[go: up one dir, main page]
More Web Proxy on the site http://driver.im/

DE10061348C2 - Verfahren zur Quantifizierung von Cytosin-Methylierungen in komplex amplifizierter genomischer DNA - Google Patents

Verfahren zur Quantifizierung von Cytosin-Methylierungen in komplex amplifizierter genomischer DNA

Info

Publication number
DE10061348C2
DE10061348C2 DE10061348A DE10061348A DE10061348C2 DE 10061348 C2 DE10061348 C2 DE 10061348C2 DE 10061348 A DE10061348 A DE 10061348A DE 10061348 A DE10061348 A DE 10061348A DE 10061348 C2 DE10061348 C2 DE 10061348C2
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
dna
sample
adapters
amplified
cytosine
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
DE10061348A
Other languages
English (en)
Other versions
DE10061348A1 (de
Inventor
Alexander Olek
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Epigenomics AG
Original Assignee
Epigenomics AG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Epigenomics AG filed Critical Epigenomics AG
Priority to DE10061348A priority Critical patent/DE10061348C2/de
Priority to AU2002227866A priority patent/AU2002227866A1/en
Priority to US10/433,742 priority patent/US20050019762A1/en
Priority to EP01989384A priority patent/EP1366190A2/de
Priority to PCT/DE2001/004617 priority patent/WO2002046452A2/de
Publication of DE10061348A1 publication Critical patent/DE10061348A1/de
Application granted granted Critical
Publication of DE10061348C2 publication Critical patent/DE10061348C2/de
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Fee Related legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6827—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism
    • C12Q1/683—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism involving restriction enzymes, e.g. restriction fragment length polymorphism [RFLP]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6869—Methods for sequencing
    • C12Q1/6874—Methods for sequencing involving nucleic acid arrays, e.g. sequencing by hybridisation

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Beschrieben wird ein Verfahren zur Bereitstellung von demethylierter DNA als Referenzmaterial für die Analyse von Cytosin-Methylierungen in genomischen DNA-Proben unter Verwendung komplexer Amplifikationen.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Quantifizierung von Cytosin-Methylierungen einer genomischen DNA-Probe mit unbekanntem Metylierungsstatus durch den Vergleich mit einer demethylierten Referenz-DNA.
5-Methylcytosin ist die häufigste, kovalent modifizierte Base in der DNA eukaryotischer Zellen. Sie spielt beispielsweise eine Rolle in der Regulation der Transkription, genomischem Imprinting und in der Tumorgenese. Die Identifizierung von 5-Methylcytosin als Bestandteil genetischer Information ist daher von erheblichem Interesse. 5- Methylcytosin-Positionen können jedoch nicht durch Sequenzierung identifiziert werden, da 5-Methylcytosin das gleiche Basenpaarungsverhalten aufweist wie Cytosin. Darüberhinaus geht bei einer PCR-Amplifikation die epigenetische Information, welche die 5-Methylcytosine tragen, vollständig verloren.
Die Amplifikation von DNA mittels PCR ist Stand der Technik.
Es sind mehrere Verfahren bekannt, die diese Probleme lösen. Meist wird eine chemische Reaktion oder enzymatische Behandlung der genomischen DNA durchgeführt, infolge derer sich die Cytosin von den Methylcytosin-Basen unterscheiden lassen. Eine gängige Methode ist die Umsetzung von genomischer DNA mit Bisulfit, die nach alkalischer Hydrolyse in zwei Schritten zu einer Umwandlung der Cytosin-Basen in Uracil führt (Shapiro, R., Cohen, B., Servis, R. "Nature", 227, 1047 (1970). 5-Methylcytosin bleibt unter diesen Bedingungen unverändert. Die Umwandlung von C in U führt zu einer Veränderung der Basensequenz, aus der sich durch Sequenzierung nun die ursprünglichen 5-Methylcytosine ermitteln lassen.
Die Modifikation der genomischen Base Cytosin zu 5-Methylcytosin stellt bis heute den wichtigsten und best-untersuchten, epigenetischen Parameter dar. Trotzdem gibt es bis heute zwar Methoden, umfassende Genotypen von Zellen und Individuen zu ermitteln, aber noch keine vergleichbaren Ansätze, auch in großem Maße epigenotypische Information zu generieren und auszuwerten.
Demethylierte DNA wird im Stand der Technik bei zahlreichen Verfahren zur Quantifizierung von DNA-Methylierung eingesetzt. Stellvertretend seien genannt: "Rapid quantitation of methylation differences at specific sites using methylation-sensitive single nucleotide primer extension" (Gonzalgo, M. L., Jones P. A. "Nucleic Acids Res.", 25, 2529 (1997)) und "Detection and measurement of PCR bias in quantitative methylation analysis of bisulphite-treated DNA" (Warnecke, P. M., Stirzaker, C., Melki, J. R., Douglas, S. M., Paul, C. L., Clark, S. J. 25, 4422 (1997)). Diese demethylierte DNA wird z. B. aus Zellen gewonnen, die in der Zielsequenz demethyliert sind oder aus Zellen, denen das Enzym DNA-Methyltransferase fehlt.
Andererseits ist es leicht möglich, demethylierte DNA-Fragmente mittels PCR herzustellen, da während der Amplifikation die Methylierungsinformation verloren geht, d. h., es wird anstelle von Methylcytosin immer Cytosin eingebaut, wenn, wie üblich, in der Polymerasereaktion dCTP eingesetzt wird.
Möchte man jedoch Cytosin-Methylierung, wie oben erwähnt, mittels der Bisulfit-Methode untersuchen, bei der alle nicht methylierten Cytosinbasen in Uracil und letztlich in Thymin umgewandelt werden, so muss für die Quantifizierung eine Referenz-DNA hergestellt werden, welche anstelle aller methylierten und nicht methylierten Cytosine Thymin enthält. Diese DNA dient dann als Referenzmaterial für einen Methylierungsstatus von 0%. Am einfachsten kann man diese DNA für die Analyse einzelner Fragmente erhalten, indem man zunächst in einer ersten Amplifikation eine PCR der genomischen DNA-Probe durchführt und dabei das gewünschte Fragment erzeugt, welches dann im wesentlichen keine Methylierung mehr aufweist. Nachfolgend wird die Bisulfit-Behandlung durchgeführt und das betreffende Fragment, nun mit entsprechend anderen Primern, zum zweiten Mal amplifiziert.
Dieses Verfahren eignet sich jedoch nicht zur Durchführung komplexer Amplifikationen, die viele Fragmente gleichzeitig für die Methylierungsdetektion bereitstellen sollen. Hier stellt sich das Problem, dass nur schwer sichergestellt werden kann, dass die erste Amplifikation auch wesentlich die Fragmente bereitstellt, die in der zweiten PCR nach der Bisulfit-Reaktion amplifiziert werden sollen. Dies ist aber essentiell, da die zu untersuchende Probe, für deren Methylierungsanalyse die Vergleichs-DNA hergestellt wird, üblicherweise ausschliesslich nach der Bisulfitbehandlung amplifiziert wird. Damit ist bei einer komplexen PCR-Reaktion eine Vergleichbarkeit von Referenz und Probe nicht mehr gegeben, da sie potentiell unterschiedliche Fragmente enthalten.
Aufgabenstellung
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Analyse von Cytosin-Methylierungen in genomischen DNA-Proben bereit, wozu als Referenzmaterial DNA mit einem Methylierungsgrad von 0% hergestellt wird. Damit ist es erstmals möglich, für komplexe Amplifikationen eine im wesentlichen unmethylierte Referenz-DNA bereitzustellen.
Beschreibung
Die vorliegende Erfindung beschreibt ein Verfahren zur Bereitstellung von demethylierter DNA als Referenzmaterial für die Analyse von Cytosin-Methylierungen in genomischen DNA-Proben unter Verwendung komplexer Amplifikationen. Dazu werden im Einzelnen die folgenden Verfahrensschritte durchgeführt:
  • a) Eine genomische DNA-Probe wird mit Primern amplifiziert, die entweder sehr kurze oder degenerierte Oligonukleotide oder zu Adaptoren komplementäre Oligonukleotide sind. Für den zweiten Fall wird vor der Amplifikation mit einem Restriktionsenzym geschnitten und die Adaptoren, unter denen man kurze Nukleotidfragmente bekannter Sequenz versteht, an die Enden der entstandenen DNA-Fragmente ligiert.
Die Amplifikate werden chemisch derart behandelt, dass an der 5-Position unmethylierte Cytosinbasen in Uracil, Thymin oder in eine andere, im Hybridisierungsverhalten dem Cytosin unähnliche Base umgewandelt werden, während die 5-Methylcytosinbasen im wesentlichen unverändert bleiben. Dies wird im folgenden unter chemischer Vorbehandlung verstanden.
Die chemisch vorbehandelten Amplifikate werden wiederum amplifiziert. Als Primer werden dazu entweder mehrere, spezifisch hybridisierende Oligonukleotide oder aber zu den Adaptoren komplementäre Oligonukleotide verwendet. Für den letzteren Fall wird ebenfalls die chemische Vorbehandlung durchgeführt.
  • a) Eine zu untersuchende, genomische DNA-Probe wird mittels eines Restriktionsenzyms geschnitten. An die Enden der DNA-Fragmente werden Adaptoren ligiert und die Probe nachfolgend geteilt. Der erste Teil der Probe wird mit Primeroligonukleotiden amplifiziert, die zu den Adaptoren komplementär sind. Der zweite Teil der Probe wird hingegen nicht amplifiziert.
Die beiden Teile der Probe werden chemisch separat vorbehandelt und amplifiziert, wobei zu den Adaptoren komplementäre Primeroligonukleotide verwendet werden. Die beiden Teile der Probe werden anschließend analysiert. Dabei liefert der erste Teil der Probe den Referenzwert für einen Methylierungsgrad von 0%. Der zweite Teil der Probe hingegen liefert den Messwert, der dem Methylierungsgrad in der ursprünglichen, genomischen DNA-Probe im wesentlichen entspricht.
Die zu analysierende, genomische DNA wird bevorzugt aus den üblichen Quellen für DNA erhalten, wie z. B. Zelllinien, Blut, Sputum, Stuhl, Urin, Gehirn-Rückenmarks-Flüssigkeit, in Paraffin einbettetes Gewebe, beispielsweise Gewebe von Augen, Darm, Niere, Hirn, Herz, Prostata, Lunge, Brust, Leber, Haut oder Knochenmark, histologische Objektträger und alle möglichen Kombinationen hiervon.
Bevorzugt wird dazu die oben beschriebene Behandlung genomischer DNA mit Bisulfit (Hydrogensulfit, Disulfit) und anschließender, alkalischer Hydrolyse verwendet, die zu einer Umwandlung nicht methylierter Cytosin-Nukleobasen in Uracil führt.
In einer besonders bevorzugten Variante des Verfahrens wird für die Amplifikation die Polymerasekettenreaktion (PCR) eingesetzt. Für die Polymerasekettenreaktion wird vorzugsweise eine hitzebeständige DNA-Polymerase verwendet. Die Amplifikation von mehreren gleichen oder mehreren unterschiedlichen DNA-Abschnitten wird bevorzugt in einem Reaktionsgefäß durchgeführt.
Als Restriktionsendonukleasen werden vorzugsweise verwendet: RsaI, DpnI, DpnII, MseI, Sau3AI, AluI, NlaIII, HaeIII, BfaI, Tsp509I, BstUI oder MboI.
Die Amplifikate werden nach der chemischen Behandlung durch Bindung an eine Festphase oder an ein Gel und Waschschritte von den Reagenzien und anderen Bestandteilen des Reakionsgemisches abgetrennt.
Die Reagenzien und die anderen Bestandteile des Reakionsgemisches werden bevorzugt derart verdünnt, dass sie in der nachfolgenden Amplifikation nicht mehr hinderlich sind, jedoch die Konzentration des behandelten Amplifikates nach wie vor für die zweite Amplifikation ausreicht.
Besonders bevorzugt wird die hergestellte, demethylierte Referenz-DNA auf die gleiche Weise analysiert wie eine zu untersuchende Proben-DNA. Diese Referenz-DNA liefert in der Analyse den Vergleichswert für einen Methylierungsgrad von 0%. Vorzugsweise wird zusätzlich eine enzymatisch aufmethylierte DNA, die im folgenden gleichermaßen wie die Proben-DNA behandelt wurde, als Referenz für einen Methylierungsgrad von 100% dient.
Die nachfolgenden Beispiele erläutern die Erfindung:
Beispiel 1a Herstellung einer demethylierten Referenz-DNA mittels Multiplex-PCR
Das folgende Beispiel bezieht sich auf die Herstellung einer runtermethylierten DNA- Probe, die als Referenz im Vergleich zu einer unbekannt methylierten DNA dient. Man setzt eine genomische DNA-Probe ein, die in diesem Fall mit dem Restriktionsenzym, Mss1, verdaut wurde. Dann werden (1-40 ng) der geschnittenen DNA durch eine Voramplifikation vervielfältigt, indem eine DOP-PCR (degenerate oligonucleotide primed polymerase chain reaction) nach der Methode von Nelson (V. G. Cheung, S. F. Nelson, PNAS 93, 1476-1479, 1996) mit dem genomischen Primeroligonukleotid 5'-CCGACTCGA­ GNNNNNNATGTG G-3' durchgeführt wird. Die Methode dient vor allem dazu, sehr kleine Mengen an genomischer DNA vorzuamplifizieren, um dann aus 2-15 µg (200-1000 bp) eine vielfache, genetische Analyse zu erlauben. Bei der Amplifikation werden sämtliche Methylcytosine als Cytosinbasen behandelt.
Reaktionsansatz (50 µl)
 1,0 µl (1-40 ng) DNA
 2,0 µl (2 µM) DOP-Primer (5'-CCGACTCGAGNNNNNNATGTG G-3')
 5,0 µl (200 µM) dNTP's (Fermentas)
 5,0 µl PCR-Puffer (10 ×, 15 mM MgCl2
) (Qiagen)
 0,5 µl (2,5 U) Taq-Polymerase (HotstarTaq, Qiagen)
36,5 µl Wasser (für die Molekularbiologie, Fluka)
Die PCR-Reaktion wird im Master-Cycler-Gradient (Eppendorf, Hamburg) mit folgendem Programm durchgeführt.
Die PCR-Probe wird mit Wasser verdünnt (1 : 10-1 : 100), und 1 µl der Verdünnung werden mit Hydrogensulfit (= Bisulfit, Disulfit) chemisch umgewandelt. Die DNA wird zuerst thermisch denaturiert und anschließend mit Hydrogensulfit (= Bisulfit, Disulfit), einem Radikalfänger und einem denaturierenden Reagenz versetzt und längere Zeit bei erhöhter Temperatur inkubiert. Die Bisulfit-Reaktion führt zur Umwandlung aller Cytosinbasen in Uracil. Zur Reinigung der bisulfitierten DNA wird diese auf eine Reversed-Phase-C18- Festphase gebunden und durch Waschen mit einer geeigneten Pufferlösung von Chemikalien befreit. Anschließend wird die DNA mit einem polaren Lösungsmittel, wie z. B. Acetonitril oder Wasser, eluiert und auf ein kleineres Volumen konzentriert. Die alkalische Hydrolyse der mit Hydrogensulfit (= Bisulfut, Disulfit) behandelten Fragmente erfolgt für 20 min bei 96°C unter basischen Bedingungen unmittelbar vor der spezifischen Amplifikation. In dieser werden vorzugsweise zwischen 1-500 verschiedene Primeroligonukleotide, die keine Wobble-Basenpaarungen enthalten, eingesetzt. In diesem Beispiel wird die spezifische Amplifikation mit 128 Primeroligonukleotiden durchgeführt, wobei mindestens 64 Primeroligonukleotide mit Cy5 (Amersham Pharmacia) markiert sind. Dabei handelt es sich um je ein Primeroligonukleotid eines Primerpaares.
Reaktionsansatz Multiplex PCR (25 µl)
 1,0 µl Hydrogensulfit behandelte DNA
 2,5 µl PCR-Puffer (10 ×, Qiagen)
 0,6 µl Primeroligonukleotidmischung (128 Primeroligonukleotide, 64 davon sind Cy5- markiert, 0,78 pmol/µl von jedem)
 0,8 µl dNTPs (25 mM pro dNTP, Gibco-BRL)
 3,0 µl MgCl2
(15 mM)
 4,5 µl Wasser (für die Molekularbiologie, Fluka)
12,5 µl Tris-HCl (pH 9,5; 100 mM)
 0,2 µl Polymerase (1 unit) (HotstarTaq, Qiagen)
Die PCR-Reaktion wird im Master-Cycler-Gradient (Eppendorf, Hamburg) mit folgendem Programm durchgeführt.
Die erzeugten PCR-Amplifikate wurden durch Agarosegel-Elektrophorese (1,5% Agarose in 0,5 × TBE-Puffer, Sambrook et al.) analysiert. Hierfür werden 4 µl des PCR-Ansatzes der Gelelektrophorese unterzogen. Unter den angegeben Bedingungen werden 64 Gene gleichzeitig erfolgreich amplifiziert.
Beispiel 1b Herstellung einer unbekannt methylierten DNA-Probe mittels Multiplex-PCR
Das folgende Beispiel 1b bezieht sich auf die Herstellung einer unbekannt methylierten DNA-Probe, die mit der runtermethylierten Referenz DNA aus Beispiel 1a verglichen wird. Man setzt eine genomische DNA-Probe ein, die in diesem Fall mit dem Restriktionsenzym MssI gespalten wurde. Die Probe wird anschließend mit Hydrogensulfit (= Bisulfit, Disulfit) umgesetzt. Dabei kann man nach 2 verschiedenen Methoden vorgehen. Die erste Methode (Olek et al., "Nucl. Acids. Res.", 1996, 24, 5064-5066) ist eine Umsetzung mit Hydrogensulfit und einem Radikalfänger, wobei die DNA in Agarose eingebettet ist. Die Desulfonierung der DNA erfolgt ebenfalls in Agarose. Die DNA wird in diesem Fall ohne weitere Reinigungsoperationen in eine Preamplifikation (PEP = primer extension preamplification) eingesetzt. Alternativ wird die DNA ohne Agarosematrix ebenfalls mit Hydrogensulfit (= Bisulfit, Disulfit) und einem Radikalfänger bei erhöhter Temperatur chemisch umgewandelt. Ein organisches Reagenz, welches die Denaturierung unterstützt, wird zugesetzt und der Ansatz bei erhöhter Temperatur inkubiert. Durch die Behandlung mit Hydrogensulfit werden in beiden Methoden alle Cytosin-Basen zu Uracil umgesetzt, wobei Methylcytosine erhalten bleiben. Zur Reinigung der ohne Agarosematrix bisulfitierten DNA wird diese auf eine Reversed-Phase-C18-Festphase gebunden und durch Waschen mit einer geeigneten Pufferlösung von Chemikalien befreit. Anschließend wird die DNA mit einem polaren Lösungsmittel, wie z. B. Acetonitril und Wasser, eluiert und auf ein kleineres Volumen konzentriert. Die Preamplifikation der mit Hydrogensulfit behandelten DNA wird mit degenerierten Primeroligonukleotiden (5'-TTATAATGTTTT und 5'-TAATATACTAAT) durchgeführt.
Reaktionsansatz (20 µl)
 1,0 µl Bisulphit-DNA (0.2-1 ng)
 2,0 µl Reaktions-Puffer (10 ×, Qiagen)
 2,0 µl dNTP's (10 mM pro dNTP, Fermentas)
 1,0 µl Primer (TTATAATGTTTT) 25 pmol
 1,0 µl Primer (TAATATACTAAT) 25 pmol
 0,2 µl Polymerase (1 unit) (HotstarTaq, Qiagen)
12,8 µl Wasser (für die Molekularbiologie, Fluka)
Die nachfolgende Amplifikation mit Cy5-gelabelten Bisulfit-spezifischen Primeroligonukleotiden erfolgt mit den im Beispiel 1a beschriebenen 128 Primeroligonukleotiden, wobei das gleiche Primeroligonukleotid Cy5-gelabelt ist. Die Amplifikate werden zur Analyse ebenfalls einer Agarosegel-Elektrophorese unterzogen.
Beispiel 1c Vergleich der unbekannt methylierten DNA-Probe mit der runtermethylierten Referenz-DNA
Der Vergleich der unbekannt methylierten DNA-Probe mit der runtermethylierten Referenz- DNA erfolgt vorzugsweise durch Hybridisierung auf ein Oligonukleotidarray. Entsprechend der Position auf dem Array ist sind fluoreszierende Punkte sichtbar. Es fällt auf, dass bestimmte Punkte auf dem Array relativ zu den anderen und zur Referenz-DNA eine deutlich erhöhte oder verminderte Fluoreszenz zeigen, sofern die Amplifikate in den einzelnen zu untersuchenden Proben in vergleichbarer Konzentration vorliegen. Es werden die Intensitäten des Fluoreszenzfarbstoffes Cy5 (635 nm) in den einzelnen Amplifikaten gemessen. Die Art und Weise der Auswertung von Fluoreszenzmessungen sind dem Fachmann bekannt.
Beispiel 2 Herstellung demethylierter Referenz-DNA
Im ersten Schritt wird eine genomische Sequenz durch Zugabe eines Restriktionsenzyms, hier NIaIII (Fermentas), welches die Sequenz CATG erkennt, nach Herstellerangaben enzymatisch gespalten. Dabei werden Fragmente von durchschnittlich 400 bp Größe erzeugt. Die gespaltenen Fragmente weisen 3' überhängende CATG-Enden auf und werden mit dem Oligomer mit der genomischen Sequenz TGTCATCCTGTTGTCATG unter Zugabe von T4-DNA-Ligase gemäß Standardbedingungen (Fermentas) an die Sequenzabschnitte ligiert und nicht ligierte Adaptoren nach Standardbedingungen mit einem Reinigungskit (Qiaquick PCR Purification Kit, Qiagen) entfernt. Anschließend werden mit Klenow-Enzym (DNA-Polymerase I, Roche Molecular Biochemicals) und dNTP's die einzelsträngigen Enden zum Doppelstrang ergänzt (Fig. 1a).
Soll eine Referenz-DNA hergestellt werden, so ist wie folgt zu verfahren:
Es werden in dem nun folgenden Schritt die ligierten Sequenzabschnitte in einer PCR-Reaktion unter Zugabe von Primeroligonukleotiden mit der Sequenz TGTCATCCTGTTGTCATG und mit einer hitzebeständigen DNA-Polymerase amplifiziert. Die PCR-Reaktion wird im Master- Cycler-Gradient (Eppendorf, Hamburg) mit folgenden Parametern durchgeführt: Denaturierung: 15 Minuten (min) bei 96°C; die folgenden Zyklen werden 45mal wiederholt: 60 Sekunden (sec) bei 96°C, 45 sec bei 51°C, 60 sec bei 72°C und anschliessende Inkubation für 10 Minuten bei 72°C.
Im nächsten Schritt wird die DNA unter Verwendung von Bisulfit (Hydrogensulfit, Disulfit) derart behandelt, dass alle nicht an der 5-Position der Base methylierten Cytosine so verändert werden, dass eine hinsichtlich des Basenpaarungsverhaltens unterschiedliche Base entsteht, während die in 5-Position methylierten Cytosine unverändert bleiben. Wird für die Reaktion 1.7 M Bisulfitlösung verwendet, so findet an den nicht methylierten Cytosinbasen eine Addition statt. Zudem müssen ein denaturierendes Reagenz oder Lösungsmittel sowie ein Radikalfänger zugegen sein. Eine anschließende, alkalische Hydrolyse führt dann zur Umwandlung von nicht methylierten Cytosin-Nukleobasen in Uracil. Diese umgewandelte DNA dient dazu, methylierte Cytosine nachzuweisen. Im letzten Verfahrensschritt verdünnt man die behandelte DNA-Probe mit Wasser oder einer wässrigen Lösung. Bevorzugt wird anschliessend eine Desulfonierung der DNA (20 min, 96°C) bei pH 9 durchgeführt. Im letzten Schritt des Verfahrens amplifiziert man die DNA- Probe mit den nun zu der Bisulfit behandelten DNA-komplementären Primern wiederum in einer Polymerasekettenreaktion. Die PCR-Reaktion wird im Master-Cycler-Gradient (Eppendorf, Hamburg) mit folgenden Parametern durchgeführt: Denaturierung: 15 Minuten (min) bei 96°C; die folgenden Zyklen werden 45mal wiederholt: 60 Sekunden (sec) bei 96°C, 45 sec bei 42°C, 60 sec bei 72°C und anschliessende Inkubation für 10 Minuten bei 72°C (Fig. 1b).
Soll eine DNA mit unbekanntem Methylierungsstatus untersucht werden (Fig. 2), so ist die geschnittene und mit Adaptoren ligierte DNA (Fig. 1a) mit Bisulfit zu behandeln. Nach der Bisulfitbehandlung erfolgt eine PCR, wobei die Primeroligonukleotide mit den Sequenzen TGTTATTTTGTTGTTTAG und TATCATCCTATTATGATA verwendet werden. Die PCR- Reaktion wird im Master-Cycler-Gradient (Eppendorf, Hamburg) mit folgenden Parametern durchgeführt: Denaturierung: 15 Minuten (min) bei 96°C, die folgenden Zyklen werden 45­ mal wiederholt: 60 Sekunden (sec) bei 96°C, 45 sec bei 42°C, 60 sec bei 72°C und anschliessende Inkubation für 10 Minuten bei 72°C.
Sowohl im Fall der runtermethylierten Referenz-DNA als auch im Fall einer DNA mit unbekanntem Methylierungsstatus beruht der Nachweis des Hybridisierungsprodukts auf Cy5-fluoreszenzmarkierten Primeroligonukleotiden, die für die Amplifikation verwendet wurden. Nur wenn in der Bisulfit behandelten DNA an dieser Stelle ein methyliertes Cytosin vorgelegen hat, kommt es zu einer Hybridisierungsreaktion der amplifizierten DNA mit dem Oligonukleotid. Somit entscheidet der Methylierungsstatus des jeweiligen zu untersuchenden Cytosins über das Hybridisierungsprodukt.
Legenden zu den folgenden Figuren
Fig. 1a:
  • a) Restriktionsenzym, NlaIII
  • b) Adaptor 1 5'-TGTCATCCTGTTGT, Ligase z. B. T4-DNA
  • c) Klenow-Enzym (DNA-Polymerase I), dNTP's, Puffer
  • d) Reinigung (Qiaquick Reinigungskit)
Fig. 1b:
  • a) PCR, Primer 5'-TGTCATCCTGTTGTCATG, dNTP's, Puffer, TAQ
  • b) Reaktion mit Hydrogensulfit
  • c) PCR, Primer 1 5'-TGTTATTTTGTTGTTATG, Primer 2 5'-TATCATCCTATTATCATA
Fig. 2:
  • a) Reaktion mit Hydrogensulfit
  • b) PCR, Primer 1 5'-TGTTATTTTGTTGTTATG, Primer 2 5'-TATCATCCTATTATCATA

Claims (11)

1. Verfahren zur Bereitstellung von demethylierter DNA als Referenzmaterial für die Analyse von Cytosin-Methylierungen in genomischen DNA-Proben unter Verwendung komplexer Amplifikationen, dadurch gekennzeichnet, dass die folgenden Verfahrensschritte ausgeführt werden:
  • a) eine genomische DNA-Probe wird amplifiziert, wobei entweder sehr kurze oder degenerierte Oligonukleotide oder zu Adaptoren komplementäre Oligonukleotide jeweils als Primer verwendet werden; in letzterem Fall wird die genomische DNA vor der Amplifikation mit einem Restriktionsenzym geschnitten und die Adaptoren an die Enden der entstandenen DNA-Fragmente ligiert;
  • b) die Amplifikate werden chemisch derart behandelt, dass nicht methylierte Cytosinbasen in Uracil oder in eine andere im Hybridisierungsverhalten dem Cytosin unähnliche Base umgewandelt werden, während die 5-Methylcytosinbasen im wesentlichen unverändert bleiben;
  • c) die chemisch vorbehandelten Amplifikate werden wiederum amplifiziert, wobei entweder mehrere, spezifisch hybridisierende Oligonukleotide oder aber zu den Adaptoren komplementäre Oligonukleotide jeweils als Primer verwendet werden; im letzteren Fall werden die Adaptoren gemäß den Regeln des Schrittes 1b) ebenfalls umgewandelt.
2. Verfahren zur Analyse von Cytosin-Methylierungen in genomischen DNA-Proben unter Verwendung komplexer Amplifikationen mittels Adaptoren, dadurch gekennzeichnet, dass die folgenden Verfahrensschritte ausgeführt werden:
  • a) eine zu untersuchende, genomische DNA-Probe wird mittels eines Restriktionsenzyms geschnitten;
  • b) an die Enden der DNA-Fragmente werden Adaptoren ligiert und die Probe nachfolgend geteilt; der erste Teil der Probe wird mittels zu den Adaptoren komplementären Oligonukleotiden als Primer amplifiziert, wohingegen der zweite Teil der Probe nicht amplifiziert wird;
  • c) die beiden Teile der Probe werden chemisch separat derart behandelt, dass nicht methylierte Cytosinbasen in Uracil oder in eine andere im Hybridisierungsverhalten dem Cytosin unähnliche Base umgewandelt werden, während die 5-Methylcytosinbasen im wesentlichen unverändert bleiben;
  • d) die chemisch behandelten, beiden Teile der Probe werden amplifiziert, wobei zu den Adaptoren nach der chemischen Behandlung komplementäre Oligonukleotide als Primer verwendet werden;
  • e) beide Teile der Probe werden analysiert, wobei der erste Teil der Probe den Referenzwert für einen Methylierungsgrad von 0% liefert und der zweite Teil der Probe den Messwert, der dem Methylierungsgrad in der ursprünglichen, genomischen DNA-Probe im wesentlichen entspricht.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass für die Amplifikation eine PCR (Polymerasekettenreaktion) eingesetzt wird.
4. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass für die Polymerasekettenreaktion eine hitzebeständige DNA-Polymerase verwendet wird.
5. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Amplifikation von mehreren DNA-Abschnitten in einem Reaktionsgefäß durchführt wird.
6. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die chemische Behandlung mit Natriumbisulfit durchgeführt wird.
7. Verfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Amplifikate nach der chemischen Behandlung durch Bindung an eine Festphase oder ein Gel und Waschschritte von den Reagenzien und anderen Bestandteilen des Reaktionsgemisches abgetrennt werden.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass nach der chemischen Behandlung die Reagenzien und die anderen Bestandteile des Reakionsgemisches derart verdünnt werden, dass sie in der nachfolgenden Amplifikation nicht mehr hinderlich sind, jedoch die Konzentration des behandelten Amplifikates nach wie vor für die zweite Amplifikation ausreicht.
9. Verfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass eine der folgenden Restriktionsendonukleasen verwendet wird: RsaI, DpnI, DpnII, MseI, Sau3AI, AluI, NlaIII, HaeIII, BfaI, Tsp509I, BstU1 oder MboI.
10. Verfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die hergestellte, demethylierte Referenz-DNA auf die gleiche Weise analysiert wird wie eine zu untersuchende Proben-DNA und in der Analyse den Vergleichswert für einen Methylierungsgrad von 0% liefert.
11. Verfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass zusätzlich eine enzymatisch aufmethylierte DNA, die im folgenden gleichermaßen wie die Proben-DNA behandelt wurde, als Referenz für einen Methylierungsgrad von 100% verwendet wird.
DE10061348A 2000-12-06 2000-12-06 Verfahren zur Quantifizierung von Cytosin-Methylierungen in komplex amplifizierter genomischer DNA Expired - Fee Related DE10061348C2 (de)

Priority Applications (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE10061348A DE10061348C2 (de) 2000-12-06 2000-12-06 Verfahren zur Quantifizierung von Cytosin-Methylierungen in komplex amplifizierter genomischer DNA
AU2002227866A AU2002227866A1 (en) 2000-12-06 2001-12-05 Method for quantifying cytosine methylations in genomic dna that is amplified in a complex manner
US10/433,742 US20050019762A1 (en) 2000-12-06 2001-12-05 Method for quantifying cytosine methylations in genomic dna that is amplified in a complex manner
EP01989384A EP1366190A2 (de) 2000-12-06 2001-12-05 Verfahren zur quantifizierung von cytosin-methylierungen in komplex amplifizierter genomischer dna
PCT/DE2001/004617 WO2002046452A2 (de) 2000-12-06 2001-12-05 Verfahren zur quantifizierung von cytosin-methylierungen in komplex amplifizierter genomischer dna

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE10061348A DE10061348C2 (de) 2000-12-06 2000-12-06 Verfahren zur Quantifizierung von Cytosin-Methylierungen in komplex amplifizierter genomischer DNA

Publications (2)

Publication Number Publication Date
DE10061348A1 DE10061348A1 (de) 2002-06-20
DE10061348C2 true DE10061348C2 (de) 2002-10-24

Family

ID=7666462

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE10061348A Expired - Fee Related DE10061348C2 (de) 2000-12-06 2000-12-06 Verfahren zur Quantifizierung von Cytosin-Methylierungen in komplex amplifizierter genomischer DNA

Country Status (5)

Country Link
US (1) US20050019762A1 (de)
EP (1) EP1366190A2 (de)
AU (1) AU2002227866A1 (de)
DE (1) DE10061348C2 (de)
WO (1) WO2002046452A2 (de)

Families Citing this family (40)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004050839A2 (en) * 2002-11-27 2004-06-17 Sequenom, Inc. Fragmentation-based methods and systems for sequence variation detection and discovery
AU2003900368A0 (en) * 2003-01-24 2003-02-13 Human Genetic Signatures Pty Ltd Assay for nucleic acid molecules
US20060024676A1 (en) * 2003-04-14 2006-02-02 Karen Uhlmann Method of detecting epigenetic biomarkers by quantitative methyISNP analysis
AU2004235331B2 (en) * 2003-04-25 2008-12-18 Sequenom, Inc. Fragmentation-based methods and systems for De Novo sequencing
US7288373B2 (en) * 2003-05-02 2007-10-30 Human Genetic Signatures Pty Ltd. Treatment of methylated nucleic acid
ATE476523T1 (de) * 2003-06-17 2010-08-15 Human Genetic Signatures Pty Verfahren zur genomamplifikation
WO2005024053A1 (en) 2003-09-04 2005-03-17 Human Genetic Signatures Pty Ltd Nucleic acid detection assay
US9394565B2 (en) * 2003-09-05 2016-07-19 Agena Bioscience, Inc. Allele-specific sequence variation analysis
US7608394B2 (en) * 2004-03-26 2009-10-27 Sequenom, Inc. Methods and compositions for phenotype identification based on nucleic acid methylation
EP1727911B1 (de) 2004-03-26 2013-01-23 Sequenom, Inc. Basenspezifische spaltung methylierungsspezifischer amplifikationsprodukte in kombination mit massenanalyse
US20060019270A1 (en) * 2004-04-01 2006-01-26 Board Of Regents The University Of Texas System Global DNA methylation assessment using bisulfite PCR
US8168777B2 (en) * 2004-04-29 2012-05-01 Human Genetic Signatures Pty. Ltd. Bisulphite reagent treatment of nucleic acid
EP1802772A4 (de) * 2004-09-10 2008-12-31 Sequenom Inc Verfahren zur nukleinsäuresequenzanalyse mit grosser reichweite
EP1794173B1 (de) 2004-09-10 2010-08-04 Human Genetic Signatures PTY Ltd Amplifikationsblocker umfassend interkalierende nukleinsäuren (ina) enthaltend interkalierende pseudonukleotide (ipn)
NZ555620A (en) * 2004-12-03 2008-08-29 Human Genetic Signatures Pty Methods for simplifying microbial nucleic acids by chemical modification of cytosines
WO2006066353A1 (en) * 2004-12-23 2006-06-29 Human Genetic Signatures Pty Ltd Detection of human papilloma virus
US7449297B2 (en) 2005-04-14 2008-11-11 Euclid Diagnostics Llc Methods of copying the methylation pattern of DNA during isothermal amplification and microarrays
WO2006125267A1 (en) * 2005-05-26 2006-11-30 Human Genetic Signatures Pty Ltd Isothermal strand displacement amplification using primers containing a non-regular base
US8343738B2 (en) * 2005-09-14 2013-01-01 Human Genetic Signatures Pty. Ltd. Assay for screening for potential cervical cancer
US20070122818A1 (en) * 2005-10-31 2007-05-31 Abhijit Mazumder Gene methylation assay controls
US20080050738A1 (en) * 2006-05-31 2008-02-28 Human Genetic Signatures Pty Ltd. Detection of target nucleic acid
JP2008136404A (ja) * 2006-11-30 2008-06-19 Sysmex Corp Ｄｎａメチル化検出における非メチル化シトシン変換処理後のｄｎａ量の確認方法
US8206927B2 (en) * 2007-01-23 2012-06-26 Sequenom, Inc. Method for accurate assessment of DNA quality after bisulfite treatment
US20080213870A1 (en) * 2007-03-01 2008-09-04 Sean Wuxiong Cao Methods for obtaining modified DNA from a biological specimen
US20100092972A1 (en) * 2007-03-16 2010-04-15 Human Genetic Signatures Pty Ltd. Assay for gene expression
EP2215250B1 (de) 2007-11-27 2013-02-27 Human Genetic Signatures Pty Ltd Enzyme zur amplifikation und zum kopieren bisulphit-modifizierter nukleinsäuren
AU2008341021A1 (en) * 2007-12-20 2009-07-02 Human Genetic Signatures Pty Ltd Elimination of contaminants associated with nucleic acid amplification
CA2717320A1 (en) * 2008-03-11 2009-09-17 Sequenom, Inc. Nucleic acid-based tests for prenatal gender determination
US8476013B2 (en) * 2008-09-16 2013-07-02 Sequenom, Inc. Processes and compositions for methylation-based acid enrichment of fetal nucleic acid from a maternal sample useful for non-invasive prenatal diagnoses
US8962247B2 (en) 2008-09-16 2015-02-24 Sequenom, Inc. Processes and compositions for methylation-based enrichment of fetal nucleic acid from a maternal sample useful for non invasive prenatal diagnoses
US8541207B2 (en) * 2008-10-22 2013-09-24 Illumina, Inc. Preservation of information related to genomic DNA methylation
ES2577017T3 (es) 2009-12-22 2016-07-12 Sequenom, Inc. Procedimientos y kits para identificar la aneuploidia
CN102533944B (zh) * 2010-12-10 2014-04-09 深圳华大基因科技服务有限公司 用于甲基化dna的富集和测序的半甲基化接头及其用途
WO2012149339A2 (en) 2011-04-29 2012-11-01 Sequenom, Inc. Quantification of a minority nucleic acid species
EP2753710B1 (de) 2011-09-07 2017-01-11 Human Genetic Signatures Pty Ltd Molekularer detektionstest
EP3757210B1 (de) 2012-03-02 2022-08-24 Sequenom, Inc. Verfahren zur anreicherung von krebsnukleinsäure aus einer biologischen probe
US9920361B2 (en) 2012-05-21 2018-03-20 Sequenom, Inc. Methods and compositions for analyzing nucleic acid
JP2015521862A (ja) 2012-07-13 2015-08-03 セクエノム， インコーポレイテッド 非侵襲性の出生前診断に有用な母体サンプル由来の胎児核酸のメチル化に基づく富化のためのプロセスおよび組成物
EP3597774A1 (de) 2013-03-13 2020-01-22 Sequenom, Inc. Primer zur analyse der dna-methylierung
EP3736344A1 (de) 2014-03-13 2020-11-11 Sequenom, Inc. Verfahren und prozesse zur nichtinvasiven beurteilung genetischer variationen

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE19754482A1 (de) * 1997-11-27 1999-07-01 Epigenomics Gmbh Verfahren zur Herstellung komplexer DNA-Methylierungs-Fingerabdrücke
DE19853398C1 (de) * 1998-11-19 2000-03-16 Epigenomics Gmbh Verfahren zur Identifikation von Cytosin-Methylierungsmustern in genomischer DNA
DE19905082C1 (de) * 1999-01-29 2000-05-18 Epigenomics Gmbh Verfahren zur Identifikation von Cytosin-Methylierungsmustern in genomischen DNA-Proben
DE19935772C2 (de) * 1999-07-26 2002-11-07 Epigenomics Ag Verfahren zur relativen Quantifizierung der Methylierung von Cytosin Basen in DNA-Proben
IL154663A0 (en) * 2000-09-01 2003-09-17 Epigenomics Ag Method for determining the degree of methylation of defined cytosines in genomic dna in the sequence context 5'-cpg-3'
DE10050942B4 (de) * 2000-10-10 2005-11-17 Epigenomics Ag Verfahren zum Nachweis von Cytosin-Methylierungen

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Nature 227, 1970, S.1047-1048 *

Also Published As

Publication number Publication date
WO2002046452A2 (de) 2002-06-13
DE10061348A1 (de) 2002-06-20
EP1366190A2 (de) 2003-12-03
WO2002046452A3 (de) 2003-09-18
AU2002227866A1 (en) 2002-06-18
US20050019762A1 (en) 2005-01-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE10061348C2 (de) Verfahren zur Quantifizierung von Cytosin-Methylierungen in komplex amplifizierter genomischer DNA
DE69804143T2 (de) Verfahren zur charakterisierung von nukleinsäuremolekulen, das die erzeugung von verlängerbaren aufwärtsgelegenen dns-fragmenten, die durch spaltung der nukleinsäure an einer abasischen stelle entsteht, umfasst
EP1423533B1 (de) Verfahren zum nachweis von cytosin-methylierung mit hoher sensitivität
DE69527444T2 (de) Glycosylase verwendende detektion von bestimmten nukleinsäuresequenzen
DE60029323T3 (de) Verfahren zur analyse der dna-methylierung mit hoher durchsatzrate
DE69816286T2 (de) Verfahren zur Erkennung von Nukleinsäuremethylierungen durch AFLP
EP1370691B1 (de) Verfahren zum nachweis von cytosinmethylierungsmustern mit hoher sensitivität
DE69531542T2 (de) Ligase/polymerase-vermittelte analyse genetischer elemente von einzelnukleotid-polymorphismen und ihre verwendung in der genetischen analyse
DE69900949T2 (de) Dns amplifizierung aus einzelnen zellen
DE10056802B4 (de) Verfahren zur Detektion von Methylierungszuständen zur toxikologischen Diagnostik
DE10201138A1 (de) Verfahren zum Nachweis von Cytosin-Methylierungsmustern durch exponentielle Ligation hybridisierter Sondenoligonukleotide
DE60014350T2 (de) Verfahren zur erkennung und/oder analyse, unter verwendung von primertechniken, von einfachen nukleotidpolymorphismen in restriktionsfragmenten speziell aus amplifizierten restriktionsfragmenten generiert durch aflp
EP2240610B1 (de) Amplifikation von bisulfitierten nukleinsäuren
DE69121791T2 (de) Verfahren zur quantitativen Bestimmung von DNS-Sequenzen
EP1369493B1 (de) Verfahren zur quantitiven Bestimmung des Methylierungsgrades von Cytosinen in CpG-Positionen
DE10236406C1 (de) Verfahren zur Amplifikation von Nukleinsäuren mit geringer Komplexität
WO2007009822A2 (de) Verfahren zur quantifizierung von methylierter dna
DE10392538B4 (de) Verfahren zur Analyse von methylierten Nukleinsäuren
EP1339873B1 (de) Diagnose von mit humos assoziierten krankheiten
WO2001027317A2 (de) Verfahren zur unterscheidung von 5-position methylierungsänderungen
DE10132211A1 (de) Nachweis spezifischer Dinukleotide in DNA-Proben durch Fluoreszenzresonanzenergietransfer (FRET)
DE102006035600B3 (de) Verfahren zum Nachweis eines Methylierungsmusters
EP1432827B1 (de) Verfahren zum nachweis von dna-methylierung mittels markierten s-adenosylmethioninanaloga
EP1711628B1 (de) Verfahren zur kalibrierung und kontrolle von methylierungsanalyse-methoden mit hilfe von nicht-methylierter dna
EP1392856B1 (de) Verfahren für die simultane amplifikation vieler sequenzen in einer pcr-reaktion und deren markierung

Legal Events

Date Code Title Description
OP8 Request for examination as to paragraph 44 patent law
D2 Grant after examination
8364 No opposition during term of opposition
R119 Application deemed withdrawn, or ip right lapsed, due to non-payment of renewal fee

Effective date: 20110701