CZ296014B6 - Způsob vazby zbytku aminokyseliny na peptidový řetězec - Google Patents

Abstract

Popisuje se způsob použití trifosgenu jako účinného vazebného činidla při peptidové syntéze vytvářením chloridu aminokyseliny in situ z chráněné aminokyseliny. Tento způsob je zvláště vhodný pro vazebné reakce na stericky bráněné zbytky aminokyselin nebo pro další jiné vazby. Navíc může být stejné činidlo použito pro derivatizaci peptidů tvorbou amidové vazby mezi volným aminem na peptidu a karboxylovou kyselinou nebo pro vazbu aminokyseliny na pevný nosič.

Description

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká způsobu vytváření chloridů aminokyselin in šitu s použitím bis— (trichlormethyl)karbonátu, běžně známého jako trifosgen, a způsobů použití tohoto postupu pro syntézu peptidů na pevné fázi a pro derivatizaci pevného nosiče.

Dosavadní stav techniky

V oboru syntézy peptidů jsou některé vazebné reakce známé jako obtížně proveditelné, zvláště takové reakce, které se týkají vazby na objemově nebo stericky bráněné aminokyselinové zbytky, jako jsou N-alkylované, C-alkylované a C“-rozvětvené aminokyseliny. Aby bylo možno dosáhnout přijatelných výtěžků při provádění těchto reakcí, byla vyvinuta řada speciálních vazebných činidel. Mezi další známé postupy pro zlepšení výtěžku vazebných reakcí patří použití předem vytvořených chloridů aminokyselin.

Obecné použití chloridů chráněných aminokyselin při syntéze peptidů na pevné fázi (solid phase peptide synthesis, SPPS) je omezené zejména proto, že chloridy fluorenylmethoxykarbonyl (Fmoc) aminokyselin, které mají vedlejší řetězce chráněné labilními ochrannými skupinami včetně bez omezení skupin t-butyl (t-Bu), t-butoxykarbonyl (Boc) nebo trityl (Trt), mají omezenou stabilitu při skladování. Například chloridy Fmoc-aminokyselin (AA) s vedlejšími řetězci chráněnými t-Bu nemohly obecně být použity. V některých případech (kyselina asparagová a kyselina glutamová) nemohly být chloridy získány a v jiných případech (tyrosin, serin, threonin) byla jejich stabilita při skladování nedostatečná pro praktické použití. Navíc je příprava chloridů odvozených od sloučenin Fmoc-lysin(Boc), Fmoc-tryptofan(Boc), Fmoc-cystein(Trt), Fmocglutamin(Trt) a Fmoc-arginin-2,2,5,7,8-pentamethylchroman-6-sulfonyl(Pmc) problematická, protože dochází k vedlejším reakcím a látky vyžadují speciální reakční podmínky a čištění (Carpino a další, Acc. Chem. Res. 29: 268, 1996). Tento problém také ztěžuje obecné použití předem vytvořených chloridů Fmoc-aminokyselin při automatické syntéze peptidů. Přes tato omezení se chloridy kyselin používaly v SPSS zvláště pro sestavování bráněných sekundárních aminokyselin (viz Carpino a další, 1996 výše, a tam uvedené odkazy).

Vazba chráněných aminokyselin na N“-alkylované aminokyseliny byla dosud považována za obtížnou jak v roztoku, tak i na pevné fázi. Tato vazba byla používána u modelových peptidů pro demonstraci účinnosti nových, účinnějších vazebných metod. V těchto modelech by byly jako nukleofílní činidla použity N-methylované aminokyseliny, protože bylo zjištěno, že vazba na N-methylované aminokyseliny se sterickou zábranou na C“ (např. N-methylvalin a kyselina N-methylaminoizomáselná) probíhá mnohem pomaleji než vazba na prolin. Některá vazebná činidla a metody aktivace, jako je brom-tris-pyrrolidinofosfoniumhexafluorfosfát (PyBroP) (Coste a další, Tetrahedron Lett. 31, 669, 1990), l-hydroxy-7-azabenzotriazol (HOAt)/O-(7azabenzotriazol-l-yl)-l,l,3,3-tetramethyluroniumhexa-fluorfosfát (HATU) (Carpino a další, J. Chem. Soc., Chem. Commun. 201, 1994), urethanem chráněné N-karboxyanhydridy (UNCA) (Spencer a další, Int. J. Pep. Prot. Res. 40: 282, 1992) a halogenidy kyselin (Carpino a další, 1996 výše) byly zvláště doporučeny pro dosažení vazby na N-alkylaminokyseliny.

Bylo zjištěno, že metoda používající chloridy kyselin je nejlepší způsob vazby chráněných aminokyselin na stericky bráněné deriváty aminokyselin, jako jsou N-alkylaminokyseliny v průběhu SPPS kostry cyklických peptidů. Aby bylo možno předejít omezením spojeným s metodou předem vytvářených chloridů kyselin, a aby bylo možno použít tohoto způsobu obecně při SPPS, bylo by výhodné vyvinout účinnou a obecně použitelnou metodu umožňující vytváření chloridů Fmoc-aminokyselin (Fmoc-AA) in šitu.

-1 CZ 296014 B6

Reakční činidlo bis-(trichlormethyl)karbonát (BTC) (Councler, C., Ber. Dtsch. Chem. Ges.VP. 1697, 1880), nazývané také hexachlordimethylkarbonát nebo „trifosgen“, je pevná stabilní náhrada fosgenu, ekvivalentní 3 mol fosgenu. Trifosgen byl používán jako účinné karbonylační činidlo pro syntézu různých aza-analogů peptidů obsahujících aza-alanin, kyselinu aza-asparagovou a zbytky aza-asparaginu na pevné fázi (André a další, J. Pep. Sci. 3: 429, 1997).

Použití trifosgenu jako reakčního činidla pro tvorbu izokyanátů nebo jiných reakčních sloučenin použitelných v chemii peptidů bylo popsáno v Eckert DE3440141, Nippon Kayaku JP 10007623. Byla také popsána použitelnost trifosgenu při výrobě různých meziproduktů pro farmaceuticky účinné látky (Hoffman a další, DD292452). Nikde se neuvádí ani nenavrhuje, že trifosgenové reakční činidlo je vhodné pro vytváření chloridů chráněných aminokyselin in šitu, tedy jako vazebného činidla při SPPS (přehled viz Cotarca a další, Synthesis 553, 1996).

Plynný fosgen byl dlouho ceněný při reakcích jak v laboratorním, tak i v provozním měřítku, i když byla také velmi dokumentována nebezpečí, zvláště nebezpečí pro dýchací trakt. Kapalný trichlormethylchloroformát, běžně známý jako „difosgen“ (Fridgen, L. N. a Prol, J. J., J. Org. Chem. 54: 3231, 1989), který byl již použit jako náhrada fosgenu, se ukázal jako použitelný ve všech běžných reakcích využívajících fosgenu, ale pro jeho kapalné skupenství představuje doprava a skladování této sloučeniny stále značné riziko. Protože je BTC krystalická pevná látka (teplota tání 81 až 83 °C), je bezpečnější a umožňuje snadnou manipulaci, je možno toto činidlo používat pro všechny aplikace, kde se vyžaduje fosgenová chemie (Cotarca a další, výše). Z hlediska chemické syntézy poskytuje 1 mol BTC tři molární ekvivalenty fosgenu, který reaguje s hydroxylovými a aminovými skupinami a skupinami karboxylových kyselin jako nukleofílními Činidly, za vytvoření chloroformátu, izokyanátů nebo acylchloridu. Vezmeme-li v úvahu všechny tyto vlastnosti spolu se skutečností, že BTC je levný a méně náchylný k hydrolýze než fosgen, je překvapivé, že dosud nebylo uvažováno použití BTC jako obecného vazebného činidla.

Analogy peptidů s cyklizovanou kostrou

Cyklizace v kostře (backbone cyclization) je způsob, který umožňuje konverzi peptidů na konformačně omezená peptidomimetika s požadovanými farmakologickými vlastnostmi jako je metabolická stabilita, selektivita a zlepšená biologická dostupnost (Gilon a další, Biopolymers 32: 745,1991; Býka další, J. Med. Chem. 39: 3174,1996; Gilon a další, J. Med. Chem. 42: 919,1998).

Při cyklizaci kostry se atomy N“ a/nebo C“ v peptidové kostře spojují různými mezemíkovými skupinami (spacers). Pro syntézu peptidů s cyklickou N-kostrou bylo připraveno velké množství ortogonálně chráněných fúnkcionalizovaných N“-alkylaminokyselin (N-vazebné jednotky) (Bitan a další, J. Chem. Soc., Perkin trans. I, 1501, 1997a; Muller a další, J. Org. Chem. 62: 411, 1997). Tyto jednotky byly zařazovány do peptidů pomocí SPPS nebo metodami reakcí v roztoku a po ortogonálním odstranění ochranných skupin z ω-funkčních skupin na N“-alkylu se tyto látky cyklizují. Kritickým krokem při syntéze cyklických peptidů s N-kostrou je vazba chráněných aminokyselin na stericky bráněný sekundární amin N“(to-funkcionalizovaný alkyl) aminokyselinový zbytek na peptidylové pryskyřici.

Syntéza cyklických peptidů s N-kostrou, které zahrnovaly N^a(<a-funkcionalizovaný alkyl)glycinové stavebné jednotky, byla již popsána. V těchto případech bylo dosaženo vazby chráněných aminokyselin na sekundární amin vazebné jednotky Gly navázané na peptidylovou pryskyřici vícenásobnými reakcemi s benzotriazol-l-yl-oxy-tris-(dimethylamino)fosfoniumhexafluorfosfátem BOP nebo PyBroP, jako vazebnými činidly (Bitan a další, J. Pept. Res. 49: 421, 1997b; Byk a další, 1996 výše). Obecně však bylo zjištěno, že vazba chráněných aminokyselin na stavební jednotky jiné než Gly (cyklické stavební jednotky neobsahující v kostře Gly) je obtížná a dokonce nemožná.

Bylo ukázáno, že vazba mnoha Fmoc-aminokyselin na stericky bráněné sekundární aminy včetně řady stavebních jednotek neobsahujících Gly navázaných na peptidylovou pryskyřici, by mohla

-2CZ 296014 B6 být uskutečněna se středními až vysokými výtěžky použitím metody využívající chloridy kyselin, ale nikoli fluoridů kyselin (Carpino a další, 1996 výše), nebo jiná reakční činidla jako je PyBrOP (Coste a další, výše, HOAt/HATU Carpino 1994, výše), 2-(2-oxo-l(2H)-pyridyl)-l,l,3,3-bispentamethylenuroniumtetrafluorborát (TOPPipU) Henkleinet a další, „Peptides, 1990“, Proč, of the 21' European Peptide Symposium, E. Giralt a D. Andreu, ed., str. 67 ESCOM Leiden, 1990), UNCA (Spencer a další, 1992) a Mukaiymovo činidlo (Mukaiyama T., Angew. Chem., Int. Ed. Ing., 18: 7078, 1979).

Podstata vynálezu

Předmětem předkládaného vynálezu je poskytnutí způsobu zlepšení obtížně proveditelných vazebných reakcí při SPPS. Dalším předmětem vynálezu je poskytnutí způsobu zlepšení výtěžku požadovaného stereoizomeru při syntéze peptidů na pevné fázi. Ještě dalším předmětem je poskytnutí způsobů pro umožnění vícečetné paralelní syntézy (multiple parallel synthesis, MPS). Dalším předmětem je poskytnutí způsobů pro navázání chráněných aminokyselin na funkcionalizované pevné nosiče nebo pro navázání biologicky nebo lékařsky důležitých ligandů na peptid nebo peptidylovou pryskyřici v průběhu SPPS. Dalším předmětem vynálezu je poskytnutí způsobů pro cyklizaci peptidů navázaných na pevný nosič. Dalším předmětem je poskytnutí způsobů pro tvorbu močovinové vazby zařazené v sekvenci nebo jako můstek cyklizovaných peptidů.

Podle předkládaného vynálezu se poskytuje způsob vytváření chloridů chráněných aminokyselin in šitu použitím činidla jako je fosgen, difosgen nebo výhodněji trifosgen. Chloridy chráněných aminokyselin vytvořené tímto způsobem jsou použitelné zvláště při vazebné reakci zbytku aminokyseliny na peptidový řetězec. Mohou být také použity pro vazbu uhlohydrátové skupiny na peptidový řetězec.

Vytváření chloridů kyselin in šitu použitím způsobů podle předkládaného vynálezu tedy dále poskytuje způsob, při kterém je možno navázat další biologicky důležité kyseliny, včetně bez omezení kyseliny glukuronové, DTPA a DOTA, na peptidový řetězec přes aminovou kostru, nebo funkční skupinu postranního řetězce aminokyseliny. Nyní bylo zjištěno, že podle předkládaného vynálezu může být pro vytváření chloridů chráněných aminokyselin in šitu bis-(trichlormethyl)karbonát, známý také pod triviálním chemickým názvem trifosgen. Použití tohoto způsobu předchází mnoha problémům spojeným s obtížnými kroky vazebných reakcí při SPPS, zvláště v případech, kdy se kroku vazebné reakce účastní stericky bráněné zbytky aminokyselin, nebo analogy aminokyselin s velkým objemem.

Poskytují se metody pro použití BTC jako pohodlného a účinného vazebného činidla pro obtížně proveditelné vazby při SPPS. Tyto metody poskytují značně vyšší výtěžky požadovaného produktu při SPPS se zachováním konfigurace a bez nežádoucích vedlejších reakcí, a umožňují také provádění vícečetných paralelních peptidových syntéz. Tyto metody také umožňují syntézu komplexních analogů peptidů s vícečetnými cyklizacemi, například bř- a tricyklických peptidů.

Jeden způsob podle předkládaného vynálezu poskytuje způsob vazby zbytku aminokyseliny na peptidový řetězec, který zahrnuje následující kroky:

(i) poskytne se zbytek aminokyseliny s volnou karboxylovou skupinou a blokovanou aminoskupinou, popřípadě s dalšími blokovanými funkčními skupinami vedlejších řetězců;

(ii) provede se reakce blokované aminokyseliny s bis-(trichlormethyl)karbonátem v rozpouštědle, které je vzhledem k této reakci inertní, za získání chloridu aminokyseliny;

(iii) provede se neutralizace volné kyseliny přidáním organické báze;

(iv) získaná suspenze obsahující chlorid aminokyseliny se přidá ke sloučenině zvolené ze skupiny zahrnující peptid s blokovaným karboxylovým koncem a volným aminovým koncem, a peptidylovou pryskyřici obsahující alespoň jeden volný aminový konec; a

-3CZ 296014 B6 (v) použije se reakčních podmínek umožňujících vazbu chloridu aminokyseliny na peptid za získání peptidu prodlouženého o jeden zbytek aminokyseliny.

Druhý způsob podle předkládaného vynálezu zahrnuje způsob vazby zbytku aminokyselin na pevný nosič, který zahrnuje následující kroky:

(i) poskytne se zbytek aminokyseliny s volnou karboxylovou skupinou a blokovanou aminoskupinou, popřípadě s dalšími blokovanými funkčními skupinami vedlejších řetězců;

(ii) provede se reakce blokované aminokyseliny s bis-(trichlormethyl)karbonátem v rozpouštědle, které je vzhledem k této reakci inertní, za získání chloridu aminokyseliny;

(iii) provede se neutralizace volné kyseliny přidáním organické báze;

(iv) získaná suspenze obsahující chlorid aminokyseliny se přidá ke sloučenině zvolené ze skupiny zahrnující pryskyřici obsahující alespoň jeden volný aminový konec a pevný nosič nesoucí funkční skupinu schopnou vazby na chlorid; a (v) použije se reakčních podmínek umožňujících vazbu chloridu aminokyseliny na pevný nosič.

Nejvýhodnější provedení podle předkládaného vynálezu je shrnuto ve schématu 1.

Schéma 1

Uskutečnění obtížně proveditelné vazby s použitím BTC v rozpouštědle, které je vůči této reakci

inertní
	-Fmoc-AA-OH +	BTC
	I	II

Fmoc-AA-Cl III

R

HN-CH-CO-peptidyl-pryskyřice

IV

THF, dioxan diglym,

1,3-dichlorpropan

R₃N při 50 °C 1 h dvojí vazebná reakce

R

I

Fmoc-AA-N-CH-CO-peptidyl-pryskyřice

R» V

-4CZ 296014 B6

BCT =	Bis-(trichlormethyl)karbonát (trifosgen)
Fmoc-AA =	Fluorenylmethoxykarbonyl-proteinogenní cc-aminokyselina
R =	Vedlejší řetězce všech proteinogenních a-aminokyselin
R' =	CH3, (CH2)n=2_4-NH-Alloc, (CH2)n=2_3-COOAllyl
R3N =	terciární nebo aromatický amin

Přehled obrázků na výkresech

Obr. 1 Chromatogram HPLC produktu získaného v příkladu 38.

Obr. 2 Analýza produktu získaného v příkladu 38 hmotnostní spektrometrií.

Obr. 3 Chromatogram HPLC produktu získaného v příkladu 49.

Obr. 4 Chromatogram HPLC produktu získaného v příkladu 55.

Obr. 5 Chromatogram HPLC PTR 3227 získaného v příkladu 63.

Obr. 6 Analýza PTR 3229 získaného v příkladu 64 hmotnostní spektrometrií.

Obr. 7 Analýza PTR 3237 získaného v příkladu 65A hmotnostní spektrometrií.

Obr. 8 Chromatogram HPLC s hmotnostní spektrum PTR 3231 získaného v příkladu 65B.

Obr. 9 Chromatogram HPLC a hmotnostní spektrum peptidů MPS č. 20 získaného v příkladu 66.

Obr. 10 Chromatogram HPLC a hmotnostní spektrum analogu cyklosporinu syntetizovaného v příkladu 67.

Podrobný popis vynálezu

Podle předkládaného vynálezu se poskytují způsoby pro vytváření chloridů chráněných aminokyselin in šitu s použitím činidel jako je fosgen, difosgen nebo trifosgen. Ve všech výhodných provedeních uváděných v předkládaném vynálezu se jako příkladů postupů používá syntézy peptidů na pevné fázi, ačkoli jsou tyto postupy velmi vhodné také pro v oboru známou syntézu peptidů v roztoku. Navíc mohou být stejné postupy potenciálně použitelné pro vazbu jiných skupin na peptidový řetězec, včetně bez omezení vazby uhlohydrátové skupiny na peptidový řetězec, a pro způsoby vícečetné paralelní syntézy peptidů. Způsoby podle předkládaného vynálezu jsou také velmi vhodné pro syntézu komplexních peptidových analogů jako jsou bi- a tricyklické peptidy, a pro syntézu analogů cyklosporinu, které obsahují sedm stericky bráněných N-methylaminokyselin. Způsoby jsou také vhodné pro tvorbu močovinové vazby v sekvenci, nebo jako můstku u cyklizovaných peptidů.

Zkratky

Při popisu vynálezu a způsobech jeho provádění a využití se používají některé zkratky.

Například AA označuje aminokyselinu; ACN je acetonitril; Alloc je allyloxykarbonyl; Boc je t-butoxykarbonyl; BOP je benztriazol-l-yl-oxy-tris-(dimethylaminofosfoniumhexafluorofosfát; BCT je bis-(trichlormethyl)karbonát; DCM je dichlormethan; DIEA je diizopropylethylamin; DOTA je kyselina tetraazacyklodekantetraoctová; DTPAje kyselina diethylentriaminpentaoctová; Fmoc je fluorenylmethoxykarbonyl; Gin je glutamin; HATUje 0-(7-azabenzotriazol-l-yl)-

1,1,3,3-tetramethyluroniumhexafluorfosfát; HOAt je l-hydroxy-7-azabenztriazol; HPPA je kyselina parahydroxyfenylpropionová; MBHA je methylbenzhydrylamin; Me je methyl; MPS je vícečetná paralelní syntéza (multiple parallel synthesis); NMP je N-methylpyrrolidon; Pmc je 2,2,5,7,8-pentamethylchroman-6-sulfonyl; PyBrOP je brom-tris-pyrrolidino-fosfoniumhexa

-5CZ 296014 B6 fluorfosfát; SPPS je syntéza na pevné fází; t-Bu je t-butyl; TFA je kyselina trifluoroctová; THF je tetrahydrofuran; TIS je triizopropylsilan; TOPPipU je 2-(2-oxo-l(2H)-pyridyl)-l,l,3,3-bispentamethylenuroniumtetrafluorborát; Trt je trityl; UNCA označuje urethanem chráněné N-karboxyanhydridy.

Aminokyseliny

Aminokyseliny používané v rámci tohoto vynálezu jsou dostupné komerčně nebo mohou být získány rutinními metodami syntézy. Přirozeně kódované aminokyseliny a jejich deriváty jsou reprezentovány třípísmenovými kódy podle konvenci IUPAC. Jestliže není uvedeno jinak, byl použit L izomer. D izomery se označují písmenem „D“ před zkratkou zbytku.

Seznam nekódovaných aminokyselin: Abu je kyselina 2-aminomáselná, Aib je kyselina 2-aminoizomáselná, β-Ala je β-alanin, Amb je kyselina 3-aminomethylbenzoová; ChxGly znamená cyklohexylglycin, Dab znamená kyselinu diaminomáselnou, GABA znamená kyselinu gama aminomáselnou, Hcys je homocystein, lNal je 1-naftylalanin, 2Nal je 2-naftylalanin, Nva je norvalin, (p-Cl)Phe je para chlorfenylalanin, (p-NH₂)Phe je para aminofenylalanin, (p-F)Phe je para fluorfenylalanin, (p-NO₂)Phe je para nitrofenylalanin, Sar je sarkosin, Thi je thienylalanin.

Jak se používá v popisu a nárocích, „blokované aminokyseliny“ označují aminokyseliny, ve kterých je reaktivní skupina chráněná specifickou blokující nebo ochrannou skupinou, která může být selektivně odstraněna, a alternativně může být označována termínem „chráněná aminokyselina“ známých v oboru.

Jak se zde používá, „peptid cyklický v kostře“, znamená analog lineárního peptidu, který obsahuje alespoň jednu vazebnou jednotku, která byla spojena za vytvoření můstku přes dusík alfa peptidové kostry s další stavební jednotkou, nebo s další aminokyselinou v sekvenci. Výraz „stavební jednotka“ označuje N“-(o-funkcionalizovaný derivát aminokyseliny.

Stavební jednotky používané při syntéze peptidů cyklizovaných vkostře

Termín „stavební jednotka“ označuje N“-m-funkcionalizovaný derivát kyseliny obecného vzorce 1:

B-N-CH(R’)-CO-OH

I

X

I

A—G (1) kde X je mezemíková skupina zvolená ze skupiny alkylen, substituovaný alkylen, arylen, cykloalkylen a substituovaný cykloalkylen; R' je postranní řetězec aminokyselin, popřípadě svázán se specifickou ochrannou skupinou; B je ochranná skupina zvolená ze skupiny alkoxy, substituovaný alkoxy nebo arylkarbonyl a G je funkční skupina zvolená ze skupiny aminy, thioly, alkoholy, karboxylové kyseliny a estery, aldehydy, alkoholy a alkylhalidy; a A je specifická ochranná skupina skupiny G.

Tato stavební jednotka zabudovaná do sekvence peptidu bude mít následující strukturu:

-6CZ 296014 B6

---------N-CH(R’)-CO--------X

-----------G (2) kde X je mezemiková skupina zvolená ze skupiny alkylen, substituovaný alkylen, ary len, cykloalkylen a substituovaný cykloalkylen; R' je postranní řetězec aminokyseliny, popřípadě s navázanou specifickou ochrannou skupinou; a G je funkční skupina zvolená ze skupiny aminy, thioly, alkoholy, karboxylové kyseliny a estery, a alkylhalidy; která je zabudována do peptidové sekvence a potom selektivně cyklizována prostřednictvím funkční skupiny G s jedním z postranních řetězců aminokyselin v uvedené peptidové sekvenci, nebo s dalším ω-funkcionalizovaným derivátem aminokyseliny.

Stavební jednotky se zkracují třípísmenovým kódem odpovídající modifikované aminokyseliny následovaným typem reaktivní skupiny (N pro amin, C pro karboxyl) a uvedením počtu mezemíkových methylenových skupin. Například označení GlyC2 popisuje modifikovaný zbytek Gly s karboxylovou reaktivní skupinou a dvouuhlíkovým methylenovým mezemíkem, a označení PheN3 znamená modifikovanou fenylalaninovou skupinu s aminoreaktivní skupinou a tříuhlíkovým methylenovým mezemíkem.

Metody pro výrobu těchto stavebních jednotek se popisují v mezinárodních patentových přihláškách zveřejněných jako WO 95/33765 a WO 98/04583 a v patentech US 5 723 575; 5 811 391; 5 883 293; 5 874 529 a 5 770 687, přičemž všechny tyto prameny se výslovně zařazují do předkládaného popisu odkazem, tak, jak se uvádějí ve svém celku.

Obecné postupy

Ve většině následujících příkladů byly používané určité postupy které jsou pro jednoduchost dále shrnuty v odstavci obecných postupů.

Obecný postup A: SPPS modelových peptidů g Rinkovy amidmethylbenzhydrylaminové pryskyřice (MBHA) (0,55 mmol/g) byl ponechán nabobtnat 1,5 h v N-methylpyrrolidonu (NMP) v reakční nádobě opatřené dnem ze sintrovaného skla a umístěné na třepačce. Ochranná skupina Fmoc byla odstraněna 20% piperidinem v NMP (dvakrát 15 min, vždy 8 ml). Po promytá NMP (5 x, 8 ml, 2 min) byla odstranění Fmoc monitorováno Kaiserovým testem.

Vazebný cyklus byl prováděn s Fmoc AA nebo Fmoc N-Me AA nebo Fmoc-stavební jednotkou (3 ekvivalenty) PyBrOP (3 ekvivalenty) diizopropylethylamin (DIEA) (6 ekvivalentů) v NMP (8 ml) 1 h při pokojové teplotě. Ukončení reakce bylo monitorováno Kaiserovým testem a rozpouštědlo bylo odstraněno filtrací. Pryskyřice byla promyta NMP (5 x, 8 ml, 2 min). Ochranná skupina Fmoc byla odstraněna jako výše. Vazba Fmoc AA nebo Fmoc N-Me AA nebo Fmocstavební jednotky na AA-pryskyřici byla prováděna jak bylo popsáno výše s použitím PyBrOP jako vazebného činidla. Vazba Fmoc AA nebo Fmoc N-Me AA nebo Fmoc-vazebné jednotky na N-Me nebo vazebnou jednotku-pryskyřice byla prováděna podle postupu popsaného jako obecný postup B. Prodlužování peptidu bylo prováděno opakováním odstraňování ochranné skupiny Fmoc a vazebného cyklu popsaného výše. Konečné odstranění ochranné skupiny Fmoc bylo následováno promytím (NMP 5 x 8 ml, 2 min, a dichlormethan (DMC) 3 x 8 ml, 2 min).

-7CZ 296014 B6

Peptidy lová pryskyřice byla sušena ve vakuu. Rychlé odštěpení bylo prováděno tak, že malé množství peptidylové pryskyřice bylo zpracováno použitím 95% kyseliny trifluoroctové (TFA) s obsahem 1 % triizopropylsilanu (TIS) a 4 % H₂O. Rozpouštědla byla odstraněna v proudu dusíku a zbytek byl vložen do směsi voda : acetonitril (ACN s obsahem 0,1 % TFA). Po filtraci byl roztok nastříknut na HPLC a/nebo do hmotnostního spektrometru.

Obecný postup B: Vazba sloučenin Fmoc-AA na AA peptidylovou pryskyřici a na N-alkylovanou AA pryskyřici použitím BTC

Fmoc AA nebo Fmoc N-Me AA nebo Fmoc-stavební jednotka (5 ekv., 0,275 mmol) a BTC (1,65 ekv., 0,09 mmol) byly rozpuštěny buď v tetrahydrofuranu (THF), dioxanu, diglymu, nebo v 1,3-dichlorpropanu za získání 0,15M roztoku, do kterého byl přidán 2,4,6-kolidin (14 ekv., 0,75 mmol) za získání bílé suspenze. Tato suspenze byla vlita do N-Me AA nebo stavební jednotky-peptidyl-pryskyřice předem promyté vhodným rozpouštědlem. Směs byla protřepávána při 50 °C 1 h a zfiltrována. Peptidylová pryskyřice byla promyta DCM, ponechána nabobtnat pomocí vhodného reakčního rozpouštědla a vazebná reakce byla ještě jednou opakována. V případech, kdy byla vazebná reakce prováděna s Fmoc-AA na AA peptidylovou pryskyřici, byly použity pouze 3 ekv. sloučenin Fmoc-AA, 1 ekv. BTC a 8 ekv. 2,4,6-kolidinu v dioxanu při pokojové teplotě po dobu 1 h.

Obecný postup C: Vazba Fmoc AA nebo N-Me AA nebo vazebných jednotek na funkcionalizovaný pevný nosič

Fmoc AA nebo Fmoc NMeAA nebo Fmoc-stavební jednotka ve formě chloridu byly připraveny in sítu jak bylo popsáno v postupu B. Suspenze v dioxanu byla vlita na předaktivované sklo nebo na hydroxymethylovaný polystyren. Směs byla třepána při 50 °C 1 h a zfiltrována. Derivatizovaný nosič byl promyt DCM. Stupeň derivatizace byl určen Fmoc piperidinovou metodou.

Obecný postup D: Derivace amino- nebo hydroxypeptidylové pryskyřice

Kyseliny jako je 1,2,3,4-tetra-O-acetylglukoronová kyselina, diethylentriaminpentaoctová kyselina (DTPA), tetraazocyklo-dekantetraoctová kyselina (DOTA) nebo parahydroxyfenylpropionová kyselina (HPPA) byly převedeny na odpovídající chloridy kyselin použitím BTC, jak bylo popsáno v postupu B. Suspenze byla vlita do amino- nebo hydroxypeptidylové pryskyřice a zahřívána 1 h při 50 °C. Po zfiltrování a promytí byla derivatizovaná peptidylová pryskyřice štěpena a charakterizována jak se popisuje v postupech A, G a H.

Obecný postup E: SPPS peptidů cyklizovaných v kostře - cyklizace a štěpení

Peptidylové pryskyřice obsahující dvě vazebné jednotky byly syntetizovány použitím obecných postupů A & B. Ochranné skupiny Allyl/Alloc byly odstraněny reakcí s tetrakis(trifenylfosfin)paladiem, 5% kyselinou octovou a 2,5% N-methylmorfolinem v DCM v atmosféře argonu po dobu 1,5 h při pokojové teplotě. Peptidová pryskyřice byla promyta chloroformem a potom NMP. Cyklizace byla prováděna v NMP s PyBOP (3 ekvivalenty) a DIEA (6 ekvivalentů) 1 h při pokojové teplotě. Po promytí NMP byla cyklizace opakována. Peptid cyklický v kostře byl zbaven ochranných skupin a odštěpen z pryskyřice působením 10 ml směsi TFA 94 %, voda 2,5 %, TIS 1 % a ethandithiol 2,5 % při 0 °C v atmosféře argonu 0,5 hod a při pokojové teplotě 1 až 3 h. Pryskyřice byla odstraněna filtrací a promyta dalším množstvím TFA, spojené roztoky byly odpařeny proudem dusíku za získání oleje, který po zpracování chladným etherem (40 ml) ztuhnul. Ether byl odstraněn po centrifugaci a pevná látka byla sušena ve vysokém vakuu přes noc za získání surového peptidů.

Obecný postup F: Cyklizace peptidů obsahujících dvě N-stavební jednotky použitím BTC

Peptidylové pryskyřice s obsahem dvou N-stavebních jednotek byly syntetizovány obecnými postupy A, B a E. Cyklizace byla prováděna v dioxanu s BTC (0,33 ekv.) při pokojové teplotě

-8CZ 296014 B6

h. Chemické postupy a charakterizace byly prováděny podle popisu v obecných postupech E, G aH.

Obecný postup G: Analýza surových peptidů HPLC

Vzorek surových peptidů byl rozpuštěn v rozpouštědle A (voda + 0,1% TFA) a nastříknut do přístroje HPLC (kolona Cl8 250 x 4 mm, průtok 1 ml/min). Jako eluent byla použita rozpouštědla A a B (ACN, 0,1% TFA). Hydrofobní peptidy byly eluovány použitím lineárního gradientu od 90 % do 10 % A v průběhu 35 min. Hydrofílní peptidy byly eluovány použitím lineárního gradientu od 100 % do 10 % A v průběhu 35 min. Peptidy byly detekovány online UV detekto1 o rem nastaveným na 214 nm.

Obecný postup H: Analýza peptidů hmotnostní spektrometrií

Surové peptidy nebo frakce jímané z HPLC byly analyzovány hmotnostním spektrometrem s kvadrupólovým analyzátorem nebo hmotnostním spektrometrem s iontovou pastí.

Vynález bude nyní blíže popsán na příkladech týkajících se konkrétních peptidů a peptidomimetických sloučenin. Tyto příklady nemají být považovány za omezující a předpokládá se, že vynález není omezen rozsahem příkladů, ale rozsahem nároků následujících po popisu.

Příklady provedení vynálezu

Chloridy karboxylových kyselin se nejpohodlněji připravují, jestliže reaguje BTC s karboxylovými kyselinami v rozpouštědle, které je vzhledem k BTC inertní, při teplotách v rozmezí mírně 25 nad pokojovou teplotou až do teploty varu pod zpětným chladičem, s výhodou v přítomnosti

DMF nebo terciárních aminů jako katalyzátorů. Je důležité, že použité rozpouštědlo má být inertní vzhledem k BTC, aby bylo možno dosáhnout požadovaných výsledků syntézy.

S ohledem na tyto předpoklady a na skutečnost, že v případě předem připravených chloridů slou30 cenin Fmoc-AA byly nejlepší konverze získány zahříváním vNMP, prováděli přihlašovatelé předběžné studie s BTC za následujících podmínek: sloučeniny Fmoc-AA (3 ekv.) a BTC (1,2 ekv.) reagovaly vNMP a potom byl přidán DIEA (12 ekv.). Po půlhodině při pokojové teplotě byly aktivované AA přilévány k peptidové pryskyřici, která byla ponechána nabobtnat při 65 °C 1 h. Dvojí vazba za těchto podmínek poskytla požadované peptidy, ale se ztrátou stereo35 chemického uspořádání. Změna báze na slabší stericky bráněný 2,4,6-kolidin nezlepšila významným způsobem stereochemickou integritu vazby, jak je ukázáno v tabulce 1.

Závěrem je možno uvést, že i když je rozpouštědlo NMP velmi účinné při obecných postupech syntézy peptidů na pevné fázi, jak je v oboru dobře známo, není vhodným reakčním činidlem pro 40 vazby zprostředkované BTC.

-9CZ 296014 B6

Tabulka 1: Shrnutí obtížně proveditelných reakcí s použitím BTC/NMP při 65

Poměr isomerů (c)	0> v“	v-	CO	to	a>	| 1:20	co V“	X— Φ E o j# c Φ x?	jeden isomer	jeden isomer
. 'p -Q cc 3	T~ ¢0 a“ CM + CM N“ 0' CM	CM to CN ·+ O ’Τ CM	IO CD Ν' r~ + co CN •sr	CO co co + a> <53 CN	CN N b-? +· O Nh?	CO <D T~ + •^r o co T“*	σ> o. o (N 4· O N> σΓ τ—	o? Ν- έο V*	N> co G) V“	CN N* 0) V“
M. h. produktu	O c Φ NI Φ «J c	CO co co” 00 to	CO 00 co CD	co CD	σΓ CN mt	0) N	Τ’ N-T co N	V tn o to	Τ’’ N~ Ν'	CO r~ CD UO	Γ-’ LD ΙΛ
o c Φ s o CL >x >	xr U) co ID	r- co CO CD	<3> CN CN CD -q-	co co 04	CN CO o o Ν'	Ν’ CO cd' ID N“	V CO o CD	CD CO o h’Τ	CD c? o o to	σ> co cď tO LO
0 N _ rt) g o	O o	O o. v-	a o T—	O o	O o	O O	ID σ>	o 0)	o CN	o CM
Produkt	e» X Z 1 U. x: H co Z ro < 1 co > 1 o u. <	CN X z X— XT H có Z as < f Φ x: CL 1 O) <	<N X 1 k~ JC H* 1 CO O a < > φ JZ CL.	fN X z 1 j5 1 CO O < π Φ -J	X Z » i— co 2 03 > t Φ a_	ÍN X z 1 u. x: H co 2 φ > 1 zs Φ -J	ΓΝ x z 4 U x: H* 1 CO O 3 Φ -J 1 Φ x: a.	04 X z 1 Ur JZ H 4 CO o z; Φ 4 ZF ai _j	Ol X 1 ČL 1». CO Z C0 > ♦ Φ x: a.	Ο» X z 1 CL |— l CO Z Φ > i Φ u
H .?	co CM	co CM	O CM CD	o <N <o	V CM N-	r~ CN NÝ	ID ’Ν cd	to T. o	O) xT T~	03 xf
Substrát	c E 1 JZ H co Z co <	,c £ 4 U. x: CO Z co <	a E JZ H· 1 CO o <	c £ 4 k_ X H 4 CO O «j <	c E 4 V. JZ H <6 «j >	Je e .£ <1 X 1— t co o as >	c E u. x: H 4 CO Z3 Φ _J	tz ix 1 u x: 1 CO ZJ Φ -J	íZ ix t IX u. 1- < CO Z >	.Ξ E 1 d. u. H 1 CO Z C3 >
No.	v-	CN	co	«φ	tn	<o	N*	00	CJ>	O r—

V případech 1 - 2 byl jako báze použit DIEA. Retenční časy (R.T.) substrátu se uvádějí pro Frrioc-chráněný derivát Experimenty 3-10 byly prováděny v MPS formátu v 5,5 mM měřítku s kolidinem jako bází.

(c) Založeno na integraci plochy pod křivkou získané analýzou HPLC.

(b) Analyzováno obecným postupem G pro hydrofobní peptidy.

(c) Isomery mají stejnou molekulovou hmotnost, ale různé retenční časy.

-10CZ 296014 B6

Schéma 2

Navrhovaný mechanizmus pro vazbu v NMP působením BTC

(COj + CIjC-0)

Fmoc-(D.L)AA-BU-peptidyl-pryskyřice

Pro vysvětlení racemizace materiálů Fmoc AA v průběhu jejich účinné vazby zprostředkované BTC na materiál stavební jednotka-peptidyl-pryskyřice v NMP navrhují autoři přihlášky mechanizmus (schéma 2), při kterém nadbytek NMP reaguje sBTC za vytvoření sloučeniny 1, která ztrátou fosgenu a CO₂ poskytla meziprodukt 2 Vilsmayerova typu. Přídavek opticky čisté FmocAA k chlorimiovému iontu 2 a odstranění chloridu poskytnou aktivní ester 3, který se váže na peptidovou pryskyřici. Na druhé straně, N-alkoxykarbonylem chráněný aminoaktivní ester 3 přechází podle dosavadních znalostí za bazické katalýzy na oxazolon 4, který snadno racemizuje. Další experimenty se stericky bráněnými polárními aminokyselinami nesoucími chráněné postranní řetězce, poskytly nedostatečné výsledky, jak je ukázáno v tabulce 2.

Tabulka 2: Souhrn experimentů s použitím BTC/NMP s polárními aminokyselinami

No.	Fmoc-A A	Substrát	% konverze	M. h. produktu	R.T. min (d)
vypočt.	nalez
11	Arg(Pmc)	AlaC3-Thr-Rink	30(a)-100(b)	471,23	472,3	8,07
12	Glu(tBu)	LeuC3-Thr-Rink	10(a)-50(b)	486,32	487,0	14,60
13	Glu(tBu)	AlaC3-Thr-Rink	30{c)	444,27	445,8	9,50
14	Gln(Trt)	AlaC3-Thr-Rink	30 (C)	443,28	444,9	8,52
15	Met	AlaC3-Thr-Rink	20(c)	446,27	447,9	13,08
16	Trp(Boc)	AlaC3-Thr-Rink	80 (C)	501,3	502,8	16,22

(a) Po 1 h při 75 °C (b) Po třech vazebných cyklech při 65 °C (c) Po dvou vazebných cyklech při 65 °C (d) Analyzováno obecným postupem G pro hydrofobní peptidy

-11 CZ 296014 B6

Celkový nedostatek těchto aminokyselin a velké množství jiných polárních a aromatických sloučenin Fmoc AA pro vazbu na materiály stavební jednotky-peptidyl-pryskyřice s většími zábranami, a také skutečnost, že v případě Fmoc-Asn(Trt) a Fmoc-His(Trt) nebyla pozorována žádná reakce, i v případě materiálu Ala-vazebná jednotka-peptidyl-pryskyřice v NMP, způsobily nut5 nost změny na inertní rozpouštědlo pro reakci. Dvojí vazba Fmoc-Val a Fmoc-Ile na Ν^α-(ωkarba!lyloxypropyl)-Ala (označovaný AlaC3) a N“-(ro-karballyloxypropyl)-Leu (označovaný LeuC3)-peptidylové pryskyřice s použitím BTC v THF po dobu pouze 1 h při 50 °C ovšem poskytla požadovaný peptid s konverzí 100% a bez detekovatelné racemizace. Tyto výsledky přiměly autory vynálezu testovat celou řadu dalších syntetických reakcí, které zahrnují vazbu ío všech proteinogenních Fmoc-AA (s výjimkou Gly) na celou řadu materiálů vazebné jednotkypeptid-pryskyřice a také na N-Me-Ala a N-Me-Phe-peptidylové pryskyřice, kdy se mění velikost a pořadí peptidylové části. Výsledky jsou ukázány v tabulce 3 a v tabulce 4.

Tabulka 3: Souhrn obtížně proveditelných vazebných reakcí s použitím BTC/THF, dioxanu, diglymu nebo DCP

No.	Fmoc-AA	Substrát	% konverze	H. h. produktu	R.T. min (d)
vypočt.	nalez
17	Ala	AiaN3-Rink	100 A,B	502,9 A 583,4 B	503,9 A 584,4 8	9,45 AX 11,65 BY
18	Ala	AlaC2-Rink	100	554,1	555,1	13,92 Y
19	Ala	AlaC3-Rink	100 A,B	682.4 A 633.5 B	683.4 A 634.5 8	14,13 AY 13,37 Bv
20	Ala	AlaN2-Rink	100 A.B	569,3 A 488,16 8	570,3 A 489,2 8	11,01 AY 9,79 8X
21	Ala	LeuN4-Ser-Rink	90	443,15	444,9	23,30 x
22	D-Ala	AlaN2-peptid-Rink	100	682,4	683,4	14,13 Y
23	Arg(Pmc)	PheC2-Thr-Rink	94	533,33	534,3	24,38 Y
24	Asp(tBu)	LysC3-Thr-Rink	100	487,31	488,9	15,67 Y
25	Cys(Trt)	ValC3-Thr~Rink	100	446,26	447,1	26,39 Y
26	Glu(tBu)	LysC3-Thr-Rink	70	501,33	502,2	16,81 Y
27	Gln(Trt)	PheC2-Thr-Rink	100	505,28	506,2	28,97 Y
28	Gln(Trt)	ValC3-Thr-Rink	82	471,2	472,2	22,95 Y
29	Gln(Trt)	LeuN4-Ser-Rink	100	500,9	501,9	12,34 x
30	D-Leu	LeuN4-Ser-Rink	100	486,0	487,0	17,70 x
31	Leu	PheN2-Gln-Rink	100	1081,7	1082,7	17,31 x
32	Leu	LysC3-Thr-Rink	100	485,37	486,2	22,43 Y
33	Ile	LeuC3-Thr-Rink	80	470,36	472,0	18,97 x

-12CL 296014 B6

No.	Fmoc-AA	Substrát	% konverze	H. h. produktu	R.T. min (d)
vypočt	nalez
34	Lys(Boc)	LeuN4-Ser-Rink	100	501,0	502,0	11,26 x
35	Lys(Boc)	PheC2-Thr-Rink	100	505,32	506,1	24,53 Y
36	Lys(Boc)	ValC3-Thr-Rink	56	472,2	473,0	22,12 Y
37	Lys(Boc)	PheN2-Rink	100	1002,4	1003,4	23,21 x
38	D-Lys(Boc)	PheN2-Rink	100	1002,4	1003,4	23,02 x
39	D-Lys(Boc)	PheN2-Rink	100	968,4	969,5	22,71 *
40	Met	LeuN4-Ser-Rink	100	503,15	504,9	16,08 x
41	Phe	AlaC3-peptid-Rink	100	1716,0	1716,8	14,76 x
42	Phe	AlaN2-Rink	100	678,49	679,9	20,45 x
43	Phe	N-MePhe-N- MePhe-Rink	100	528,2	529,9	22,06 Y
44	PheC1	N-Me-Ala-Ala- -AlaN2-Rink	100	616,8	617,8	16,25 Y
45	PheC2	N-MeAla-Ala- AlaN3-Rink	100	502,9	503,9	9,45 x
46	PheC2	N-MeAla-Ala- AlaN2-RÍnk	100	488,2	489,2	9,79 x
47	N-MePhe	N-MePheRink	100	528,2	529,9	22,06 Y
48	N-MePhe	N-MePhe-N- MePhe-Rink	100	500,18	501,2	18,52 x
49	Pro	ValC3-Thr-Rink	100	440,31	441,2	25,95 Y
50	Ser(tBu)	LysC3-Thr-Rink	100	459,32	460,1	15,61 Y
51	Thr(tBu)	AlaC2-peptid-Rink	100	1587,4	1588,7	19,25 Y
52	Thr(tBu)	AlaC3-peptid-Rink	100	1601,4	1602,7	19,67 Y
53	Thr(tBu)	ValC3-Thr-Rink	53	444,3	445,1	24,35 Y
54	Trp(tBoc)	ValN3-Trp-Rink	100	629,38	630,2	20,01 x

-13CZ 296014 B6

No.	Fmoc-AA	Substrát	% konverze	M. h. produktu	R.T. min (d)
vypočt.	nalez
55	Trp(Boc)	ValC3-Thr-Rink	100	529,33	530,1	17,80*
56	Tyr(tBu)	LeuN3-Amb-Ala- -Arg-Rink	100	1322,6	1323,6	19,05 *
57	D-Tyr(tBu)	AlaN3-Rink	100	1716,8	1716,8	14,76 x
58	Val	AlaC3-Thr-Rink	100	414,29	416,0	14,93 x
59	Val	LysC3-Thr-Rink	92	471,35	472,1	19,49 Y
60	Val	ValC3-Thr-Rink	66	442,32	443,1	14,94 *
61	PheC3	Thr-Rink	100	391,23	392,9	10,64 x

Údaje molekulové hmotnosti produktu

V případech 17, 18, 19, 20, 22, 31, 37, 44, 45, 46, 57 odpovídají údaje cyklickým peptidům.

V případech 42, 51, 52, 56 odpovídají údaje peptidům chráněným Allyl/Alloc.

V případech 22, 41, 48, 51, 52 odpovídají údaje lineárním peptidům.

V případech 43, 47 odpovídají údaje Ac-N-tripeptidu.

Peptidová sekvence

7^a) PheC2-NMeAla-Ala-AlaN3-NH₂,

7^b) GlyC 1 -Ala-Lys-(D)Ala-Ala-AlaN3-NH₂,

18) Ala-Ala-Lys-(D)Ala-Ala-AlaC2-NH₂,

19^A) (D)Ala-AlaN2-Ala-Lys-(D)Ala-Ala-AlaC3-NH₂,

9^b) AlaN2-Ala-Lys-(D)Ala-Ala-AlaC3-NH₂,

20^A) GlyC l-Ala-Lys-(D)Ala-Ala-AlaN2-NH₂,

20^b) PheC2-N-MeAla-Ala-AlaN2-NH₂,

22) (D)Ala-AlaN2-Ala-Lys-(D)Ala-Ala-AlaC3-NH₂,

31) TrpC3-Ser-Glu-Tyr-Leu-PheN2-Gln-NH₂,

37) PheCl-Phe-Phe-(D)Trp-(L)Lys-PheN2-NH₂,

8) PheC 1 -Phe-Phe-(D)Trp-(D)Lys-PheN2-NH₂,

39) PheCl-Phe-Lleu-(D)Trp-(D)Lys-PheN2-NH₂,

41) Biotin-Trp-Arg-Lys(D)Arg-Phe-AlaC3-Leu-Arg-(D)Tyr-AlaN3-NH₂,

42) PheCl-Ala-Phe-AlaN2-NH₂,

47) Phe-NMePhe-NMePhe-NH₂,

48) NMePhe-NMePhe-NMePhe-NH₂,

51) Thr-AlaC2-Ser-Glu-Asn-His-Leu-Arg-His-Ala-LeuN3-Ser-NH₂,

52) Thr-AlaC3-Ser-Glu-Asn-His-Leu-Arg-His-Ala-LeuN3-Ser-NH₂,

-14CZ 296014 B6

56) TrpC3-Ser-Glu-Tyr-LeuN3-Amb-Ala-Arg-NH₂,

57) Biotin-Trp-Arg-Lys(D)Arg-Phe-AlaC3-Leu-Arg-(D)Tyr-AlaN3-NH₂.

Metody analýzy HPLC ^x Analyzováno obecným postupem G pro hydrofobní peptidy ^Y Analyzováno obecným postupem G pro hydrofílní peptidy

Jak je vidět v tabulce 3, konverze většiny vazebných reakcí byla kvantitativní bez ohledu na vstupující látky Fmoc-AA, strukturu vazebné jednotky, sekvenci a velikost peptidylové části.

V následujícím popisu označují tučná čísla v závorkách čísla příkladu podle tabulky 3.

Tři peptidy (26, 36 a 53) poskytly konverzi nižší než 70 %. Je třeba poznamenat, že tyto vazebné reakce nebyly optimalizovány.

Na rozdíl od metody používající předem vytvořené chloridy kyselin, kde největší problém spočíval v labilitě ochranných skupin na vedlejších řetězcích, využití metod podle předkládaného vynálezu pro uskutečnění vazebné reakce následujících sloučenin Fmoc-AA poskytlo v podstatě úplnou konverzi: Arg(Pmc) (23), Asp(t-Bu) (24), Cys(Trt) (25), Lys(Boc) (34, 35), Ser(t-Bu) (50), Thr(t-Bu) (51, 52), Trp(Boc) (54) a Tyr(t-Bu) (56, 57). Protože ochrannou skupinu vedlejšího řetězce Boc je možno snadno odstranit kyselinami, autoři vynálezu monitorovali její stabilitu Keiserovým testem v průběhu BTC-zprostředkovanou vazebnou reakcí Fmoc-Lys(Boc) (34, 39). Při všech těchto reakcích byl Keiserův test negativní a požadované peptidy cyklické v kostře byly získány ve vynikajících výtěžcích, aniž by byly v surovém získaném materiálu přítomny vedlejší produkty. Z těchto výsledků je možno vyvodit závěr, že vazba s použitím BTC za výše popsaných podmínek neodstraňuje citlivé ochranné skupiny vedlejšího řetězce normálně používané při syntéze peptidů na pevné fázi využívající chemických reakcí typu Fmoc.

Autoři vynálezu ukázali, že většina chloridů sloučenin Fmoc-AA v průběhu vazebných reakcí na materiál vazebná jednotka-peptidyl-pryskyřice v různých rozpouštědlech s nebo bez použití kolidinu jako báze neracemizují. Zjištění stupně racemizace v průběhu vazebných reakcí zprostředkovaných BTC v rozpouštědle inertním vůči této reakci je založeno na následujících výsledcích: (a) jak je ukázáno v tabulce 1, jestliže dojde k racemizaci, na HPLC se naleznou dva vrcholy s identickou hmotností. V případě všech peptidů uvedených v tabulce 3, včetně peptidů, které poskytly nízké výtěžky (21, 23, 26, 28, 33, 36, 53, 58, 59), měl požadovanou molekulovou hmotnost pouze hlavní vrchol, (b) Vazebná reakce Fmoc-Lys(Boc) a Fmoc-D-Lys(Boc) na materiál PheN2 vazebná jednotka-pryskyřice, další uspořádání peptidů, odstranění ochranných skupin Allyl/Alloc, cyklizace a odstranění z pryskyřice poskytovaly dva diastereomemí peptidy cyklické v kostře (37, 38) s kvantitativní konverzí. Profil HPLC každého jednotlivého surového diastereomeru ukázal jediný oddělený vrchol se stejnou hmotností a rozdílnými retenčními časy. Navíc poskytl společný nástřik na kapilární elektroforézu těchto dvou diastereomerů 37 a 38 dva rozdílné vrcholy. Nepřítomnost racemizace v průběhu vazebné reakce chloridů Fmoc-AA na materiál stavební jednotka-peptidyl-pryskyřice je způsobena vysokou reaktivitu chloridů kyselin vůči nukleofilní substituci acylu ve srovnání s pomalejší tvorbou oxazolonu. Protože vazebná reakce zprostředkovává BTC v rozpouštědlech inertních vůči této reakci probíhá přes tvorbu chloridu kyseliny in šitu, není překvapující, že taková vazebná reakce obecně probíhá bez racemizace.

Aby bylo možno nalézt omezení BTC týkající se podpory obtížně proveditelných vazebných reakcí, autoři vynálezu syntetizovali peptidy 44 - 46, ve kterých byly různé vazebné jednotky Phe navázány na materiál N-Me-Ala-peptidyl-pryskyřice. Navíc byla prováděna vazebná reakce Fmoc-Phe v peptidu 43 na materiál N-Me-Phe-N-Me-Phe-pryskyřice a v případě peptidu 48 byla prováděna vazebná reakce Fmoc-N-Me-Phe na materiál N-Me-Phe-N-Me-Phe-pryskyřice. Všechny tyto opakované vazby probíhaly v krátkém čase při kvantitativní konverzi, což vede k závěru, že BTC je možno vhodně zvolit jako reakční činidlo pro usnadnění obtížně proveditelných vazebných reakcí u SPPS.

-15CZ 296014 B6

U většiny peptidů uvedených v tabulce 3 byla reakce prováděna na materiálu di-peptidyl-vazebná jednotka-pryskyřice. Aby bylo možno testovat schopnost BTC uskutečňovat vazebné reakce na stavební jednotku navázanou v jiných polohách podél peptidového řetězce, byla prováděna vazebná reakce v polohách 4 - 6 a 11 (peptidy 56, 41, 22, 51 a 52). Tabulka 4 ukazuje přehled peptidů syntetizovaných vazebnou reakcí BTC a uvádí korelace typu vstupující vazebné jednotky s polohou vazby podél peptidového řetězce. Zatímco vazebné reakce na polohách 4 až 6 probíhaly za normálních podmínek, vazba k poloze 11 vyžadovala pro dosažení kvantitativní konverze šesti cyklů.

v. 03 CO

Φ

CM

CM ω φ xí CL

co

τΟ Φ XX CL

CD JZ Ol

to

CO

-

en CL

-

T-

o

cn 3»

CN

c: O

ca

CN

CN

ro >

CM

Y—

CN

CN

o <D

<N

CO

_Φ

ca

-Ct T-

CN

Z 03 D

CM

w < a

CO

ca <

ΜΓ·*

CM

CO

CN

jednotka

co z ca <

CN O ca <

co O ca <

MeJ o ca <

to O ca <

CN Z ca <

CM Z Φ JZ

O φ -C £L

CN O Φ 4Z Cl

co Z Φ jC a.

Z Z Φ —1

CO Z a φ

CO O Z Φ -J

-16CZ 296014 B6

Tabuika 4 pokračování

Aminokyselina navazovaná na stavební jednotku	1 Ser		CN
Met 1
CN o <u xz 0.							co
ΤΟ Φ JZ CL							co
Φ JZ a.			co		CN	CN		-
Phg
DLys
Lys				CN
c 0		CN		CN	«3 U>
Val		CN		CN
Leu		CN
0)
Z3 Φ u Q
DAla
Ala	CN
Stavební jednotka	LysN3	LysC3	Xt O <λ	CO 2 CO >	ValN3	Φ x: CL Φ 2 z	NMeAla	cn O Sk 0	NMeGly	CN Z a. u. i— Q

- 17CZ 296014 B6

Tabulka 4: pokračování

Aminokyselina navazovaná na stavební jednotku

GA8A

0 Φ S Z

o

-

CN O 2» 0

.....

b-

0»

zr 0

X—«* m co

ω «·*» o

•v*

Q. u.

CN

o l0.

σ>

U. H Q

T—

u. >» H

4> XX CL 4> 2 Z

l·»» JZ H

CN co T—

ÍO •v r~

T~*

</> X

*

o tft <

Cl ΙΛ <

CN

-

E? <ť

CM

Stavební jednotka

co Z co <

CN O CO <

co 0 co <

<r O CO <

m O CO <

04 Z 03 <

CN Z Φ je a.

O Φ CL

CN O <Ď -C CL

<0 Z <e sz OL

Nt Z □ a> -I

co Z ZS Φ -J

<O O ZJ 0)

-18CZ 296014 B6

Tabulka 4: pokračování

i 1 Aminokyselina navazovaná na stavební jednotku	1 i GABA 1
0 © Z									X. <0 cm’
CN O □
3 O		CN
w >· ϋ				CN
e t-				CN	CN
o uCL				CN
k» >% H Q
u. >>
Φ x: CL ω 2						04 CO		T“
u x:				* * CM		CN
ω X
c cn <				uC
CL <r> <		CN
CD u<				%
Stavební jednotka	CO Z w >»	CO O <Λ	O </>	CO O ro >	CO Z >	Φ -C £L Φ s Z	< Φ 2 Z	CO O □	>> 0 Φ 2 Z	CN Z CL l— H Q

-19CZ 296014 B6

Poznámky k tabulce 4

Čísla v tabulce ukazují polohu stavební jednotky (od C-konce), ke které byla AA navázána s >80 % konverzí, založeno na HPLC a potvrzeno MS.

* Dvojí vazba s 5 ekv. AA, 1,5 ekv. BTC (0,33 ekv. na AA), 14 ekv. kolidinu v inertním rozpouštědle (0,14M) při 50 °C 1 h ** Pouze 20% konverze s epimerizací nr Reakce neprobíhá

() Počet vazebných cyklů # 5 až 10% *** 50 o/_o a Předaktivace BTSA b Předaktivace materiálu vazebná jednotka-peptidylová pryskyřice pomocí BTSA, 4-7 vazebných cyklů a přídavek AgCN

Použití BTC pro vazebné reakce Fmoc-His(Trt) a FmocAsn(Trt) bylo neúspěšné. Vazebná reakce Fmoc-His(Trt) poskytla pouze 25% konverzi s celkovou racemizací, a v případě FmocAsn(Trt) reakce vůbec neprobíhala.

Příklad 62: Syntéza bicyklického peptidu PTR 3205

Dva gramy Rinkova amidu (pryskyřice MBHA, NOVA, 0,46 mmol/gram) byly ponechány nabobtnat přes noc v NMP v reaktoru opatřeném dnem ze sintrovaného skla a připevněném na třepačku. Fmoc byl z pryskyřice odstraněn s použitím 25% piperidinu v NMP (16 ml) dvakrát 15 min. Po důkladném promytí 7 x NMP (10 až 15 ml), vždy po dobu 2 minut, byla provedena vazebná reakce Phe-N3 použitím Fmoc-Phe-N3-OH (3 ekv., 2,76 mmol, 1,46 g) rozpuštěného v NMP (16 ml) a aktivovaného PyBroP (2,76 mmol, 1,28 g) a DIEA (6 ekv., 5,52 mmol, 0,95 ml) 4 min při pokojové teplotě a směs byla potom převedena do reaktoru pro uskutečnění vazebné reakce 1 h při pokojové teplotě. Po provedení reakce byla peptidová pryskyřice promyta NMP (10 až 15 ml) 7 x vždy 2 min. Ukončení reakce bylo monitorováno kvalitativním Kaiserovým testem. Odstranění Fmoc a promytí bylo prováděno výše popsaným postupem s následným promytím THF (10 až 15 ml) třikrát vždy 2 min a Fmoc-Cys(Acm)-OH (5 ekv., 4,6 mmol, 1,9 g) byl navázán na materiál stavební jednotka-peptidyl-pryskyřice s použitím bis-(trichlormethyl)karbonátu (1,65 ekv., 1,518 mmol, 0,45 g) a kolidinu (14 ekv., 12,88 mmol, 1,7 ml) v THF (30 až 35 ml, za získání směsi 0,14M) při 50 °C 1 h a tato vazebná reakce byla opakována. Zařazení Thr, Lys, (D)Trp, Phe, Cys a PheC3 bylo prováděno vazebnými cykly (monitorování kvalitativním Kaiserovým testem) použitím Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-(D)Trp(Boc)-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Cys(Acm)-OH a Fmoc-PheC3-OH, přičemž v každém reakčním cyklu byla aminokyselina rozpuštěná v NMP a aktivována PyBroP a DIEA, a po vazebné reakci byla peptidová pryskyřice promyta a potom byl odstraněn Fmoc důkladným promytím NMP, jak bylo popsáno výše pro první vazebnou reakci. Po ukončení sestavení peptidu byly z materiálu peptidyl-pryskyřice odstraněny ochranné skupiny allyl/alloc za následujících podmínek: peptidylová pryskyřice byla promyta DCM (10 až 15 ml) třikrát vždy 2 min a směsí DCM-AcOH-NMM (92,5 %, 5 %, 2,5 %) třikrát 2 min. 3 g Pd(P(Ph)₃)₄ byly rozpuštěny ve výše uvedené směsi (80 ml) a získaná žlutá suspenze byla převedena do reaktoru a směs obsahující peptidyl-pryskyřici byla odplyněna (probubláváním argonu přes dno reaktoru ze sintrovaného skla) a potom byla důkladné třepána 2 hodiny v temnu. Materiál peptidyl-pryskyřice byl promyt DCM, CHC1₃ a NMP (celkem 15 x vždy 2 min). Byla provedena cyklizace použitím PyBOP (3 ekv., 2,76 mmol, 1,436 g) a DIEA (6 ekv., 5,52 mmol, 0,95 ml) v NMP (20 ml) při pokojové teplotě 1 h a druhá cyklizace přes noc za stejných podmínek. Peptidylová pryskyřice byla pro-20CZ 296014 B6 myta NMP a potom směsí DMF-voda (15 ml, 4:1) třikrát 2 min. K materiálu peptidyl-pryskyřice byl přidán roztok I₂ (5 ekv., 4,6 mmol, 1,16 g) ve směsi DMF-voda (23 ml, 4:1) a směs byla třepána při pokojové teplotě 40 min pro dosažení cyklizace Cys-Cys. Peptidylová pryskyřice byla odfiltrována a důkladně promyta směsí DMF/voda, DMF, NMP, DCM, CHC1₃ a roztokem 5 2% kyseliny askorbové v DMF. Po konečném odstranění ochranné skupiny Fmoc a promytí jako výše a dalším promytí MeOH, s následným sušením peptidylové pryskyřice ve vakuu 20 min, byl peptid z pryskyřice odštěpen použitím 98% TFA, 2,5% TIS a 2,5% vody v celkovém objemu směsi 30 ml po dobu 30 min při 0 °C v atmosféře argonu a potom 1,5 h při pokojové teplotě. Roztok byl zfiltrován přes extrakční filtr do polypropylenové zkumavky, pryskyřice byla promyta ío 5 až 6 ml směsi a 4 až 5 ml TFA, roztok byl odpařen v proudu N₂ za získání olejovitého zbytku, který působením chladného Et₂O ztuhnul. Centrifugace a dekantace vrstvy Ět₂O a působení dalším podílem chladného Et₂O s následnou centrifugací, dekantací a sušením bílé pevné látky ve vakuu přes noc poskytlo surovou látku PTR 3205 (0,388 g) s následující strukturou:

(CH₂)₂---------------CO—NH-----------------(CH₂)₂-----------_co—nn------------(CH^, (D)Phe-— Gly ~ Phe“Cys—Phe —(D)Trp —Lys—Thr — Cys — Phe—Lys ”NH₂

Příklad 63: Syntéza tricyklického peptidů PTR 3227

PTR 3227 je tricyklický peptid cyklický v kostře s následující strukturou:

---_c0-----------------------------HN--

V této sloučenině propojuje jeden můstek stavební jednotku (Gly-C2) s postranním řetězcem zbytku Lys, druhý můstek propojuje dvě stavební jednotky (Phe-N2 a Phe-C2) a třetí je disulfidický můstek vytvořený mezi dvěma zbytky Cys. Nyní bude popsán postup syntézy tohoto analogu:

g Rinkova amidu (pryskyřice MBHA, Novabiochem, 0,46 mmol/g) byl ponechán nabobtnat 25 přes noc v NMP v reaktoru opatřeném dnem ze sintrovaného skla a připevněném na třepačku.

Fmoc byl z pryskyřice odstraněn použitím 25% piperidinu v NMP (16 ml) dvakrát 15 min. Po důkladném promytí 7x NMP (10 až 15 ml) vždy 2 min, byla provedena vazebná reakce Lys(Dde) použitím materiálu Fmoc-Lys(Dde)-OH (3 ekv., 1,38 mmol, 0,735 g) rozpuštěného v NMP (8 ml) a aktivovaného PyBroP (1,38 mmol, 0,64 g) a DIEA (6 ekv., 2,76 mmol, 0,47 ml) 30 4 min při pokojové teplotě a potom byla směs převedena do reaktoru k vazebné reakci prováděné h při pokojové teplotě. Po vazebné reakci byla peptidová pryskyřice promyta NMP (10 až ml) 7 x vždy 2 min. Ukončení reakce bylo monitorováno kvalitativním Kaiserovým testem. Odstranění Fmoc a promytí bylo prováděno s následující vazbou Fmoc-PheN2-OH (3 ekv.,

1,38 mmol, 0,71 g), jak bylo popsáno výše. Po vazebné reakci byl odstraněn Fmoc a bylo prove35 děno promytí NMP, peptidová pryskyřice byla potom promyta THF (10 až 15 ml) třikrát vždy min a byl navázán Fmoc-Cys(Acm)-OH (5 ekv., 2,3 mmol, 0,95 g) na materiál Bu-peptidylpryskyřice s použitím BTC (1,65 ekv., 0,759 mmol, 0,225 g) a kolidinu (14 ekv., 6,44 mmol, 0,85 ml) v THF (16 ml, za získání 0,14M směsi) při 50 °C 1 h. Tato obtížně proveditelná vazebná reakce byla opakována ještě jednou. Sestavení Thr, Lys, (D)Trp, Phe, Cys aPheC2 bylo

-21 CZ 296014 B6 provedeno vazebnými cykly (monitorováno kvalitativním Kaiserovým testem) s použitím FmocThr(tBu)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-(D)Trp(Boc)-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Cys(Acm)-OH a Fmoc-PheC2-OH, v každém reakčním cyklu byla aminokyselina rozpuštěna v NMP a aktivována PyBroP a DIEA, po vazebné reakci byla peptidová pryskyřice promyta a Fmoc byl odstraněn s následným důkladným promytím NMP, jak bylo popsáno výše pro první vazebnou reakci. Po sestavení PheC2 byly z peptidylové pryskyřice odstraněny ochranné skupiny ally 1/alloc za následujících podmínek: peptidylová pryskyřice byla promyta DCM (10 až 15 ml) třikrát vždy 2 min, a směsí DCM-AcOH-NMM (92,5 %, 5 %, 2,5 %) třikrát vždy 2 min. Ve výše uvedené směsi (40 ml) bylo rozpuštěno 1,5 g Pd(P(Ph)₃)₄ a získaná žlutá suspenze byla převedena do reaktoru a směs s peptidylovou pryskyřicí byla odplyněna (probubláváním plynného argonu dnem reaktoru) a potom důkladně třepána 2 hodiny v temnu. Peptidylová pryskyřice byla promyta DCM, CHC1₃ a NMP (celkem 15 x vždy 2 min). Proběhla cyklizace použitím PyBOP (3 ekv., 1,38 mmol, 0,72 g) a DIEA (6 ekv., 2,76 mmol, 0,475 ml) v NMP (10 ml) při pokojové teplotě 1 h a druhá cyklizace přes noc za stejných podmínek.

Odstranění ochranných skupin Fmoc bylo provedeno jak bylo popsáno výše s následným promytím NMP, potom byla provedena vazebná reakce Fmoc-GlyC2-OH na cyklický peptid s použitím 5 ekv., Bu (2,3 mmol, 0,94 g), BCT (1,65 ekv., 0,759 mmol, 0,225 g) a kolidinu (14 ekv., 6,44 mmol, 0,85 ml) vTHF (16 ml, za získání 0,14M směsi) při 50 °C 1 h, a tento obtížně proveditelný reakční postup byl prováděn ještě jednou. Vazebná reakce (D)-Phe na dekapeptidovou pryskyřici byla provedena použitím Boc-(D)-Phe-OH (4 ekv., 1,84 mmol, 0,488 g) a PyBroP (1,84 mmol, 0,857 g) jako vazebného činidla a DIEA (8 ekv., 3,68 mmol, 0,63 ml) jako báze ve směsi DMF/DCM (1:1,8 ml) jednou po dobu 1,5 h, a potom byl proveden druhý vazebný cyklus za stejných podmínek 2 h při pokojové teplotě. Potom bylo po promytí provedeno selektivní odstranění Dde z Νε postranního řetězce Lys (v poloze 1 vzhledem k C-konci) použitím 2% hydrazinu v DMF (25 ml x 3 min x 3) při pokojové teplotě, a potom po promytí DMF a NMP byly z peptidylové pryskyřice odstraněny allylové ochranné skupiny, jak bylo popsáno výše, s použitím 0,75 g Pd(P(Ph)₃)₄. Peptidylová pryskyřice byla promyta CHC1₃, DCM a NMP a potom byla provedena cyklizace PyBOP, jak bylo popsáno výše (Kaiserův test byl negativní). Po praní směsí DMF-voda (12,5 ml, 4:1) třikrát vždy 2 min byl do peptidylové pryskyřice přidán roztok I₂ (5 ekv., 2,3 mmol, 0,583 g) ve směsi DMF-voda (12,5 ml, 4:1) a směs byla třepána při pokojové teplotě 40 min pro dosažení cyklizace Cys-Cys. Peptidylová pryskyřice byla odfiltrována a důkladně promyta směsí DMF/voda, DMF, NMP, DCM, CHC1₃ a také 2% kyselinou askorbovou v DMF a potom samotným DMF. Po promytí DCM a MeOH s následným sušením peptidylové pryskyřice ve vakuu po dobu 20 min byl peptid z pryskyřice odštěpen použitím 95% TFA, 2,5% TIS a 2,5 %^vvody v celkovém množství směsi 15 ml po dobu 30 min při 0 °C v atmosféře argonu, a potom 1,5 h při pokojové teplotě. Roztok byl zfíltrován přes extrakční filtr do polypropylenové zkumavky, pryskyřice byla promyta 5 až 6 ml výše uvedené směsi a 4 a 5 ml TFA, roztok byl odpařen v proudu dusíku za získání olejového zbytku, který působením chladného Et₂O ztuhnul. Centrifugace a dekantace Et₂O vrstvy a působení další části chladného Et₂O s následnou centrifugací a dekantací a sušení bílé pevné látky ve vakuu přes noc poskytlo surovou látku PTR-3227 (72 mg, 10 %). Chromatogram HPLC surového peptidů je ukázán na obr. 5.

Příklad 64: Vazebná reakce galaktózového derivátu na peptid cyklický v kostře za získání PTR 3229

Peptid cyklický v kostře byl zbaven ochranných skupin Fmoc a potom promyt NMP a THF. Vazebný cyklus použitím l,2:3,4-di-0-izopropyliden-D-galaktopyranózy (5 ekv., 1,15 mmol, 0,3 g) a 0,33 ekv. BTC (0,379 mmol, 0,112 g) jako reakčního činidla a 14 ekv. kolidinu (3,22 mmol, 0,425 ml) jako báze v THF (15 ml) při pokojové teplotě byl prováděn 1 h. Po promytí DCM a MeOH byl peptid odštěpen z pryskyřice použitím TFA (95 %), TIS (2,5 %) a vody (2,5 %) v celkovém objemu 15 ml směsi po dobu 1,5 h při pokojové teplotě. Po dalším zpracování byl získán surový PTR-3229 (0,176 g) se sekvencí galaktóza-Dab-Phe-Trp-(D)Trp-Lys

-22CZ 296014 B6

Thr-Phe-Gly(C3)-NH₂. Tento peptidový analog obsahuje můstek propojující stavební jednotku GlyC3 a zbytek Dab. Analýza hmotnostního spektra surového peptidů je ukázána na obr. 6.

Příklad 65: Tvorba močovinové vazby použitím BTC

A: Tvorba močovinové vazby v můstku vazbou Ile (izokyanátový derivát vytvořený pomocí BTC) na Lys-peptidylovou pryskyřici za vytvoření peptidového analogu PTR 3237 s následující strukturou:

Analýza hmotnostního spektra tohoto surového peptidů je uvedena na obr. 7.

B: Tvorba močovinové vazby v sekvenci použitím diaminu se provádí následujícím způsobem: k 5 ekv. hydrochloridu mono Fmoc-diaminu vCH₂C1₂ (0,15M), byl přidán 1 ekv. DIEA (pro neutralizaci hydrochloridu). Po 1 min byl přidán 1,55 ekv. BTC a suspenze byla míchána 2 minuty, a potom bylo přidáno 14 ekv. DIEA. Po 1 min byl získaný roztok přidán kpeptidylové pryskyřici a směs byla míchána 1 h při pokojové teplotě, s následným promytím CH₂C1₂ a NMP. Získaný peptidový analog cyklický v kostře, označený PTR 3241, má následující strukturu:

OH

o ch₂ o

II I II

HN-C~NH-CH-C~Trp—(D)Trp— Lys—Thr—Phe-pGly-NH₂ (Ch₂)₂------_ΝΉ-----_co------------------------(_CH₂)₃

Chromatogram HPLC a hmotnostní spektrum surového peptidů jsou znázorněny na obr. 8.

Příklad 66: Vícečetná paralelní syntéza použitím BTC

Přibližně 500 oddělených peptidů bylo syntetizováno v MPS formátu použitím BTC jako vazebného činidla. Příklad výsledků syntézy pro 24 peptidů je uveden v tabulce 5.

-23CZ 296014 B6

Hmotnostní spektrum

Nalezeno

889,2

963,1

790,1

938,9, 462,9 (cyklický tri peptid)

878,1

790, 434 (cyklický tripeptid)

70S

859

818

878,1

CM «3 CO

CO <0' O O0

Kvalit.výsl.

z-*s + *

4- 4·

(++) j

t 4· w

(++)

1 + »W*

T i·

T i-

4· 4-

4- 4*

T +

(++)

Vypočt.

888,41

i 962,42

789,33

938,39

877,36

789,31

704,28

CO co kO 00

817,36

877,37

co CO_ t— CO co

806,31

1-. JK ř—

u. xz H

u. xz H

u. JZ H

u. XZ

fcnp JZ H

Vw JC I—

txx· j=

5— xz H

kw· xz l·*

u. XX H

έ I-

Φ JC. CL

Φ JZ Ct

Φ JZ CL

® JZ 0-

Phe

Φ jC CL

<D XZ O.

<0 JZ O.

Φ JZ CL

Φ XZ CL

Φ «ΧΖ CL

Φ x: (L

CM Q « 4

CM O Φ C 0-

GlyC2 I

co □ w X _J

co U 3 Φ _l

co 2 >

CM O «3 <

CM O 0> «c £t*

CM u X 0

co 0 w X —1

1 LeuC3

<0 O 75 >

JE 0

c

c 0

c 0

<5

c 0

>> 0

X 0

X 0

0

x 0

X 0

75 >

0 V»

« >

w <

i— Φ 0

>> 0

4

>N O

0 k<

«i—* s

tfí <

OJ <

cn u. <

O) U. <

<

>· h*

k_ H

0

<

u. X H

Φ

3 Φ

Φ 5

GlyN3

CO X 0

co Z x 0

CO Z 0

<0 Z x 0

<0 z X 0

CO Z >> O

co Z x O

co Z X 0

CO Z >» 0

CO X 0

co Z X 0

cu

XI

O

T5

Φ

U—.

CD

xz

w

Xi

0

Ό

x~“

V“

-

-

T~

V-

-

CM

CM

CM

CM

-

CM

co

<0

r-

CO

a>

0 x—

-

CM v

-24CZ 296014 B6

Tabulka 5: pokračování

Nalezeno

σ> CM CJ>

tj OS Q. 'cl + Ξ X5 Cl <0 a. Έ C, co «7 m <o o a>

748,9

<0 a. a •f S a. OJ a *c x-*· co <0 M*

1---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 1 975,9, 448(tripeptid+piper.), 893,9 (?)

z-X 0) a ?· « + X 5 z cl 4· CL ’C CD «*>* - 3 <0 5 03 00 ¢0

co 00

co“ <o <33

o cm' CO «3

964,9

-να» OO

CO oo co

Kvalit.výsl.

\ 4· + v?

4^ 1 4·

+ +

i x/

z*x 1

i X-ν'

<-x 4· 4· X/1

xx 4· .4*

+ £

✓*x 4· * X*·

v 4* x->

**x 4· 4· X-**

Vypočt.

σ> CO oo CM co

CM * xf O 0>

<33 CM_ co’ M· X

<33 CO <n o o

T~ xr in b* a>

b* CO O* oo 00

<» CO o CO CO

o co co’ «Ο <33

<n co CM* co oo

xr Mf M·' co <33

Jx. CO o CD 00

Xt U0 00 co

5— H

i— S= H

u. XZ H

Uw x: H

Im jC 1-

u. se F-

u. x: t-

u. H

t— JC

w Xi F-

W XT

u, x: F-

Φ JE cl

o> C CL

03 JC

<D Xi a.

0) xz CL

a> JCi a.

03 «*- CL

Φ XZ 0.

03 CL

03 Xi CL

<— 03 x: a.

03 j~ CL

CM Q ta <

CM O to jS a

CM U X 0

CO Q ω _j

«0 O □ 03 -J

CO O « >

CM O « <

CM O 03 £ CL

CM U X 0

co O « > -J

co 0 3 03 ~J

CO U « >

Jí Μ»

s

JJJ

03

0)

3 03 _J

O 03 -1

3 Φ _J

3 Φ

3 Φ _J

3 Φ _J

5k H

03

0

Q. « <

CX ω <

>7 o

u. >> H·

cx V) <

cx v> <

C 0

u. Φ 0

8 CL

Φ X5 CL

o CL

v03 ω

u. x: F-

CL l_ F-

i— >» h*

ro >

a> se CL

2.

0? SZ CL

Zl 0

c 0

CO Z X 0

CO Z >1 O

co Z X 0

CO Z >H 0

co Z X 0

<o z X 0

co Z X 0

CO Z >> 0

co Z X 0

co Z >* 0

co Z X 0

CO Z X 0

Φ

Η-

03

c

CO

SZ

o

T3

Φ

03

SZ

CM

CM

CM

CM

CO

co

CO

CO

CM

co

¢0

co

CO

u>

CO v-

rx

co

03

o CM

τCM

CM CM

co CM

CM

-25CZ 296014 B6

Poznámky k tabulce 5

Postup obtížně proveditelné reakce: předaktivace AA mimo automatický syntezátor peptidů (ACT 396 s Labtech 4 firmy Advanced ChemTech).

Pět ekv. AA ve 150 ml dioxanu + 1,65 ekv. BCT ve 150 μΐ dichlorpropanu, míchání, po 1 min bylo přidáno 14 ekv. kolidinu v dichlorpropanu.

Předaktivované aminokyseliny byly na destičku přeneseny manuálně.

Reakce 3 x 1 h při 60 °C.

Příklady chromatogramu HPLC a hmotnostních spekter surového peptidů MPS (č. 20 v tabulce 5) jsou uvedeny v obr. 9.

Příklad 67: Syntéza analogu cyklosporinu použitím BTC

Reakční činidlo BCT bylo použito u obtížně proveditelných vazebných reakcích při syntéze analogu cyklosporinu s následující sekvencí:

Ala-NMeLeu-NMeLeu-NMeVal-NMeLeu-Abu-Sar-NMeLeu-Val-NMeLeu-Ala-NH2

Tato peptidomimetická látka je lineární derivát cyklosporinového analogu popsaného v článku Raman a další, J. Org. Chem. 63: 5734, 1998. Chromatogram HPLC a hmotnostní spektrum surového peptidů jsou uvedeny v obr. 10.

Claims (16)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Způsob vazby zbytku aminokyseliny na peptidový řetězec, vyznačující se tím, že zahrnuje následující kroky:

   (i) poskytne se zbytek aminokyseliny s volnou karboxylovou skupinou a blokovanou aminoskupinou, popřípadě s dalšími blokovanými funkčními skupinami vedlejších řetězců;

   (ii) provede se reakce blokované aminokyseliny s bis-(trichlormethyl)karbonátem v rozpouštědle, které je vzhledem k této reakci inertní, za získání chloridu aminokyseliny;

   (iii) provede se neutralizace volné kyseliny přidáním organické báze;

   (iv) získaná suspenze obsahující chlorid aminokyseliny se přidá ke sloučenině zvolené ze skupiny zahrnující peptid s blokovaným karboxylovým koncem a volným aminovým koncem, a peptidylovou pryskyřici obsahující alespoň jeden volný aminový konec; a (v) použije se reakčních podmínek umožňujících vazbu chloridu aminokyseliny na peptid za získání peptidů prodlouženého o jeden zbytek aminokyseliny.
2. 2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že peptidový řetězec obsahuje v N-koncové poloze stericky bráněný zbytek.
3. 3. Způsob podle nároku 2, vyznačující se tím, že se dále provádí zahřívání reakční směsi v průběhu vazebné reakce chloridu aminokyseliny speptidem.
4. 4. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že se dále do reakční směsi chloridu aminokyseliny a peptidů přidává katalyzátor.

   -26CZ 296014 B6
5. 5. Způsob podle nároku 2, vyznačující se tím, že stericky bráněný zbytek v N-koncové poloze peptidového řetězce zahrnuje stericky bráněný sekundární amin.
6. 6. Způsob podle nároku 2, vyznačující se tím, že stericky bráněný zbytek v N-koncové poloze peptidového řetězce zahrnuje zbytek N-alfa(co-funkcionalizovaný)alkylaminokyseliny.
7. 7. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že inertní rozpouštědlo se volí ze skupiny dioxan, tetrahydrofuran, diglym a 1,3-dichlorpropan.
8. 8. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že vazebná reakce peptidů dále zahrnuje vícečetnou paralelní peptidovou syntézu.
9. 9. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že vazebné činidlo se poskytuje ve stechiometrickém poměru alespoň přibližně jedna třetina molárního ekvivalentu vzhledem ke zbytku aminokyseliny.
10. 10. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že báze se volí ze skupiny kolidin, diizopropylethylamin, pyridin, dimethylpyridin a chinaldin.
11. 11. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že aminoskupina aminokyseliny se blokuje blokující skupinou zvolenou ze skupiny fluorenylmethoxykarbonyl a /erc-butoxykarbonyl.
12. 12. Způsob vazby zbytku aminokyseliny na pevný nosič, vyznačující se tím, že zahrnuje následující kroky:

    (i) poskytne se zbytek aminokyseliny s volnou karboxylovou skupinou a blokovanou aminoskupinou, popřípadě s dalšími blokovanými funkčními skupinami vedlejších řetězců;

    (ii) provede se reakce blokované aminokyseliny s bis-(trichlormethyl)karbonátem v rozpouštědle, které je vzhledem k této reakci inertní, za získání chloridu aminokyseliny;

    (iii) provede se neutralizace volné kyseliny přidáním organické báze;

    (iv) získaná suspenze obsahující chlorid aminokyseliny se přidá ke sloučenině zvolené ze skupiny zahrnující pryskyřici obsahující alespoň jeden volný aminový konec a pevný nosič nesoucí funkční skupinu schopnou vazby na chlorid; a (v) použije se reakčních podmínek umožňujících vazbu chloridu aminokyseliny na pevný nosič.
13. 13. Použití sloučeniny bis-(trichlormethyl)karbonátu pro syntézu chloridů aminokyselin in šitu v průběhu peptidové syntézy.
14. 14. Použití sloučeniny fosgenu pro syntézu chloridů aminokyselin in šitu v průběhu peptidové syntézy.
15. 15. Použití sloučeniny difosgenu pro syntézu chloridů aminokyselin in šitu v průběhu peptidové syntézy.
16. 16. Použití podle některého z nároků 13 až 15, kde peptidová syntéza se provádí na pevné fázi.