CZ291798B6

CZ291798B6 - Peptidy, jejich použití a farmaceutický prostředek s jejich obsahem

Info

Publication number: CZ291798B6
Application number: CZ1997914A
Authority: CZ
Inventors: Romano Deghenghi
Original assignee: Romano Deghenghi
Priority date: 1994-09-27
Filing date: 1995-09-13
Publication date: 2003-05-14
Also published as: HK1001207A1; CA2201122A1; MX9702275A; HUT77525A; PL181588B1; IL115381A0; EP0783521A1; WO1996010040A1; KR100369105B1; JP3810083B2; HU221481B; CN1121413C; ES2186730T3; RU2157378C2; CN1158622A; PL319382A1; SK39997A3; IL115381A; KR970706305A; PT783521E

Abstract

eÜen spo v v peptidech obecn ho vzorce A-D-Mrp-B-C, kde A znamen imidazolacetyl, izonipecotyl nebo 4-aminobutyryl, D znamen ozna en pravoto iv ho izomeru, Mrp znamen 2-alkyltryptofan o 1 a 3 atomech uhl ku v alkylov sti, B znamen D-Trp, nebo D-beta-naftylalanin, C znamen Phe-LysNH.sub.2.n., jako i adi n soli t chto l tek s farmaceuticky p°ijateln²mi organick²mi nebo anorganick²mi kyselinami, kter jsou schopn uvolnit r stov² hormon p°i peror ln m pod n a tak zvyÜovat · innost adenylcykl zy uvnit° bun k. Z tohoto d vodu je uveden l tky mo no zpracov vat na farmaceutick² prost°edek, kter² rovn tvo° sou st °eÜen a je ur en pro uvoln n r stov ho hormonu nebo zv²Üen · innosti adenylcykl zy.\

Description

Oblast techniky

Vynález se týká peptidů, které obsahují aminokyselinu D-2-alkyltryptofan a jsou schopné uvolnit růstový hormon, GH, při perorálním podání. Vynález se rovněž týká použití těchto peptidů a farmaceutického prostředku s jejich obsahem.

Dosavadní stav techniky

Vzestup koncentrace růstového hormonu GH u savců po podání látek, které vyvolávají jeho uvolnění, může vést k urychlení růstu a ke zvětšení svalové hmoty a také ke zvýšení produkce mléka v případě, že je dosaženo dostatečně vysoké koncentrace GH. Je známo, že zvýšení koncentrace růstového hormonu u savců může být dosaženo podáváním známých látek, způsobujících uvolnění tohoto hormonu, například hormonů, uvolňujících růstový hormon, GHRH.

Zvýšení koncentrace růstového hormonu u savců je možno dosáhnout také podáváním peptidů, které mohou způsobit toto uvolnění. Některé z těchto peptidů již byly popsány například v patentových US spisech 4 223 019, 4 223 020, 4 223 021, 4 224 316, 4 226 857, 4 228 155, 4 228 156, 4 228 157,4 228 158,4 410 512,4 410 513,4 411 890 a 4 839 344.

V poslední době je dávána přednost peptidům s poměrně krátkým řetězcem se svrchu uvedeným účinkem z toho důvodu, že tyto látky je možno snadno připravit, čistit a zpracovávat a mimoto jsou takové látky účinné i při perorálním podání.

Jeden z peptidů, schopných uvolnit růstový hormon je dlouhou dobu znám pod označením GHRP-6, byl popsán v publikaci C. Y. Bowers a další, Endocrinology, 114, 1537, 1984 a má vzorec EQs-D-Trp-Ala-Trp-D-Phe-Lys-NH₂. Faktor GHRP-6 je schopný uvolnit růstový hormon in vitro i in vivo a je účinný při perorálním podání u různých živočichů včetně člověka. Molekulární mechanismus této látky byl sledován, mimoto byl stejným způsobem sledován jeden z analogů této látky, heptapeptid s označením GHRP-1 podle publikací Cheng a další, Endocrinology, 124 2791, 1989 a M. S. Akman a další, Endocrinology, 132, 1286, 1993. Bylo prokázáno, že na rozdíl od přírodních látek typu GHRH působí tyto peptidy přes různé receptory a odlišným mechanismem, nezávislým na cAMP a působícím přes jiné nitrobuněčné cesty, například mobilizací zdrojů vápníku a postupem, závislým na proteinkináze C, PKC, podle publikace L. Bresson-Bépoldin a L. Dufy-Barbe, Cell. Calcium, 15, 247, 1994.

Nyní bylo zcela neočekávaně zjištěno, že v případě, že se do peptidů typu GHRP zavede D-2-alkyltryptofan, 2-Mrp, dochází k modifikaci nitrobuněčného mechanismu pro uvolnění GH.

V některých případech bylo možno prokázat významný vzestup účinnosti adenylcyklázy v předním laloku hypofyzy myšího původu i lidského původu, specifický mechanismus tohoto účinku však zůstává stále j eště nevyj asněný.

Znamená to, že při modifikaci, která spočívá v přidání jediné alkylové skupiny v poloze 2 tryptofanu vjeho D-formě dojde nejen ke zvýšení stálosti zbytku Trp podle WO 91/18016 (R. Deghenghi, zveřejněná 28. 11. 1991) a podle publikace R. Deghenghi a další, Life Sciences, 54, 1321, 1994, nýbrž také ke zcela neočekávané změně nitrobuněčného mechanismu, takže mechanismus již není závislý na vápníku, v některých případech je závislý na adenylcykláze a je podobnější mechanismu působení GHRH a jiných peptidových hormonů podle publikace James D. Watson a další, Molecular Biology of the Gene, 4. vydání, The Benjamin/Cummings Publishing Company, lne., Menlo Park, Califomia, 1987, str. 60.

-1 CZ 291798 B6

Další neočekávanou vlastností nových látek je vysoký účinek některých penta-, hexa- a heptapeptidů, modifikovaných uvedeným způsobem a příznivý poměr účinku při perorálním podání i u malých tetrapeptidů této skupiny.

Podstata vynálezu

Podstatou vynálezu tvoří peptidy obecného vzorce

A-D-Mrp-B—C, kde

A mámená imidazolacetyl, izonipecotyl nebo 4-aminobutyryl,

D mámená omáčení pravotočivého izomeru,

Mrp mámená 2-alkyltryptofan o 1 až 3 atomech uhlíku v alkylové části,

B mámená D-Trp, nebo D-beta-naftylalanin,

C mámená Phe-LysNH₂, jakož i adiční soli těchto látek s farmaceuticky přijatelnými organickými nebo anorganickými kyselinami.

Vynález je tedy založen na zjištění, že účinné jsou zejména ty peptidy s krátkým řetězcem, které ve svém řetězci obsahují D-izomer 2-alkyltryptofanu, označovaný D-2-Me-Trp nebo pouze D-Mrp.

V průběhu popisu budou použity pro zbytky aminokyselin následující zkratky:

Gly = glycin

Tyr = L-tyrosin

Ile = L-izoleucin

Glu = kyselina L-glutamová

Thr = L-threonin

Phe = L-fenylalanin

Ala = L-alanin

Lys = L-lysin

Asp = kyselina L-asparagová

Cys = L-cystein

Arg = L-arginin

Gin = L-glutamin

Pro = L-prolin

Leu = L-leucin

Met = L-methionin

Ser = L-serin

Asn = L-asparagin

His = L-histidin

Trp = L-tryptofan

Val = L-valin

D-beta-Nal = D-beta-naftylalanin

INIP = izonipecotyl

IMA = imidazolylacetyl

-2CZ 291798 B6

GAB = 4-aminobutyryl

Mrp = 2-alkyltryptofan.

Alkylovou skupinou je nižší alkylová skupina o 1 až 3 atomech uhlíku. Jde tedy o methyl, ethyl, propyl nebo izopropyl, nej výhodnější je methylová skupina.

V případě, že zkratku aminokyseliny předchází písmeno D, to znamená to D-konfiguraci uvedeného zbytku aminokyseliny.

Výhodnými látkami pro uvolnění růstového hormonu podle vynálezu jsou následující sloučeniny:

INIP-D-Mrp-D-Trp-Phe-Lys-NH₂; INIP-D-Mrp-D-p-Nal-Phe-Lys-NH₂;

IMA-D-Mrp-D-Trp-Phe-Lys-NH₂; IMA-D-Mrp-D-p-Nal-Phe-Lys-NH₂;

GAB-D-Mrp-D-Trp-Phe-Lys-NH₂; GAB-D-Mrp-D-P-Nal-Phe-Lys-NH₂;

kde Mrp znamená 2-methyltryptofan a INIP, IMA a GAB mají svrchu uvedený význam, jakož i adiční soli těchto peptidů s farmaceuticky přijatelnými organickými nebo anorganickými kyselinami.

Uvedené látky je možno podávat parenterálně, avšak pohodlněji perorálně nebo do nosu, nebo je možno je zpracovat do systémů s řízeným uvolněním, jako jsou biologicky degradovatelné mikrokapsle, mikrokuličky, podkožní implantáty a podobně.

Peptidy podle vynálezu je možno připravit běžnými postupy z chemie peptidů, jak na pevné fázi, tak v roztoku nebo dalšími klasickými postupy. Syntéza na pevné fázi začíná od C-zakončení připravovaného peptidů. Vhodný výchozí materiál je možno připravit například tak, že se chráněná alfa-aminokyselina naváže na chlormethylovanou pryskyřici, hydroxymethylovanou pryskyřici, benzhydrylaminopryskyřici, tj. BHA, nebo na para-methylbenzhydrylaminopryskyřici, p-Me-BHA. Chlormethylované pryskyřice se dodávají například pod značkou BIOBRADS® SX 1 (BioRad Laboratories, Richmond, Califomia). Příprava hydroxymethylových pryskyřic je popsáno v Bodansky a další, Chem. Ind. (Londýn), 38, 15997, 1966. Pryskyřice typu BHA byly popsány v Pietta a Marshall, Chem. Comm., 650, 1970 a běžně se dodávají (Peninsula Laboratoieres lne., Belmont, Califomia).

Po počátečním navázání je možno odstranit ochrannou skupinu na alfa-aminokyselině různými činidly, například kyselinou trifluoroctovou TFA, nebo chlorovodíkovou HC1 v organickém rozpouštědle při teplotě místnosti. Po odstranění ochranné skupiny na alfa-aminokyselině je možno postupně navázat v požadovaném pořadí zbývající chráněné aminokyseliny. Každá z chráněných aminokyselin se obecně nechá reagovat v přebytku přibližně 3* při použití vhodné aktivační skupiny pro karboxylovou skupinu, jako je například dicyklohexylkarbonyldiimid DCC nebo diizopropylkarbodiimid DIC v roztoku například v methylenchloridu nebo dimethylformamidu DMF, použít je možno také směs těchto látek. Po získání celého řetězce je možno výsledný peptid odštěpit od pryskyřice působením vhodného reakčního činidla, například fluorovodíku HF, který nejen odštěpí peptid od pryskyřice, nýbrž také běžné ochranné skupiny na postranních řetězcích. Při použití chlormethylované nebo hydroxymethylované pryskyřice vede působení HF ke tvorbě peptidů ve volné formě. V případě, že se užije BHA nebo p-Me-BHApryskyřice, vede působení HF přímo ke tvorbě amidu peptidů ve volné formě.

Uvedený postup je známý a byl popsán v publikaci Atherton a Sheppard, Solid Phase Peptide Synthesis (IRL Press, Oxford, 1989).

-3CZ 291798 B6

Pokud jde o postupy, prováděné v roztoku, byly tyto postupy podrobně popsány v publikacích Bodansky a další, Peptide Synthesis, 2. vydání, John Wiley and Sons, New York, N. Y., 1976 a Jones, The Chemical Synthesis of peptides, Clarendon Press, Oxford, 1994.

Sloučeniny podle vynálezu je možno podávat různým živočichům, včetně člověka, účinné dávky je možno snadno stanovit podle druhu živočicha, věku, pohlaví a hmotnosti. Například u člověka při nitrožilním podání se výhodná dávka pohybuje v rozmezí 0,1 až 10 mikrogramů peptidu na kg hmotnosti. Při perorálním podání je zapotřebí užít obvyklého vyššího množství. Například při perorálním podání u člověka se bude typická dávka pohybovat v rozmezí 30 až lOOOmikro10 gramů/kg. Přesnou dávkuje možno snadno stanovit jednoduchými pokusy.

Farmaceutický prostředek podle vynálezu bude obsahovat účinnou složku nebo její adiční sůl s organickou nebo anorganickou kyselinou, jednotlivě nebo ve směsi a popřípadě spolu s nosným prostředím, ředidlem, matricí nebo povlakem pro zpomalené uvolnění účinné látky. Farmaceutic15 ké formy se zpomaleným účinkem jsou zvláště vhodné, může jít například o biologicky degradovatelné matrice, vhodné pro podkožní podání ve formě implantátu. Příklady takových matric byly popsány ve WO 92/22600 a WO 95/12629.

Biologická účinnost

Účinnost sloučenin podle vynálezu in vivo byla stanovena na krysách ve stáří 10 dnů. Podkožně (s.c.) bylo podáno 300 mikrogramů/kg nebo v případě studia závislosti účinku na dávce byly podány různé dávky podle publikace R. Deghenghi a další, Life Sciences, 54, 1321, 1994. Výsledky jsou shrnuty v následující tabulce, uvolněný GH byl měřen 15 minut po podání účinné 25 látky.

GHRP-2, kteiý byl užit jako kontrolní standard, má strukturu D-Ala-D-beta-Nal-Ala-Trp-DPhe-Lys-NH₂ podle Chem a Clarke, J. Neuroend., 7,179, 1995.

Tabulka

Peptid	dávka pg/kg s.c.	GH kontrolní GH uvolněný
(ng/ml)	(ng/ml)
His-D-Mrp-Ala-Trp-DPhe-Lys-Thr-NH₂	300	31±8	176±20
His-D-Mrp-Ala-Trp-DPhe-Lys-D-Thr-NH₂	300	31±8	169±27
D-Thr-D-Mrp-Ala-Trp-D-Phe-Lys-D-Thr-NH₂	300	31±8	266±20
D-Thr-His-D-Mrp-Ala-Trp-D-Phe-Lys-NH₂	300	31±8	86±19
D-Ala-D-Mrp-Ala-Trp-D-Phe-Lys-NH₂	40	34±1	200±20
D-Ala-D-Mrp-Ala-Trp-D-Phe-Lys-NH₂	320	34±1	251±32
His-D-Mrp-Ala-Trp-NH₂	5000	69±14	124±37
imidazolacetyl-D-Mrp-Ala-Trp-D-Phe-Lys-NH₂	300	20±3	159±27
INIP-D-Mrp-D-Trp-Phe-Lys-NH₂	300	15	155
INIP-D-Mrp-D-P-Nal-Phe-Lys-NH₂	300	15	150
GAB-D-Mrp-D-Trp-Phe-Lys-NH₂	300	10	110
(GHRP-2)	300	10	98,6

Účinnost in vitro na adenylcyklázu byla měřena na buněčném materiálu z předního laloku 35 hypofýzy u krys s hmotností 150 g. bylo možno prokázat 30% vzestup ve srovnání s výchozí hodnotou při dávce EC₅₀=0,23 nmol peptidu D-Ala-D-Mrp-Ala-Trp-D-Phe-LysNH₂, kdežto peptid GHRP-6, His-D-Trp-Ala-Trp-D-Phe-LysNH₂ byl neúčinný.

Praktické provedení vynálezu bude osvětleno následujícími příklady.

-4CZ 291798 B6

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Příprava GAB-D-Mrp-D-Trp-Phe-Lys-NH₂ (Mrp = 2-methyltryptofan)

Syntéza byla uskutečněna na pevné fázi při použití 9-fluorenylmethyloxykarbonylaminokyselin (Fmoc), včetně přípravy pryskyřice, příprava byla prováděna v reaktoru tvaru sloupce jedním z několika známých postupů podle publikace Solid phase peptide synthesis, E. Atherton a R. C. Sheppard, IRL Press a Oxford University Press, 1989. Chráněnými aminokyselinami byly Fmoc-Lys(Fmoc)-Opfp (Opfp = pentafluorfenylester), Fmoc-Phe-Opfp, Fmoc-D-Trp-Opfp, Fmoc-D-2-Me-Trp-Opfp a Fmoc-GAB-Opfp. Je také možno použít reakční činidla podle Castra, hexafluorát (BOP) a benztriazol-l-yloxy-tris(pyrrolidino)fosfoniumhexafluorfosfát podle publikace Le Nguyen a Castro, 1988, Peptide Chemistry 1987, s. 231-238, Protein Research Foundation Osaka, a Tetrahedron Letters, 31,205, 1990. Jde o výhodná reakční činidla pro usnadnění vazby.

Po odštěpení a izolaci se výsledný peptid čistí ve formě acetátu. Čistota (HPLC) = 98 %, molekulová hmotnost (M+LF) = 764,3, teoretická hodnota je 763,9.

Příklad 2

Způsobem podle příkladu 1 byly připraveny následující peptidy, které byly získány ve formě acetátů.

INIP-D-Mrp-D-Trp-Phe-Lys-NH₂, čistota (HPLC) = 99,0 %, molekulová hmotnost M+LF = 801,4, teoreticky 790,0.

JNIP-D-Mrp-D-beta-Nal-Phe-Lys-NH₂, čistota (HPLC = 96,5 %, molekulová hmotnost M+HF = 801, 4, teoreticky 801,0.

IMA-D-Mrp-D-Trp-Phe-Lys-NH₂, čistota (HPLC) = 99,2 %, molekulová hmotnost M+EF = 786,5, teoreticky = 786,8.

IMA-D-Mrp-D-beta-Nal-Phe-Lys-NH₂, čistota (HPLC) = 97,3 %, molekulová hmotnost M+H^4- = 798,3, teoreticky = 797,9,

GAB-D-Mrp-D-beta-Nal-Phe-Lys-NH₂, kde Mrp = 2-methyltryptofan a INIP, IMA a GAB mají svrchu uvedený význam.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Peptidy obecného vzorce

A-D-Mrp-B-C, kde

A znamená imidazolacetyl, izonipecotyl nebo 4-aminobutyiyl,

D znamená označení pravotočivého izomerů,

Mrp znamená 2-alkyltryptofan o 1 až 3 atomech uhlíku v alkylové části,

B znamená D-Trp, nebo D-beta-naftylalanin,

C znamená Phe-LysNH₂, jakož i adiční soli těchto látek s farmaceuticky přijatelnými organickými nebo anorganickými kyselinami.
2. Peptidy podle nároku 1, obecného vzorce, v němž 2-methyltryptofan, 2-ethyltryptofan, 2-propyltryptofan a 2-izopropyltiyptofan.
3. Peptidy podle nároku 1, obecného vzorce, v němž Mrp znamená 2-methyltryptofan.
4. Použití peptidů podle nároků 1 až 3 pro výrobu farmaceutického prostředku pro uvolnění růstového hormonu u živočichů.
5. Použití podle nároku 4, pro výrobu farmaceutického prostředku pro použití u člověka.
6. Použití peptidů podle nároků 1 až 3 pro výrobu farmaceutického prostředku pro zvýšení nitrobuněčné účinnosti adenylcyklázy.
7. Farmaceutický prostředek, vyznačující se tím, že jako účinnou složku obsahuje alespoň jeden peptid podle nároků 1 až 3, popřípadě ve směsi s nosičem nebo pomocnými látkami.
8. Farmaceutický prostředek podle nároku 7, vyznačující se tím, že je ve formě určené pro parenterální, perorální nebo intranasální podání, pro podání ve formě s řízeným uvolněním účinné látky nebo má formu podkožního implantátu.