Schritt ein Gradient in Z- Richtung angelegt werden.

Die in Fig. 7 dargestellt 3-dimensionale Anordnung mit orthogonal geordneter Anordnung der Reaktionsproben zeichnet sich durch gute Übersichtlichkeit aus. Werden die Proben nicht in einen wärmeleitfähigen Block sondern mit Einzelhei­ zung temperiert, so können auch abweichende 3-dimensionale Anordnungen verwendet werden, bei denen die Proben z. B. beliebig vertauscht angeordnet sind, analog zur Vertauschung zwischen den Fig. 5 und 6.

Fig. 8 zeigt eine Ausführungsvariante, bei der alle in Fig. 7 dargestellten Pro­ ben in dem dargestellten flächigen Array angeordnet sind. Man kann erkennen, daß hier die in Fig. 7 einzeln dargestellten drei Ebenen nebeneinander in einer Fläche angeordnet sind, und zwar in den ersten sechs Spalten übereinander die obere und mittlere Fläche gemäß Fig. 7 und in der 7 und 8 Spalte die unterste Fläche der Fig. 7 in Umordnung. Mit Einzelheizung der Reaktionsproben oder z. B. geeigneter Unterteilung größerer, nicht dargestellter Heizeinrichtungen kön­ nen an die Proben der Anordnung gemäß Fig. 8 schrittweise dieselben Gra­ dienten angelegt werden, wie zur Ausführungsform der Fig. 7 erläutert.

Die Fig. 9 bis 11 zeigen eine weitere Ausführungsform der Labortempe­ riereinrichtung in drei Schritten einer dreischrittigen Schrittfolge. Dabei zeigt Fig. 9 den Annealingschritt, Fig. 10 den Elongationsschritt und Fig. 11 den Denaturierungsschritt. Die in den Figuren angegebenen Temperaturen entspre­ chen den zugehörigen Temperaturbereichen, die anhand der Fig. 1 bis 4 be­ reits erläutert wurden.

In allen drei Fig. 9 bis 11 ist dieselbe flächige Arrayanordnung von Reakti­ onsproben, jeweils mit Kreisen angedeutet, dargestellt. Im Ausführungsbeispiel sind die Reaktionsproben in sechs Spalten und vier Zeilen in orthogonaler Aus­ richtung angeordnet.

Beim Annealingschritt der Fig. 9 ist die Arrayfläche mit einer lotrecht stehen­ den ersten Mittellinie in zwei erste Teilflächen (links bzw. rechts der Mittellinie) unterteilt. In den beiden so gebildeten Teilflächen sind die mit Pfeilen darge­ stellten Temperaturgradienten angelegt, die zu der mit den Zahlen angegebenen Temperaturverteilung führen. Die rechts und links außen liegenden Spalten liegen auf 40°, die nahe der ersten Mittellinie liegenden Spalten liegen auf 60°. Es handelt sich also um gleiche Gradienten jedoch mit umgekehrter Richtung.

Beim Elongationsschritt der Fig. 10 wird eine entsprechende Temperaturvertei­ lung jedoch innerhalb des für den Elongationsschritt benötigten Temperaturberei­ ches von 70° bis 76° angelegt. Hier liegt allerdings die zweite Mittellinie senk­ recht zur ersten Mittellinie, also waagerecht. Es sind wiederum gegenläufige gleiche Gradienten in den so gebildeten zweiten Teilflächen angelegt.

Fig. 11 zeigt den Denaturierungsschritt. Bei diesem wird in den aus den beiden aus Fig. 9 und 10 ersichtlichen Mittellinien gebildeten vier Quadranten jeweils unterschiedliche Temperatur von 90° bis 96° angelegt, also im Temperaturbe­ reich der für die Denaturierung erforderlich ist.

Betrachtet man die unterstrichen gekennzeichnete Reaktionsprobe die in Spalte 5, Zeile 2 liegt, und verfolgt man diese durch die drei in den Fig. 9, 10 und 11 dargestellten Schritte, so erkennt man, daß diese Probe eindeutig hinsichtlich der optimalen Temperaturen in den drei Schritten identifiziert werden kann. Sie benötigt für den Annealingschritt gemäß Fig. 9 etwa 50°, für den Elongations­ schritt gemäß Fig. 10 etwa 75° und für den Denaturierungsschritt gemäß Fig. 11 etwa 92°.

Läge die optimale Temperatur bei dem Schritt gemäß Fig. 9 bei 50, gemäß Fig. 10 bei 75°, gemäß Fig. 11 jedoch anders, und zwar beispielsweise bei 96°, so läge die Probe, für die alle drei Temperaturen optimal sind, in der zweiten Spalte und der dritten Zeile. Es ist zu beachten, daß, wenn in Fig. 9 die optimale Tempe­ ratur wie erwähnt bei 50° liegt, dann sowohl in der fünften Zeile als auch in der zweiten Zeile die optimale Temperatur herrscht. Beim gewählten Beispiel der Fig. 10 liegt die optimale Temperatur in der zweiten Zeile und auch in der dritten Zeile.

Es wird nur angemerkt, daß in den Fig. 9 bis 11 eine sehr kleine Arrayfläche mit wenigen Reaktionsproben dargestellt ist, um die zeichnerische Darstellung zu erleichtern. Dadurch ergibt sich beim Elongationsschritt in Fig. 10 für die Re­ aktionsproben nur eine Differenzierung in zwei Temperaturen. Wird die Anzahl der Zeilen und Spalten deutlich erhöht, so lassen sich wesentlich feinere Tempe­ raturunterschiede auswerten.

Wird anstelle der in den Fig. 9 bis 11 dargestellten Arrayfläche mit 24 Proben in sechs Spalten und vier Zeilen die übliche, wesentlich größere Anzahl von 384 Proben in vierundzwanzig Spalten und sechzehn Zeilen verwendet und wird, wie in den Fig. 9 bis 11 dargestellt, mit Teilflächen in Form von Quadranten ge­ arbeitet, so ergeben sich vier Quadranten mit je zwölf Spalten und acht Zeilen. Sollen Temperaturübergangsprobleme im Bereich der Mittellinien zwischen den Quadranten vermieden werden, so können beispielsweise jeweils die beiden den Mittellinien in jedem Quadranten benachbarten Zeilen bzw. Spalten frei gelassen werden. Es verbleiben dann noch in den vier Ecken des Arrays angeordnete, mit Proben besetzte Bereiche, die jeweils in zehn Spalten und sechs Zeilen sechzig Proben aufnehmen und in denen mit hoher Temperaturauflösung die optimale Temperatur gesucht werden kann.

Wird bei einer solchen Labortemperiereinrichtung mit einem durchgehend wär­ meleitfähigen Temperierblock nach Art der Konstruktion gearbeitet, die in der DE 196 46 115 C2 in den Fig. 1 bis 3 dargestellt ist, dann kann der Tempe­ rierblock z. B. an seiner den Proben abgewandten Unterseite mit neun Peltiere­ lementen in 3 × 3 Anordnung großflächig besetzt sein. Dabei liegen in beiden Richtungen die mittleren Peltierelemente unter den Mittellinien und beheizen jeweils vom Rand her zwei benachbarte Quadranten. Mit dieser Anordnung läßt sich in unterschiedlicher Strombeaufschlagung der Peltierelemente abwechselnd die Gradiententemperierung nach Fig. 9 und nach Fig. 10 erzielen. Zur Erzeu­ gung der quadrantenweise unterschiedlichen Beheizung gemäß Fig. 11 könnte die Unterseite des Temperieblockes zusätzlich mit die Quadranten bedeckenden Heizfolien versehen sein, die bei dem Schritt gemäß Fig. 11 und bei ausgeschal­ teten Peltierelementen die Quadranten einzeln auf die gewünschte Temperatur bringen.

Anders als bei der in den Fig. 9 bis 11 dargestellten Ausführungsform können die Gradienten auch in anderer Weise angelegt werden. Gemäß Darstellung in Fig. 9 werden der rechte obere und der rechte untere Quadrant mit dem selben Gra­ dienten in der selben Richtung beaufschlagt. Der Gradient könnte in diesen bei­ den Quadranten auch mit entgegengesetzter Richtung angelegt sein. Dasselbe gilt auch für die Quadranten links oben und unten. Es kann z. B. im linken oberen Quadranten der Gradient mit Pfeil nach links und links unten der Gradient mit Pfeil nach rechts angelegt sein. Diese Überlegung gilt auch für die Fig. 10.

Allgemein gilt für diese Ausführungsform, daß in den vier durch die Quadranten gebildeten Teilflächen jeweils im ersten und zweiten Schritt Gradienten in ver­ schieden Richtungen angelegt sind und im dritten Schritt (Fig. 11) jeweils alle Proben einer Teilfläche auf gleicher Temperatur liegen. Werden im dritten Schritt nicht, wie in Fig. 11 dargestellt, vier sondern z. B. sechs unterschiedliche Tempe­ raturen benötigt, so sind dementsprechend sechs auf die vorbeschriebene Weise zu behandelnde Teilflächen erforderlich.

In jeder Teilfläche liegt im dritten Schritt eine andere Temperatur an, und werden in den beiden anderen Schritten Gradienten über jede Teilfläche angelegt. Da es für jede Kombination der unterschiedlichen Temperaturen der unterschiedlichen Schritte eine Probe gibt, die mit dieser Temperaturkombination behandelt wurde, werden mit dieser Anordnung auch alle Wechselwirkungen zwischen den Schrit­ ten berücksichtigt.

Claims (14)

1. Labortemperiereinrichtung zur gemeinsamen Temperierung von Reakti­ onsproben in mindestens zwei Schritten in jeweils zugeordneten be­ stimmten Temperaturbereichen, welche als Schrittfolge wiederholt nach­ einander ausgeführt werden, wobei die Labortemperiereinrichtung in ei­ nem beliebig ausgewählten ersten Schritt der Schrittfolge mehrere jeweils wenigstens eine Probe enthaltende erste Gruppen von Proben auf inner­ halb der Gruppen gleiche und zwischen den Gruppen unterschiedliche Temperaturen innerhalb des dem ersten Schritt zugeordneten ersten Tem­ peraturbereiches bringt, dadurch gekennzeichnet, daß in einem beliebig ausgewählten zweiten Schritt der Schrittfolge, wenn das Reaktionsprodukt bei den beiden Schritten hinsichtlich gleicher Auswertparameter beeinflußt wird, bei mindestens einer der ersten Gruppen wenigstens zwei der Proben verschiedenen zweiten Gruppen angehören, die auf innerhalb der Gruppen gleiche und zwischen den Gruppen unterschiedliche Temperaturen innerhalb des dem zweiten Schritt zugeordneten zweiten Temperaturbereiches gebracht sind, und wobei, wenn die Auswertparameter unterschiedlich sind, wenigstens zwei beliebige der Proben unterschiedlichen dritten Gruppen angehören, die auf innerhalb der Gruppen gleiche und zwischen den Gruppen unterschiedliche Temperaturen innerhalb des dem zweiten Schritt zugeordneten zweiten Temperaturbereiches gebracht sind.

2. Labortemperiereinrichtungen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß bei zwei Schritten mit unterschiedlichen Auswertparametern alle Pro­ ben einer dritten Gruppe in einer ersten Gruppe enthalten sind oder alle Proben einer ersten Gruppe in einer dritten Gruppe enthalten sind.

3. Labortemperiereinrichtungen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß bei zwei Schritten mit gleichen Auswertparametern bei allen zweiten Gruppen jeweils alle Proben unterschiedlichen ersten Gruppen angehören.

4. Labortemperiereinrichtungen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Proben in einem Array in Zeilen und Spalten angeordnet sind.

5. Labortemperiereinrichtungen nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Zeilen und Spalten orthogonal zueinander angeordnet sind.

6. Labortemperiereinrichtungen nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß alle Proben einer Gruppe in einer Zeile oder in einer Spalte liegen.

7. Labortemperiereinrichtungen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß nur je eine der ersten und/oder zweiten und/oder dritten Gruppen meh­ rere Proben enthalten.

8. Labortemperiereinrichtungen nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die mehrere Proben enthaltenden Gruppen Proben derjenigen anderen Gruppen enthalten, die in ihrem jeweils zugeordneten Temperaturbereich in der Nähe der mittleren Temperatur liegen.

9. Labortemperiereinrichtungen nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die dritten Gruppen Teilbereiche des Arrays ausbilden, welche mit ih­ ren Bereichsgrenzen nur jeweils Proben derselben dritten Gruppe um­ schließen.

10. Labortemperiereinrichtungen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß bei allen Schritten der Schrittfolge die Proben auf gruppenweise unter­ schiedliche Temperaturen im Bereich des zugeordneten Temperaturberei­ ches gebracht sind.

11. Labortemperiereinrichtung zur gemeinsamen Temperierung von Reakti­ onsproben in mindestens drei Schritten in jeweils zugeordneten bestimm­ ten Temperaturbereichen, welche als Schrittfolge wiederholt nacheinander ausgeführt werden, wobei die Labortemperiereinrichtung in einem beliebig ausgewählten ersten Schritt der Schrittfolge mehrere jeweils wenigstens eine Probe enthaltende erste Gruppen von Proben auf innerhalb der Grup­ pen gleiche und zwischen den Gruppen unterschiedliche Temperaturen in­ nerhalb des dem ersten Schritt zugeordneten ersten Temperaturbereiches bringt, und wobei in einem beliebig ausgewählten zweiten Schritt der Schrittfolge bei mindestens einer der ersten Gruppen wenigstens zwei Proben verschiedenen zweiten Gruppen angehören, die auf innerhalb der Gruppen gleiche und zwischen den Gruppen unterschiedliche Temperatu­ ren des dem zweiten Schritt zugeordneten zweiten Temperaturbereiches gebracht werden, dadurch gekennzeichnet, daß in einem beliebig ausgewählten dritten Schritt der Schrittfolge bei mindestens einer der ersten Gruppen und mindestens einer der zweiten Gruppen wenigstens jeweils zwei Proben verschiedenen dritten Gruppen angehören, die auf innerhalb der Gruppen gleiche und zwischen den Gruppen unterschiedliche Tempe­ raturen innerhalb des dem dritten Schritt zugeordneten dritten Tempera­ turbereiches gebracht werden.

12. Labortemperiereinrichtung nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Reaktionsproben 3-dimensional angeordnet sind und zur Erzeu­ gung der unterschiedlichen Temperaturen für drei Schritte Temperaturgra­ dienten in X-, Y- und Z-Richtung angelegt werden.

13. Labortemperiereinrichtung nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Reaktionsproben in einer Fläche angeordnet sind.

14. Labortemperiereinrichtung nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß in dem ersten Schritt die Fläche mit einer ersten Mittellinie in zwei er­ ste Teilflächen geteilt ist, in denen jeweils gleiche Temperaturgradienten mit entgegengesetzter Richtung senkrecht zur Mittellinie angelegt sind, und daß in dem zweiten Schritt die Fläche mit einer zweiten Mittellinie, die senkrecht zur ersten Mittellinie steht, in zwei zweite Teilflächen geteilt ist, in denen jeweils gleiche Temperaturgradienten mit entgegengesetzter Richtung senkrecht zur Mittellinie angelegt sind, und daß in dem dritten Schritt in den durch die beiden Mittellinien gebildeten vier Quadranten der Fläche unterschiedliche Temperaturen angelegt sind.