KR20020047245A

KR20020047245A - 면역요법에 사용하기 위한 수정 펩티드 및 펩티드모방체

Info

Publication number: KR20020047245A
Application number: KR1020027004940A
Authority: KR
Inventors: 반스타베렌카테리나조안나; 티머르스코르넬리스마리우스; 갈렌반필리푸스조한네스마리에; 크네그텔르날두스마르셀루스알폰수스; 부츠안나마리아헬레나; 밀텐부르그안드레아스마르티누스마리아
Original assignee: 에프.지.엠. 헤르만스 ; 이.에이치. 리링크; 악조 노벨 엔.브이.
Priority date: 1999-10-18
Filing date: 2000-10-12
Publication date: 2002-06-21
Also published as: MXPA02003520A; CO5271650A1; EP1226167A1; HUP0203504A3; NO20021763L; SK6842002A3; NZ518256A; CA2386398A1; JP2003512388A; NO20021763D0; RU2002113107A; CZ20021356A3; CN1379786A; AU1139601A; TR200201036T2; BR0014803A; AU780238B2; HUP0203504A2; PL354590A1; AR026068A1

Abstract

본 발명은 H-Arg-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-OH에서 유도되며 일반식(II):Q-A1-A2-A3-A4-A5-A6-A7-A8-A9-A10-A11-A12-A13-Z을 갖는 수정 펩티드에 관한 것이다. 일반식 (II)에서 A1 내지 A13은 일반식(I)의 아미노산들에 대응하며, Q는 H에 대응하고, Z는 OH에 대응한다. 본 발명에 따른 수정은 a) A1 내지 A13에서 1-6, 바람직하게는 1-4 아미노산의 비천연 아미노산 또는 β아미노산으로 치환; b) 하나 이상의 아미드 결합을 환원된 아미드 결합 또는에틸렌 이소스테르로 치환; c) Q 및/또는 Z에서의 치환; 및 선택적으로 d) 총 6개 수정까지의 천연 아미노산의 치환으로 구성된 a, b 또는 c 군 중 하나 이상을 선택한다. 자가면역 질환에 걸린 환자의 관용 유도를 유도하기 위해 펩티드를 사용할 수 있다.

Description

면역요법에 사용하기 위한 수정 펩티드 및 펩티드모방체{MODIFIED PEPTIDES AND PEPTIDOMIMETICS FOR USE IN IMMUNOTHERAPY}

면역계는 자가항원에 대해 본래 갖춰진 관용에 의해 획득되는 외래 항원(비자기 항원)과 자가항원(자기 항원, 개체 자신의 신체로부터 유래됨) 사이의 구별 원리 상에 확립되어 있다.

면역계는 외래 항원으로부터 개체를 보호하고, T- 및 B-림프구와 같은 특정 세포를 활성화하고 인터류킨, 항체 및 보체 인자 같은 가용성 인자들을 생산함으로써 외래 항원 노출에 반응한다. 면역계가 반응하는 항원은 항원 제시 세포(APC)에 의해 분해되고, 항원 단편은 주요 조직적합 복합체(MHC) 클래스 II 당단백질과 관련하여 세포 표면 상에 발현된다. MHC-당단백질-항원-단편 복합체가 T 세포에 제시되고, 이때 결합된 MHC 클래스 II 단백질과 연합하여 T 세포 수용체에 의해 항원 단편이 인식된다. T 세포가 활성화되고, 즉 증식되고/되거나 인터류킨을 생산하고, 그 결과 공격 중인 항원으로 안내되는 활성화된 림프구를 확장시킨다(Grey et al.,Sci. Am., 261:38-46, 1989).

또한, 자기 항원은 계속해서 프로세싱되고 MHC 당단백질에 의해 항원 단편으로서 T 세포에 제시된다(Jardetsky et al., Nature 353:326-329, 1991). 따라서, 자기 인식은 면역 시스템에 고유한 것이다. 정상적인 상황에서, 면역계는 자기 항원에 관용적이며 이들 자기 항원에 의한 면역 반응의 활성화가 회피된다.

자기 항원에 대한 관용을 상실한 경우, 면역계가 하나 또는 그 이상의 자기 항원에 대해 활성화되고, 그 결과 자가반응성 T 세포를 활성화하고 자가항체를 생산한다. 이 현상을 자가면역이라 언급한다. 일반적으로 면역 반응은 파과적이기 때문에, 즉 침입하는 외래 항원을 파괴하기 때문에, 자가면역 반응은 신체 자체의 조직 파괴를 야기할 수 있다.

자가면역 질환에 대한 T 세포의 기여는 수개의 연구에서 확립되었다. 마우스에서, 실험적인 자가면역 뇌척수염(EAE)은, MHC 클래스 II 분자와 복합체를 이룬 미엘린 염기성 단백질(MBP)의 단일 에피토프에 대한 특이성에 의해 연결되는, 고도로 제한된 군의 T 세포에 의해 매개된다. 각종 자가면역 질환에 높은 감염성을 갖는 종인 루이스 래트에서, 질환은 T 세포에 의해 매개되는 것으로 보여졌다. 인간에서 자가면역 질환은 자가-공격성 T 세포의 발달과 관련이 있는 것으로 여겨진다.

파괴적인 자가면역 반응은 류마티스성 관절염(RA)과 같은 각종 질환과 연루되어 왔으며, 여기서 완전한 상태의 관절 연골은 다수의 활성화된 림프구 및 MHC 클래스 II 발현 세포의 존재로 인해 발생된 만성적인 염증성 프로세스에 의해 파괴된다. 연골조직의 단순한 존재는 국소적인 염증 반응을 지속하는데 필요한 것처럼보인다: 연골조직의 악화는 RA에서 연골-반응성 자가반응성 T 세포의 활성과 관련이 있다(Sigall et al., Clin. Exp. Rheumat. 6:59, 1988: Glant et al., Biochem. Soc. Trans. 18:796, 1990; Burmester et al., Rheumatoid arthritis Smolen, Kalden, Maini(Eds) Springer-Verlag Berlin Heidelberg, 1992). 게다가, 수술에 의해 RA 환자로부터 연골을 제거하면 염증성 프로세스를 감소시키는 것으로 보여졌다(R.S. Laskin, J.Bone Joint Surgery(Am) 72:529, 1990). 따라서, 연골 단백질은 T 세포를 자극하는 능력이 있는 표적 자가항원으로 여겨진다. 이들 자가반응성 T 세포의 활성화는 자가면역 질환을 발달시키도록 유도한다. 그러나, 류마티스성 관절염 발병에서 역할하는 자가항원성 성분을 동정하는 것은 아직 어려운 상태이다.

연골 파괴를 결과로 나타내는 염증성 반응은 예컨대 스테로이드 약물과 같은 수개의 약물로 치료될 수 있다. 그러나, 이들 약물은 자주 비특이적이고 독성 부작용을 갖는 면역억제제이다. 비특이적 면역억제의 단점은 이를 매우 불리한 요법으로 만든다.

본 발명은 HC gp-39(263-275)에 기초한 수정 펩티드, 이들 펩티드를 함유하는 약학 조성물, 및 자가면역 질환에 걸린 환자에게서 관용 유도를 유도하기 위한 이들 펩티드의 용도에 관한 것이다.

도 1

APC로서 방사선 조사된 자기 유래의 PBMC을 사용하여 리드 펩티드 또는 선별된 수정 펩티드들로 자극한 후 클론 235의 증식을 실시예 15에 기재된 바와 같이 측정하였다. 0, 0.4, 2, 10 및 50 ㎍/㎖의 농도에서 펩티드의 자극 활성을 시험하였다. 리드 펩티드 H-Arg-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-OH(폐쇄형 원)로 자극, Ac-Arg-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-ψ[CH₂NH]-Gly-NH₂(폐쇄형 사각)로 자극, Ac-Arg-NhSer-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-NH₂(개방형 원)으로 자극 또는 Ac-Arg-NhSer-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-ψ[CH₂NH]-Gly-NH₂(개방형 사각)으로 자극시킨 후 235 클론의 반응을 나타낸다.

표 2

하이브리도마 분석(제1 라인 시험): + = 화합물이 미수정된 263-275 펩티드와 필적하거나 이보다 우수한 방식으로 3개 모두의 하이브리도마를 자극함. +^*= 3개 모두는 아니나 1 또는 2개 하이브리도마에 대해 입증된 작용제 활성. 효력(유사체의 자극 활성 / 리드 펩티드, 예컨대 HC gp-39(263-275)의 자극 활성)이 있는 인간 클론의 반응성(클론 235 및 243의 증식). - = 효력 < 0.6, + = 효력 0.6-12,++ = 효력 > 12-100, +++ = 효력 >100. Ac-Arg-NhSer-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-NH₂, Ac-Arg-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-ψ[CH₂NH]-Gly-NH₂, D-1-글루시틸-Arg-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-OH, CH₃(OCH₂CH₂)₃-OCH₂C(O)-Arg-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-NH₂, 및 H-Arg-Ser-Phe(4Cl)-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-OH는 HLA-DRB1^*0401에 결합하는 친화도에 대해 시험하였고 리더-펩티드 H-Arg-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-OH의 친화도와 비교하였다. 가장 활성이 있는 화합물들(Ac-Arg-NhSer-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-NH₂및 Ac-Arg-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-ψ[CH₂NH]-Gly-NH₂)은 원래 펩티드의 친화도에 필적하는, HLA-DRB1^*0401와의 결합에 대한 상대 친화도를 보여주었다.

항원-특이 비독성 면역억제 요법은 비특이 면역억제에 대해 매우 흥미있는 대안을 제공한다. 이 항원-특이 요법은 표적 자가항원 또는 표적 자가항원 유래의 합성 T 세포-반응성 펩티드로 환자를 치료하는 것을 포함한다. 이들 합성 펩티드는 자가항원의 T 세포 에피토프에 대응하며 그 자체 및 자가항원 모두에 특이 T 세포 관용을 유도하는데 사용될 수 있다. 면역계의 탈감작화 또는 면역학적 관용은 항원 또는 에피토프를 흡입하거나 이들이 제공된 동물들이, 상기 항원 또는 에피토프가전신 경로를 통해 도입될 때, 항원 또는 에피토프에 대한 전신성 면역 반응을 덜 발달시킬 수 있다는 장기간 관찰된 현상에 기초한다.

류마티스성 관절염은 HLA-DR4-양성 개체에서 자주 발생하는 자가면역 질환이다. 질환 연루는 DR4 분자가 T-세포에 자가항원을 제시하는 것을 의미할 수 있다. 이 자가면역 질환의 표적은 관절 연골세포가 매트릭스 내 조직화된 유일한 세포 유형 생산 산물을 제공하는 관절이다. RA에서 나타나는 관절 파괴는 연골-특이, 자가반응성 T-세포에 의해 매개되는 것으로 생각된다. 연골-유래 단백질인 인간 연골 gp-39(HC gp-39)는 최근 RA에서 후보 자가항원으로 확인되었다. HC gp-39 단백질의 주요 에피토프, 즉 263-275 서열을 포괄하는 펩티드는 RA 환자에게서 우선적으로 인식되며, 이는 이 에피토프가 류마티스성 관절염에서 자가면역 공격의 표적이라는 것을 암시한다. 18명의 RA 환자 중 8명은 이 펩티드에 반응하였으나, 건강한 공여자 그룹에서는 반응성이 확인되지 않았다(Verheijden et al., Arthtritis Rheum. 40:1115, 1997). 따라서, 데이타는 이 펩티드 또는 HC gp-39 단백질이 관절내 면역 인식 표적이라는 것을 강력히 암시한다.

관절염 질환에서 HC gp-39의 중요성은 Balb/c 마우스의 관절염 형성에 의해 추가 입증되었다. IFA내 혼합된 ㎍ 함량의 단백질을 흉부 영역에 단일 주입하는 것은 RA를 연상시키는 만성 관절 염증을 유도하였다.

HC gp-39 펩티드 263-275에 대한 반응은 HC gp-39로 면역시킨 다음 DRB1^*0401-트랜스제닉 마우스 유래의 DRB1^*0401-제한, 펩티드-특이 T-T 하이브리도마 세트를 형성시킴으로써 추가 검사하였다. DR4(DRB1^*0401)와 관련하여 펩티드 263-275에 특이적인 하이브리도마의 정교한 특이성이 정의되고 비교되었다. 그 결과, DRB1^*0401에 의해 제시되는 263-275 에피토프의 인식에 있어서 차이가 있는 3개 하이브리도마가 동정되었다. (사용된 3개 하이브리도마 사이의 에피토프 인식의 차이는 263-275 서열 내 N- 및 C-말단 절단형 펩티드가 상이한 하이브리도마를 자극하는데 사용될 때 가시화되었다). 5G11 하이브리도마는 265-275 서열에 가장 바람직하게 반응하는 것으로 발견되었다. 대조적으로, 8B12 하이브리도마에 의한 인식은 서열 264-274 주위에 집중되어 있는 반면, 14G11 하이브리도마는 264-275에 가장 바람직하게 반응하였다.

HC gp-39(263-275)-반응성 T-세포를 관용화시키는 것은 RA 환자에게 유익할 수 있다. 본 발명은 면역 반응을 유도하는 성능이 우수하고 관용화 성능이 우수한, HC gp-39(263-275) 서열에 기초한 수정 펩티드 유도체를 제공한다.

놀랍게도, HC gp-39(263-275)에 기초한 특이 펩티드 수정은 HC gp-39(263-275) 펩티드에 특이적인 T-세포 하이브리도마 세트에 작용성이며, 263-275 에피토프 서열을 수용한 펩티드로 자극한 후 형성되는 2개의 인간 T-세포 클론을 자극시키는데 우수하다는 것이 밝혀졌다. 게다가, 이들 수정 펩티드는 생체내 우수한 관용화 성능을 보여주었다.

따라서, 본 발명의 일 양상에 따라, H-Arg-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-OH(식 I; 서열번호 1)에서 유도되고 일반식 Q-A1-A2-A3-A4-A5-A6-A7-A8-A9-A10-A11-A12-A13-Z(식 II)을 갖는 수정 펩티드를 제공한다. 일반식 I, 에서 A1 내지 A13은 식 I의 아미노산에 대응하고, Q는 H에 대응하며, Z는 OH에 대응한다. 본 발명에 따른 수정은 하기 a), b) 및 c)로 구성된 군에서 선택된다.

a) A1 내지 A13에서 1-6개, 바람직하게는 1-4개 아미노산을 비천연 아미노산 또는 β아미노산으로 치환하는 것.

b) 하나 이상의 아미드 결합을 환원된 아미드 결합 또는 에틸렌 이소스테르로 치환하는 것.

c) Q 및/또는 Z에서의 치환.

하나 이상의 이들 군으로부터 선택된 수정의 개수는 1-6개이다. 추가로, 총 수정 개수가 6개를 넘지 않는 한 아미노산은 다른 천연 아미노산으로 치환될 수 있다.

식 I에 기초한 수정 펩티드(HC gp-39(263-275))는 C- 및/또는 N-말단 수정에 의해 안정화되며, 이는 엑소펩티다제 촉매의 가수분해를 감소시킬 것이다. 이러한 수정은 N-말단 아실화(예, 아세틸화=Ac-펩티드), C-말단 아미드 도입(예, 펩티드-NH₂), 아실화와 아미드 도입의 조합(예, Ac-펩티드-NH₂) 및 예컨대 L-아미노산 대신 D-아미노산의 도입을 포함할 수 있다. 다른 수정은 엔도펩티다제에 의한 가수분해를 방지하는데 집중되어 있다.

하기 표 1은 펩티드 연결에 관한 것이다.

이들 수정의 예는 L-아미노산 대신 D-아미노산의 도입, 수정된 아미노산, 펩티드 내 고리화, 수정 펩티드 결합의 도입, 예컨대 환원된 펩티드 결합 ψ[CH₂NH] 및 펩토이드(N-알킬화된 글리신 유도체)이다.

다른 펩티드 유사체는 식 I 또는 일반식 II의 펩티드와 관련있을 수 있으나, 통상 -NH-C(O)-펩티드 결합 대신 표 1에 표시된 연결들 또는 이들의 임의의 조합이 각 -NH-C(O)-결합 대신 사용될 수 있다. 만일 N-말단에 있는 아미노기가 제거되면(예, A1=식 II에서 데스아미노아르기닌), 식 II에서 Q는 어떠한 원자에도 해당되지않는다. 본 발명에 따른 바람직한 펩티드는 Q가 H, (C_1-6)알킬, 포르밀, (C_1-6)알킬카르보닐, 카르복시(C_1-6)알킬, (C_1-6)알킬옥시카르보닐, (C_2-6)알케닐옥시카르보닐, (C_6-14)아릴(C_1-6)알킬; (C_6-14)아릴(C_1-4)알킬옥시카르보닐, CH₃(OCH₂CH₂)_n-OCH₂-C(O)-(여기서 n은 1-10), HOCH₂-(CHOH)_m-CH₂-(여기서 m은 3-4); 1-메틸-피리디늄-3-카르보닐, 1-메틸-피리디늄-4-카르보닐 또는 Lys이거나, 만일 A1이 H₂N-C(=NH)NH-(CH₂)_n-C(O)-(여기서 n은 2-5)이면 Q는 부재하고; Z는 OR(여기서 R은 H, (C_1-6)알킬, (C_2-6)알케닐, (C_6-14)아릴(C_1-4)알킬, (C_6-14)(C_4-13)헤테로아릴(C_1-6)알킬 또는 NR₁R₂(여기서 R₁및 R₂는 독립적으로 H, (C_1-6)알킬 또는 (C_1-6)아릴(C_1-6)알킬에서 선택됨)이고; 선택적으로, Q 및 Z는 위치 A1 및/또는 A13 다음에 위치하는 10개 이하의 아미노산을 추가로 포함한다. A1 내지 A13에서 하나 이상의 다른 천연 아미노산으로 치환하는 것은 바람직하게는 4개이하, 더욱 바람직하게는 2개 이하 위치에서 수행한다.

본 발명에 따른 펩티드의 경우, 일반식 II에서 하기 치환이 바람직하다: Q가 H, (C_1-6)알킬, 포르밀, (C_1-6)알킬카르보닐, 카르복시(C_1-6)알킬, (C_1-6)알킬옥시카르보닐, (C_2-6)알케닐옥시카르보닐, (C_6-14)아릴(C_1-6)알킬; (C_6-14)아릴(C_1-4)알킬옥시카르보닐, CH₃(OCH₂CH₂)_n-OCH₂-C(O)-(여기서 n은 1-10), HOCH₂-(CHOH)_m-CH₂-(여기서 m은 3-4); 1-메틸-피리디늄-3-카르보닐, 1-메틸-피리디늄-4-카르보닐 또는 Lys이거나,만일 A1이 H₂N-C(=NH)NH-(CH₂)_n-C(O)-(여기서 n은 2-5)이면 Q는 부재한다. 더욱 바람직한 치환은 Q가 H, (C_1-6)알킬, (C_1-6)알킬카르보닐, 카르복시(C_1-6)알킬, (C_1-6)알킬옥시카르보닐, CH₃(OCH₂CH₂)_n-OCH₂-C(O)-(여기서 n은 1-10), HOCH₂-(CHOH)_m-CH₂-(여기서 m은 3-4); 1-메틸-피리디늄-3-카르보닐, 1-메틸-피리디늄-4-카르보닐 또는 Lys이거나, 만일 A1이 H₂N-C(=NH)NH-(CH₂)_n-C(O)-(여기서 n은 2-5)이면 Q는 부재한다. 더욱 바람직한 펩티드는 Q가 H, 메틸; 아세틸; 카르복시메틸렌, 메톡시카르보닐; CH₃(OCH₂CH₂)₃-OCH₂-C(O)-, D-1-글루시틸, 1-메틸-피리디늄-3-카르보닐 또는 1-메틸-피리디늄-4-카르보닐이거나, 만일 A1이 H₂N-C(=NH)NH-(CH₂)₄-C(O)-이면 Q는 부재한다. A1은 L-Arg, D-Arg, L-Lys, D-Lys, L-Ala, D-Ala, H₂N-C(=NH)NH-(CH₂)_n-C(O)-(여기서 n은 2-5), H₂N-(CH₂)_n-C(O)-(여기서 n은 2-7), (R)-{-HN-CH[(CH₂)_n-NH-C(=NH)-NH₂]-CH₂-C(O)-}(여기서 n은 2-5) 또는 (S)-{-HN-CH[(CH₂)_n-NH-C(=NH)-NH₂]-CH₂-C(O)-}(여기서 n은 2-5) 또는 -N[(CH₂)_n-NH-C(=NH)-NH₂]-CH₂C(O)-(여기서 n은 2-5)이다. 바람직하게, A1은 L-Arg, D-Arg, L-Ala, H₂N-C(=NH)NH-(CH₂)_n-C(O)-(여기서 n은 2-5), H₂N-(CH₂)_n-C(O)-(여기서 n은 2-7), (S)-{-HN-CH[(CH₂)_n-NH-C(=NH)-NH₂]-CH₂-C(O)-}(여기서 n은 2-5) 또는 -N[(CH₂)_n-NH-C(=NH)-NH₂]-CH₂C(O)-(여기서 n은 2-5)이다. 더욱 바람직하게, A1은 L-Arg, D-Arg, L-Ala, H₂N-C(=NH)NH-(CH₂)₄-C(O)-, H₂N-(CH₂)_n-C(O)-(여기서 n은 5-7), (S)-{-HN-CH[(CH₂)₃-NH-C(=NH)-NH₂]-CH₂-C(O)-} 또는 -N[(CH₂)₃-NH-C(=NH)-NH₂]-CH₂C(O)-(여기서 n은 2-5)이다.

A2는 L-Ser, D-Ser, L-hSer, D-hSer, L-Thr, D-Thr, L-Ala, D-Ala, Gly 또는 -N[(CH₂)_n-OH]-CH₂-C(O)-(여기서 n은 2-5)이다. 바람직하게, A2는 L-Ser, L-Ala, D-Ala, Gly 또는 -N[(CH₂)_n-OH]-CH₂-C(O)-(여기서 n은 2-5)이다. 더욱 바람직하게, A2는 L-Ser, L-Ala 또는 -N[(CH₂)₂-OH]-CH₂-C(O)-이다.

A3은 L-Phe, D-Phe, L-Phe(X), D-Phe(X)(X는 독립적으로 (C_1-4)알킬, 히드록시, 할로, (C_1-6)알킬카르보닐아미노, 아미노 또는 니트로), L-Hfe, D-Hfe, L-Thi, D-Thi, L-Cha, D-Cha, L-Pal(3), D-Pal(3), L-1-Nal, D-1-Nal, L-2-Nal, D-2-Nal, L-Ser(Bzl), D-Ser(Bzl), (R)-{-HN-CH(CH₂-아릴)-CH₂-} 또는 (S)-{-HN-CH(CH₂-아릴)-CH₂-} 또는 (R)-{-HN-CH(CH₂-아릴)-CH₂-} 또는 (S)-{-HN-CH(CH₂-아릴)-CH₂-} 에서 하나 이상 선택된다. 바람직하게, A3은 L-Phe, D-Phe, L-Phe(X), 또는 D-Phe(X)(X는 할로 또는 니트로), L-Hfe, L-Thi, L-Cha, L-Pal(3), L-1-Nal, L-2-Nal, L-Ser(Bzl) 또는 (S)-{-HN-CH(CH₂-아릴)-CH₂-}이다. 더욱 바람직하게, A3은 L-Phe, D-Phe, L-Phe(X)(X는 할로 또는 니트로), L-Hfe, L-Thi, L-Cha, L-Pal(3), L-1-Nal, L-2-Nal 또는 L-Ser(Bzl)이다.

A4는 L-Thr, D-Thr, L-Ser, D-Ser, L-hSer, D-hSer, L-Ala, D-Ala 또는 Gly이다. 바람직하게 A4는 L-Thr 또는 L-Ala이다.

A5는 L-Leu, D-Leu, L-Ile, D-Ile, L-Val, D-Val, L-Nva, D-Nva, L-Ala, D-Ala, Gly, (R)-{-HN-CH(CH₂-CH(CH₃)₂)-CH₂-} 또는 (S)-{-HN-CH(CH₂-CH(CH₃)₂)-CH₂-}이다. 바람직하게 A5는 L-Leu, L-Ala 또는 (S)-{-HN-CH(CH₂-CH(CH₃)₂)-CH₂-}이다.

A6은 L-Ala, D-Ala 또는 Gly이다. 바람직하게 A6은 L-Ala 또는 Gly이다.

A7은 L-Ser, D-Ser, L-hSer, D-hSer, L-Thr, D-Thr, L-Ala, D-Ala 또는 Gly이다. 바람직하게 A7은 L-Ser 또는 L-Ala이다.

A8은 L-Ser, D-Ser, L-hSer, D-hSer, L-Thr, D-Thr, L-Ala, D-Ala 또는 Gly이다. 바람직하게, A8은 L-Ser 또는 L-Ala이다.

A9는 L-Glu, D-Glu, L-Asp, D-Asp, L-Ala, D-Ala 또는 Gly이다. 바람직하게, A9는 L-Glu 또는 L-Ala이다.

A10은 L-Thr, D-Thr, L-Ser, D-Ser, L-hSer, D-hSer, L-Ala, D-Ala 또는 Gly이다. 바람직하게, A10은 L-Thr 또는 L-Ala이다.

A11은 Gly, L-Ala, D-Ala 또는 -NH-CH₂-CH₂-이다. 바람직하게, A11은 Gly, L-Ala 또는 -NH-CH₂-CH₂-이다.

A12는 L-Val, D-Val, L-Nva, D-Nva, L-Leu, D-Leu, L-Ile, D-Ile, (R)-{-HN-CH[CH(CH₃)₂]-CH₂-}, (S)-{-HN-CH[CH(CH₃)₂]-CH₂-}, (R)-{-HN-CH[CH₂CH₂CH₃]-CH₂-}, (S)-{-HN-CH[CH₂CH₂CH₃]-CH₂-}, (R)-{-HN-CH[CH₂CH(CH₃)₂]-CH₂-} 또는 (S)-{-HN-CH[CH₂CH(CH₃)₂]-CH₂-}, (RR)-{-HN-CH[CH₂(CH(CH₃)-CH₂CH₃]-CH₂-} 또는 (RS)-{-HN-CH[CH₂(CH(CH₃)-CH₂CH₃]-CH₂-}, (SR)-{-HN-CH[CH₂(CH(CH₃)-CH₂CH₃]-CH₂-} 또는 (SS)-{-HN-CH[CH₂(CH(CH₃)-CH₂CH₃]-CH₂-}이다. 바람직하게, A12는 L-Val 또는 (S)-{-HN-CH[CH(CH₃)₂]-CH₂-}이다.

A13은 Gly, L-Ala 또는 D-Ala이다. 바람직하게, A13은 Gly 또는 L-Ala이다.

나아가, 본 발명에 따른 펩티드에서 Z는 OR(여기서, R은 H, (C_1-6)알킬, (C_2-6)알케닐, (C_6-14)아릴(C_1-4)알킬, (C_4-13)헤테로아릴(C_1-6)알킬) 또는 NR₁R₂(여기서, R₁및 R₂는 독립적으로 H, (C_1-6)알킬 또는 (C_6-14)아릴(C_1-6)알킬에서 선택됨)이다. 바람직하게, Z는 OR(여기서, R은 H) 또는 NR₁R₂(여기서, R₁및 R₂는 독립적으로 H 또는 (C_1-6)알킬에서 선택됨)이다. 더욱 바람직하게, Z는 OH, NH₂또는 NHEt이다.

본 발명에 따른 펩티드는 임의적으로 N 및 C 말단 단부에서, 즉 A1 및/또는 A13 다음에서 수개의 아미노산으로 연장될 수 있다. 바람직하게, 이들은 10개 이하의 아미노산으로 연장될 수 있다. 따라서, Q 및 Z는 위치 A1 및/또는 A13 옆에 위치하는 10개 이하의 아미노산을 추가 함유할 수 있다.

펩티드는 수개 위치에서 일반식 I과 상이할 수 있으나, 바람직하게는 1-4개 위치에서, 더욱 바람직하게는 2-3개 위치에서 수정된다.

본 명세서에 사용된 (C_1-6)알킬은 1-6개 탄소 원자를 갖는 분지쇄 또는 비분지쇄 알킬기를 의미하며, 예를들면 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸, sec-부틸, tert-부틸 및 헥실이 있다. 1-4개 탄소 원자를 갖는 알킬기가 가장 바람직하다.

(C_1-4)알킬은 1-4개 탄소 원자를 갖는 분지쇄 또는 비분지쇄 알킬기를 의미한다.

(C_2-6)알케닐은 2-6개 탄소 원자를 갖는 분지쇄 또는 비분지쇄 알케닐기를 의미하며, 예를들면, 에테닐, 2-부테닐 등이 있다. (C_1-4)알케닐기가 바람직하며, (C_1-3)알케닐기가 가장 바람직하다.

(C_1-6)알킬카르보닐은 카르보닐기에 부착된 1-6개 탄소 원자를 갖는 분지쇄 또는 비분지쇄 알킬기를 의미하며, 예를들면, 아세틸기가 있다. 1-4개 탄소 원자를 갖는 알킬기가 가장 바람직하다.

카르복시-(C_1-6)알킬은 1-6개 탄소 원자를 갖는 분지쇄 또는 비분지쇄 알킬기에 부착된 카르복시기를 의미한다. 1-4개 탄소 원자를 갖는 알킬기가 가장 바람직하다.

(C_1-6)알킬옥시카르보닐은 옥시카르보닐기에 부착된 분지쇄 또는 비분지쇄 알킬기를 의미하며, 예를들면 메톡시카르보닐-, 또는 tert-부틸옥시카르보닐-(Boc-)기가 있다. 1-4개 탄소 원자를 갖는 알킬기가 가장 바람직하다.

(C_2-6)알케닐옥시카르보닐은 옥시카르보닐기에 부착된, 이전에 정의한 바와같이 2-6개 탄소 원자를 갖는 분지쇄 또는 비분지쇄 알케닐기를 의미하며, 예를들면 알킬옥시카르보닐기가 있다. (C_1-4)알케닐기가 바람직하며, (C_1-4)알케닐기가 가장 바람직하다.

(C_1-4)(디)알킬아미노는 알킬 부분이 이전에 정의한 동일 의미를 갖는, 1-6개 탄소 원자를 갖는 (디)알킬아미노기를 의미한다. 1-4개 탄소 원자를 갖는 알킬기가 바람직하다.

아미노(C_1-6)아실은 아미노기로 기능화된 1-6개 탄소 원자를 갖는 아실기를 의미한다. 1-4개 탄소 원자를 갖는 아실기가 바람직하다.

(C_6-14)아릴은 6-14개 탄소원자를 갖는 방향족 탄화수소기를 의미하며, 예를들면 페닐, 나프틸, 테트라히드로나프틸, 이데닐, 안트라실이 있으며, 이들은 선택적으로 오르토 및/또는 메타 위치에서 하나 이상의 치환기로 치환될 수 있다. 치환기의 예로는 비제한적으로 수산기, 할로겐, 니트로, 시아노, 아미노((C_1-6)아실) 또는 (디)(C_1-6)알킬아미노가 있으며, 여기서 아실 및 알킬 부분은 이전에 정의한 것과 동일한 의미이다. (C_6-10)아릴기가 바람직하며, 페닐이 가장 바람직하다.

(C_4-13)헤테로아릴(C_1-6)알킬은 4-13개 탄소 원자, 바람직하게는 4-9개 탄소 원자를 갖으며 적어도 N, O 및/또는 S에서 선택된 하나의 헤테로원자를 포함하며 1-6개 탄소 원자를 갖는 분지쇄 또는 비분지쇄 알킬기에 연결된 치환 또는 비치환된 방향족기를 의미한다. 헤테로아릴기 상의 치환기는 아릴기에 대하여 나열된 치환기의 군에서 선택될 수 있다. 질소-함유 헤테로아릴기는 알킬기에 탄소 또는 질소 원자를 통해 연결될 수 있다. 알킬기 중 1-4개 탄소 원자를 갖는 기가 바람직하다.

(C_1-6)알킬(C_6-14)아릴은 이전에 정의한 아릴기에 부착된, 이전에 정의한 분지쇄 또는 비분지쇄 알킬기를 의미한다. (C_6-10)아릴기가 바람직하며, 페닐이 가장 바람직하다. 알킬기 중 1-4개 탄소 원자를 갖는 기가 바람직하다.

(C_6-14)아릴(C_1-6)알킬은 알킬기가 (C_1-6)알킬기이고 아릴기가 이전에 정의한 (C_6-14)아릴기인 아릴알킬기를 의미하며, 예를들면 벤질-(Bzl) 또는 트리페닐메틸-(Trt)기가 있다. (C_6-10)아릴기가 바람직하며, 페닐이 가장 바람직하다. 알킬기 중 1-4개 탄소 원자를 갖는 기가 바람직하다.

(C_1-6)알킬카르보닐아미노는 알킬기가 1-6개 탄소 원자를 함유하고 이전에 정의한 것과 같은 의미를 갖는 알킬카르보닐아미노기를 의미한다. 1-4개 탄소 원자를 갖는 알킬기가 바람직하다.

(C_6-14)아릴(C_1-4)알킬옥시카르보닐은 알킬기가 (C_1-4)알킬기이고 아릴기가 이전에 정의한 것이며 알킬옥시카르보닐기에 연결된 (C_6-14)아릴기를 의미하며, 예를들면, 벤질옥시카르보닐-(Z) 또는 플루오레닐-메톡시카르보닐-(Fmoc)기가 있다. (C_6-10)아릴기가 바람직하며, 페닐이 가장 바람직하다.

할로는 F, Cl, Br 또는 I를 의미한다.

천연적으로 발생하는 아미노산은 하기와 같이 약자(3문자 코드)를 사용하여 표시한다: 알라닌(Ala), 아르기닌(Arg), 아스파라긴(Asn), 아스파르트산(Asp), 시스테인(Cys), 글루타민(Gln), 글루탐산(Glu), 글리신(Gly), 히스티딘(His), 세린(Ser), 이소류신(Ile), 류신(Leu), 리신(Lys), 메티오닌(Met), 페닐알라닌(Phe), 프롤린(Pro), 트레오닌(Thr), 트립토판(Trp), 티로신(Tyr) 및 발린(Val). 모든 아미노산의 입체화학은 L-로 한정한다.

비천연 아미노산은 임의적으로 천연 아미노산과 동일하지 않은 화학 구조를 갖는 Nα-치환된 α-아미노산이다. 비천연 아미노산은 예를들면, Phe(X)[여기서, X는 Phe 중 페닐 고리의 파라 위치에 있는 치환기임], hSer(2-아미노-4-히드록시부타노산), 노르류신(Nle, 2-아미노헥사노산), 노르발린(Nva, 2-아미노펜타노산), L-Hfe(L-α-호모페닐알라닌), D-Hfe(D-α-호모페닐알라닌), L-Thi(β-티에닐-L-알라닌), D-Thi(β-티에닐-D-알라닌), L-Cha(β-시클로헥실-L-알라닌), D-Cha(β-시클로헥실-D-알라닌), L-Pal(3)(β-3-피리딜-L-알라닌), D-Pal(3)(β-3-피리딜-D-알라닌), L-1-Nal(β-1-나프틸-L-알라닌), D-1-Nal(β-1-나프틸-D-알라닌), L-2-Nal(β-2-나프틸-L-알라닌), D-2-Nal(β-2-나프틸-D-알라닌), L-Ser(Bzl)(O-벤질-L-세린), D-Ser(Bzl)(O-벤질-D-세린), 및 NVal(N-이소프로필글리신, NArg (N-(3-구아니디노프로필)글리신)과 NhSer (N-(2-히드록시에틸)글리신)과 같은 N-알킬글리신 유도체가 있다. 또한, 입체화학이 D-로 정의된 천연 발생 아미노산도 상기 아미노산 군에 포함된다.

환원된 아미드 결합을 통합한 펩티드에서 아미노산의 원래 카르보닐기는 메틸렌기로 치환되었다는 것을 이해하여야 한다. 에틸렌 이소스테르를 통합한 펩티드에서 원래 카르복사미드 기능(-C(O)-NR-)은 에틸렌기(-CH=CR-)로 치환되었다.

서열 내 두 아미노산 잔기 사이에 있는 ψ[CH₂NH]는 상기 아미노산 잔기 사이에 있는 원래 아미드 결합(-C(O)-NH-)이 환원된 아미드 결합(-CH₂NH-)으로 치환되었다는 것을 의미한다.

식 I에 제시된 수개의 아미노산은 일반식 2 중 대응 위치에 고정되는 것이 바람직하다. 따라서, 본 발명의 바람직한 구체예는 일반식 Q-A1-A2-A3-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-A11-A12-Gly-Z(식 III)을 갖는 수정 펩티드이다(여기서, Q, A1, A2, A3, A11, A12 및 Z는 이전에 정의한 바와 같다). 일반식 III에서 가장 바람직간 치환은 A1의 경우, L-Arg, D-Arg, H₂N-C(=NH)NH-(CH₂)₄-C(O)-, H₂N-(CH₂)_n-C(O)-(여기서 n은 5-7), 또는 -N[(CH₂)₃-NH-C(=NH)-NH₂]CH₂C(O)-이고, A2의 경우, L-Ser, -N[(CH₂)₂-OH]-CH₂-C(O)-이고, A3의 경우 L-Phe, L-Phe(X) (여기서 X는 할로), L-1-Nal, L-2-Nal, L-Ser(Bzl), L-Thi, L-Cha 또는 L-Pal(3)이다.

더욱 바람직한 일반식 III의 펩티드는 A1이 Arg이고, A3이 Phe이며, A11이 Gly이고, 이는 일반식 IV: Q-Arg-A2-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-A12-Gly-Z를 초래한다(여기서, 위치 Q, A2, A12 및 Z는 이전에 정의한 바와 같다).

가장 바람직한 펩티드는 데스아미노아르기닐-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-NH₂, 데스아미노아르기닐-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-OH, CH₃-(OCH₂CH₂)₃-OCH₂-C(O)-Arg-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-NH₂, D-1-글루시틸-Arg-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-OH, CH₃O-C(O)-Arg-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-OH, Ac-Arg-Ser-Phe-ψ[CH₂NH]-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-NH₂, Ac-Arg-Ser-Phe-Thr-Leu-ψ[CH₂NH]-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-NH₂, Ac-Arg-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-ψ[CH₂NH]-Gly-NH₂, Ac-Arg-N[(CH₂)₂-OH]-CH₂-C(O)-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-NH₂, Ac-Arg-N[(CH₂)₂-OH]-CH₂-C(O)-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-ψ[CH₂NH]-Gly-NH₂, H-Arg-Ser-Phe(Cl)-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-OH, H₂N-(CH₂)₅-C(O)-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-OH, H₂N-(CH₂)₆-C(O)-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-OH, (N-메틸-니코티노일)⁺-Agr-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-OH로 구성된 군에서 선택된다.

식 V에 나타난 바와 같이, N-말단 수정을 갖는 수정된 HC gp39(263-275) 펩티드의 합성에 적절한 방법론은, 식 VI의 유도체로 시작한다. 수정 펩티드는 일상적으로 사용되는 고체상 펩티드 합성(SPPS) 방법에 의해 합성된다(B. Merrifield,Solid Phase Peptide Synthesis, Peptides 1995, 93-169, Editor: B.Gutte, Academic, San Diego, California, USA; P.Lloyd-Williams, F.Albericio, E. Giralt, Tetrahedron 49:11065-11133, 1993). 사용된 링커의 유형에 따라, 펩티드 사슬은 에스테르(PAC 링커) 또는 아미드(PAL 링커) 연결을 통해 지지체에 연결된다.

[식 V]

[식 VI]

Fmoc-C-말단 아미노산을 고체 지지체에 고착시킨 후(m=1, A-B=Fmoc), 예를들면 커플링제 HATU(L. Carpino, A. El-Faham, C.A.Minor, F. Albericio, J. Chem. Soc., Chem. Comm. 201-203, 1994) 또는 PyBOP(J. Coste, D. Le-Nguyen, B. Castro, Tetrahedron Lett. 31:205-208, 1990) 및 DiPEA를 사용하여, 적절하게 보호된 Fmoc-아미노산 유도체로 연속 아실화시키고 이어서 Fmoc 보호기(A-B=H)를 피페리딘 매개로 제거함으로써 자동화된 펩티드 합성기로 사슬을 연장시켰다(m=2-12). 대안으로, 펜타플루오로페닐(Pfp) 아미노산 활성 에스테르(A. Dryland, R.C. Sheppard, Tetrahedron 44: 859-876, 1988)를 사용하여 축합하였다. 이어서, 동일 프로토콜로 N-말단 아미노산 B을 도입하고 Fmoc-기를 제거하였다. 이로써 수득한 13량체 펩티드 유도체(A=H, B=N-말단 아미노산, m=12)는 N-말단을 기능화시켰다. N-말단에 추가 아미드 결합을 도입하는 것(A=알킬카르보닐)은 원하는 산(X-OH)으로 다른 HATU 또는 PyBOP-매개성 축합을 수행함으로써 또는 피리딘 존재하에 아실 클로라이드(X-Cl)로 커플링함으로써 달성될 수 있다. 수성 매질 내에서 완전하게 탈보호된 펩티드 중 자유 N-말단과 N-메틸(이소)니코티늄 히드록시숙신이미드 활성 에스테르의 DiPEA-매개성 반응(M.L. Tedjamulia, P.C. Srivastava, F.F. Knapp, J.Med. Chem., 28:1574-1580, 1985)에 의해 수지[즉, 식 V, A=H, B=N-말단 아미노산, Z=OR(여기서 R=H, 알킬) 또는 Z=NR¹R²(여기서 R¹, R²=H 또는 알킬)]로부터 절단(하기 참조)한 후 전하를 띤 1-메틸 피리디늄-4-카르보닐 단위 또는 1-메틸 피리디늄-3-카르보닐단위를 도입할 수 있다(cf. 식 V 중 A=H에서 A=N-메틸(이소)니코티늄 으로 전환).

DMF/HOAc(99/1, v/v) 중 NaBH(OAc)₃의 존재하에 고정화된 펩티드를 적절한 알데히드로 처리함으로써 환원성 아민화를 통해 N-알킬화를 수행할 수 있다(식 VI, A=H에서 A=알킬로 전환). 대안으로, DiPEA 존재하에 알킬 할로겐화물과 고정된 펩티드(A=H)를 반응시켜 N-알킬화된 펩티드에 접근한다(예, tert-부틸 브로모아세테이트와의 반응). 또한, 자유 NH₂(식 VI에서 A=H)는 CH₂Cl₂/DiPEA에서 해당 카르바모일 클로라이드와 반응시킴으로써 카르바모일기(예, 메톡시카르보닐)로 기능화될 수 있다(식 VI에서 A=H에서 A=알킬옥시카르보닐로의 전환). TFA/Et₃SiH/아니솔/ROH(R=H, 알킬)를 사용하여 산-불안정성 보호기를 제거함과 동시에 고체 지지체로부터 펩티드를 절단한 후, 일반식 V(Z=OR)을 갖는 펩티드를 RP-HPLC로 정제한다. 대안으로, 수지로부터 절단하는 동안 C-말단에 아미드 기능을 갖게 할 수 있다(Z=NR¹R², 여기서 R¹및 R²=H 또는 알킬). 이 경우, 펩티드 사슬(식 VI)과 PEG-PS 고체 지지체 사이에 상이한 링커(PAL: B.Merrifield, Peptides, 93-169, 1995)를 사용한다. 만일 PAL 링커의 자유 아미노기를 알킬화시킨 후 최초 (C-말단)아미노산을 부착한다면, C-말단 알킬 아미드는 중합체 지지체로부터 절단된 후 형성될 것이다.

동일한 Fmoc-SPPS 전략을 사용하면, 입수가능한 비천연 아미노산(예, D-아미노산 또는 치환된 페닐알라닌 유도체)을 함유하는 펩티드에 접근할 수 있다. 이와 별도로, 문헌상 공정(J.A. Kruijtzer, L.J.F. Hofmeyer, W. Heerma, C. Versluis, R.M.J. Liskamp, Chem. Eur. J. 4:1570-1580, 1998)을 사용하여 용액 내에서 먼저 N-알킬 글리신 유도체(펩토이드 단량체, 식 V 및 VI에서 R_n ¹=아미노산 측쇄, R_n ²=H)를 합성한다. 또한, SPPS 이전에, 공지 공정(H.M.M. Bastiaans, A.E. Alewijnse, J.L. van der Baan, H.C.J. Ottenheijm, Tetrahedron Lett. 35:7659-7660, 1994)에 따라 수정된 N-말단 아미노산 β-호모-L-아르기닌[B=NH-CH(CH₂CH₂CH₂NH-CH(=NH)NH₂)-CH₂-C(O)]을 용액에서 준비하였다. 이로써 수득된 단량체 아미노산 내 자유 NH₂기를 Fmoc 보호기로 보호한 후, SPPS 프로토콜을 사용하여 화합물을 연장하는 펩티드(식 VI) 내에 통합할 수 있다.

최종 부류의 수정 펩티드는 하나 이상의 환원된 아미드 결합(식 V에서 R_n ³=H₂)을 함유하는 펩티드를 포함한다. 이들 유도체는 수정된 SPPS 프로토콜에 의해 접근가능하며(J.J. Wen, A.R. Spatola, J. Pept. Res., 49:3-14, 1997), 여기서 성장하는 사슬(식 VI에서 1<m<12)의 자유 N-말단 아미노산은 환원 조건(NaBH₃CN, DMF/HOAc, 99/1, v/v) 하에 새로 온 아미노산 알데히드로 알킬화한다. 필요한 N-Fmoc 보호된 아미노산 알데히드는 상업적으로 입수가능하거나 문헌 방법(J.J. Wen, C.M. Crews, Tetrahedron: Asymmetry 9:1855-1858, 1998)에 의해 접근할 수 있다. 이로서 연장된 사슬(A-B=Fmoc, R_n ¹=H, R_n ²=아미노산 측쇄, R_n ³=H₂)은 이어서 Boc기로 보호되는 제2 아미노 기능( R_n+1 ¹=H)을 함유한다. Fmoc 보호기를 제거한 후, 펩티드 사슬은 SPPS 프로토콜을 사용하여 더 연장될 수 있다.

[식 VII]

대안으로, 일반식 VII를 갖는 이량체 구조는 SPPS 이전에 용액에서 합성될 수 있다. 따라서, 적절한 아미노산 벤질 에스테르 (H₂N-CH(R_n+1 ²)-CO₂Bzl)는 환원에 의해 Fmoc 보호된 아미노산 알데히드 (Fmoc-NH-CH(R_n ²)-C(O)H) 로 알킬화되어 이량체 2차 아민을 생성한다. Boc기(R_n+1 ¹=Boc)로 아미노 기능을 보호하고 이어서 벤질 에스테르를 가수분해한 후 식 VII의 화합물이 형성되며, 이 화합물은 SPPS 공정을 사용하여 성장하는 사슬안으로 통합될 수 있다.

본 발명에 따른 펩티드는 치료 물질로서 사용할 수 있다. 더욱 구체적으로는, 자가면역 질환 장애, 더욱 구체적으로는 관절염에 걸린 환자에서 자가항원에 대한 특이 T-세포 관용을 유도하는데 이들을 사용할 수 있다.

강화된 시험관내 자극성 활성 및 강화된 생체내 활성을 갖는 MHC 클래스 II 제한된 T-세포 에피토프 구조에 기초하여 수정된 펩티드는 공지 기법을 사용하여 선택할 수 있다.

주어진 T-세포 에피토프의 작용성 특성을 유지하기 위하여, 관련 MHC 분자와의 결합에 관여하는 잔기를 너무 많이 방해하지 않고 또한 관련 T-세포의 TCR 관계에 관여하는 잔기에 너무 많이 영향을 미치지 않는 것이 중요하다고 여겨진다. 따라서, 작용성 수정 펩티드의 선택에는 하기 1) 내지 3)을 포함한다.

1) 관련 MHC 분자를 결합하는 것에 대한 수정 펩티드의 친화도의 정의 및 야생형 미수정 펩티드 에피토프의 친화도와 비교.

2) 수정 펩티드의 자극 활성의 정의 및 시험관내 분석(방사선 조사되고 펩티드 항원 및 특이 T-세포와 함께 항온처리된 항원 제시 세포)을 이용한 야생형 미수정 펩티드의 활성과의 비교. 바람직하게, 상이한 TCR 클론형을 가지나 동일 MHC 클래스 II 분자와 관련하여 동일 에피토프와 반응성이 있는, 광범위한 패널의 에피토프-특이 MHC 클래스 II 제한된 T-세포를 평가하여야 한다. 이 목적을 위해, 특이 T-세포 하이브리도마 또는 특이 T-세포 라인/클론의 패널을 사용할 수 있다. 인간용 수정 에피토프를 선택하는 것은 인간 T-세포 인식을 위해 선별되고 수정된 에피토프들의 관련성을 보증하기 위해 인간 T-세포 라인/클론들을 사용하는 것이 필요하다.

3) 수정 펩티드의 생체내 활성의 정의(임의적). 이 목적을 위해 하기와 같은 상이한 실험 기구들이 사용될 수 있다.

a) 지연 유형의 과민성 시험

b) 생체내 (면역보강제와 함께 또는 면역보강제 없이) 항원 투여한 후 생체외 T-세포 활성화 분석

c) 수정 펩티드 항원의 투여에 의해 자가면역 질환의 실험적 모델에서의 질환 조절.

야생형 펩티드와 비교하여 시험관내 강화된 작용성 활성 또는 강화된 생체내 효과를 갖는 바람직한 화합물을 선별하는 것이 바람직하다.

마우스에서 인식되는 개별적인 HC gp-39 유래 펩티드는 비측 처리 이후 이들 펩티드에 대한 반응성을 하향 조절하는 것으로 예상된다. 이러한 반응성은 당해 펩티드로 동물을 접종하고 DTH 반응의 결과 발 종창(swelling)을 정량화함으로써 측정될 수 있다. Balb/c 마우스에서 펩티드 면역화한 결과 HC gp-39 펩티드 263-275에 대한 면역학적 반응을 나타낸다. 따라서, HC gp-39로 면역된 마우스는 DTH 반응을 검출하기 위해 HC gp-39 263-275로 접종될 수 있다. 수정 펩티드의 생체내 관용원성을 묘사하기 위해, 마우스의 코구멍 마다 각종 농도의 HC gp-39 263-275 또는 펩티드 유도체들로 처리할 수 있다. 관용 유도의 면에서 우수한 프로필을 갖는 수정 펩티드 유도체는 원래 펩티드보다 더 낮은 농도에서 상기 생체내 분석에서 활성이 있는 것으로 예상된다. 천연 펩티드 대 수정 펩티드 유도체로 관용 유도의 효과를 정량적으로 검측할 수 있기 위해서, 각종 적용 계획 및 투여량으로 시험할 수 있다. 마지막으로, HC gp-39 263-275의 수정된 형태가 천연 263-275 펩티드보다 이 모델에서 HC gp-39 263-275 유도성 DTH 반응을 하향조절하는데 더욱 효과적인지를 조사할 수 있다.

관용은 본 발명에 따른 펩티드 또는 관용원을 고투여량 또는 저투여량으로 투여함으로써 달성될 수 있다. 관용원 또는 펩티드의 양은 투여 경로, 투여 시간, 환자 연령, 일반적인 건강 상태 및 규정식에 따라 다를 것이다.

일반적으로 펩티드 또는 단백질을 신체 중량 1kg 당 0.01 내지 1000㎍, 바람직하게는 0.05 내지 500㎍, 더욱 바람직하게는 0.1 내지 100㎍의 투여량으로 사용할 수 있다.

본 발명의 다른 일면은 본 발명에 따른 하나 이상의 펩티드 및 약학적 허용 담체를 함유하는 약학 조성물이다.

약학적 허용 담체는 당업자에게 잘 알려져 있으며, 예를들면, 무균 염수, 락토즈, 수크로즈, 인산칼슘, 젤라틴, 덱스트린, 아가, 펙틴, 땅콩유, 올리브유, 참깨유 및 물을 포함한다. 기타 담체는 원하는 경우 예를들면 리포좀 내 박힌 MHC 클래스 II일 수 있다.

게다가, 본 발명에 따른 약학 조성물은 1종 이상의 면역보강제를 포함할 수 있다. 적절한 면역보강제는 다른 것들 중 수산화알루미늄, 인산알루미늄, 암피겐, 토코페놀, 모노포스페닐 지질 A, 뮤라밀 디펩티드 및 사포닐(예, Quill A)을 포함한다. 면역보강제의 양은 면역보강제 그 자체의 성질에 따라 다르다.

나아가, 본 발명에 따른 약학 조성물은 1종 이상의 안정화제, 예컨대 탄수화물(예, 소르비톨, 만니톨, 전분, 수크로세덱스트린 및 글루코즈), 단백질(예, 알부민 또는 카제인) 및 알칼리성 인산염과 같은 완충액을 포함한다.

적절한 투여 경로는 근육내 주사, 피하주사, 정맥주사 또는 복강내주사, 구강 및 비강내 투여이다. 구강 및 비강내 투여는 바람직한 투여 경로이다. 특히, 항원에 특이적인 조절 세포는 점막(예, 비측 점막)을 통해 항원을 가함으로써 생성될 수 있다. 항원의 점막 투여는 상기 항원에 대한 면역학적 관용을 유도하는 것으로 나타났다.

본 발명에 따른 펩티드는 또한 관절 연골의 만성 염증에 관여하는 활성화된 자가반응성 T 세포의 존재를 검출하는 진단 방법에 사용하기 매우 적절하다.

본 발명에 따른 진단 방법은 하기 단계를 포함한다:

a) 개체의 혈액 시료로부터 말초 혈액 단핵세포(PBMC)를 분리하는 단계,

b) 적절한 조건하에 상기 PBMC를 배양하는 단계,

c) 자가 항원 또는 본 발명에 따라 이로부터 유도된 1종 이상의 펩티드의 존재하에 상기 PBMC를 항온배양하는 단계 ;및

d) T 세포의 반응, 예컨대 증식성 반응을 검출하여 개체 내 활성화된 자가반응성 T 세포의 존재를 표시하는 단계.

자가반응성 T 세포의 증식성 반응을 측정함으로써 반응을 검출하는 경우, 예컨대 3H-티미딘과 같은 방사선동위원소의 혼입이 증식의 척도이다. PBMC에 존재하는 자가반응성 T 세포의 반응은 또한 시토킨-특이 ELISA로 시토킨 방출, 또는⁵¹크롬 방출에 의한 세포독성을 측정함으로써 검출할 수 있다. 다른 검출 방법은 FACS 분석에 의해 활성화 마커(예, Il-2R)의 발현을 측정하는 것이다. 따라서, 본 발명에 따라 1종 이상의 펩티드 및 적절한 검출제를 포함하는 진단 조성물은 본 발명의 일부를 형성한다. 검출 유형에 따라, 검출제는 방사선동위원소, 효소 또는 세포 표면 또는 활성화 마커에 특이적인 항체일 수 있다.

또한, 본 발명의 범주에는 본 발명에 따른 1종 이상의 펩티드를 포함하는 시험 키트가 속한다. 이들 시험 키트는 본 발명에 따른 진단 방법에 사용하기 적절하다.

따라서, 본 발명에 따라, HC gp-39 유래의 수정 펩티드를 사용하여 자가면역 질환을 하향조절할 수 있다.

하기 실시예는 본 발명을 설명하고자 하는 것이나 결코 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 않된다.

실시예 1: H-Arg-Ser-Phe(4Cl)-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-OH(1)

N-메틸-피롤리디논(NMP)에서 미리 팽창시킨 0.5g의 Fmoc-Gly-PAC-PEG-PC(PerSeptive Biosystems에서 시판함. 0.20mmol/g) 수지를 밀리포어 9050 펩신테사이저의 반응 용기에 넣었다. 피페리딘/DMF(1:4 v/v)를 사용하여 각 커플링 사이클에서 Fmoc 기를 제거하였다. 커플링 효율은 각 신장 단계 이후 Fmoc-절단을 분광기 분석함으로써 측정하였다. 각 커플링 단계에서 적절한 산-불안정성 측쇄-보호된 Fmoc 아미노산 4당량을 사용하였다. 하나의 주입기가 DMF p.a 중 0.5M HATU를 함유하고 다른 주입기가 DMF p.a. 중 1.0M DIPEA를 함유하는 이중 주입기 방식의 합성기를 사용하였다. 주 세제(wash)는 0.1% HOBt와 함께 N-메틸-피롤리디논을 함유하였다. 유사체 합성 프로토콜을 사용하였다. 최종 Fmoc기를 제거한 후, 고정된 펩티드를 갖는 수지를 반응 용기로부터 채취하고, DMF(20mL), CH₂Cl₂(20mL), 디에틸에테르(20mL), CH₂Cl₂(20mL), 디에틸에테르(20mL), CH₂Cl₂(20mL) 및 디에틸에테르(20mL) 로 연속 세척하였다. 고정된 펩티드를 진공에서 밤새 건조시켰다. 이어서 펩티드를 3시간 동안 TFA/(iPr)₃SiH/아니솔/H₂O 88/5/5/2 v/v/v/v 혼합물 10mL로 절단하였다. 이 단계에서, 모든 산불안정성 측쇄 보호기도 제거되었다. 용매를 증발시킨 후, 펩티드를 디에틸 에테르 200mL로 침전시켰다. 에테르 층을 따르고, 펩티드를 에테르 추가량(2x200mL)으로 세척하였다. 이어서, 미정제 펩티드를 질소 흐름으로 건조시키고, 동결건조시켰다. PrepPak 카트리지 40-100 mm Delta-Pak^TMC18 15㎛ 100A 역상 컬럼 상에서 HPLC 크로마토그래피로 펩티드를 정제하였다. 하기 분석에 나타난 바와 같이, 이동상은 20% 인산 완충액 pH 2.1 혼합물 및 아세토니트릴과 물의 구배로 구성되었다. 4⁰/₀₀수성 아세트산을 사용하여 펩티드를 HPLC상에서 탈염시켰다. 정제 생산물을 동결건조하였다.

이동상:A; 0.5몰/L NaH₂PO₄+ H₃PO₄, pH=2.1

B: H₂O

C: CH₃CN/H₂O = 3/2(v/v)

구배:A: 20%; B: 80% -> 20%; C: 0% -> 60% (40분 내)

수율: 68mg; HPLC 순도: 90.1%; MS: MW = 1346, 이는 분자식 C₅₅H₈₉ClN₁₆O₂₁와 일치함; 아미노산 분석: 모든 아미노산은 필요한 양으로 확인되었음; 펩티드 함량: 74.8%; 이온 크로마토크래피: 인산염: 0.6%, 아세테이트: 0.6%, 염소: 3.4%(w/w).

실시예 2: H ₂ N-(CH ₂ ) ₅ -C(O)-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-OH(2)

화합물 1(상기 참조)의 합성법에서 기재된 바와 같이, 고체상 펩티드 화학공정을 사용하여 펩티드를 합성하였다. 이 경우, 시판되는 Fmoc-아미노산 펜타플루오로페닐(Pfp) 활성 에테르를 자유 Fmoc-아미노산과 HATU/DIPEA 대신 사용하였다. 문헌 공정(A. Marston, E. Hecker, Z. Naturforsch. B Anorg. Chem. Org. Chem., 38:1015-1021, 1983)과 유사하게, 6-아미노-헥사노산으로부터 수득한, 6-Fmoc-아미노-헥사노산을 N-말단 아미노산으로서 사용하여 표제 화합물을 제작하였다. 지지체는 Fmoc-Gly-PAC-PEG-PC(0.75 g, 0.170 mmol/g) 및 3 당량이었다. 적절한 Pfp 에스테르를 사용하였다. 6-Fmoc-아미노-헥사노산의 커플링 경우 PyBOP가 커플링제(199mg)로 첨가되었다. 168mg의 미정제 생산물에 대하여 표준 공정(실시예 1)에 기재된 정밀검사를 하였다. 미정제 생산물은 HPLC(CH₃CN-H₂O 구배를 갖는 인산계 pH=2.1)로 정제하였다. 생산물은 5⁰/₀₀수성 아세트산을 사용하여 HPLC상에서 탈염하였고 동결건조 하여 원하는 펩티드 34mg을 얻었다.

HPLC 순도: 99.6%; MS: MW = 1268, 이는 분자식 C₅₅H₈₉N₁₃O₂₁와 일치함; 아미노산 분석: 모든 아미노산은 필요한 양으로 확인되었음; 펩티드 함량: 67.3%; 이온 크로마토크래피: 인산염: 10%(w/w).

실시예 3: H ₂ N-(CH ₂ ) ₆ -C(O)-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-OH(3)

N-말단 아미노산으로서 7-Fmoc-아미노-헵타노산(3a, 화합물 2a와 유사하게 제조됨: A. Marston, E. Hecker, Z. Naturforsch. B Anorg. Chem. Org. Chem., 38:1015-1021, 1983)을 사용하여 N-말단 동족체 2와 동일 방식으로 펩티드 3을 제조하였다. 지지체는 Fmoc-Gly-PAC-PEG-PC(1.0 g, 0.17 mmol/g)이었다. 표준 공정(실시예 1)에 기재된 바와 같이, 정밀검사, HPLC 정제 및 탈염하여 원하는 펩티드 45mg을 얻었다.

HPLC 순도: 95.0%; MS: MW = 1282, 이는 분자식 C₅₆H₉₁N₁₃O₂₁와 일치함; 아미노산 분석: 모든 아미노산은 필요한 양으로 확인되었음; 펩티드 함량: 87.4%; 이온 크로마토크래피: 아세트산염: 0.2%(w/w).

실시예 4: (N-메틸-니코티노일) ⁺ -Arg-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-OH(4)

펩티드 4 제작 이전에, 문헌 공정(M.L. Tedjamulia, P.C. Srivastava, F.F. Knapp; J. Med. Chem. 28:1574-1580, 1985)에 따라 출발물질 N-숙신이미딜(1-메틸-3-피리디니오)포르메이트 요오드화물(4a)을 합성하였다. 화합물 4의 합성은 용액 안에서 수행하였다. 실시예 1에 따른 SPPS 방법에 의해 제조된 펩티드 H-Arg-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-OH(4b, 26mg, 0.02mmol)를 DMF/H₂O(1/99 v/v, 10mL)에 용해시키고, DIPEA/DMF(1/1, v/v)를 첨가하여 pH=9를 얻었다. 이어서, N-숙신이미딜(1-메틸-3-피리디니오)포르메이트 요오드화물(4a, 0.056g. 0.15mmol)을 2 부분으로 첨가하였다. DIPEA/DMF(1/1, v/v)를 몇 방울 첨가함으로써 pH를 pH=9로 유지시켰다. 혼합물을 실온에서 4시간동안 교반하고 나서 10mL의 H₂O와 5mL의 인산염 완충액 pH=2.1으로 희석하였다. 이전에 보여준 바와 같이(실시예 1), 인산염 완충액계를 사용하여 즉시 HPLC로 생성물을 정제하였다. 5⁰/₀₀수성 아세트산으로 탈염하고 동결건조하여 원하는 펩티드 4, 14mg을 얻었다.

HPLC 순도: 98.1%; MS: MW = 1430; 아미노산 분석: 모든 아미노산은 필요한 양으로 확인되었음; 펩티드 함량: 56.3%; 이온 크로마토크래피: 염소: 1.4%, 인산염: 1.0%, 트리플루오로아세테이트: 0.8%, 아세트산염: 0.3%(w/w).

실시예 5: 데스아미노아르기닐-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-OH(5)

Fmoc-보호된 아미노산, HATU, DIPEA 및 1.0g의 Fmoc-Gly-PAC-PEG-PS 수지를 사용하여 화합물 1에 대해 전술한 공정에 따라 펩티드 5를 제조하였다. 지지체 로딩은 0.17 mmol/g이었다. 최종 단계에서 데스아미노-Arg(Adoc)₂-OH(5a)는 고정된 펩티드 사슬과 커플링되었다. 공지 공정(R. Presentini, G. Antoni, Int. J. Pept. Protein Res., 27:123-126, 1986)에 따라 카르복실산 5a를 제조하였다. 정밀검사 및 정제 조건은 펩티드 1의 경우와 동일하였다.

수율: 58mg; HPLC 순도: 91.1%; MS: MW = 1296; 아미노산 분석: 모든 아미노산은 필요한 양으로 확인되었음; 펩티드 함량: 76.2%; 이온 크로마토크래피: 인산염: 0.4%, 트리플루오로아세테이트: 0.6%, 아세테이트: 0.2%(w/w).

실시예 6: 데스아미노아르기닐-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-NH ₂ (6)

고형 지지체로서 PAC-PEG-PS 대신 PAL-PEG-PS 수지(0.17mmol/g)를 사용하여 전술한 펩티드 5의 경우와 유사한 방식으로 펩티드 6을 조립하였다. 이 경우, 시판되는 (PerSeptive Biosystems) Fmoc-PAL-PEG-PS 수지로부터 Fmoc기를 제거하고 형성된 H-PAL-PEG-PS 지지체를 HATU/DIPEA 매개 하에 Fmoc-Gly-OH와 축합시켰다. 펩티드 사슬을 신장시키고 실시예 1에 기술한 동일 조건하에 수지로부터 후속 절단시킨 이후, 원하는 카르복사미드 C-말단을 수득하였다. 정밀검사 및 정제 조건은 펩티드 1의 경우와 동일하였다.

수율: 43mg; HPLC 순도: 91.3%; MS: MW = 1295; 아미노산 분석: 모든 아미노산은 필요한 양으로 확인되었음; 펩티드 함량: 76.5%; 이온 크로마토크래피: 염소: 0.5%, 아세트산염: 4.0%(w/w).

실시예 7: CH ₃ (OCH ₂ CH ₂ ) ₃ -OCH ₂ -C(O)-Arg-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-NH ₂ (7)

펩티드 7의 합성의 경우, 문헌 공정(A.H. Haines, P. Karntiang, Carbohydr. Res., 78:205-211, 1980)에 따라 먼저 출발물질 CH₃(OCH₂CH₂)₃-OCH₂-CO₂H(7a)를 합성하였다. 아미노산 Pfp 에스테르를 사용하여 실시예 2에 나타낸 바와 같이, 보호되고 고정된 펩티드 H-Arg(Pmc)-Ser(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Leu-Ala-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Glu(OtBu)-Thr(tBu)-Gly-Val-Gly-PAL-PEG-PS(7b)를 합성하였다. 수지 상의 펩티드(7b)는 NMP에서 미리 팽창시키고, 169mg(0.64 mmol)의 커플링제 TFFH(테트라메틸플루오로-포름아미디늄 헥사플루오로포스페이트)와 함께 142 mg(0.64mmol)의 CH₃(OCH₂CH₂)₃-OCH₂-CO₂H(7a)을 첨가하였다. 배합된 반응물을 de Pepsythesizer에서 60분 동안 순환시켰다. 실시에 5에 기재된 바와 같이, 수지로부터 절단 및 정말 검사하였다. 이어서 미정제 펩티드를 실시예 1에 개설된 용매 및 시스템으로 HPLC함으로써 정제하였다. 2.5⁰/₀₀AcOH를 사용하여 HPLC 컬럼상에서 생성물을 탈염하였다.

수율: 120mg; HPLC 순도: 78%; MS: MW = 1515; 이온 크로마토크래피: 염소: 0.1%, 인산염: 0.3%, 트리플루오로아세테이트: 4.0%, 인산염: 0.3%(w/w).

실시예 8: D-1-글루시틸-Arg-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-OH(8)

N-말단이 수정된 펩티드 8의 조립 이전에, 실시예 1에 따라, 링커 타입이 다른 것(PAL 대신 PAC)을 제외하고는 펩티드 7b와 동일한 서열을 갖는 펩티드 H-Arg(Pmc)-Ser(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Leu-Ala-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Glu(OtBu)-Thr(tBu)-Gly-Val-Gly-PAL-PEG-PS(8a)를 합성하였다. 환원제로서 NaBH(Oac)₃(212mg, 1.0 mmol)을 사용하고 DMF/HOAc 중 고정화된 펩티드 8a(500mg, 0.2 mmol/g) (99/1, v/v, 10mL)로 6-O-트리틸-α/β-D-글루코피라노즈(8b, 422mg, 1.0 mmol, T. Utamura, K. Kuromatsu, K. Suwa, K. Koizumi, T. Shingu, Tetsuro; Chem. Pharm. Bull. 34:2341-2353, 1986)를 밤새 처리함으로써 환원성 아민화를 수행하였다. 이어서, 그결과 형성된 완전히 보호된 유도체 (6-O-트리틸-D-1-글루시틸)-Arg(Pmc)-Ser(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Leu-Ala-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Glu(OtBu)-Thr(tBu)-Gly-Val-Gly-PAL-PEG-PS를 실시예 1에 기재한 조건을 사용하여 수지로부터 절단하면서 동시에 트리틸기 및 아미노산-보호기를 제거하고, 예비 HPLC로 정제하고 5⁰/₀₀수성 HOAc로 탈염한 이후, 38mg의 표적 펩티드 8가 제공되었다.

HPLC 순도: 84.7%; MS: MW = 1475; 아미노산 분석: 모든 아미노산은 필요한 양으로 확인되었음; 펩티드 함량: 61.0%; 이온 크로마토크래피: 염소: 0.1%, 아세트산염: 1.7%(w/w).

실시예 9: MeO-C(O)-Arg-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-OH(9)

디옥산 중 고정된 펩티드 H-Arg(Pmc)-Ser(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Leu-Ala-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Glu(OtBu)-Thr(tBu)-Gly-Val-Gly-PAL-PEG-PS(8a)를 현탁시키고 0℃로 냉각시킴으로써 펩티드 9의 합성을 시작하였다. 이 현탁액에 4N aq NaOH 100㎕과 메틸 클로로포르메이트 100㎕를 첨가하였다. 반응 혼합물을 16시간동안 진탕시키고, 이어서 수지를 EtOH/H₂O, EtOH, CH₂Cl₂및 에테르로 세척하였다. 진공하에 건조시킨 후, 생성물을 수지로부터 절단 제거하고 이전 펩티드 합성법(실시예 1)에 기술한 바와 같이 정제하였다. 최종적으로, 펩티드는 5⁰/₀₀수성 아세트산으로 HPLC 상에서 탈염한 후 동결건조하여, 펩티드 9를 수득하였다.

수율: 11mg; HPLC 순도: 96.8%; MS: MW = 1368; 아미노산 분석: 모든 아미노산은 필요한 양으로 확인되었음; 펩티드 함량: 60.5%; 이온 크로마토크래피: 염소: 2.0%, 인산염: 0.2%, 아세트산염 0.4%(w/w).

실시예 10: Ac-Arg-Ser-Phe-Thr-Leu-ψ[CH ₂ NH]-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-NH ₂ (10)

펩티드 10의 합성 이전에, 공지 공정(J.-P. Meyer, P. Davis, K.B. Lee, F. Porreca, H.I. Yamamura, V. Hruby, J. Med. Chem. 38:3462-3468, 1995)에 따라, 원하는 아미노산 알데히드 기본단위(building block) Fmoc-Leu-H(10a)를 제조하였다. 화합물 10a는 추가 정제없이 사용하였다. 실시예 1이 기술된 방법에 따라, 수지를 8-아미노산 펩티드 사슬로 기능화시켜 H-Ala-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Glu(OtBu)-Thr(tBu)-Gly-Val-Gly-PAL-PEG-PS(10b)를 수득하였다. 후자인 고정된 유도체(1g,0.2mmol/g)을 DMF 중 1% 아세트산 5mL에 현탁시켰다. 2.5mL의 DMF 중 Fmoc-Leu-H(10a) 148mg과 2.5ml의 DMF 중 NaCNBH₃30mg인 2개 용액을 제조하였다. 두 용액을 모두 배합하고 펩티드 10b의 현탁액에 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 밤새 진탕하였다. 이어서, 수득한 중간체 Fmoc-Leu-ψ[CH₂NH]-Ala-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Glu(OtBu)-Thr(tBu)-Gly-Val-Gly-PAL-PEG-PS(10c)를 새롭게 도입된 2급 아민 작용기에서 Boc₂O와 피리딘으로 보호하였다. 수지-결합된 펩티드 10c를 10mL의 무수 CH₂Cl₂에 현탁시키고, 35mg(0.16 mmol)의 Boc₂O 및 13㎕(0.16 mmol)의 피리딘을 첨가하였다. 피리딘으로 pH를 pH = 8로 유지시키고 혼합물을 밤새 진탕하였다. 정밀검사를 위해 CH₂Cl₂, EtOH, CH₂Cl₂, 에테르로 수지를 세척하고 진공에서 건조시켰다. Fmoc 아미노산을 사용한 SPPS 및 용매로서 NMP를 사용한 HATU/DIPEA 프로토콜(실시예 1)에 의해 합성을 계속하였다. 최종 단계로 4-니트로페닐 아세테이트와 커플링하여 N-말단 아세틸 기를 도입하였다. 실시예 1에 기술한 정밀검사 이후, 미정제 펩티드를 HPLC로 정제하고, 5⁰/₀₀아세트산으로 탈염하고, 동결건조하여 표적 펩티드 10을 수득하였다.

수율: 28mg; HPLC 순도: 76.3%; MS: MW = 1339; 이온 크로마토크래피: 트리플루오로아세테이트: 1.2%, 아세트산염: 2.0%(w/w).

실시예 11: Ac-Arg-Ser-Phe-ψ[CH ₂ NH]-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-NH ₂ (11)

펩티드 11을 합성하기 위해, 실시예 1에 기재된 SPPS 프로토콜로 수득한 수지-결합 보호 펩티드 H-Thr(tBu)-Leu-Ala-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Glu(OtBu)-Thr(tBu)-Gly-Val-Gly-PAL-PEG-PS(11b)에 Fmoc-Phe-H(11a, J.-P. Meyer, P. Davis, K.B. Lee, F. Porreca, H.I. Yamamura, V. Hruby, J. Med. Chem. 38:3462-3468, 1995)를 환원적으로 커플링시켰다. 펩티드 11b(1.0g, 0.2mmol/g) 및 알데히드 11a(200mg)를 1% 아세트산/DMF 5mL에 현탁시키고, 즉시 DMF 5mL에 용해된 NaCNBH₃30mg(0.48 mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 16시간동안 교반한 결과 Fmoc-Phe-ψ[CH₂NH]-Thr(tBu)-Leu-Ala-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Glu(OtBu)-Thr(tBu)-Gly-Val-Gly-PAL-PEG-PS를 수득하였다. 이어서 펩티드 사슬은 실시예 8에 기재한 HATU/DIPEA SPPS 프로토콜을 사용하여 적절한 Fmoc-아미노산 및 N-말단 아세틸화제로 신장시켰다. 정밀검사, HPLC-정제 및 탈염을 실시예 1에 기재된 바와 같이 수행하였다.

수율: 52mg; HPLC 순도: 97.9%; MS: MW = 1338; 아미노산 분석: 모든 아미노산은 필요한 양으로 확인되었음; 펩티드 함량: 92.4%; 이온 크로마토크래피: 아세트산염: 2.5%(w/w).

실시예 12: Ac-Arg-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-ψ[CH ₂ NH]-Gly-NH ₂ (12)

상기 화합물을 합성하기 위해, 수지상에서 Fmoc-Val-H로 환원성 알킬화를 수행하는 것은 불가능하였다. 따라서, 디펩티드 유사체 Fmoc-Val-ψ[CH₂NH]-Gly-OH(12d)를 수지에 고정시키기 이전에 용액에서 제조하였다.

Fmoc-Val-ψ[CH ₂ NH]-Gly-Obzl(12c)

Fmoc-Val-H(12a, 3.16g, 10 mmol, T. Moriwake, S.-I. Hamano. S. Saito, S. Torii, S. Kashino, J. Org. Chem., 54:4114-4120, 1989)를 EtOH/HOAc(80mL, 99/1, v/v)에 용해시키고 HCl.H-Gly-Obzl(12b, 2.02g, 10mmol), 이어서 NaCNBH₃(0.94g, 15mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 이어서, 5% aq. NaHCO₃(20mL)을 첨가하여 반응 혼합물을 중화하였다. 이어서, 혼합물을 진공하에 농축시키고, 잔류물을 CH₂Cl₂로 추출하였다. 배합된 유기층을 satd. Aq. NaCl로 세척하고, 재빨리 Na₂SO₄상에서 건조시키고, 여과시키고, 용매를 증발시켜 황색 오일을 얻었다. 실리카겔 크로마토그래피(용리액: CH₂Cl₂중 0-4% 메탄올)로 정제한 후, 화합물 12c를 백색 고형물로 분리하였다. 수율: 1.85g(39%).

분석: TLC:(실리카, CH₂Cl₂/MeOH 98/2) Rf=0.45, MS: MW = 472.

Fmoc-Val-ψ[CH ₂ N(Boc)]-Gly-Obzl(12d)

Fmoc-Val-ψ[CH₂NH]-Gly-Obzl(12c, 0.910g, 1.93 mmol), Boc₂O(0.420g, 1.93mmol) 및 DIPEA(0.336g, 1.93mmol)를 무수 CH₂Cl₂(20mL)에 용해시켰다. DIPEA를 첨가함으로써 pH를 염기성으로 유지시키고, 혼합물을 실온에서 발새 교반하였다..이어서, 10% KHSO₄를 첨가함으로써 반응 혼합물을 산성화시켰다. 물을 첨가하고, 수성층을 CH₂Cl₂로 추출하였다. 배합된 유기층을 aq. Satd. NaCl로 세척하고, 재빨리 MgSO₄상에서 건조시키고, 용매를 증발시켜 0.96g(97%)의 12d를 수득하였다. 분석: TLC:(실리카, CH₂Cl₂/MeOH 98/2) Rf=0.55, MS: MW = 572.

Fmoc-Val-ψ[CH ₂ N(Boc)]-Gly-OH(12e)

Fmoc-Val-ψ[CH₂N(Boc)]-Gly-Obzl(12d, 0.97g, 1.70 mmol)를 MeOH/EtOAc(1/1, v/v, 100mL)의 혼합물에 용해시키고 상압에서 10% Pd/C로 2시간동안 수소화하였다. 팔라듐 촉매를 여과제거하고, 여과물을 농축하여 담황색 오일의 카르복실산 12e를 제공하였다. 수율: 0.661g(81%). 분석: TLC:(실리카, CH₂Cl₂/MeOH/AcOH 90/9/1) Rf=0.42, MS: MW = 482.

HATU/DIPEA 이중 주입기 모드 및 HATU/DIPEA와의 이중 커플링을 갖는 펩티드 합성기를 사용하여, 화합물 Fmoc-Val-ψ[CH₂N(Boc)]-Gly-OH(12e)(0.661, 1.37mmol)를 PAL-PEG-PS 수지(1.5g, 0.15mmol/g, 0.225 mmol) 상에서 로딩시켰다. 치환 수준은 표준 Fmoc 절단 공정으로 측정하고, 로딩된 수지가 0.13mmol/g(수율: 87%)이었다. 그 결과 형성된 펩티드 H-Val-ψ[CH₂N(Boc)]-Gly-PAL-PEG-PS(12f)를, 각 Fmoc-아미노산 당 60분간의 이중 축합 단계와 함께 HATU/DIPEA SPPS 프로토콜(실시예 1)을 사용하여 추가 연장하였다. 4-니트로페닐 아세테이트를 사용하여 펩티드 9 및11과 유사한 N-말단 아세틸기를 도입하였다. 실시예 1과 같이 정밀검사, 정제 및 탈염을 수행하였다.

수율: 17mg; HPLC 순도: 80.1%; MS: MW = 1338; 아미노산 분석: 모든 아미노산은 필요한 양으로 확인되었음; 펩티드 함량: 63.7%; 이온 크로마토크래피: 염소: 1.0%, 인산염: 0.2%, 아세트산염: 0.2%(w/w).

실시예 13: Ac-Arg-NhSer-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-NH ₂ (13)

펩티드 13을 합성하기 위해, 필수 펩티드성 단량체인 Fmoc-NhSer(tBu)-OH(13e)를 먼저 제조하였다.

Z-2-아미노에틸-tert-부틸 에테르(13a)

3.25g MgSO₄(27 mmol)를 CH₂Cl₂(무수) 80mL에 현탁시켰다. N₂하에, 진한 H₂SO₄1.5mL를 첨가하였다(공정: S.W. Wright D.L. Hageman, A.S. Wright, L. McClure, Tetrahedron Lett., 38:7345-7348, 1997). 혼합물을 15분동안 교반하고 이후 tert-BuOH(12.9mL) 및 CH₂Cl₂(20mL)에 용해된 시판용 Z-2-아미노에탄올(5.28g, 27mmol)을 첨가하였다. 5일간 교반한 후, 5% aq. NaHCO₃200mL을 반응 혼합물에 첨가하고, 모든 MgSO₄가 용해될 때까지 교반하였다. 층을 분리시키고, CH₂Cl₂층을 브라인으로 세척하였다. 유기층을 MgSO₄상에서 건조시키고 여과시키고 용매를 증발시켜 미정제 13a, 5.6g를 수득하였다. 생성물을 컬럼 크로마토그래피(용리액:헵탄/EtOAc 3:1 v/v)로 정제하였다. 수율 5.00g(78%).¹H NMR(CDCl₃) δ: 1.15(s, 9H, tBu), 3.3-3.5(dt, 4H, 2xCH₂), 5.1(bs, 2H, CH₂Bzl), 7.4(m, 5H, Ar)

2-아미노에틸-tert-부틸 에테르.HCl(13b)

에틸 아세테이트(150mL) 중 벤질 에테르 13a, 5.00g 용액에 10% Pd/C 225mg을 첨가하고, 2시간동안 완전히 H₂거품이 일게하였다. 촉매를 여과제거하여 1M aq. HCl 15mL을 첨가하였다. 용매를 증발시키고, 소부피의 에테르를 첨가하였다. 침전된 생성물 13b를 여과제거하고 진공에서 건조시켰다. 수율 2.35g(77%). NMR(CDCl₃) δ: 1.20(s, 9H, tBu), 3.15(t, 2H, CH₂), 3.65(t, 2H, CH₂), 8.1-8.4(bs, 2H, NH₂)

N-(2-tert-부톡시에틸)-글리신(H-NhSer(tBu)-OH)(13c)

H₂O 25mL 중 13b(2.30g, 15mmol) 용액에 글리옥실산.H₂O 1.40g(15.2mmol)을 첨가하였다. 1.0M aq NaOH로 pH를 pH=6으로 조정하였다. 이 용액에, Pd/C 230mg을 첨가하고 이어서 반응 혼합물을 45psi H₂압력에서 밤새 진탕시켰다. 촉매를 여과제거하고 H₂O 5mL로 세척하였다. 추가 정제 없이 다음 단계에 13c를 함유하는 여과물을 사용하였다.

Fmoc-NhSer(tBu)-OH(13d)

여전히 H₂O에 용해되어 있는 반응 생성물 13c를 1N NaOH로 pH=9.5로 조정하였다. 염기성 용액을 아세톤 25mL로 희석시키고, 아세톤 25mL에 용해된 Fmoc-Osu5.40g(16mmol)를 적가하였다. 1N NaOH로 pH를 pH=9.5로 유지시켰다. 밤새 교반한 후, 반응 혼합물을 150mL로 농축시키고 에테르/헵탄(1/1, v/v) 2x50mL로 세척하였다. 20% 시트르산으로 H₂O층을 pH=2.5로 산성화시키고, 에틸 아세테이트 100mL로 3회 추출하였다. 유기층을 배합하고, Na₂SO₄상에서 건조시켰다. 용매를 증발시키고, 생성물을 컬럼 크로마토그래피(실리카, CH₂Cl₂/MeOH 5/1, v/v)로 정제하고 동결건조시켰다. 수율 5.44g(91%).¹H NMR(CDCl₃) δ: 1.20(s, 9H, tBu), 3.2(dt, 2H, CH₂), 3.6-3.7(dt, 2H, CH₂), 4.05(s, 2H, CH₂CO₂H), 4.2(b, 1H Fmoc), 4.4-4.6(2H, 2 x d, Fmoc), 7.3-7.8(m, 8H, ArH, Fmoc).

전술한(실시예 1) 이중 주입기 기법을 사용한 펩티신테사이저 상에서 펩티드 13을 합성하였다. 지지체는 Fmoc-PAL-PEG-PS (1.0g, 0.15mmol/g, 0.15 mmol)이고, 용매는 NMP이었다. Fmoc-NhSer(tBu)-OH(13d)를 포함한 모든 아미노산에 대하여 이중 커플링(커플링시간 60분)을 사용하였다. N-말단 아세틸기는 4-니트로페닐 아세테이트를 사용하여 도입하였다. 정밀검사 및 수지와 보호기의 절단 제거를 표준 방식(실시예 1)으로 수행하였다. 미정제 펩티드를 HPLC로 정제하고 5^o/_oo수성 아세트산으로 탈염하였다. 수율: 50mg; HPLC 순도: 98.6%; MS: MW = 1366; 아미노산 분석: 모든 아미노산은 필요한 양으로 확인되었음; 펩티드 함량: 82.1%; 이온 크로마토크래피: 염소: 0.3%, 아세트산염: 1.3%(w/w).

실시예 14: Ac-Arg-NhSer-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-ψ[CH ₂ NH]-Gly-NH ₂ (14)

펩티신테사이저 상에서 HATU/DIPEA를 사용하여 합성하였다. 전술한 기능화된 수지 H-Val-ψ[CH₂N(Boc)]-Gly-PAL-PEG-PS(12f)와 보호된 펩티드성 Fmoc-NhSer(tBu)-OH(13d)를 기본단위로 사용하였다. 전술한 바와 같이, 이중 주입기 기법 및 커플링 당 60분의 이중 커플링을 사용하였다. 합성기 상에서 펩티드 사슬의 신장을 중단한 후, Fmoc-NhSer(tBu)-OH(13d)와 상기 아미노산의 커플링을 초음파처리로 DMSO에 용해시키고, 이어서 고정된 펩티드 사슬 (H-Phe-Thr(tBu)-Leu-Ala-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Glu(OtBu)-Thr(tBu)-Gly-Val-ψ[CH₂NH]-Gly-PAL-PEG-PS)에 커플링시켰다. 나머지 (Arg) 아미노산을 축합시키고 4-니트로페닐 아세테이트를 사용하여 아세틸화시킴으로써 합성을 종결하였다. 펩티드의 정밀검사, 정제 및 탈염은 실시예 1에 개요된 표준 공정이었다. 동결건조로 인해 펩티드 14, 47mg이 수득되었다.

HPLC 순도: 72.9%; MS: MW = 1352; 이온 크로마토크래피: 트리플루오로아세테이트 5.5%(w/w).

실시예 15

항원-특이 T 세포 하이브리도마를 사용한 작용제 펩티드의 사전-선별(제1 라인 시험)

수정 펩티드의 작용제 활성을 시험하기 위해, 3개의 상이한 HC gp-39(263-275)-특이 하이브리도마 세포 라인을 사용하였다(5G11, 8B12 및 14G11). 5x10⁴개 하이브리도마 세포 및 2x10⁵개 방사선 조사된 세포(12000 RAD), DRB1^*0401 특이성을 갖는 EBV-형질전환된 B 세포를 둥근 바닥 미세역가 평판의 웰에서 150㎕ 부피로 항온배양하였다. 펩티드 항원(HC gp-39(263-275) 및 수정 펩티드)을 50㎕ 부피로 첨가하고, 웰을 복사하였다. 48시간 후, 마우스 IL-2에 특이적인 Pharmingen 항체를 갖는 샌드위치 ELISA를 사용하여 100㎕의 배양 상청액을 항원-특이 IL-2 생산에 대해 시험하였다.

항원-특이 T 세포 클론을 사용한 작용제 펩티드의 선별(제2 라인 시험)

243개 T-세포 클론을 펩티드 263-275의 RA 반응자(RA 환자 243)로부터 펩티드-특이 T-세포 라인에서 분리하였다. DRB1^*0401-매치된 PBMC의 존재하에 HC gp-39(263-275) 펩티드로 4번 반복 자극시킨 후 클론을 수득하였다. H235 T-세포 클론을 HLA-DRB1^*0401-양성 공여체로부터 수득한 펩티드-자극된 T-세포 라인으로부터 분리하였다. DRB1^*0401-매치된 PBMC의 존재하에 펩티드 HC gp-39(263-275)로 2번 자극하고 PHA 클로닝으로 클론을 수득하였다. 클론 243 및 235 모두는 펩티드 항원의 인식에 있어서 제한된 HLA-DRB1^*0401로 확인되었다. 각 실험에서 자극한 이후 10-14일째 세포를 사용하였다.

편평한 바닥의 미세역가 평판 내 10% 정상 인간 풀 혈청(네덜란드 암스트르담 NHS, CLB)을 갖는 150㎕부피의 배지에서 2x10⁴개 T 세포 및 10⁵개 DRB1^*0401-매치된(3,000 Rad 조사됨) PBMC를 항온배양함으로써 클론 243 또는 클론 235의 증식성 반응을 측정하였다. 50㎕의 항원 용액(263-275 서열 또는 전술한 수정을 함유함)을 3개의 웰에 분배하였다.³H-티미딘을 항온배양 2일 또는 3일째 첨가하였다. 유리 섬유 필터상에 세포를 수집하고, 혼입된 방사능을 측정하였다.

결과.

표 2에 나열된 대부분의 수정 펩티드는 리드 펩티드 H-Arg-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-OH와 필적하는 방식으로 3개 T-세포 하이브리도마 모두를 자극할 수 있었다. 그러나, 몇몇 펩티드는 3개 하이브리도마 모두를 자극하는 것은 아니었으며, 이는 사용된 하이브리도마의 특이성 차이의 예가 된다.

두개 인간 T-세포 클론을 자극하는 성능에 대해 이들 작용제를 시험하였을 때, 시험된 화합물의 효력에 있어서 분명한 차이가 확실해졌다(표 2). 대부분의 수정 화합물은 클론 235 및 클론 243의 반응을 유도하였다. 한 화합물(Ac-Narg-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-NH₂)은 양 클론의 증식성 반응을 유도하지 못하였다. 3개 화합물(H-베타호모아르기닐-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-OH, Ac-Arg-Ser-Phe-ψ[CH₂NH]-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-NH₂및 Ac-Arg-Ser-Phe-Thr-Leu-ψ[CH₂NH]-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-NH₂)은 오직 하나의 클론(클론 243 또는 235)에서만 활성이 있었다. 3개 화합물 H-Arg-Ser-Phe(4Cl)-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-OH, H-D-Arg-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-OH, 및 CH₃OC(O)-Arg-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-OH)은 리드 펩티드 H-Arg-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-OH에 의해 유도되는 반응과 같은 크기 정도로 양 클론에 있어서 증식성 반응을 유도하였다. 7개 화합물 (Ac-Arg-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-OH, CH₃(OCH₂CH₂)₃-OCH₂C(O)-Arg-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-NH₂, D-1-글루시틸-Arg-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-OH, (N-메틸-니코티노일)⁺-Arg-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-OH, Ac-Arg-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-ψ[CH₂NH]-Gly-NH₂, Ac-Arg-NhSer-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-NH₂및 Ac-Arg-NhSer-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-ψ[CH₂NH]-Gly-NH₂)은 하나 또는 둘 모두의 클론의 증식성 반응을 유도하는데 우수하였다. 가장 강력한 화합물은 Ac-Arg-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-OH, Ac-Arg-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-ψ[CH₂NH]-Gly-NH₂, Ac-Arg-NhSer-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-NH₂및 Ac-Arg-NhSer-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-ψ[CH₂NH]-Gly-NH₂로 확인되었다(표 2 및 도 1).

실시예 16

대략 8-10주령된 암컷 Badb/c 마우스(Charles River Germany or Charles River France)를 불완전 프로인트 면역보강제 내(IFA; Sigma chemicals, St. Louis, USA) 100㎕의 항원 제형(HC gp-39(263-275) 50㎍)으로 0일째 면역시켰다. 마우스의 흉곽 내 2 부위로 항원이 피하주입되었다. 7일째, 1mg/ml 알룸(Pharmacy Donkers-Peterse, Oss, 네덜란드)내 50㎕의 부피로 0.9% NaCl(NPBI, Emmer compascuum, 네덜란드)에 희석된 항원 제형(HC gp-39(263-275))으로 마우스의 한쪽 족저에만(좌측 발) 접종하였다; 다른 (우측) 족저는 대조군으로 0.9% NaCl 내 알룸 용액 50㎕를 주입하였다. 사내에서 고안한 미세측정기를 사용하여 우측 후방 족저와 비교하여 좌측 후방 족저의 족저 두께 증가(팽창 좌측(mm) - 팽창 우측 (mm) / 팽창 우측(mm) ×100%)를 측정함으로써 지연 유형의 과민성 반응(평균 % 비 팽창)을 8일째 측정하였다.

IFA 내 HC gp-39(263-275) 50㎍을 함유하는 항원 제형 100㎕를 0일째 면역화시키기 이전에 한번(-5일째) HC gp-39(263-275) 또는 수정 펩티드 유도체의 항원 제형(50, 10, 2 또는 4㎍(또는 그 이하의 농도))을 이소플루란(Isoflurane)(Forene^R, Abbott BV, Amstelveen, The Netherlands) 마취하에 비측 적용하였다. 이들 실험에서, 마우스는 HC gp-39(263-275)로 면역 및 접종하고 DTH 반응을 전술한 바와 같이 결정하였다.

HC gp-39(263-275)에 반응하는 IFA에서 HC gp-39(263-275)로 Balb/c 마우스를 면역시키는 전술한 분석 시스템을 사용하여, 수정 펩티드 유도체와 비교하여 HCgp-39(263-275)의 비측 적용에 의한 관용 유도의 가능성있는 효과를 연구할 수 있게 되었다. HC gp-39(263-275)로 전처리하면 HC gp-39(263-275) 특이 DTH 반응이 하향조절되었다; 이 효과는 전처리 공정에 포함되었던 펩티드의 투여량에 의해 달라졌다. 다소 높은 펩티드 농도(50㎍/마우스)를 사용하여, 1회 투여량의 HC gp-39(263-275)를 비측 적용시킴으로써 DTH 반응을 완전히 폐기시킨 반면, 2㎍/마우스의 투여량은 비효과적이었다. 따라서, HC gp-39(263-275) 특이 DTH 분석 시스템 내 펩티드의 효과(관용) 투여량 및 비효과 투여량 사이를 구별할 수 있도록 프로토콜을 확립하였다. HC gp-39(263-275)에 기초한 수정 펩티드 유도체가 원래 펩티드 보다 저농도에서 효과적일 수 있다는 가정하에, 상기 펩티드는 다소 낮은 펩티드 농도에서 관용을 유도한다고 예상된다. 상기 가정에 따라, 일련의 수정 펩티드는 상기 관용 유도 프로토콜에서 시험하였다. 이 실험(2㎍이 아닌 50㎍의 HC gp-39(263-275)로 전처리함으로써 하향조절될 수 있는 신뢰성있는 HC gp-39(263-275) 반응이 유도되었음)에서, 펩티드의 특정 수정은 관용 유도에 고도로 활성이 있었던 반면, 그 이외의 것들은 그렇지 않았다(표 3 참조).

하기 표 2는 제1 라인 시험(하이브리도마 분석) 및 제2 라인 시험(사람 클론 증식 분석)에서 얻은 결과를 요약한 것이다. 하기 표 3은 DTH 시험에 관한 것이다.

1) 절반 관용원성 투여량(half tolerogenic dose): DTH반응(특정 실험에서 최대 DNH)을 50% 저해하는 시험 투여양. -: 관용원성 부재. ND: 수행하지 않음.

Claims

H-Arg-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-OH(식 I)에서 유도되며 일반식 Q-A1-A2-A3-A4-A5-A6-A7-A8-A9-A10-A11-A12-A13-Z(식 II)를 갖는 수정 펩티드로서(식 II에서 A1 내지 A13은 식 I의 아미노산들에 대응하며, Q는 H에 대응하고, Z는 OH에 대응함),

a) A1 내지 A13에서 1-6개, 바람직하게는 1-4개 아미노산을 비천연 아미노산 또는 β아미노산으로 치환하는 것;

b) 하나 이상의 아미드 결합을 환원된 아미드 결합 또는 에틸렌 이소스테르로 치환하는 것;

c) Q 및/또는 Z에서 치환하는 것; 및 선택적으로

d) 최대 총 6개 수정까지 천연 아미노산으로 치환하는 것

으로 구성된 하나 이상의 a, b 또는 c 군으로부터 1 내지 6개 수정이 선택된 것이 특징인 수정 펩티드.
제1항에 있어서, Q는 H, (C_1-6)알킬, 포르밀, (C_1-6)알킬카르보닐, 카르복시(C_1-6)알킬, (C_1-6)알킬옥시카르보닐, (C_2-6)알케닐옥시카르보닐, (C_6-14)아릴(C_1-6)알킬; (C_6-14)아릴(C_1-4)알킬옥시카르보닐, CH₃(OCH₂CH₂)_n-OCH₂-C(O)-(여기서 n은 1-10), HOCH₂-(CHOH)_m-CH₂-(여기서 m은 3-4); 1-메틸-피리디늄-3-카르보닐, 1-메틸-피리디늄-4-카르보닐 또는 Lys이거나, 만일 A1이 H₂N-C(=NH)NH-(CH₂)_n-C(O)-(여기서 n은 2-5)이면 Q는 부재하고;

Z는 OR(여기서 R은 H, (C_1-6)알킬, (C_2-6)알케닐, 아릴(C_1-4)알킬, (C_4-13)헤테로아릴(C_1-6)알킬) 또는 NR₁R₂(여기서 R₁및 R₂는 독립적으로 H, (C_1-6)알킬 또는 (C_6-14)아릴(C_1-6)알킬에서 선택됨)이고;

선택적으로, Q 및 Z는 위치 A1 및/또는 A13 다음에 위치한 10개 이하의 아미노산을 추가로 포함하는 것이 특징인 펩티드.
제1항 또는 제2항에 있어서, A1 내지 A13에서 천연 아미노산으로의 치환은 4개 이하, 바람직하게는 2개 이하의 위치에서 발생하는 것이 특징인 펩티드.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,

Q는 H, (C_1-6)알킬, 포르밀, (C_1-6)알킬카르보닐, 카르복시(C_1-6)알킬, (C_1-6)알킬옥시카르보닐, (C_2-6)알케닐옥시카르보닐, 아릴(C_1-6)알킬; (C_6-14)아릴(C_1-4)알킬옥시카르보닐, CH₃(OCH₂CH₂)_n-OCH₂-C(O)-(여기서 n은 1-10), HOCH₂-(CHOH)_m-CH₂-(여기서 m은 3-4); 1-메틸-피리디늄-3-카르보닐, 1-메틸-피리디늄-4-카르보닐 또는 Lys이거나, 만일 A1이 H₂N-C(=NH)NH-(CH₂)_n-C(O)-(여기서 n은 2-5)이면 Q는 부재하고;

A1은 L-Arg, D-Arg, L-Lys, D-Lys, L-Ala, D-Ala, H₂N-C(=NH)NH-(CH₂)_n-C(O)-(여기서 n은 2-5), H₂N-(CH₂)_n-C(O)-(여기서 n은 2-7), (R)-{-HN-CH[(CH₂)_n-NH-C(=NH)-NH₂]-CH₂-C(O)-}(여기서 n은 2-5) 또는 (S)-{-HN-CH[(CH₂)_n-NH-C(=NH)-NH₂]-CH₂-C(O)-}(여기서 n은 2-5) 또는 -N[(CH₂)_n-NH-C(=NH)-NH₂]-CH₂C(O)-(여기서 n은 2-5)이고;

A2는 L-Ser, D-Ser, L-hSer, D-hSer, L-Thr, D-Thr, L-Ala, D-Ala, Gly 또는 -N[(CH₂)_n-OH]-CH₂-C(O)-(여기서 n은 2-5)이고;

A3은 L-Phe, D-Phe, L-Phe(X), D-Phe(X)(X는 독립적으로 하나 이상의 (C_1-4)알킬, 히드록시, 할로, (C_1-6)알킬카르보닐아미노, 아미노 또는 니트로에서 선택됨), L-Hfe, D-Hfe, L-Thi, D-Thi, L-Cha, D-Cha, L-Pal(3), D-Pal(3), L-1-Nal, D-1-Nal, L-2-Nal, D-2-Nal, L-Ser(Bzl), D-Ser(Bzl), (R)-{-HN-CH(CH₂-아릴)-CH₂-} 또는 (S)-{-HN-CH(CH₂-아릴)-CH₂-} 또는 (R)-{-HN-CH(CH₂-아릴)-CH₂-} 또는 (S)-{-HN-CH(CH₂-아릴)-CH₂-}이고;

A4는 L-Thr, D-Thr, L-Ser, D-Ser, L-hSer, D-hSer, L-Ala, D-Ala 또는 Gly이고;

A5는 L-Leu, D-Leu, L-Ile, D-Ile, L-Val, D-Val, L-Nva, D-Nva, L-Ala, D-Ala, Gly, (R)-{-HN-CH(CH₂-CH(CH₃)₂)-CH₂-} 또는 (S)-{-HN-CH(CH₂-CH(CH₃)₂)-CH₂-}이고;

A6은 L-Ala, D-Ala 또는 Gly이고;

A7은 L-Ser, D-Ser, L-hSer, D-hSer, L-Thr, D-Thr, L-Ala, D-Ala 또는 Gly이고;

A8은 L-Ser, D-Ser, L-hSer, D-hSer, L-Thr, D-Thr, L-Ala, D-Ala 또는 Gly이고;

A9는 L-Glu, D-Glu, L-Asp, D-Asp, L-Ala, D-Ala 또는 Gly이고;

A10은 L-Thr, D-Thr, L-Ser, D-Ser, L-hSer, D-hSer, L-Ala, D-Ala 또는 Gly이고;

A11은 Gly, L-Ala, D-Ala 또는 -NH-CH₂-CH₂-이고;

A12는 L-Val, D-Val, L-Nva, D-Nva, L-Leu, D-Leu, L-Ile, D-Ile, (R)-{-HN-CH[CH(CH₃)₂]-CH₂-} 또는 (S)-{-HN-CH[CH(CH₃)₂]-CH₂-}, (R)-{-HN-CH[CH₂CH₂CH₃]-CH₂-} 또는 (S)-{-HN-CH[CH₂CH₂CH₃]-CH₂-}, (R)-{-HN-CH[CH₂CH(CH₃)₂]-CH₂-}, (S)-{-HN-CH[CH₂CH(CH₃)₂]-CH₂-}, (RR)-{-HN-CH[CH₂(CH(CH₃)-CH₂CH₃]-CH₂-}, (RS)-{-HN-CH[CH₂(CH(CH₃)-CH₂CH₃]-CH₂-}, (SR)-{-HN-CH[CH₂(CH(CH₃)-CH₂CH₃]-CH₂-} 또는 (SS)-{-HN-CH[CH₂(CH(CH₃)-CH₂CH₃]-CH₂-}이고;

A13은 Gly, L-Ala 또는 D-Ala이고;

Z는 OR(여기서 R은 H, (C_1-6)알킬, (C_2-6)알케닐, (C_6-14)아릴(C_1-4)알킬, (C_4-13)헤테로아릴(C_1-6)알킬) 또는 NR₁R₂(여기서 R₁및 R₂는 독립적으로 H, (C_1-6)알킬 또는 (C_6-14)아릴(C_1-6)알킬에서 선택됨)이고;

선택적으로, Q 및 Z는 위치 A1 및/또는 A13 다음에 위치하는 10개 이하의 아미노산을 추가로 포함하는 것이 특징인 펩티드.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,

Q는 H, (C_1-6)알킬, (C_1-6)알킬카르보닐, 카르복시(C_1-6)알킬, (C_1-6)알킬옥시카르보닐, CH₃(OCH₂CH₂)_n-OCH₂-C(O)-(여기서 n은 1-10), HOCH₂-(CHOH)_m-CH₂-(여기서 m은 3-4); 1-메틸-피리디늄-3-카르보닐, 1-메틸-피리디늄-4-카르보닐 또는 Lys이거나, 만일 A1이 H₂N-C(=NH)NH-(CH₂)_n-C(O)-(여기서 n은 2-5)이면 Q는 부재하고;

A1은 L-Arg, D-Arg, L-Ala, H₂N-C(=NH)NH-(CH₂)_n-C(O)-(여기서 n은 2-5), H₂N-(CH₂)_n-C(O)-(여기서 n은 2-7), (S)-{-HN-CH[(CH₂)_n-NH-C(=NH)-NH₂]-CH₂-C(O)-}(여기서 n은 2-5) 또는 -N[(CH₂)_n-NH-C(=NH)-NH₂]-CH₂C(O)-(여기서 n은 2-5)이고;

A2는 L-Ser, L-Ala, D-Ala, Gly 또는 -N[(CH₂)_n-OH]-CH₂-C(O)-(여기서 n은 2-5)이고;

A3은 L-Phe, D-Phe, L-Phe(X), D-Phe(X)(X는 할로 또는 니트로), L-Hfe, L-Thi, L-Cha, L-Pal(3), L-1-Nal, L-2-Nal, L-Ser(Bzl) 또는 (S)-{-HN-CH(CH₂-아릴)-CH₂-}이고;

A4는 L-Thr 또는 L-Ala이고;

A5는 L-Leu, L-Ala 또는 (S)-{-HN-CH(CH₂-CH(CH₃)₂)-CH₂-}이고;

A6은 L-Ala 또는 Gly이고;

A7은 L-Ser 또는 L-Ala이고;

A8은 L-Ser 또는 L-Ala이고;

A9는 L-Glu 또는 L-Ala이고;

A10은 L-Thr 또는 L-Ala이고;

A11은 Gly, L-Ala 또는 -NH-CH₂-CH₂-이고;

A12는 L-Val 또는 (S)-{-HN-CH[CH(CH₃)₂]-CH₂-}이고;

A13은 Gly 또는 L-Ala이고;

Z는 OR(여기서 R은 H) 또는 NR₁R₂(여기서 R₁및 R₂는 독립적으로 H 또는 (C_1-6)알킬에서 선택됨)이고;

선택적으로, Q 및 Z는 위치 A1 및/또는 A13 다음에 위치하는 10개 이하의 아미노산을 추가로 포함하는 것이 특징인 펩티드.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,

Q는 H, 메틸; 아세틸; 카르복시메틸렌, 메톡시카르보닐; CH₃(OCH₂CH₂)₃-OCH₂-C(O)-, D-1-글루시틸, 1-메틸-피리디늄-3-카르보닐 또는 1-메틸-피리디늄-4-카르보닐이거나, 만일 A1이 H₂N-C(=NH)NH-(CH₂)₄-C(O)-이면 Q는 부재하고;

A1은 L-Arg, D-Arg, L-Ala, H₂N-C(=NH)NH-(CH₂)₄-C(O)-, H₂N-(CH₂)_n-C(O)-(여기서 n은 5-7), (S)-{-HN-CH[(CH₂)₃-NH-C(=NH)-NH₂]-CH₂-C(O)-} 또는 -N[(CH₂)₃-NH-C(=NH)-NH₂]-CH₂C(O)-이고;

A2는 L-Ser, L-Ala 또는 -N[(CH₂)₂-OH]-CH₂-C(O)-이고;

A3은 L-Phe, D-Phe, L-Phe(X)(X는 할로 또는 니트로), L-Hfe, L-Thi, L-Cha, L-Pal(3), L-1-Nal, L-2-Nal 또는 L-Ser(Bzl)이고;

Z는 OH, NH₂또는 NHEt이고;

선택적으로, Q 및 Z는 위치 A1 및/또는 A13 다음에 위치하는 10개 이하의 아미노산을 추가로 포함하는 것이 특징인 펩티드.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 일반식은 Q-A1-A2-A3-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-A11-A12-Gly-Z(식 III)인 것이 특징인 펩티드.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 1-4개 수정을 보유하는 것이 특징인 펩티드.
제8항에 있어서, 2-3개 수정을 보유하는 것이 특징인 펩티드.
제7항에 있어서,

A1은 L-Arg, D-Arg, H₂N-C(=NH)NH-(CH₂)₄-C(O)-, H₂N-(CH₂)_n-C(O)-(여기서 n은 5-7) 또는 -N[(CH₂)₃-NH-C(=NH)-NH₂]CH₂C(O)-이고;

A2는 L-Ser 또는 -N[(CH₂)₂-OH]-CH₂-C(O)-이고;

A3은 L-Phe, L-Phe(X)(X는 할로), L-1-Nal, L-2-Nal, L-Ser(Bzl), L-Thi, L-Cha 또는 L-Pal(3)인 것이 특징인 펩티드.
제9항 또는 제10항에 있어서, 일반식은 Q-Arg-A2-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-A12-Gly-Z(식 IV)인 것이 특징인 펩티드.
데스아미노아르기닐-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-NH₂, 데스아미노아르기닐-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-OH, CH₃-(OCH₂CH₂)₃-OCH₂-C(O)-Arg-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-NH₂, D-1-글루시틸-Arg-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-OH, CH₃O-C(O)-Arg-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-OH, Ac-Arg-Ser-Phe-ψ-[CH₂NH]-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-NH₂, Ac-Arg-Ser-Phe-Thr-Leu-ψ-[CH₂NH]-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-NH₂, Ac-Arg-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-ψ-[CH₂NH]-Gly-NH₂, Ac-Arg-N[(CH₂)₂-OH]-CH₂-C(O)-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-NH₂, Ac-Arg-N[(CH₂)₂-OH]-CH₂-C(O)-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-ψ-[CH₂NH]-Gly-NH₂, H-Arg-Ser-Phe(Cl)-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-OH, H₂N-(CH₂)₅-C(O)-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-OH, H₂N-(CH₂)₆-C(O)-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-OH, (N-메틸-니코티노일)⁺-Agr-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-OH로 구성된 군에서 선택된 펩티드.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 치료 물질로 사용하기 위한 것이 특징인 펩티드.
제1항 내지 제12항에 따른 1종 이상의 펩티드 및 약학적 허용 담체를 포함하는 약학 조성물.
자가 면역 장애, 더욱 구체적으로는 관절염에 걸린 환자에게서 자가항원에 대한 특이 T-세포 관용을 유도하기 위한 약학 제제의 제조에 있어서, 제1항 내지 제12항에 따른 1종 이상의 펩티드의 용도.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 1종 이상의 펩티드 및 검출제를 포함하는 진단 조성물.