CZ2001286A3

CZ2001286A3 - Use of isolated DNA or RNA molecule, viral vector and process for preparing thereof

Info

Publication number: CZ2001286A3
Application number: CZ2001286A
Authority: CZ
Inventors: Gijsbertus Francisc Verheijden; Anna Maria Helena Boots
Original assignee: Akzo Nobel Nv
Priority date: 1998-07-23
Filing date: 1999-07-16
Publication date: 2001-08-15
Also published as: IL140825A0; BR9912378A; CA2334947A1; WO2000005254A2; AU758310B2; NO20010355L; ID27998A; TR200100175T2; SK1042001A3; US6964766B1; EP1100823A2; JP2002521388A; NO20010355D0; PE20000931A1; NZ509417A; WO2000005254A3; CN1310724A; RU2233290C2; CO5090903A1; AU5411299A

Description

Oblast techniky

Vynález se týká nových peptidů, jejich použití k léčbě chronického poškozování (destrukce) kloubní chrupavky při autoimunitních onemocněních, farmaceutických prostředků s obsahem uvedeného peptidu a diagnostické metody pro detekci autoreaktivníchbuněk T v testovaném vzorku.

Dosavadní stav techniky

Imunitní systém je založen na principu rozlišení mezi cizími antigeny (nevlastními antigeny, non-self antigens) a autoantigeny (vlastními antigeny, šelf antigens, získávaných z vlastního těla jedince), kterého se dosahuje vnitrní snášenlivostí vzhledem k autoantigenům.

Imunitní systém chrání jedince vůči cizím antigenům a na vystavení cizímu antigenu odpovídá aktivací specifických buněk, jako jsou lymfocyty T a B a produkcí rozpustných faktorů, jako jsou interleukiny, protilátky a složky komplementu. Antigen, na který imunitní systém odpovídá, je zpracován (degradován) buňkami nabízejícími antigen (APC, antigen presenting cells) a fragment antigenu je vystaven, exprimován na buněčný povrch ve spojení s glykoproteinem třídy II hlavního histokompatibilního komplexu (MHO, major histicompatibility complex). Kompex MHC-glykoprotein-antigen-fragment je nabízen (prezentován) buňkám T, které prostřednictvím svého T-buněčného receptorů rozpoznají fragment antigenu společně s bílkovinou třídy II MHC, na kterou je vázán. Buňky T se stanou aktivovanými, tj. proliferují a/nebo vytvářejí interleukiny, výsledkem čehož je rozmnožení (expanze) aktivovaných lymfocytů, zaměřených vůči napadajícímu antigenu (Grey se spol., Sci. Am. 261: 38-46, 1989).

- 2 Vlastní antigeny jsou rovněž nepřetržitě zpracovávány a jako antigenní fragmenty předkládány (nabízeny) prostřednictvím glykoproteinů MHC buňkám T (Jardetsky se spol., Nátuře 353: 326-329, 1991). Vlastní rozpoznávání je tedy vnitřní funkcí imunitního systému. Za normálních okolností je imunitní systém tolerantní (snášenlivý) vůči vlastním antigenům a aktivace imunitní odpovědi těmito vlastními antigeny je vyloučena.

Pokud je snášenlivost vůči vlastním antigenům ztracena, může se imunitní systém stát aktivovaným vůči jednomu nebo více z vlastních antigenu, výsledkem čehož je aktivace autoreaktivních buněk T a tvorba autoprotilátek. Tento jev se nazývá autoimunita. Vzhledem k tomu, že imunitní odpověď je obecně destruktivní, tj. snažící se zničit agresivní (útočící) cizí antigen, může autoimunitní odpověď způsobit zničení tkáně, která je tělu vlastní.

Příspěvek buněk T k autoimunitním onemocněním byl prokázán v několika studiích. U myší je pokusná autoimunitní encefalomyelitida (EAE, experimental autoimmune encephalomyelitis) zprostředkována vysoce omezenou skupinou buněk T, spojovaných specifičností vůči jedinému epitopu myelinové zásadité bílkoviny (MBP, myelin basic protein), komplexně vázanému na molekulu třídy II MHC. U potkanů albínů druhu Lewis, který je silně náchylný k různým autoimunitním onemocněním, bylo prokázáno zprostředkování onemocnění buňkami T. U lidských autoimunitních onemocnění se rovněž předpokládá, že jsou spojeny s rozvojem autoagresivních buněk T.

Destruktivní autoimunitní odpověď je obsažena v různých onemocněních jako je revmatoidní arthritida (RA), při níž je ničena celistvost kloubní chrupavky chronickým zánětlivým procesem, jež je důsledkem přítomnosti velkého množství aktivovaných lymfocytů a buněk vyjadřujících (exprimujících) třídu II MHC. K udržování místní zánětlivé odpovědi se zdá nezbytná pouhá přítomnost chrupavky: bylo navrženo, že poškozování chrupavky je spojeno s aktivitou autoreaktivních buněk T reagujících na

- 3 chrupavku v RA (Sigall se spol., Clin. Exp. Rheumat. 6: 59, 1988; Glant se spol., Biochem. Soc. Trans. 18: 796, 1990; Burmester se spol., Rheumatoid arthritis Smolen, Kalden, Maini (ed.), Springer-Verlag Berlin, Heidelberg, 1992). Nadto chirurgické odstranění chrupavky pacientům s RA ukázalo snížení zánětlivého procesu (R. S. Laskin, J. Bone Joint Surgery (Am) 72: 529, 1990). Bílkoviny chrupavky jsou tedy považovány za cíl autoantigenů, které jsou oprávněné stimulovat buňky T. Aktivace těchto autoreaktivních buněk T vede k rozvinutí autoimunitního onemocnění. Ovšem identifikování autoantigenních složek, hrajících roli v nástupu revmatoidní arthritidy, zůstává až dosud nezachytitelné.

Zánětlivá odpověď, jejímž následkem je destrukce chrupavky, může být léčena různými léky, jako jsou například steroidní léky. Ovšem tyto léky jsou často imunosupresivními léky, které nejsou specifické a vykazují toxické vedlejší účinky. Nevýhody nespecifické imunosuprese ji činí vysoce nevýhodnou terapií.

Antigenně specifická, netoxická imunosupresní terapie poskytuje velmi atraktivní alternativu nespecifické imunosuprese. Tato antigenně specifická terapie zahrnuje léčbu pacientů cílovým autoantigenem nebo syntetickými peptidy, reagujícími s buňkami T a odvozenými od autoantigenu. Tyto syntetické peptidy odpovídají T-buněčným epitopům autoantigenu a mohou být použity k indukci specifické T-buněčné snášenlivosti (tolerance) jak vůči nim samotným, tak i vůči autoantigenu. Ačkoli se to zdá paradoxní desenzitizovat imunitní systém naprosto stejným antigenem, jaký je zodpovědný za aktivaci imunitního systému, kontrolované podávání cílového (auto)antigenu může být velmi účinné pro desenzitizaci imunitního systému. Desenzitizace nebo imunologická snášenlivost (tolerance) imunitního systému je založena na dlouho pozorovaném jevu, že zvířata, která byla krmena antigenem či epitopem nebo je inhalovala, jsou méně schopná vytvářet systémovou imunitní odpověď vůči uvedenému antigenu či epitopu, pokud se tento antigen nebo epitop zavádí systémovou cestou.

- 4 Lidský chrupavkový glykoprotein-39 (HC gp-39) byl dříve identifikován jako cílový autoantigen při revmatoidní arthritidě (RA)(Verheijden se spol., Arthritis Rheum. 40: 1115-1125, 1997). Následná strategie k určení odpovídajících auto-epitopů na HC gp-39 byla založena na předpokladu, že molekuly DR4 nebo DR1 predisponují k RA (Gao se spol., Arthritis Rheum. 33: 939-946, 1990, Nelson se spol, Rheumatoid Arthritis, Proceedings of the Eleventh International Histocompatibility Workshop and Conference, díl 1, ed. Tsuji a další, Oxford University Press, 1991) na dvou úrovních. Nejprve určením repertoáru buněk T a za druhé výběrem determinanty. Sdílený epitop nacházený u DR molekul asociovaných s RA by se mohl podílet na výběru podobných sad peptidů k nabízení (presentaci) buňkám T (Gregerson se spol., Arthritis Rheum. 30. 1205-1213, 1987. Domělé vazebné sekvence v primární struktuře HC gp-39 byly identifikovány za použití DR4 (Bl*0401) úseku (motivu), navazujícího peptidy (Verheijden se spol., Arthritis Rheum. 40: 1115-1125, 1997). HC gp-39, bílkovina o 362 aminokyselinách, za vylouční signální sekvence (Hakala se spol., J. Biol.Chem. 268: 25803-25810. 1993), obsahuje 6 regionů, vyhovujících tomuto úseku (motivu). Syntetizovány byly čtyři takto zvolené peptidy a byly testovány vzhledem k navázání variant DR1 a DR4 (B 1*0401 a 0404), asociovanými s RA. Bylo zjištěno, že všechny peptidy na bázi úseku (motivu), zahrnující aminokyselinové zbytky 103-116, 259-275 a 326-338 z HC gp-39, se navazují s vysokou poměrnou afinitou na molekuly DRB 1*0401. Následně bylo testováno rozpoznání těchto peptidů buňkami T periferní krve pacientů s RA a zdravých dárců. Veškeré peptidy na bázi motivu byly snadno rozpoznány u pacientů s RA, což ukazuje na vysokou četnost buněk T specifických vůči HC gp-39 u RA. Odpověď vůči aminokyselinovým zbytkům 263-275 byla nej význačnější; 8 z 18 pacientů s RA odpovídalo na tento peptid (Verheijden se spol., Arthritis Rheum. 4fí.: 1115-1125, 1997). HC gp-39 je tedy cílem pro imunitní rozpoznání v kloubu.

Významnost této bílkoviny pro arthritické onemocnění byla dále prokázána její arthritogeností (schopností vyvolat arthritidu) u myší Balb/c. Jediná injikace mikrogramových množství bílkoviny, smíšené v IFA, do hrudní

- 5 oblasti těchto myší indukovala chronický kloubní zánět, připomínající RA (Verheijden se spol., Arthritis Rheum. 40: 1115-1125, 1997).

V nedávné době byla isolována a popsána nová lidská chondrocytární bílkovina, YKL-39 (Hu se spol., J. Biol. Chem. 271: 19415-19420, 1996). Bílkovina sdílí významnou sekvenční identitu s HC gp-39 (YKL-40). Jiný homolog HC gp-39 je vylučován lidskými makrofágy a nazývá se chitotriosidasa (Boot se spol., J. Biol. Chem. 270: 26252-26256, 1995). Sekvence odpovídající HC gp-39 (263-275) peptidu RSFTLASSETGVG (sekv. s identifikačním číslem 3) jsou identifikovány jako HSFTLASAETTVG (sekv. s identifikačním číslem 2) na bílkovině YKL-39 (266-278) a RSFTLASSSDTRVG (sekv. s identifikačním číslem 4) na makrofágové chitotriosidase (269-282) (Tabulka 1).

Chitosidasový peptid Chi (269-282) obsahuje DRB1*0401 úsek (motiv) navazující peptidy, který byl dříve použit k výběru T-buněčných epitopů na bílkovinách. Naproti tomu peptid YKL-39 (266-278) tento motiv 0401 neobsahuje.

Bude jasné, že dosažení snášenlivosti u buněk T reagujících na HC gp-39 (263-275) může být u pacientů s RA přínosem. Rovněž imitující epitopy (mimicry epitopes) HC gp-39 (263-275) mohou mít stejnou funkci a mohou být použity k indukování snášenlivosti. Takové imitující epitopy budou mít s výhodou alespoň stejnou kapacitu vyvolání snášenlivosti.

K účinnějšímu využití terapie indukující snášenlivost pro léčbu buňkami T zprostředkované destrukce chrupavky existuje značná potřeba identifikovat peptidy reagující s buňkami T, které mohou desenzitizovat pacienty vůči autoantigenu, aktivujícímu buňky T, odpovědné za zánětlivý proces.

- 6 Ačkoli peptid YKL-39 neobsahuje úsek (motiv) 0401, bylo překvapivě zjištěno, že epitop YKL-39 (266-278) je epitop imitující (mimicry epitop) HC gp-39 (263-275).

Tento epitop je tedy vhodný k vyvolání snášenlivosti vůči autoreaktivním buňkám T, reagujícím s HC gp-39 (263-275), YKL-39 (266-278) nebo jejich imitujícím epitopům u pacientů s revmatoidní arthritidou.

Podstata vynálezu

Předmětem vynálezu je poskytnutí peptidů, které jsou schopné indukovat systémovou imunologickou snášenlivost (toleranci), konkrétněji specifickou T-buněčnou snášenlivost, s výhodou vůči odpovídajícímu chrupavkovému antigenu u pacientů, trpících buňkami T - zprostředkovanou destrukcí chrupavky. Peptidy podle předkládaného vynálezu jsou charakterizovány tím, že obsahují jednu nebo více z aminokyselinových sekvencí FTLASAETT (sekv. s identifikačním číslem 1). Konkrétněji peptidy podle vynálezu obsahují sekvenci HSFTLASAETTVG (sekv. s identifikačním číslem 2).

Do rozsahu vynálezu patří rovněž multimery peptidů podle tohoto vynálezu, jako například dimer či trimer peptidů podle vynálezu. Multimerem podle vynálezu může být buď homomer, sestávající z většího množství stejného peptidů, nebo heteromer, sestávající z odlišných peptidů.

Charakteristické aminokyselinové sekvence peptidů podle vynálezu mohou být po stranách chráněny náhodnými aminokyselinovými sekvencemi. Přednost se dává postraním sekvencím, majícím na peptidy stabilizující účinek, což zvyšuje jejich biologickou dostupnost.

Glykoprotein 39 lidské chrupavky je cílový autoantigen u pacientů s RA, který aktivuje specifické buňky T a vyvolává tak nebo zprostředkovává

- 7 zánětlivý proces. Peptidy odvozené od HC gp-39 byly rozpoznávány především autoreaktivními buňkami T u pacientů s RA, ale jen zřídka buňkami T, získanými od zdravých dárců, což ukazuje, že HC gp-39 je autoantigenem při RA. Arthritogenní povaha HC gp-39 byla dále dokázána u myší Balb/c. Jediná podkožně podávaná injekce uvedené bílkoviny myším Balb/c byla schopna u zvířat iniciovat známky arthritidy. Průběh onemocnění, indukovaného HC gp-39, byl charakterizován opakovanými recidivami na předních a/nebo na zadních tlapkách a postupným vývojem od mírné arthritidy do její závažnější formy. Rovněž bylo pozorováno symetrické rozdělení postižených kloubů, které spolu s pozorováním opakovaných recidiv, připomíná postup onemocnění u arthritidy a zejména u revmatoidní arthritidy.

Překvapivě bylo zjištěno, že peptid YKL-39 (266-278) byl účinný jako látka, vyvolávající snášenlivost, tolerogen. Odborníkovi bude zřejmé, že peptidy mohou být rozšířeny buď na jedné nebo druhé straně peptidu, nebo na obou stranách a stále vykazovat stejnou imunologickou funkci. Rozšířenou částí může být aminokyselinová sekvence, podobná přírodní sekvenci bílkoviny YKL-39.

Peptidy podle vynálezu mohou být připravovány dobře známými metodami organické chemie pro syntézu peptidů, jako například syntézou peptidů v pevné fázi, popsané například v J. Amer. Chem. Soc. 85: 2149 (1963) a v Int. J. Peptide Protein Res. 35: 161-214 (1990). Peptidy podle vynálezu mohou být připravovány také technikami rekombinantní DNA. Sekvence nukleových kyselin, kódující peptid podle vynálezu nebo multimer takových peptidů, se vloží do expresního vektoru. Vhodné expresní vektory zahrnují nezbytné kontrolní oblasti pro replikaci a expresi. Expresní vektor lze přimět k expresi v hostitelské buňce. Vhodnými hostitelskými buňkami jsou například bakterie, kvasinky a savčí buňky. Tyto techniky jsou v oboru dobře známé, viz například Sambrooke se spol., Molecular Cloning: a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor laboratory Press, Cold Spring Harbor, 1989.

- 8 Peptidy mohou být stabilizovány C- a/nebo N-koncovými modifikacemi, které budou snižovat exopeptidázou katalyzovanou hydrolýzu. Modifikace mohou zahrnovat: C-koncovou acylaci (např. acetylaci = Ac-peptid), zavedení N-koncového amidu (např. peptid-NH₂), kombinace acylace a zavedení amidu (např. Ac-peptid-NH₂) a zavedení D-aminokyselin namísto L-aminokyselin (Powell se spol., J. Pharm. Sci. 41: 731-735, 1992).

Jiné modifikace jsou zaměřeny na prevenci hydrolýzy, působené endopeptidázami. Příklady těchto modifikací jsou: zavedení D-aminokyselin místo L-aminokyselin, modifikovaných aminokyselin, cyklizace uvnitř peptidů, zavedení modifikovaných peptidových vazeb, např. redukovaných peptidových vazeb ψ[ΟΗ₂ΝΗ] a např. peptoidů (N-alkylovaných glycinových derivátů) (Adang se spol., Reci. Trav. Chim. Pays-Bas 113: 63-78, 1994 a Simon se spol, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 49: 9367-9371, 1992).

Peptidy podle vynálezu jsou T-buněčné epitopy, které jsou rozpoznávány autoreaktivními buňkami T a jsou schopné je stimulovat. Tyto autoreaktivní buňky T mohou být nalezeny např. v krvi pacientů, trpících autoimunitními onemocněními.

Podle vynálezu tedy jsou peptidy, uvedené peptidy připomínající omezené T-buněčné epitopy MHC třídy II, přítomné na cílovém autoantigenu, zahrnující peptid o sekvenci identifikačního č. 1 nebo o sekvenci id. č. 2, velmi vhodné pro použití v terapii, kterou se indukuje snášenlivost specifických T-buněk vůči uvedenému autoantigenu u savců, konkrétněji u lidí, trpících destrukcí chrupavky zprostředkovanou buňkami T, jako je například arthritida a konkrétněji revmatoidní arthritida. Volitelně může být taková léčba kombinována s podáváním jiných léčiv, jako jsou tzv. DMARD (chorobu modifikující antirevmatika, disease modifying anti-rheumatic drugs), například sulfasalazin, antimalarika (chlorochin, hydroxychlorochin), injikovatelné nebo orálně podávané zlato, metotrexát, D-penicillamin, azathioprin, cyklosporin, mykofenolát, tzv. NSAID (nesteroidní protizánětlivá léčiva, non steroidal

- 9 anti-inflammatory drugs), kortikosteroidy či jiné léky, o nichž je známo, že ovlivňují průběh onemocnění u autoimunitních pacientů.

Peptidy podle vynálezu mohou být také použity k modulaci lymfocytů, reagujících s antigeny, které se odlišují od uvedeného autoantigenu, jsou ale přítomné ve stejné tkáni jako autoantigen, tj. jsou to bílkoviny nebo jejich části, zahrnující peptid podle sekvence o id. č. 1 nebo sekvence o id. č. 2. Indukcí antigenně specifické T-buněčné snášenlivosti mohou být autoimunitní poruchy léčeny okolně působící imunosupresí. Obecněji jsou buňkami, které mají být modulovány, hematopoietické buňky. Obecně musí peptid k tomu, aby fungoval jako látka vyvolávající snášenlivost (tolerogen), splňovat alespoň dvě podmínky, tj. musí mít imunomodulační kapacitu a musí být místně exprimován, obvykle jako část větší bílkoviny.

Předkládaný vynález tedy poskytuje způsob, jak léčit pacienty trpící zánětlivým autoimunitním onemocněním, podáním farmaceutického přípravku, který obsahuje peptidy podle vynálezu. Takoví pacienti mohou trpět nemocemi jako je Gravesova choroba, juvenilní arthritida, primární glomerulonefritida, osteoarthritida, Sjogrenův syndrom, myasthenia gravis (těžká svalová ochablost), revmatoidní arthritida, Addisonova choroba, primární biliární sklerosa, uveitida, systémový lupus erythematosis, zánětlivé střevní onemocnění, sclerosis multiplex (roztroušená skleróza) či diabetes. Peptidy podle předkládaného vynálezu mohou být tedy použity v přípravě léčiva k indukování snášenlivosti u pacientů, trpících těmito chorobami.

Léčení autoimunitních poruch peptidy podle vynálezu využívá skutečnosti, že okolně působící suprese je indukována nesouvisejícími, ale společně se vyskytujícími antigeny. Regulační buňky vylučují antigenně specifickým způsobem pleiotropní bílkoviny jako jsou cytokiny, které mohou imunitní odpověď modulovat ke snížení.

- 10 Podle vynálezu mohou být pacienti, trpící T-buněčně zprostředkovanou destrukcí kloubní chrupavky, léčeni léčebnými prostředky, obsahujícími jeden nebo více peptidů podle vynálezu a farmaceuticky přijatelný nosič. Podávání farmaceutického prostředku podle vynálezu bude indukovat systémovou imunologickou snášenlivost, zejména snášenlivost vůči specifickým autoreaktivním buňkám T těchto pacientů, vůči autoantigenním bílkovinám v napadené kloubní chrupavce a vůči jiným vlastním anigenům, které vykazují identifikované epitopy buněk T vazebných pro MHC třídy II, charakterizované nebo imitované (mimikrizované) aminokyselinovými sekvencemi jednoho nebo více z peptidů podle vynálezu. Indukovaná snášenlivost tedy povede ke snížení místní zánětlivé odpovědi v napadené kloubní chrupavce.

Velmi vhodnými peptidy pro použití ve farmaceutickém prostředku podle vynálezu jsou peptidy, obsahující peptid YKL-39 (268-276) nebo YKL-39 (266-278), chráněný ze stran sekvencemi až do celkové délky 55 aminokyselin. Ještě lépe mají peptidy délku 25 aminokyselin. A nejlépe je aminokyselinovou sekvencí peptidů sekvence FTLASAETT nebo HSFTLASAETTVG.

Peptidy podle vynálezu mají tu výhodu, že vykazují specifický účinek na autoreaktivní buňky T a ponechávají tak, oproti nespecifickému supresivnímu účinku imunosupresivních léčiv, ostatní složky imunitního systému intaktní. Léčba peptidy podle vynálezu bude bezpečná a nevyvolá toxické vedlejší účinky.

Systémové imunologické snášenlivosti může být dosaženo podáním vysokých nebo nízkých dávek peptidů podle vynálezu. Množství peptidu bude záviset na způsobu podání, době podání, na stáří pacienta, stejně jako na jeho dietě celkovém zdravotním stavu a.

Obecně může být použito dávkování od 0,01 do 10 000 pg peptidu na kg tělesné hmotnosti, lépe od 0,05 do 500 pg a nejlépe od 0,1 do 100 pg peptidu.

- 11 Farmaceuticky přijatelné nosiče jsou dobře známé odborníkům v oboru a zahrnují například steriní fyziologický roztok, laktózu, sacharózu, fosforečnan vápenatý, želatinu, dextrin, agar, pektin, arašídový olej, olivový olej, sezamový olej a vodu. Jiné nosiče mohou být, jako například molekuly MHC třídy II, vloženy do liposomů.

Navíc může farmaceutický prostředek podle vynálezu obsahovat jednu nebo více adjuvantních látek. Vhodné adjuvantní látky zahrnují, kromě jiného, hydroxid hlinitý, fosforečnan hlinitý, amphigen, tokofenoly, monofosfenyllipid A, muramyldipeptid a saponiny jako je Quill A. Adjuvantní látky, které mají být použity k toleranční terapii podle vynálezu, jsou s výhodou mukózními adjuvantními látkami jako B-podjednotka cholerového toxinu nebo karbomery, které se vážou na mukózní epitel. Množství adjuvantní látky závisí na povaze této látky samotné.

Dále může farmaceutický prostředek podle vynálezu obsahovat jedno nebo více stabilizačních činidel, jako například cukrů zahrnujících sorbitol, mannitol, škrob, sacharózodextrin a glukózu, bílkovin jako je albumin nebo kasein a pufrů, jako jsou alkalické fosforečnany.

Vhodným způsobem podání jsou nitrosvalové injikace, podkožní injikace, nitrožilní injikace nebo injikace do břicha, podávání ústy a podání nosem, například ve spreji.

Jiným předmětem vynálezu je poskytnutí způsobu detekce autorealtivních buněk T, zúčastněných v destrukci kloubní chrupavky a testovací sady pro použití v tomto způsobu. Peptidy podle vynálezu jsou tedy velmi vhodné pro použití v diagnostické metodě pro detegování přítomnosti aktivovaných autoreaktivních buněk T, které se účastní chronického zánětu a destrukce kloubní chrupavky.

- 12 Diagnostická metoda podle vynálezu zahrnuje následující kroky:

a) isolování mononukleárních buněk z periferní krve (PBMC, peripheral blood mononuclear cells) z krevního vzorku jedince,

b) kultivaci uvedených mononukleárních buněk z periferní krve za vhodných podmínek,

c) inkubaci kultury uvedených mononukleárních buněk z periferní krve v přítomnosti jednoho nebo více peptidů podle vynálezu, a

d) detekci odpovědi buněk T, například proliferativní odpovědi, svědčící u jedince o přítomnosti aktivovaných autoreaktivních buněk T.

Detekce proliferativní odpovědi buněk T může být prováděna například stanovením inkorporace ³H-thymidinu.

Do rozsahu vynálezu patří také testovací sady, které obsahují jeden nebo více peptidů podle vynálezu. Tyto testovací sady jsou vhodné pro použití v diagnostické metodě podle vynálezu.

Následující příklady jsou pro vynález ilustrativní a žádným způsobem nemají být brány jako omezující rozsah vynálezu.

Přehled obrázků na výkresech

Obr. 1

Obr. la, b, c. Křížová reaktivita tří, rozdílných, HC gp-39-specifických hybridomů (8B12, 14G11, 20H5) s YKL-39 (266-278) (CVR0271B = HC gp-39 (263-275), KV0432B = YKL-39 (266-278), CC0332B = Chi(269-282), KV0431A = YKL-39 (262-274).HCDA.8B12.1D8,

- 13 14G11.1H7 a 20H5.4F6.2F6 jsou HLA-DRBl*0401-omezené hybridomy, specifické pro HC gp-39 (263-275). Aktivace T-buněčných hybridomů je vyjádřena jako produkce IL-2.

Obr. 2: Vyvolání snášenlivosti ( tolerizace) in vivo pomocí HC gp-39 (263-275) nebo YKL-39 (266-278)

U myší Balb/c byla vyvolána snášenlivost (byly tolerizovány) intranasálním podáním 50, 10 nebo 2 pg HC gp-39 (263-275) nebo YKL-39 (266-278) a následně imunizovány prostřednictvím HC gp-39 (263-275). Myši, které byly předléčeny fyziologickým roztokem nebo byly ponechány neléčené, byly začleněny jako kontroly.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1: Vytyčení sekvencí

Lidská chondrocytární bílkovina, YKL-39, sdílí významnou sekvenční identitu s HC gp-39 (YKL-40). Jiný homolog HC gp-39 je vylučován lidskými makrofágy a je označován jako chitotriosidasa (Boot se spol.,1995). Sekvence odpovídající RSFTLASSETGVG (HC gp-39 (263-275), sekv. id. č. 3) byly identifikovány jako HSFTLASAETTVG v bílkovině YKL-39 (266-278) a jako RSFTLASSSDTRVG (sekv. id.č. 4) v makrofágové chitotriosidase (269-282), viz Tabulka 1. Chi (269-282) obsahuje peptidový vazebný úsek (motiv) HLA-DRB 1*0401, který byl dříve použit k výběru T-buněčných epitopu v bílkovinách. Naproti tomu peptid YKL-39 (266-278) tento motiv neobsahuje. Všechny peptidy byly syntetizovány.

Tabulka 1

Vytyčení HC gp-39 (263-275) sekvence s odpovídající oblastí v YKL-39 a makrofágové chitotriosidase

Příklad 2: Vazba peptidů na HLA-DRB 1*0401

Peptidy z příkladu 1 byly testovány pro vazbu DRB 1*0401-kódovaných molekul. Molekuly HLA-DR4 (DRBl*0401) byly vyčištěny z homozygotních, virem Epstein-Barrové (EBV) -transformovaných lidských B-lymfoblastoidních buněčných linií Hulyl381C2 a kompetitivní vazebné stanovení peptidu HLA-DR bylo prováděno v podstatě tak, jak bylo popsáno Verheijdenem se spoluautory, 1997. Afinita daného peptidu pro vazbu DRB 1*0401-kódovaných molekul byla vztahována ke kompetici s peptidem, použitým jako markér. Tato poměrná vazebná afinita byla definována jako koncentrace peptidu, při níž byl signál snížen na 50 % (IC50). Peptid HA-F je kladnou kontrolou (hemaglutinin 307-319; PKFVKQNTLKLAT; v poloze 309 je Y substituován F; sekvence id. č. 5). Je známo, že tento peptid má vysokou afinitu k molekulám DRB 1*0401.

Podle předpokladu bylo nalezeno, že peptid Chi(269-282) byl s velkou afinitou vázán na DRB 1*0401 (viz Tabulka 2). Peptid YKL-39 (266-278), který není vybaven úsekem (motivem), účinně vazebným pro DRBl*0401, se s velmi vysokou afinitou váže na DR4(Bl*0401).

- 15 Tabulka 2: vazba peptidu na HLA-DRBl*0401-kódované molekuly

	hodnoty IC50
peptid	vsádka	pokus A	pokus B	pokus C
YKL39(262-274)	KV0431A	0,006	0,005	nestanoveno
YKL39(266-278)	KV432B	0,035	0,032	0,12
HCgp39(263-275)	CVR271B	nestanoveno	0,008	0,038
Chi(269-282)	CC0332B	0,053	0,11	0,16
HA-F	AE0690A	0,20	0,14	0,20

Příklad 3: Stimulace T-buněčných hybridomů

Hybridomy specifické pro HC gp-39 (263-275) byly testovány na rozpoznání odpovídajících sekvencí.

K testování zkřížené reaktivity tří rozdílných, HC gp-39-specifických hybridomových buněčných linií s YKL-39 nebo chitotriosidasovým peptidem bylo inkubováno 5 x 10⁴ hybridomových buněk a 2 x 10⁵ ozářených (12 000 RAD) buněk B transformovaných virem Epstein-Barrové (EBV), vykazujících specifitu DRB1*O4O1, v objemech 150 μΐ v jamkách mikrotitračních destiček s kulatým dnem. Peptidový antigen (HC gp-39 (263-275), YKL-39 (266-278), chitotriosidasa (269-282) nebo kontrolní peptid) byl přidáván v objemech 50 μΐ do duplicitních jamek. Po 48 hodinách bylo 100 μΐ kultivačního supernatantu testováno vzhledem k produkci IL-2 za použití sendvičového testu ELISA s protilátkami Pharmingen, specifickými vůči myšímu IL-2.

Bylo zjištěno, že syntetický peptid YKL-39 (266-278) vytvářel odpověď podobnou HC gp-39(263-275), zatímco Chi (269-282) odpověď neposkytoval. Údaje naznačují, že tři různé receptory buněk T (TCR), používané třemi odlišnými hybridomy, nerozlišují mezi HC gp-39 (263-275) či YKL-39 (268-278), jsou-li předkládány DRB 1*0401-kódovanými molekulami (Obr. la,

- 16 lb, lc), ale rozlišují mezi HC gp-39 (263-275 a Chi (269-282). Údaje ukazují, že YKL-39 (266-278) je mimikrový epitop HC gp-39 (263-275). (Obr. la,b,c).

Příklad 4: Rozpoznání YKL-39 (266-278) mononukleárními buňkami z periferní krve (PBMC)

Mononukleárních buňky z periferní krve (PBMC) byly isolovány z heparinizované periferní krve standardním odstředěním na Ficoll-Paque (Pharmacia, Uppsala, Švédsko). Buňky byly suspendovány v jamkách v koncentraci 5 x 10⁵ buněk na 1 ml. Buňky byly inkubovány v médiu buď samotné, nebo v přítomnosti 10 nebo 50 pg/ml peptidového antigenu (YKL-39 (266-278)). Kultury byly inkubovány 6 dní při 37°C ve zvhcované atmosféře 5% CO₂. Poté byly suspendovány a objemy 100 μΐ nebo 150 μΐ média byly distribuovány do jamek 96-jamkové mikrotitrační destičky s okrouhlými dny ke čtyřem souběžným stanovením. Pak byly buňky pulsně značeny 0,5 pCi (1,85 x 10⁴ Bq) [³H]thymidinu ( [³H]TdR) a po 18 hodinách od inkorporace byla měřena radioaktivita buněk. Výsledky znázorněné v Tabulce 3 jsou vyjádřeny jako ukazatel stimulace (SI), (antigen-specifické impulsy/impulsy pozadí).

Z Tabulky 3a lze usoudit, že epitop YKL-39 (266-278) je u pacientů s RA snadno rozpoznatelný. Tabulka 3b naznačuje, že rozpoznání YKL-39 (266-278)) polymorfonukleárními buňkami z periferní krve se shoduje s rozpoznáním HC gp-39 (263-275) a HC gp-39 a dále, že rozpoznání YKL-39 (266-278) je obecně zřetelnější než rozpoznání HC gp-39 (263-275).

- 17 Tabulka 3a. Rozpoznání epitopu YKL-39 (266-278) polymorfonukleárními buňkami z periferní krve

dárce		typování	SI 10 pg/ml	SI 50 pg/ml
242-0.2	neodpovídající	0404/15	3	<2
337-0.2	odpovídající	0401/02	19	58
338-0.1	neodpovídající	03/14	<2	<2
454-0	odpovídající	0401/	9	9
456-0	odpovídající	nestanoveno	15	4
457-0	neodpovídající	nestanoveno	<2	<2
458-0	odpovídající	nestanoveno	4	27
459-0	odpovídající	nestanoveno	<2	25
460-0	neodpovídající	nestanoveno	3	<2

SI = antigenně specifické impulsy/impulsy pozadí; SI > 5 jsou brány kladně; odpovídající (neodpovídající) = reagující (nereagující) jedinec

Tabulka 3b. Rozpoznání epitopu YKL-39 (266-278) se shoduje s rozpoznáním HC gp-39 (263-275) a bílkoviny HC gp-39

dárce	O/N	YKL-39 (266-278)	HC gp-39 (263-275)	HC gp-39
		SI Bg/ml	SI pg/ml	SI pg/ml
10	50	10	50	10	50
169	odp.	27	32	10	27	24	44
455	odp.	20	35	1	15	45	95
447	neodp.	1	2	1	1	1	1
327	odp.	6	5	3	5	12	19

SI = antigenně specifické impulsy/impulsy pozadí; SI > 5 jsou brány kladně; odpovídající (neodpovídající) = reagující (nereagující) jedinec;

dárce 447 odpovídá na tetanový toxoid a Candida Albicans

- 18 Příklad 5: Indukce snášenlivosti (tolerance)

Vyvinuto bylo vůči HC gp-39 (263-275)-specifické stanovení DTH (delayed-type hypersensitivity, přecitlivělost opožděného typu), vhodné ke sledování indukce snášenlivosti peptidovými antigeny. Imunizace myší Balb/c pomocí HC gp-39 (263-275) v nekompletním Freundově adjuvans (IFA) byla účinná pro indukci odpovědi DTH, následující po provokaci peptidem HC gp-39 (263-275). Tento systém DTH na bázi peptidu byl použit k detekci modulace odpovědi DTH aplikací peptidu HC gp-39 (263-275) nosem. Bylo zjištěno, že aplikace HC gp-39 (263-275) dávkově závislým způsobem modulovala odpověď DTH, indukovanou HC gp-39 (263-275) směrem k nižším hodnotám. Aplikace YKL-39 (263-278) nosem ovšem má za následek výraznější modulaci odpovědi DTH směrem k nižším hodnotám, ukazující, že YKL-39 (266-278) může účinně tolerizovat peptidově specifickou odpověď, indukovanou HC gp-39 (263-275) (Tabulka 4, Obr. 2a,b,c).

Tabulka 4. Pokusná předem připravená tolerizace

předléčení	senzibilizace	provokace	tolerance
žádné	HC gp-39 (263-275)	HC gp-39 (263-275)	ne
fyziol. roztok	HC gp-39 (263-275)	HC gp-39 (263-275)	ne
HC gp-39 (263-275)	HC gp-39 (263-275)	HC gp-39 (263-275)	ano
YKL-39 (266-278)	HC gp-39 (263-275)	HC gp-39 (263-275)	ano

/fcrs tupuje:

Seznam sekvencí <110> Akzo Nobel N.V.

<12O> Nové peptidy pro použití v imunoterapii autoimunitních onemocnění (Peptidy) <130>

<140>

<141>

<150> 98202470.5 <151> 1998-07-23 <160> 5 <170> Patentln Ver. 2.1 <210> 1 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1

Phe Thr Leu. Ala Ser Ala Glu Thr Thr

5 <210> 2 <211> 13 <212 > PRT <213> Homo sapiens <400> 2

His Ser Phe Thr Leu Ala Ser Ala Glu Thr Thr Val Gly

<210> 3 <211> 13 <212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 3

Arg Ser Phe Thr Leu Ala Ser Ser Glu Thr Gly Val Gly

5 10 <210>

<211>

<212>

PRT <213>

Homo sapiens <400>

Arg Ser Phe Thr Leu

Ala

Ser Ser Ser Asp Thr Arg Val Gly <210>

<211>

<212>

PRT <213>

Homo sapiens <400>

Pro Lys Phe Val Lys

Gin

Asn Thr Leu Lys Leu Ala Thr

Ρ U Ϊ4)&1 -Τ9 ΡΑΤΕΝΤΟΥÉ

Claims

NÁROKY

1. Peptid mající aminokyselinovou sekvenci o 9 až 55 aminokyselinových zbytcích, obsahujícící sekvenci aminokyselin FTLASAETT (sekvence id. č. 1).
2. Peptid podle nároku 1, který obsahuje sekvenci aminokyselin HSFTLASAETTVG (sekvenci id. č. 2).
3. Peptid podle nároku 1 nebo 2, mající sekvenci aminokyselin tvořenou nejvýše 25 aminokyselinovými zbytky.
4. Peptid podle nároku 1 nebo 2, mající sekvenci aminokyselin FTLASAETT (sekvence id. č. 1) nebo HSFTLASAETTVG (sekvenci id. č. 2).
5. Peptidy podle kteréhokoli z nároků 1 až 4 pro použití jako léčivo.
6. Farmaceutický prostředek vyznačující se tím, že obsahuje jeden nebo více peptidů podle nároků 1 až 4 a farmaceuticky přijatelný nosič.
7. Použití jednoho nebo více peptidů podle nároků 1 až 4 pro výrobu farmaceutického přípravku pro indukování specifické T-buněčné snášenlivosti vůči autoantigenu u pacientů trpících autoimunitními chorobami, konkrétněji arthritidou.
8. Diagnostický prostředek, vyznačující se tím, že obsahuje jeden nebo více peptidů podle kteréhokoli z nároků 1 až 4 a detekční činidlo.