CN1954073B - 被修饰Bouganin蛋白、细胞毒素及其方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明提供被修饰形式的Bouganin蛋白,它与非-被修饰Bouganin蛋白相比具有生物活性和减弱的激活T-细胞倾向。本发明还提供bouganin的T-细胞表位肽,和被修饰的bouganin的T-细胞表位肽,后者与非-被修饰的T-细胞表位肽相比具有减弱的激活人T-细胞倾向。本发明还提供细胞毒素,它具有能够与附着于被修饰Bouganin蛋白的癌细胞结合的配体。还提供用本发明的细胞毒素抑制或破坏哺乳动物细胞的方法和治疗人癌症的药物组合物。
Description
发明领域
本发明涉及被修饰bouganin蛋白和包含可用作癌症治疗剂的被修饰蛋白的细胞毒素。确切地说,通过去除或改变T-细胞表位从而降低bouganin毒素的免疫原性。
发明背景
存在许多这样的例子,治疗性蛋白质的效力受限于对该治疗性蛋白质出现的不期望的免疫反应。几种小鼠单克隆抗体已经在许多人类疾病环境中表现出作为治疗剂的可能性,但它们却在特定病例中由于诱导出显著的人抗鼠抗体(HAMA)应答而失效[Schroff,R.W.等人(1985)Cancer Res.45:879-885;Shawler,D.L.等人(1985)J. Immunol. 135:1530-1535]。对于单克隆抗体,已开发出许多技术以试图降低HAMA应答[WO89/09622;EP0239400;EP0438310、WO91/06667]。这些重组DNA方法通常降低最终抗体构建物中的小鼠遗传信息而同时提高最终构建物中的人遗传信息。尽管如此,在某些情况下,所得的“人源化”抗体仍然在患者体内引发了免疫应答[Issacs J.D.(1990)Sem.Immunol.2:449,456;Rebello,P.R.等人(1999)Transplantation68:1417-1420]。
诱导免疫应答的关键是在蛋白质内存在能够通过呈递至II类MHC分子上而刺激T细胞活性的肽,即所谓的T细胞表位。这样的T-细胞表位通常是任何能够与II类MHC分子结合的氨基酸残基序列。“T-细胞表位”暗指当其与MHC分子结合时能够被T-细胞受体(TCR)识别的表位,且至少在理论上它能够通过与TCR结合导致这些T细胞的活化从而促进T-细胞应答。
II类MHC分子是一群高度多态的蛋白质,它们在辅助T-细胞选择和 活化中起重要作用。人白细胞抗原群DR(HLA-DR)是这组蛋白质的主要同种型;然而,同种型HLA-DQ和HLA-DP 执行相似的功能。在人类群体中,个体带有二至四个DR等位基因、两个DQ和两个DP等位基因。许多DR分子的结构已经被分析清楚,它们呈现为具有许多与蛋白质疏水残基(口袋残基)结合的疏水口袋的开放末端肽结合沟[Brown等人(1993)Nature 364:33;Stern等人(1994)Nature 368:215]。用于区分同种异型II类分子的多态性促成了肽结合沟内极度多样的不同肽结合表面,并且在群体水平上确保了其识别异源蛋白和发起对病源生物的免疫应答的最大灵活度。
对治疗性蛋白质的免疫应答通过II类MHC肽呈递途径发生。此时外源蛋白质被吞入并经过加工与DR、DQ或DP型的II类MHC分子一起被呈递。II类MHC分子由专门的抗原呈递细胞(APC)表达,比如巨噬细胞和树突细胞等。II类MHC肽复合物被T-细胞表面的同类T-细胞受体的结合,以及与比如CD4分子这样的其它特定共同受体的交叉结合,可诱导T-细胞内呈现活化状态。该活化导致细胞因子的释放并进一步激活比如B细胞这样的其它的淋巴细胞来产生抗体或激活T-杀伤细胞形成全细胞免疫应答。
根据WO98/52976、WO00/34317、WO02/069232、WO02/079232和WO02/079415所认识到的,表位去除是T-细胞表位鉴定的第一步。在这些教导中,通过在目的蛋白中进行审慎的氨基酸取代来去除预计的T-细胞表位。除计算机技术外,还有许多测定合成肽结合II类MHC分子的能力的方法。一种示例方法利用了确定MHC同种异型的B-细胞系作为II类MHC结合表面的来源,且可应用于II类MHC配体鉴定[Marshall K.W等人(1994)J. Immunol.152:4946-4956;O'Sullivan等人(1990)J.Immunol.145:1799-1808;Robadey C.等人(1997)J. Immunol 159:3238-3246]。然而,这样的技术不适于从极度多样的MHC同种异型筛选多个潜在表位,它们也无法验证一种结合肽作为T-细胞表位起作用的能力。
开发重组MHC分子与合成肽的可溶性复合物的技术也逐渐被采用[Kern,F.等人(1998)Nature Medicine 4:975-978;Kwok,W.W.等人 (2001)TRENDSinImmunol.22:583-588]。这些试剂和方法用于鉴定源自人或实验动物外周血样品中是否存在能够结合特定MHC-肽复合物的T-细胞克隆,且适于从极度多样的MHC同种异型筛选多个潜在表位
T-细胞活化的生物检测法为阅读测试肽/蛋白序列激发免疫应答的能力提供了一种实际选择途径。这类方法的例子包括Petra等人将T-细胞增殖检测法应用于链激酶、之后利用合成肽刺激T-细胞系进行表位作图的工作[Petra,A.M.等人(2002)J. Immunol.168:155-161]。类似地,利用了破伤风毒素蛋白的合成肽的T-细胞增殖检测法成功地定义了该毒素的主要免疫表位[Reece J.C.等人(1993)J. Immunol.151:6175-6184]。WO99/53038公开了一种方法,在该方法中通过利用分离的人免疫细胞亚组,在存在目的合成肽的情况下促进它们的体外分化和培养,以及测定任何所诱导的培养T-细胞的增殖,可以测定测试蛋白中的T-细胞表位。Stickler等人也描述了同样的技术[Stickler,M.M.等人(2000)J.Immunotherapy 23:654-660],在这两个例子中,都将该方法应用于检测细菌枯草杆菌蛋白酶中的T-细胞表位。这样的技术需要细心的细胞分离技术和添加多种细胞因子的细胞培养以获得令人满意的免疫细胞亚组(树突细胞、CD4+和/或CD8+T-细胞),且无益于利用多个供体样品的快通量筛选。
近来,已经开发出了一种将基于总体的T-细胞增殖检测法和在设计去除表位的蛋白质时在计算机上模拟肽MHC结合相结合的组合方法。WO03/104803]。
如上述及其结果,令人满意的是鉴定并除去或至少减少一种总体而言具有治疗价值但最初具有免疫原性的肽、多肽或蛋白质上的T-细胞表位。
发明概述
本发明的目的是克服这一实际问题:因治疗目的而导入人体中的可溶性蛋白质会引发导致产生与可溶性蛋白结合的宿主抗体的免疫应答。本发明试图通过提供具有减弱的引发免疫应答倾向的bouganin蛋白来解 决该问题。根据本文描述的方法,本发明人已经鉴定了bouganin分子中包含驱动对该蛋白的免疫应答的T-细胞表位的区域。
本发明涉及一种被修饰Bouganin蛋白,该被修饰Bouganin具有减弱的引发免疫应答的倾向。在一种优选实施方式中,该被修饰Bouganin具有减弱的激活T-细胞的倾向,且该被修饰Bouganin在T-细胞表位中的一个或多个氨基酸残基处经过了修饰。该T-细胞表位优选选自:
a)AKVDRKDLELGVYKL(表位区域R1,SEQ ID NO:2),
b)LGVYKLEFSIEAIHG(表位区域R2,SEQ ID NO:3);和
c)NGQEIAKFFLIVIQM(表位区域R3,SEQ ID NO:4)。
本发明还涉及一种包含与本发明的被修饰Bouganin蛋白结合的靶部分的细胞毒素。在一种实施方式中,该靶部分是一种与癌细胞结合的配体。在另一种实施方式中,该配体是一种与癌细胞结合的抗体或抗体片段。在一种特定实施方式中,该抗体识别Ep-CAM或肿瘤-结相关抗原。在一种最特定的实施方式中,本发明提供一种包含VB6-845或VB6-011的细胞毒素。
另一方面,本发明提供一种抑制或破坏癌细胞的方法,包括向癌细胞施用本发明的细胞毒素。
本发明还涉及一种根据动物的需要通过向其施用本发明的细胞毒素来治疗癌症的方法。
更进一步,还提供了一种制备用于治疗患有癌症的动物的药物的方法,包括以下步骤:鉴定bouganin的T-细胞表位,修饰T-细胞表位中的一个或多个氨基酸残基从而制备具有减弱的激活T-细胞倾向的被修饰Bouganin;制备带有一个结合于被修饰Bouganin的癌-结合配体的细胞毒素;和将该细胞毒素悬浮于药学可接受载体、稀释剂或赋形剂。
在又一方面,本发明提供一种用于治疗癌症的药物组合物,它包含本发明的细胞毒素和药学可接受载体、稀释剂或赋形剂。
本发明的细胞毒素、组合物和方法可用于治疗各种不同形式的癌症,比如结肠直肠癌、乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌、头颈癌、膀胱癌、胃 肠癌、前列腺癌、小细胞和非小细胞癌、恶性毒瘤、神经胶质瘤、T-和B-细胞淋巴瘤。
本发明还提供Bouganin蛋白的T-细胞表位肽和本发明的被修饰T-细胞表位肽。
根据以下详细说明,本发明的其它特征和优势将逐渐显现。然而,应当理解,该详细说明和说明本发明优选实施方式的特定实施例仅仅作为解释说明而提供,因为对于本领域普通技术人员来说从该详细说明得到在本发明精神和范围内的各种不同变化和修饰是显而易见的。
附图简述
本发明将结合以下附图进行说明:
附图1显示去除了T-细胞表位的被修饰Bouganin蛋白Bou156(panel A)和Bou157(panel B)的活性检测结果。Bou156包括V123A、D127A、Y133N和I152A取代。Bou157包括V123A、D127A、Y133Q和I152A取代。两种检测都以野生型蛋白和失活的被修饰Bouganin(Y70A)作为对照。活性以荧光素酶活性比检测中Bouganin蛋白浓度的%表示。
附图2显示三个合成肽和两个不同的PBMC供体样品的T-细胞增殖检测。检测了1μM终浓度终浓度(panel A)和5μM终浓度(panel B)的名称为DeI-41、DeI-44和DeI-50的肽。这些肽源自bouganin分子的免疫原性区域,包含为去除其免疫原性而设计的取代。
附图3表示VB6-845,一种具有一个Fab抗-Ep-CAM的被修饰Bouganin细胞毒素,其中该de-bouganin(Bou156)通过一个成对碱性氨基酸蛋白酶接头与CH结构域的C-末端相连接。附图3A显示编码原序列的双顺反子单元,附图3B显示该原序列的核酸编码序列(SEQ IDNO:15)和氨基酸序列(SEQ ID NO:16),以及附图3C显示不含pelB序列的组装VB6-845蛋白。
附图4显示表达载体pING3302的图形。利用EcoRI和XhoI限制性 位点将实施例中的插入连接到3302载体中。
附图5显示不含植物毒素的对照Fab抗-Ep-CAM构建体,de-bouganin(VB5-845)。附图5A显示编码原序列的双顺范子单元,附图5B显示该原序列的核酸编码序列(SEQ ID NO:17)和氨基酸序列(SEQID NO:18),以及附图5C显示不含pelB序列的组装VB5-845蛋白。
附图6显示Fab抗-Ep-CAM de-bouganin构建体VB6-845-CL-de-bouganin,其中Bou156连接于CL结构域的C-末端。附图6A显示编码原序列的双顺范子单元,附图6B显示该原序列的核酸编码序列(SEQ IDNO:19)和氨基酸序列(SEQ ID NO:20),以及附图6C显示不含pelB序列的组装VB6-845-CL-de-Bouganin蛋白。
附图7显示Fab抗Ep-CAM,de-bouganin构建体,VB6-845-NVH-de-bouganin,其中Bou156连接于VH结构域的N-末端。附图7A显示编码原序列的双顺范子单元,附图7B显示该原序列的核酸编码序列(SEQ IDNO:21)和氨基酸序列(SEQ ID NO:22),以及附图7C显示不含pelB序列的组装VB6-845-NVH-de-Bouganin蛋白。
附图8显示Fab抗-Ep-CAM de-bouganin构建体,VB6-845-NVL-de-bouganin,其中Bou156连接于VL结构域的N-末端。附图8A显示编码原序列的双顺范子单元,附图8B显示该原序列的核酸编码序列(SEQ IDNO:23)和氨基酸序列(SEQ ID NO:24),以及附图8C显示不含pelB序列的组装VB6-845-NVL-de-Bouganin蛋白。
附图9是显示在实验室水平诱导的E104细胞上清液中VB6-845(附图3的构建体)和VB6-845-CL-de-bouganin(Bou156)(附图6的构建体)表达的蛋白质印迹。
附图10显示流式细胞术反应性研究结果。附图10A显示VB6-845(附图3的构建体)和VB6-845-CL-de-bouganin(附图6的构建体)在Ep-CAM-阳性细胞系CAL 27和OVCAR-3和Ep-CAM-阴性细胞系A-375中的结果,而附图10B显示用VB6-845(附图3的构建体)和VB6-845-白树毒蛋白(附图14C的构建体)和对照(PBS)所作的相同测试的结果。
附图11是显示如实施例7中所述的-VB6-845和ProxiniumTM在NIH:OVCAR-3细胞中的竞争性检测结果的图。
附图12是显示实施例7的无细胞检测结果的图。
附图13显示实施例8中比较VB6-845(附图3的构建体)、VB6-845-CL-de-bouganin(附图6的构建体)和de-bouganin(Bou156)在CAL 27(附图13A)和NIH:OVCAR3(附图13B)细胞中的细胞毒性的MTS细胞毒性检测结果。
附图14A和B显示实施例8中比较VB6-845(的构建体附图3)、VB6-845-白树毒蛋白(的构建体附图14C)和白树毒蛋白在CAL 27(附图14A)和NIH:OVCAR3(附图14B)细胞中的细胞毒性的MTS细胞毒性检测结果。附图14C显示核酸编码序列(SEQ ID NO:25)和VB6-845-白树毒蛋白构建体的氨基酸序列(SEQ ID NO:26)。
附图15显示VB6-011原序列的核酸编码序列(SEQ ID NO:27)和氨基酸序列(SEQ ID NO:28)。
附图16显示实施例9的MTS细胞毒性检测结果,其VB6-011在MB-435S细胞中的细胞毒性。
发明详述
本发明人已经鉴定了Bouganin中的T-细胞表位,并且已经设计和制备出了与非-被修饰Bouganin蛋白相比具有减弱的激活人T细胞倾向的被修饰Bouganin蛋白。
(A)被修饰Bouganin蛋白
本发明涉及一种被修饰Bouganin蛋白,其中为获得与非被修饰-Bouganin蛋白相比减弱了的引发免疫应答,优选为T-细胞应答,的倾向已经对bouganin进行了修饰。成熟的Bouganin蛋白是具有250个氨基酸的单链多肽,分子量约为26,200 Da[Den Hartog等人(2002)EuR.J.Biochem.269:1772-1779;美国专利NO.6,680,296]。Bouganin最初是分 离自植物BougainvilleaspectabilisWilld的1型核糖体失活蛋白(RIP)[Bolognesi等人(1997)Planta203:422-429]。这些来自植物的RIP是使细胞的主要核糖体RNA脱嘌呤、由此破坏核糖体和导致蛋白质合成中止及细胞死亡的RNA N-糖苷酶。
成熟Bouganin蛋白的氨基酸序列(以单字母码表示)为:
YNTVSFNLGEAYEYPTFIQDLRNELAKGTPVCQLPVTLQTIADDKR
FVLVDITTTSKKTVKVAIDVTDVYVVGYQDKWDGKDRAVFLDKV
PTVATSKLFPGVTNRVTLTFDGSYQKLVNAAKVDRKDLELGVYK
LEFSIEAIHGKTINGQEIAKFFLIVIQMVSEAARFKYIETEVVDRGLY
GSFKPNFKVLNLENNWGDISDAIHKSSPQCTTINPALQLISPSNDPW
VVNKVSQISPDMGILKFKSSK[SEQ ID NO:1]。
术语“非-被修饰Bouganin蛋白”意指,未经为降低其引发免疫应答倾向的修饰的Bouganin蛋白。野生型或非-被修饰Bouganin的序列示于SEQ ID NO:1中。然而,本领域技术人员将理解,术语“非-被修饰Bouganin”也包括对SEQ ID NO:1的修饰,只要这样的修饰不会降低其引发免疫应答的倾向。可以对SEQ ID NO:1作出的修饰的例子包括肽片段和不降低该蛋白质免疫原性的保守氨基酸取代。
术语“被修饰Bouganin蛋白”意指与非-被修饰Bouganin蛋白(如上所述)相比已经经过修饰的Bouganin蛋白,其中所述修饰会降低bouganin引发免疫应答的倾向。被修饰Bouganin蛋白还可以指脱免疫的bouganin。“被修饰Bouganin蛋白”可以是经过修饰的全长序列或经过修饰的非-被修饰Bouganin蛋白片段。与野生型bouganin序列相比,“被修饰Bouganin蛋白”还可能包含其它不改变该肽的免疫原性的改变。被修饰Bouganin蛋白优选具有与非-被修饰Bouganin相同的生物学活性。
本文中所使用的术语“降低的引发免疫应答的倾向”意指,被修饰Bouganin蛋白具有比非-被修饰Bouganin更低的免疫原性。
术语“免疫应答”包括细胞和体液免疫应答二者。在一种优选实施方式中,被修饰Bouganin具有降低的激活T-细胞的倾向。
本文中所使用的术语“降低的激活人T-细胞的倾向”意指被修饰 Bouganin蛋白具有比非-被修饰Bouganin蛋白更低的激活人T-细胞的倾向。本领域技术人员能够用本领域已知的方法,包括评估该蛋白的刺激指数,测试被修饰Bouganin是否具有更低的激活T-细胞的倾向。
本文中所使用的术语“刺激指数”指被修饰或非-被修饰Bouganin蛋白激活人T细胞的能力的度量。例如,可以测试被修饰或非-被修饰Bouganin蛋白、或其肽在体外激发人T-细胞增殖应答的能力。当采用取自健康供体的原始人T-细胞来完成该类型的方法,本发明人已经确定,在这样一种检测方法的操作中,等于或大于2.0的刺激指数是一个有效的诱导增殖的度量。刺激指数通常得自将用测试肽测得的增殖分数(例如如果使用3H-胸腺嘧啶掺入的话计算每分钟的放射活性)除以在未接触测试肽的细胞中测得的分数。
在一种实施方式中,本发明提供一种被修饰Bouganin蛋白,该被修饰Bouganin蛋白具有生物活性且具有比非-被修饰Bouganin蛋白低的激活人T细胞的倾向。
在另一种实施方式中,本发明提供一种被修饰Bouganin蛋白,该被修饰Bouganin蛋白具有比非-被修饰Bouganin蛋白低的激活人T细胞的倾向以及具有低于非-被修饰Bouganin蛋白的生物活性。在又一种实施方式中,本发明提供一种被修饰Bouganin蛋白,该被修饰Bouganin蛋白具有降低的激活人T细胞的倾向且无生物活性。这样的被修饰蛋白可以,例如,用作对照、用于检测或tolerize subjects。
本文所使用的术语“生物活性”是指被修饰或非-被修饰Bouganin蛋白抑制核糖体上的蛋白质合成的能力,它可以通过多种方法进行测定。应当注意,被修饰Bouganin蛋白仍然具有生物活性,即使这样的活性低于非-被修饰的蛋白的,然而它需要具有一定水平的可检测活性。例如,被修饰或非-被修饰Bouganin蛋白的生物活性可以通过鉴定其N-糖苷酶活性来测定,且尤其具有足够的活性来提供对蛋白质翻译的显著抑制。一种这样的适宜检测方法包括在无细胞蛋白合成检测中测试变体bouganin蛋白与非-被修饰Bouganin相比的活性。将包含甲硫氨酸的转录/翻译偶联混合物、编码报告蛋白荧光素酶的DNA和非被修饰和被修饰Bouganin蛋白 的梯度稀释物共同孵育。加入底物试剂后用发光计数器可以容易地测定所翻译的荧光素酶水平。所测定的发光量与反应中存在的bouganin N-糖苷酶活性成反比。通常提供比如失活Bouganin蛋白,例如包含Y70A取代,这样的阴性对照。
在一种优选实施方式中,被修饰Bouganin肽在Bouganin蛋白序列中的一个或多个T-细胞表位被修饰。
术语“T-细胞表位”意指,能够结合II型主要组织相容性复合物(MHC)、能够刺激T-细胞和/或在与II类MHC的复合物中能够结合(不需要可测定的激活)T-细胞的氨基酸序列。
一方面,可以在本发明中使用得到含有经过修饰的T-细胞表位的被修饰Bouganin蛋白的总体方法包括以下步骤:
(i)确定蛋白质或其部分的氨基酸序列;
(ii)通过比如利用体外或计算机芯片技术或生物检测法测定肽与MHC
分子的结合这样的方法鉴定该蛋白质氨基酸序列中的一或多个潜在
T-细胞表位;
(iii)设计带有一或多个位于所鉴定的T-细胞表位中的经过修饰的氨基 酸的新序列变体,根据利用体外或计算机芯片技术或生物检测法测 定肽与MHC分子的结合所确定的,通过这种方式来基本上降低或去 除该T-细胞表位的活性。以避免由于该序列突变而形成新的潜在T- 细胞表位的方式来构造这样的序列变体表位,除非接下来再以这种 方式来修饰这样的新潜在T-细胞表位以基本或去除T-细胞表位的活 性;
(iv)通过重组DNA技术构建这样的序列变体,和根据熟知的重组技 术测试所述变体以鉴定一或多个具有所需特性的变体;和
(v)选择性地重复步骤(ii)至(iv)。
在一个实施例中,通过对非-被修饰Bouganin蛋白中任一T-细胞表位中的氨基酸残基进行取代、添加或缺失来实施步骤(iii)。在另一个实施例中,制备被修饰Bouganin蛋白的方法参照同源蛋白序列和/或计算机模 型进行。
根据步骤(ii)来鉴定潜在的T-细胞表位可以按照本领域以前描述过的方法来完成。适宜的方法公开于WO98/59244、WO98/52976、WO00/343 17、WO02/069232,可用于鉴定bouganin衍生肽与II类MHC分子的结合倾向。为鉴定生物相关肽,本发明人已开发出一种用于exploiting离体人T-细胞增殖检测的方法。已证实该方法是一种非常有效的方法,它包括在某个方案中对重叠bouganin衍生肽序列进行测试以扫描和测试整个bouganin序列。测试合成肽激发体外培养的人T-细胞的增殖应答的能力。本发明人用取自健康供体的天然人T-细胞来实施该类型方法,已经确立,在这样一种检测方法的操作中,等于或大于2.0的刺激指数是一个有效的诱导增殖的度量。刺激指数通常得自将用测试肽测得的增殖分数(例如如果使用3H-胸腺嘧啶掺入的话计算每分钟的放射活性)除以在未接触测试肽的细胞中测得的分数。
相应地,在本发明的研究中,在用取自天然供体(也即不存在已知的bouganin的致敏)的PBMC(外周血单核细胞)做的T-细胞增殖检测中,使用了89个合成的15-mer肽(列于表1)。选择了20份供体PBMC样品以达到最理想的II类MHC同种异型覆盖率。在通过3H-胸腺嘧啶掺入来评估增殖之前,用各肽在三份培养物中刺激7天。所有的肽均稀释为两个浓度:1μM和5μM。刺激指数(SI)计算为:掺入细胞的3H量,除以假刺激对照中掺入的3H量。
本方法已经鉴定出了bouganin分子在人体中最具免疫原性的区域。因此,在一种特定实施方式中,被修饰Bouganin蛋白在T-细胞表位中选自以下的一个或多个氨基酸残基得到修饰:
a)AKVDRKDLELGVYKL,本文中称作表位区域R1(SEQ ID NO:2);
b)LGVYKLEFSIEAIHG,本文中称作表位区域R2(SEQ ID NO:3);和
c)NGQEIAKFFLIVIQM,本文中称作表位区域R3(SEQ ID NO:4)。
根据在两个或多个供体PBMC样品中给出的SI>2,已经鉴定出了这些T-细胞表位。上述公开的肽序列给出了构建被修饰Bouganin蛋白所需的关键信息,在这些被修饰蛋白中一个或多个这些肽被弱化。
在本发明的一种实施方式中,本发明的被修饰Bouganin蛋白被除去了至少一个T-细胞表位。在另一种实施方式中,本发明的被修饰Bouganin蛋白被除去了一个、两个或三个T-细胞表位。本发明还考虑了一种被修饰Bouganin蛋白,其中优选在T-细胞表位中有1至9个氨基酸残基被修饰。在另一种实施方式中,修饰了1至5个氨基酸残基。本文所使用的术语“被修饰”意指,通过取代、添加或缺失对氨基酸残基进行被修饰,优选通过取代,但Bouganin蛋白具有减弱的刺激人T细胞的倾向。在另一种实施方式中,被修饰的蛋白具有生物学活性。更优选地,本发明的被修饰Bouganin蛋白通过在对应于上述序列(a)、(b)或(c)中特定的任一氨基酸的位置进行取代得以修饰。
本发明的一种实施方式包括bouganin蛋白,对于这些蛋白,对在表位R1~R3任何一个中鉴定到的II类MHC配体进行了修饰以使结合消失或者减少该肽能够结合的MHC同种异型的数量。可以通过取代、添加或缺失来对R1至R3区域中使结合消失或者减少该肽能够结合的MHC同种异型数量的氨基酸进行修饰。
为去除T-细胞表位,在肽序列中预计能够实现基本减弱或除去T-细胞表位活性的适当位置进行氨基酸取代。在实践中,适宜位置在一种实施方式中是结合于II类MHC结合沟口袋内的氨基酸残基。
在一种实施方式中,对位于肽的所谓的P1或P1锚位置的裂隙的第一个口袋内的结合进行修饰。肽P1锚残基与II类MHC结合沟第一口袋间的结合互作的质量被视为整个肽分子的总结合亲和力的主要决定因素。肽该位置的适宜取代将用更不易于容纳进该口袋的残基来进行,例如,取代为一个更加亲水的残基。还考虑了肽中位于等同于MHC结合裂隙中的其它口袋区域的结合的氨基酸残基。
可以理解,在给定潜在T-细胞表位中的单个氨基酸取代、缺失或添加是一种优选的去除表位的途径。可以考虑在单一表位中的组合修饰 (也即取代、缺失和添加),例如当各定义表位间彼此重叠时尤其适于采用组合修饰,正如本发明中表位区域R1和R2重叠了5个残基。此外,可以在类似于II类MHC结合沟“口袋残基”的位置进行给定表位中的单个氨基酸修饰或者单个表位中的组合修饰,但不是在肽序列中的任何位置。可以利用本领域已知的基于芯片的技术参照同源结构或结构学方法来做修饰。所有这样的修饰均落入本发明范围内。
对Bouganin的肽区域R1~R3进行了分析以指示出其各序列中的II类MHC配体。采用了WO98/59244和WO02/069232中给出的开发这种方案的软件工具作这一分析。该软件模拟肽II类MHC结合互作水平的抗原呈递过程从而为任何给定肽序列提供结合分数。对群体中存在的许多主要II类MHC同种异型测定了这样的分数。由于该方案能够测试任何肽序列,因此能够预测氨基酸取代、添加或缺失后对于肽与II类MHC结合沟的相互作用的结果。由此可以设计出新的序列组成,它包含数量减少的能够与II类MHC互作并由此作为免疫原性T-细胞表位起作用的肽。
在这种方案下,在本发明的一种实施方式中,表位区域R1内的取代包括在位置V123、D127和/或E129的变化。类似地,对于表位区域R2,在一种实施方式中该取代位于Y133。该残基落入R1和R2的重叠区,但Y133位的取代足以除去R2相关的II类MHC配体且其自身不足以除去R1相关的II类MHC配体。对于表位区域R3,在本发明的一种实施方式中,是对残基E151和/或I152进行取代。
在所有情况中,都是对一或多个替代氨基酸残基进行取代。用MHCII模拟软件对R1作的分析表明,氨基酸残基123、127、129和131是该表位中结合MHC II分子的关键残基。残基123是R1区的一个优选突变位点,因为它位于分子表面、远离活性位点且在RIP序列比对中是可变的。然而,并不是所有的取代都产生活性分子,因此需要在生物活性检测中对突变进行验证。因此,例如在R1中,取代V1 23T、V123A和V123Q是优选的可选择的取代例子。RIP中发现残基131是绝对保守的,因此它有可能不适于突变。残基127和129不是高度保守的,但发现只有有限数量的残基对MHC II结合有影响。取代组:D127G、D127A、E129Q和E129G也是优选取代。对于R2,残基133显示为除去MHC II 结合的一个可能的候选残基,其明显的表面定位(根据模型确定)加上它在RIP中不是高度保守的这样一个事实使它成为了突变的一个好候选残基。发现优选的可选择取代是Y133N、Y133T、Y133A、Y133R、Y133D、Y133E、Y133Q、Y133G、Y133K、Y133H和Y133S。对于R3,氨基酸残基152、155和158被鉴定为MHC II结合的关键残基。然而,残基155和158是一段高度保守疏水序列的一部分,由此暗示它们的突变将不能产生有生物活性的分子。发现弱保守残基是更为可能的候选者。对于R3,取代组:I152Q和I152A也是优选取代。
相应地,本发明提供一种被修饰Bouganin蛋白,其中的bouganin在以下X1、X2、X3、X4或X5中的一或多个位置处被修饰:
a)AKX1DRKX2LX3LGVX4KL(表位区域R1,SEQ ID NO:5);
b)LGVX4KLEFSIEAIHG(表位区域R2,SEQ ID NO:6);和
c)NGQEX5AKFFLIVIQM(表位区域R3,SEQ ID NO:7)
其中的X1至X5可以是任何氨基酸。
在一种特定实施方式中,X1是T或A或Q;X2是G或A;X3是Q或G;X4是N或D或T或A或R或Q或E或G或H或K或S;和X5是Q或A(表位区域R1,SEQ ID NO:8;表位区域R2,SEQ ID NO:9;表位区域R3,SEQ ID NO:10)。
根据用离体T-细胞检测做的肽表位作图研究、基于芯片的MHC肽结合模拟以及来自序列同源性分析的结构考量进行综合考虑,可以编辑得到一个最优选的取代组。最后,如果某一个活性肽是优选的,可以对这一包含一个或多个取代的被修饰蛋白进行体外活性检测。
相应地,在另一种实施方式中,本发明提供一种被修饰Bouganin肽,它包含氨基酸序列:
YNTVSFNLGEAYEYPTFIQDLRNELAKGTPVCQLPVTLQTIADDK
RFVLVDITTTSKKTVKVAIDVTDVYVVGYQDKWDGKDRAVFLD
KVPTVATSKLFPGVTNRVTLTFDGSYQKLVNAAKX1DRKX2LX3L
GVX4KLEFSIEAIHGKTINGQEX5AKFFLIVIQMVSEAARFKYIETE
VVDRGLYGSFKPNFKVLNLENNWGDISDAIHKS SPQCTTINPALQ
LISPSNDPWVVNKVSQISPDMGILKFKSSK
其中的X1至X5可以是任何氨基酸(SEQ ID NO:11)。
在一种优选实施方式中,X1是T或A或Q;X2是G或A;X3是Q或G;X4是N或D或T或A或R或Q或E或G或H或K或S;和X5是Q或A(SEQ ID NO:12)。
在一种特定实施方式中,被修饰Bouganin蛋白包含氨基酸序列:
YNTVSFNLGEAYEYPTFIQDLRNELAKGTPVCQLPVTLQTIADDK
RFVLVDITTTSKKTVKVAIDVTDVYVVGYQDKWDGKDRAVFLD
KVPTVATSKLFPGVTNRVTLTFDGSYQKLVNAAKADRKALELG
VNKLEFSIEAIHGKTINGQEAAKFFLIVIQMVSEAARFKYIETEVV
DRGLYGSFKPNFKVLNLENNWGDISDAIHKSSPQCTTINPALQLIS
PSNDPWVVNKVS QISPDMGILKFKS SK(SEQ ID NO:13)。
在又一种实施方式中,被修饰Bouganin蛋白包含氨基酸序列:
YNTVSFNLGEAYEYPTFIQDLRNELAKGTPVCQLPVTLQTIADDK
RFVLVDITTTSKKTVKVAIDVTDVYVVGYQDKWDGKDRAVFLD
KVPTVATSKLFPGVTNRVTLTFDGSYQKLVNAAKADRKALELG
VQKLEFSIEAIHGKTINGQEAAKFFLIVIQMVSEAARFKYIETEVV
DRGLYGSFKPNFKVLNLENNWGDISDAIHKS SPQCTTINPALQLIS
PSNDPWVVNKVSQISPDMGILKFKSSK(SEQ ID NO:14)。
下划线残基被来自非-被修饰Bouganin蛋白的残基取代。
如同本领域技术人员所清楚的,多个可选择的修饰组能够实现除去不需要的表位这一目的。然而所得序列将在很大程度上与本文所公开的蛋白质保持同源,它们由此落入本发明的范围。本发明公开的序列的明显的化学等价物也被考虑落入本发明范围内。这样的等价物包括以基本相同的方式基本完成相同功能的蛋白质。
在另一种实施方式中本发明的被修饰Bouganin蛋白在蛋白质的T-细胞表位中有1、2、3、4、5或更多个氨基酸修饰。
在又一种实施方式中,本发明的被修饰Bouganin蛋白在T-细胞检测中进行测试时与非-被修饰Bouganin蛋白相比激发出降低的刺激指数。
在本发明的另一种实施方式中,用T-细胞检测对Bouganin蛋白的T-细胞表位作图,之后对这些表位进行修饰以使得再次在T-细胞检测中进行测试时被修饰Bouganin蛋白激发出低于非-被修饰Bouganin蛋白的刺激指数,优选该刺激指数小于2.0。
本领域技术人员清楚,如果被修饰Bouganin蛋白具有基本降低的或者没有生物活性,则它还需要通过氨基酸残基取代、添加或缺失作进一步以恢复被修饰Bouganin蛋白的生物活性。然而,这样的具有基本降低的或者没有生物活性的被修饰Bouganin蛋白仍然包括在本发明范围内,并且可以用作检测中的对照,或者用于tolerization。
在一种实施方式中,被修饰Bouganin在70位的酪氨酸残基处发生突变从而产生一种失活bouganin。在一种特定实施方式中,酪氨酸位置70被丙氨酸取代。在一种优选实施方式中,被修饰Bouganin具有序列:
YNTVSFNLGEAYEYPTFIQDLRNELAKGTPVCQLPVTLQTIADDK
RFVLVDITTTSKKTVKVAIDVTDVAVVGYQDKWDGKDRAVFLD
KVPTVATSKLFPGVTNRVTLTFDGSYQKLVNAAKVDRKDLELG
VYKLEFSIEAIHGKTINGQEIAKFFLIVIQMVSEAARFKYIETEVVD
RGLYGSFKPNFKVLNLENNWGDISDAIHKS SPQCTTINPALQLISP
SNDPWVVNKVSQISPDMGILKFKSSK[SEQ ID NO:129]。
在本发明的规划下,通过突变对表位进行弱化处理从而得到不再能够作为T-细胞表位起作用的序列。有可能用重组DNA方法来实现靶序列定向诱变,许多这样的技术都是可以获得的也是本领域已知的。实践中,为获得所需的免疫和功能特征可以制备并测试许多被修饰Bouganin蛋白。尤其重要的是,对蛋白质序列进行修饰时,所构思的改变不会引入新的免疫原性表位。实践中可以通过利用任何适宜的方法再次测试所构思序列中表位和/或II类MHC配体的存在与否来避免这一事件的发生。
本发明的被修饰Bouganin蛋白还可以包含或用于获得或设计“肽模拟 物”。“肽模拟物”是在分子间互作中用作肽替代物的结构(综述参见Morgan等人(1989),Ann.Reports Med.Chem.24:243-252)。肽模拟物包括可能包含或可能不包含氨基酸和/或肽键但保持本发明肽的结构和功能特征,包括生物活性和降低的激活人T细胞的倾向,的合成结构。肽模拟物还包括肽、寡肽(Simon等人(1972)Proc.Natl.Acad,Sci USA 89:9367)。
可以根据通过D-氨基酸对L-氨基酸的系统替换、用带有具不同电性特征的基团的侧链替换、和通过用氨基键系统替换肽键获得的信息来设计肽模拟物。还可以导入位置构型限制来确定对候选肽模拟物的活性构型要求。这些模拟物包括电子等排氨基键、或D-氨基酸以稳定或促进反向构型和辅助稳定分子。环形氨基酸类似物可用于约束氨基酸残基于特定的构型状态。这些模拟物还可包括本发明蛋白质的二级结构的模拟物。这些结构可以将氨基酸残基的三维定向模拟进蛋白质的已知二级构型中。还可以使用N-取代氨基酸寡肽拟肽,也可以将拟肽用作产生新分子化学多样性文库的结构基序。
可以通过几种方法中的任何一种来制备本发明的分子,但最优选采用常规重组技术来完成。用本文提供的蛋白质序列和信息来推导编码任一优选蛋白质序列的多核苷酸(DNA)是一种相对直接的方法。例如可以利用计算机软件工具,比如DNSstar软件套[DNAstar Inc,Madison,WI,USA]或类似的软件,来实现。任何这样的能够编码本发明的优选多肽或其显著同源物的DNA序列应理解为本发明的实施方式。
作为一个总体规划,编码任一被修饰Bouganin蛋白序列的基因可以通过基因合成来制备并将其克隆进适宜的表达载体。依次将表达导入宿主细胞和所选择及培养的细胞。从培养基中纯化本发明的蛋白质,并将其制成用于治疗性给药的制剂。作为可选择的形式,通过例如依照cDNA克隆策略利用从Bougainvillea spectabilis Willd植物根组织制得的RNA获得野生型bouganin基因序列。野生型基因可用作突变模板和用于构建优选的变体序列。在这点上,利用Higuchi等人[Higuchi等人(1988)Nucleic Acids Res.16:7351]描述的“重叠延伸PCR”策略是非常方便的,尽管其它方法和系统也易于应用。
同样可以通过许多方式评估本发明蛋白质的生物活性。在一种实施方式中,用N-糖苷酶活性,尤其是用足以对蛋白质翻译产生显著抑制的活性,来鉴定被修饰Bouganin分子。一种这样的适宜检测包括在无细胞蛋白质合成系统中测试被修饰Bouganin蛋白与非-被修饰Bouganin相比的活性。将包含甲硫氨酸、编码报告蛋白质荧光素酶的DNA以及非-被修饰和被修饰Bouganin蛋白的系列稀释物的转录/翻译耦联混合物进共培养。加入底物试剂用发光计可以容易地探测所翻译的荧光素酶水平。所测得的发光与反应中存在的bouganin N-糖苷酶活性成反比。提供例如包含Y70A取代这样的失活Bouganin蛋白作为阴性对照是常规的。
可以通过重组DNA技术来实现优选和活性bouganin分子的构建,这包括与目的抗体或其它靶部分融合的bouganin分子。纯化和操作重组蛋白的方法包括融合蛋白是本领域熟知的。文献中充分描述了所需技术,例如,“Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, second edition(Sambrook等人,1989);“Oligonucleotide Synthesis”(M.J.Gait,ed.,1984);“Animal Cell Culture”(R.I.Freshney,ed.,1987);“Methods inEnzymology”(Academic Press,Inc.);“Handbook of ExperimentalImmunology”(D.M.Weir & C.C.Blackwell,eds.);“Gene TransferVectors for Mammalian Cell”(J.M.Miller&M.P.Calos,eds.,1987);“Current Protocols in Molecular Biology”(F.M.Ausubel等人,eds.,1987);“PCR:The Polymerase Chain Reaction”, (Mullis等人,eds.,1994);“Current Protocols in Immunolo gy”(J.E.Coligan等人,eds.,1991)。
可以用重组DNA方法来制备本发明的蛋白质和肽。还可以利用蛋白质化学中熟知的技术比如固相合成(Merrifield,1964,J. Am.Chem.Assoc.85:2149-2154)或在同质液中合成(Houbenweyl,1987,Methodsof Organic Chemistry,ed.E.Wansch,第15I和II卷,Thieme,Stuttgart)通过化学合成制备本发明的蛋白质。
本发明还提供包含编码本发明被修饰Bouganin蛋白或肽序列,优选编码如SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:14的本文所述的蛋白质的序列,的分离纯化的核酸分子。
本文中所使用的术语“分离纯化的”指,通过重组DNA技术产生的基本无细胞物质或培养基的核酸,通过化学合成的化学前体、或其它化合物。“分离纯化”的核酸也基本不含其天然序列两侧的序列(也即位于核酸5'和3'末端的序列)。
本文所使用的术语“核酸”指由天然碱基、糖和intersugar(骨架)连接组成的核苷酸序列或核苷单体。该术语还包括具有类似功能的包含非天然单体的被修饰或被取代序列或其部分。本发明的核酸序列可以是核糖核酸(RNA)或脱氧核糖核酸(DNA),可以包含包括腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶在内的天然碱基。序列还可以包含比如黄漂亮、次黄嘌呤、2-氨基腺嘌呤、6-甲基、2-丙基、和其它烷基腺嘌呤、5-卤尿嘧啶、5-卤胞嘧啶、6-氮尿嘧啶、6-氮胞嘧啶、和6-氮胸腺嘧啶、假尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、8-卤腺嘌呤、8-氨基腺嘌呤、8-硫腺嘌呤、8-硫-烷基腺嘌呤、8-羟基腺嘌呤和其它8-取代腺嘌呤、8-卤鸟嘌呤、8-氨基鸟嘌呤、8-硫鸟嘌呤、8-硫烷基鸟嘌呤、8-羟基鸟嘌呤和其它8-取代鸟嘌呤、其它氮和deaza尿嘧啶、胸腺嘧啶脱氧核、胞嘧啶、腺嘌呤、或鸟嘌呤、5-三氟甲基尿嘧啶和5-三氟胞嘧啶这样的被修饰碱基。
在一种实施方式中,纯化分离的核酸分子包含本发明的编码蛋白质和肽的序列,优选SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:14,包括:
(a)核酸序列,其中T也可以是U;
(b)与(a)互补的核酸序列序列;
(c)与(a)或(b)同源的核酸序列序列;
(d)在严紧条件下与(a)至(c)杂交的(a)至(c)的至少15
个碱基、优选20至30个碱基的片段,;或
(e)由于遗传密码简并而在密码子上不同于(a)至(c)中任一
的核酸序列的核酸序列分子。
此外,可以理解,本发明包括包含与编码本发明蛋白质和肽的核酸序列具有基本序列同源性的核酸序列的核酸序列分子及其片段。术语“具有基本序列同源性的序列”意指具有不同于这些序列的轻微或不重要变化的那些核酸序列序列,即,以基本相同的方式产生功能等价蛋白质的序 列。这些变化可以促成定位突变或结构修饰。
具有基本序列同源性的核酸序列包括与编码本发明蛋白质和肽的核酸序列具有至少80%、优选90%同一性的核酸序列。
本发明的另一方面提供在杂交条件下,优选在严紧条件下,能够与本发明的核酸序列分子杂交的核酸分子及其具有至少15个碱基的片段。促进DNA杂交的适当严紧条件是本领域技术人员已知的,或者可以在Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons,N.Y.(1989),6.3.1-6.3.6找到。例如,可以使用以下条件:约45℃下6.0×氯化钠/柠檬酸钠(SSC),之后于50℃用2.0×SSC洗涤。可以根据洗涤步骤中所使用的条件选择严紧度。例如,洗涤步骤中的盐浓度可选自50℃下约0.2×SSC的高严紧度。此外,洗涤步骤中的温度可以处于约65℃的高严紧条件。
相应地,可以根据本领域已知方法将具有编码本发明蛋白质和肽的本发明的核酸序列分子整合进确保该蛋白质和肽良好表达的适宜表达载体中。可能的表达载体包括但不限于粘粒、质粒、或被修饰的病毒(例如,复制缺陷反转录病毒、腺病毒和腺伴随病毒),只要该载体与所使用的宿主细胞相容即可。“适于转化宿主细胞的载体”这一表达意指,该表达载体包含本发明的核酸序列分子和根据所使用的用于表达的宿主细胞进行选择的与核酸序列分子可操作性相连的调控序列。“可操作性相连”意指该核酸序列以允许该核酸序列表达的方式与调控序列相连。
本发明由此考虑包含本发明核酸序列或其片段以及所插入蛋白序列的转录和翻译所必需的调控序列的本发明重组表达载体。适宜的调控序列可来自多种来源,包括细菌、真菌、或病毒基因(例如,参见Goeddel,Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185,Academic Press,San Diego,CA(1990)中描述的调控序列)。对适宜调控序列的选择依赖于所选择的宿主细胞,并且可以容易地由本领域普通技术人员完成。这样的调控序列的例子包括:转录启动子和增强子或RNA聚合酶结合序列、包括翻译起始信号在内的核糖体结合序列。此外,根据所选择的宿主和所使用的载体,可以向表达载体中整合进比如 复制起点、附加DNA限制位点、增强子和为序列带来转录可诱导性的序列这样的其它序列。可以理解,所需的调控序列可以由天然蛋白质和/或其侧翼区域提供。
本发明的重组表达载体还可以包含有利于对用本发明的重组分子转化或转染了的宿主细胞进行选择的选择标记。选择标记基因的例子包括编码比如G418和潮霉素这样的带来特定药物抗性的蛋白质、β-半乳糖苷酶、氯霉素酰基转移酶、或萤火虫荧光素酶的基因。通过比如β-半乳糖苷酶、氯霉素酰基转移酶、或萤火虫荧光素酶这样的选择标记蛋白质的浓度的变化来监控选择标记基因的转录。如果选择标记基因编码赋予转化细胞抗生素抗性比如潮霉素抗性的蛋白质,则可以选择G418。整合有选择标记基因的细胞将存活,而其它细胞将死亡。这可以将本发明的重组表达载体的表达可视化并能够进行检测,尤其是测定突变对于表达和表型的效果。可以理解,选择标记可以在独立于目的核酸序列的载体上导入。
重组表达载体还可以包含编码融合部分的基因,该融合部分可提高重组蛋白质的表达、提高重组蛋白的溶解度、和作为亲和纯化的配体从而有助于靶重组蛋白的纯化。例如,可以在靶重组蛋白中加入蛋白酶切割位点从而允许在融合蛋白纯化后将重组蛋白能够从融合部分中分离出来。
可以将重组表达载体导入宿主细胞从而产生转化的宿主细胞。术语“转化的宿主细胞”意欲包括已经用本发明的表达载体转化或转染的原核和真核细胞。术语“用......转化的”、“用......转染的”、“转化”和“转染”意欲包括核酸序列(例如载体)通过本领域已知的许多可能技术之一向细胞中的导入。原核细胞可以通过,例如,点击或氯化钙介导的转化进行转化。可以通过比如磷酸钙或氯化钙共沉淀、DEAE-葡聚糖介导的转染、脂转染、点击或微注射这样的常规技术将核酸序列导入哺乳动物细胞。在Sambrook等人(Molecular Cloning:A Laboratory Manual,2ndEdition,Cold Spring Harbor Laboratory press(1989))以及其它这样的实验室教科书中可以找到转化或转染宿主细胞的适宜方法。
适宜的宿主细胞包括各种原核和真核宿主细胞。例如,可以在比如大肠杆菌、昆虫细胞(利用杆状病毒)、酵母细胞或哺乳动物细胞这样的细胞中表达本发明的蛋白质。在Goeddel,Gene ExpressionTechnology:Methods in Enzymology 185,Academic Press,San Diego,CA(1991)中可以找到其它的适宜宿主细胞。
若核酸序列的放置方式使其与另一核酸序列在功能上相关,则该核酸序列是“可操作连接的”。例如,如果前序列或分泌引导序列的DNA表达为参与多肽分泌的前蛋白,则它是与多肽DNA是可操作性相连的;启动子或增强子如果影响序列的转录,则其与编码序列是可操作性相连的;或者核糖体结合位点的位置有利于翻译,则其与编码序列是可操作性相连的。总之,“可操作性相连”意指被连接的DNA序列是邻近的,而且对于分泌引导序列,是邻近的且在同一阅读框中。然而,增强子不必须是邻近的。可以通过在常规的限制性位点的连接来完成连接。如果没有这样的位点,那么可以根据常规实践使用合成的寡核苷酸接头。
在一些实施方式中,表达载体包含编码这样的被修饰Bouganin的核酸序列:它们具有减少数量的潜在T细胞表位的,并与表达控制序列可操作性连接。在不同的实施方式中,表达载体包含编码本发明蛋白质或肽的核酸序列或其简并变体,将至少包含与适宜表达控制和选择序列可操作性相连的所述核酸序列的RIP编码结构域。关于多核苷酸的简并指这样个已得到普遍认识的事实:遗传密码中有许多氨基酸由超过一种密码子指定。密码简并使得由构成DNA的四种不同碱基的64种可能三联体序列编码20种不同的氨基酸。
本文所使用的术语“RIP编码结构域”或“核糖体失活蛋白编码结构域”意指赋予bouganin生物活性的功能结构域。
本发明的核酸序列分子还可以通过标准技术化学合成。化学合成多聚脱氧核苷酸的各种方法是已知的,包括已经在可商业获得的DNA合成仪中完全自动化的固相合成,例如肽合成(参见例如,Itakura等人,美国专利4598049;Caruthers等人,美国专利4458066;和Itakura,美国专利4401796和4373071)。
本发明还提供编码包含本发明新蛋白质和所选择的蛋白、或选择标记蛋白的融合蛋白的核酸序列。
本发明的另一方面是包含至少一种上述载体的培养细胞。
本发明的又一方面是被修饰Bouganin的方法,包括在允许被修饰Bouganin从表达载体中表达的条件下培养上述细胞并从细胞中纯化bouganin。
(B)被修饰Bouganin细胞毒素:
如前述,bouganin是使细胞的主要核糖体RNA脱嘌呤从而导致蛋白质合成终止和细胞死亡的I型核糖体失活蛋白(RIP)。因此,本发明的被修饰Bouganin可用于制备细胞毒素。包含被修饰Bouganin蛋白的细胞毒素优选于包含非-被修饰Bouganin蛋白的细胞毒素,因为前者具有更低的免疫原性且较为不太可能在达到靶物前被免疫系统破坏。
相应地,本发明还提供细胞毒素,它包含(a)本发明的被修饰Bouganin蛋白以及(b)附着于(a)的靶部分。
为方便介绍使用术语“本发明的被修饰Bouganin蛋白”,它包括本文所描述的任何或全部被修饰Bouganin蛋白,比如在上述部分(A)以及附图和实施例中所描述的被修饰Bouganin蛋白。
本文所使用的术语“靶部分”指将被修饰Bouganin蛋白运送至靶细胞的物质、方法、或技术。在一种实施方式中该靶部分是一种抗体。在一种实施方式中该靶部分可能是一种脂质体。在一种实施方式中该脂质体可连接于抗体。在另一种实施方式中该靶部分是一种能够导向与特定靶细胞发生特定结合互作的蛋白质。这样的蛋白质部分包括有特定细胞表面受体的各种多肽配体,由此包括许多细胞因子、太或多肽激素和其它生物应答调节物质。主要例子包括比如血管内皮生长因子、表皮生长因子、heregulin、白介素、干扰素、肿瘤坏死因子和其它蛋白质和糖蛋白分子。可以考虑本发明bouganin与这些或其它分子的融合蛋白,根据蛋白配体结构域可以在N-末端或C-末端方向包含被修饰Bouganin部分。可将直接将靶部分与本发明的蛋白质相连或者通过接头连接。在一种实施方 式中,接头是太接头或化学接头。同样地,也可以考虑纯化配体与被修饰Bouganin蛋白的化学交联,这也在本发明范围内。
在一种优选实施方式中,本发明提供细胞毒素,它包含(a)本发明的被修饰Bouganin蛋白,(b)附着于(a)的能够与癌细胞结合的配体。
配体可以是能够与癌细胞结合的任何分子,包括但不限于蛋白质。在一种实施方式中,配体是可识别癌细胞表面的抗体或抗体片段。
相应地,本发明的细胞毒素可用于治疗各种形式的癌症,比如结肠直肠癌、乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌、头颈癌、膀胱癌、胃肠癌、前列腺癌、小细胞和非小细胞肺癌、肉瘤、神经胶质瘤、T-和B-细胞淋巴瘤。
在一种实施方式中,癌细胞结合配体包括与癌细胞结合的完整免疫球蛋白分子。若癌细胞结合配体是抗体或其片段,细胞毒素优选为免疫毒素。在另一种实施方式中,癌细胞结合配体是Fab、Fab'、scFv、单结构域抗体片段、或通过二硫键稳定的Fv片段的二聚体。在另一种实施方式中,癌抗体包括可变重链、可变轻链、Fab、Fab'、scFv、单结构域抗体片段、或通过二硫键稳定的Fv片段。癌细胞结合配体的部分可源自一或多个物种,优选包含源自人的部分,最优选是完全人的或人源化的。所设计利于纯化以及与毒素耦联的区域也可以包括在或者被添加到癌细胞结合部分中。
在一种特定实施方式中,癌细胞结合配体识别Ep-CAM。Ep-CAM(上皮细胞粘连分子,还已知为17-1A,KSA,EGP-2和GA733-2)是一种在许多固体肿瘤,包括肺癌、乳腺癌、卵巢癌、结肠直肠癌和头颈鳞片状细胞肉瘤,中高度表达但在多数正常上皮组织中弱表达的的跨膜蛋白。
相应地,在一种实施方式中,本发明提供一种Ep-CAM-targeted-被修饰Bouganin细胞毒素,它包含:(a)与非-被修饰Bouganin蛋白相比具有降低的激活T-细胞倾向的被修饰Bouganin蛋白,(b)附着于(a)的能够结合癌细胞上的Ep-CAM的配体(比如抗体或抗体片段。
在一种特定实施方式中,细胞毒素包含:(a)与非-被修饰Bouganin 蛋白相比具有降低的激活T-细胞倾向的被修饰Bouganin蛋白,(b)附着于(a)的人源化抗体或抗体片段,它能够与人Ep-CAM细胞外结构域结合且包含来自Moc-31抗体的互补决定区(CDR)序列的。
根据本发明的适宜Ep-CAM-targeted-被修饰Bouganin包括,不限于,VB6-845及其变体,包含选择性结合Ep-CAM的其它单或双链免疫球蛋白的其它细胞毒素及其变体。本文所使用的术语“VB6-845”意指,包含与被修饰形式的bouganin,Bou 156(SEQ ID NO:13)相连的抗-Ep-CAM scFv抗体的Fab的细胞毒素。VB6-845的氨基酸序列和核酸相连示于附图3B(分别为SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:15)。
在另一种实施方式中,癌细胞结合配体识别在赘生性细胞上特异发现而在正常细胞上未发现的肿瘤相关抗原。在一种优选实施方式中,配体是与肿瘤相关抗原的抗体。抗肿瘤相关抗原抗体特异性识别来源于各种癌症的癌细胞但不识别正常的非癌性细胞。
因此在另一种实施方式中,本发明提供一种细胞毒素,它包含:(a)与非-被修饰Bouganin蛋白相比具有降低的激活T-细胞倾向的被修饰Bouganin蛋白;(b)附着于(a)的能够与癌细胞上的肿瘤相关抗原结合的配体(比如抗体或抗体片段)。
根据本发明的适宜的肿瘤相关抗原靶向被修饰Bouganin包括,不限于,VB6-011及其变体,选择性结合肿瘤相关抗原的其它单链或双链免疫球蛋白的其它细胞毒素或其变体。本文所使用的术语“VB6-011”意指,包含与被修饰形式的bouganin,Bou 156(SEQ ID NO:13)相连的H11人单克隆抗体的Fab的细胞毒素。H11抗体是通过将64岁男性癌症患者的外周血淋巴细胞与人骨髓瘤细胞系进行融合制成杂交瘤得到的。杂交瘤NBGM1/H11产生IgMk,将它再次工程化成Fab抗体形式形成VB6-011(详见US 6207153或WO 97/44461中H11抗体分泌杂交瘤的制备)。VB6-011的氨基酸序列和核酸序列示于附图15(分别为SEQ ID NO:28和SEQ ID NO:27)。
在一种特定的非限制性实施方式中,细胞毒素包含VB6-845(附图3B,SEQ ID No.16)或VB6-011(附图15,SEQ ID NO:28)。在其它的 非限制性实施方式中,细胞毒素包含VB6-845或VB6-011的变体。
VB6-845变体同样结合Ep-CAM表位或结合与VB6-845所结合表位基本类似的Ep-CAM表位,在生理条件下该变体能够竞争性抑制VB6-845与Ep-CAM结合的至少10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、或95%。VB6-845变体包含与VB6-845相同的被修饰Bouganin,或者可以包含与不同本发明被修饰Bouganin。在另一种非限制性实施方式中,细胞毒素包含含有MOC31可变区或其变体的Ep-CAM-结合部分。在又一种实施方式中,细胞毒素包含含有4D5MOCB[C2]或其部分的Ep-CAM-结合部分。在生理条件下通过与reference MOC31或4D5MOCB抗体竞争,这些细胞毒素中的任何一种与Ep-CAM的结合可以被减少至少10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、或95%。
VB6-011变体与VB6-011结合相同的肿瘤相关抗原表位或者结合与VB6-011所结合的基本类似的肿瘤相关抗原表位,生理条件下,该变体可以竞争性抑制VB6-011与肿瘤相关抗原的结合至少10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、或95%。VB6-011变体可包含与VB6-011相同的被修饰Bouganin,或可以包含不同的本发明被修饰Bouganin。在另一种非限制性实施方式中,细胞毒素包含含有H11单克隆抗体、H11抗原结合片段或其变体的肿瘤相关抗原结合部分。在生理条件下通过与reference H11抗体竞争可以使这些细胞毒素中的任一种与VB6-011的结合减少至少10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、或95%。
在一种优选实施方式中,根据标准实验技术测定的Ep-CAM-结合部分或肿瘤相关抗原结合部分的结合亲和力比VB6-845或VB6-011的结合亲和力低至少四个数量级,优选至少三个数量级,更优选低两个数量级。在一种非限制性实施方式中,在生理条件下,Ep-CAM-结合部分可以竞争性阻断已知抗-Ep-CAM抗体,例如但不限于 或MT201,与Ep-CAM的结合至少0.1%、1%、10%、15%、20%、25 %、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、或95%。在一种非限制性实施方式中,在生理条件下,肿瘤相关抗原结合部分可以竞争性阻断已知抗肿瘤相关抗原抗体,例如但不限于H11,与肿瘤相关抗原的结合至少0.1%、1%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、或95%。
本领域技术人员可以理解,可以鉴定决定特异性的残基。术语“特异性决定残基”,也称作“SDR”,指形成抗体的部分抗体决定簇的残基,尤其是CDR残基,不依赖于任何其它突变的用丙氨酸作的单一取代能够减少抗体对表位至少10倍、优选至少100倍、更优选至少1000倍的结合亲和力。亲和力的丧失强调了残基对于抗体结合表位的能力的重要性。参见例如,Tamura等人,2000,“Structural correlates of an anticarcinomaantibody:identification of specificity-determining residues(SDRs)anddevelopment of a minimally immunogenic antibody variant by retention ofSDRs only”,J.Immunol.164(3):1432-1441。
可以同时评价单个或多个突变对于结合活性的影响,尤其是对结合亲和力的影响,从而评估特定系列氨基酸对于结合互作的重要性(例如,轻链或重链CDR2对结合的贡献)。还可以对某个氨基酸突变的效果进行评估从而在单独评价时评价单个氨基酸的贡献。这样的评估可以通过,例如,通过体外饱和扫描(参见例如,美国专利NO.6 180 341;Hilton等人,1996,“Saturation mutagenesis of the WSXWS motif of theerythropoietin receptor”,J Biol Chem.271:4699-4708)和位点定向突变(参见例如,Cunningham和Wells,1989,“High-resolution表位mappingofhGH-receptor interactions by alanine-scanning mutagenesis,”Science244:1081-1085;Bass等人,1991,“A systematic mutational analysis ofhormone-binding determinants in the human growth hormone receptor,”ProcNatl Acad Sci.USA 88:4498-4502)来完成。在丙氨酸扫描突变技术中,在分子中的多个残基处导入单丙氨酸突变,测试所得分子的生物活性从而鉴定对于分子活性而言的关键氨基酸残基。
还可以通过对根据,例如,核磁共振、结晶、电子衍射、或光亲和 标记,确定的结构进行物理分析以及结合对推定的接触位点氨基酸进行突变(参见例如,de Vos等人,1992,“Human growth hormone和extracellular domain of its receptor:crystal structure of the complex”,Science 255:306-312;Smith等人,1992,“Human interleukin 4.Thesolution structure of a four-helix bundle protein”,J Mol Biol.224:899-904;Wlodaver等人,1992,“Crystal structure of human recombinant interleukin-4at 2.25 A resolution”,FEBS Lett.309:59-64)来鉴定配体-受体或其它生物互作的位点。此外,可以通过比较相关多肽或类似结合位点的氨基酸序列来评价特定单个氨基酸、或氨基酸序列的重要性。
此外,本领域技术人员将理解,亲和势(avidity)的提高可以补偿亲和力(affinity)的降低。细胞毒素对癌细胞受体的亲和势是对Ep-CAM-结合部分对Ep-CAM的结合强度的度量。Ep-CAM和Ep-CAM-结合部分间的功能性结合强度代表所有亲和键的总强度,因此单个成分可以以相对较低的亲和力结合,但是这样的成分的多聚体则可以证实有效的生物效果。实际上,Ep-CAM-结合位点和Ep-CAM表位的多重结合可以比附加的生物效果更具证明力,也即,多价的优势在于平衡常数可能是许多个数量级。
类似地,细胞毒素对癌细胞受体的亲和势是肿瘤相关抗原结合部分与肿瘤相关抗原结合强度的度量,该结合可能有多个结合位点。肿瘤相关抗原和肿瘤相关抗原结合部分的功能性结合强度代表所有亲和键的总强度,因此单个成分可以以低亲和力结合,但是这样的成分的多聚体可以证明有效的生物效果。实际上,肿瘤相关抗原结合位点与肿瘤相关抗原表位的多重互作比附加的生物活性更有说明力,也即,多价的优势在于平衡常数可能是许多个数量级。
在一种非限制性实施方式中,Ep-CAM-结合部分具有与4D5MocB基本类似的结构。这一基本类似的结构可以参照反映细胞毒素Ep-CAM-结合部分与Ep-CAM分子的结合点的表位图来进行特征描述。在另一种非限制性实施方式中,可以产生肿瘤相关抗原结合部分的表位图,这一基本类似的结构可以参照反映细胞毒素肿瘤相关抗原结合部分与肿瘤相关抗原分子的结合点的表位图来进行特征描述。
本发明的细胞毒素可以利用蛋白质化学中熟知的技术通过化学合成制备,比如固相合成(Merrifield,J.Am.Chem.Assoc.85:2149-2154(1964))或在同质液中的合成(Houbenweyl,Methods of OrganicChemistry,ed.E.Wansch,第15I和II卷,Thieme,Stuttgart(1987))。
在一种实施方式中,癌结合配体和被修饰Bouganin都是蛋白质,可以用本领域熟知的技术耦联。有上百种交联剂可以耦联这两种蛋白质。(参见例如“Chemistry of Protein Conjugation and Crosslinking”。1991,Shans Wong,CRC Press,Ann Arbor)。通常可以根据配体或毒素上可获得的或所插入的反应性官能团选择交联剂。此外,如果没有反应性基团,则可以使用可以光活化的交联剂。在特定情况中,最好在配体和毒素间包括一个间隔子。本领域已知的交联剂包括同双功能剂:戊二醛、二甲基adipimidate和Bis(di azobenzidine)和杂双功能剂:mMaleimidobenzoyl-N-Hydroxysuccinimide和Sulfo-m Maleimidobenzoyl-N-Hydroxysuccinimide。
还可以利用重组DNA技术制备配体-bouganin毒素融合蛋白。此时,将编码癌结合配体的DNA序列与编码被修饰Bouganin蛋白的DNA序列融合,从而产生嵌合DNA分子。将该嵌合DNA序列转染进能够表达配体-bouganin融合蛋白的宿主细胞。可以用本领域已知的技术从细胞培养物中回收和纯化融合蛋白。
可以用常规技术制备比如Ep-CAM和肿瘤相关抗原这样的对细胞表面蛋白有特异性的抗体。可以用在哺乳动物中引发抗体应答的肽免疫原性形式免疫哺乳动物,(例如小鼠、仓鼠或兔)。赋予肽免疫原性的技术包括与载体缀合或本领域熟知的其它技术。例如,肽可以在存在佐剂的情况下施用。可以通过探测血浆或血清中的抗体滴度来监控免疫过程。标准ELISA或其它免疫检测程序和作为抗原的免疫原来评估抗体水平。免疫后,可以获得抗血清,如果需要的话,可以从血清中分离多克隆抗体。
为产生单隆抗体,可以从被免疫的动物收获抗体产生细胞(淋巴细 胞),并通过标准体细胞融合法将其与骨髓瘤细胞融合,从而使得这些细胞不死并产生杂交瘤细胞。这样的技术是本领域已知的, (例如杂交瘤技术最初由Kohler和Milstein(Nature 256:495-497(1975)开发)以及比如人B-细胞杂交瘤技术(Kozbor等人,Immunol.Today 4:72(1983))、产生人单克隆抗体的EBV-杂交瘤技术(Cole等人,Monoclonal Antibodies in Cancer Therapy Allen R.,Bliss,Inc.,pages 77-96(1985))、和筛选组合抗体文库(Huse等人,Science 246:1275(1989))这样的其它技术。为产生与肽特异性反应的抗体,可以对杂交瘤细胞进行免疫化学筛选,并分离单克隆抗体。
本发明所使用的术语“抗体”意欲包括单克隆抗体和多克隆抗体、也能够与一种细胞表面成分特异性反应的抗体片段(例如Fab和F(ab')2,和单链抗体(scFv))、和嵌合抗体。可以利用常规技术将抗体片段化,以与上述相同的方式筛选可用的片段。例如,F(ab’)2片段可以通过用胃蛋白酶处理抗体来产生。所得F(ab’)2片段可以经过处理以减少二硫键从而产生Fab'片段。单链抗体在一个稳定折叠的多肽链上与抗体的抗原结合区结合。单链抗体可以通过重组技术产生。
嵌合抗体衍生物,即,与非人动物可变区和人恒定区结合的抗体分子也考虑在本发明范围内。嵌合抗体分子可包括,例如,来自小鼠、大鼠或其它物种的抗体的抗原结合结构域与人恒定区。可用常规方法制备包含识别细胞表面抗原的免疫球蛋白可变区的嵌合抗体(参见,例如,Morrison等人,Proc.Natl Acad.Sci.U.S.A.81:685 1(1985);Takeda等人,Nature 314:452(1985),Cabilly等人,美国专利4816567;Boss等人,美国专利4816397;Tanaguchi等人,欧洲专利171496;欧洲专利173,494,香港专利2177096B)。预期嵌合抗体在人中比对应的非嵌合抗体具有更低的免疫原性。可以通过Pluckthun等人,WO00/61635描述的方法来稳定嵌合抗体。
通过产生人恒定区嵌合体可以进一步使与细胞表面成分特异性反应的单克隆或嵌合抗体人源化,其中的可变区部分,尤其是抗原结合区的保守框区域,是人源的,并且只有超变区是非人源的。这样的免疫球蛋白分子可以通过本领域已知的方法(例如Teng等人,Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A.,80:7308-7312(1983);Kozbor等人,Immunology Today 4∶7279(1983);Olsson等人,Meth.Enzymol.,92:3-16(1982)和PCT公开文本WO92/06193或EP 239,400)制备。人源化抗体还可以通过商业化途径制备(Scotgen Limited,2 Holly Road,Twickenham,Middlesex,GreatBritain.)。此外,通过减少与细胞表面成分特异性反应的单克隆或嵌合抗体上潜在的T-细胞表位数量可以使其免疫原性降低。
与细胞表面成分特异性反应的特定抗体、或抗体片段或其部分还可以通过筛选编码免疫球蛋白基因表达文库来产生、并在带有细胞表面成分的细菌中表达。例如,完整Fab片段、VH区和Fv区可以用噬菌体表达文库在细菌中表达(参见例如Ward等人,Nature 341:544-546(1989);Huse等人,Science 246:1275-1281(1989);和McCafferty等人,Nature 348:552-554(1990))。作为选择,SCID-hu小鼠,例如由Genpharm开发的模型,可用于产生抗体及其片段。
在所有将被修饰Bouganin蛋白与抗体序列融合的情况中,最好使用其中能够结合II类MHC分子或刺激T细胞或与II类MHC分子共同结合T细胞的T细胞表位或序列已经被除去的抗体序列。
本发明的又一种实施方式,被修饰Bouganin蛋白可与一种非抗体蛋白但仍然能够导向与特定靶细胞的特异性结合的蛋白质连接。这样的蛋白质部分包括各种存在特定细胞表面受体的多肽配体,且由此包括许多细胞因子、肽和多肽激素和其它生物应答修饰物。主要例子包括比如血管内皮生长因子、表皮生长因子、heregulin、白介素、干扰素、肿瘤坏死因子和其它蛋白质和糖蛋白分子这样的蛋白质。这些分子以及其它分子与本发明bouganin的融合蛋白也可以考虑,它们可以在蛋白质配体结构域的N-末端或C-末端方向包含被修饰Bouganin部分。同样地,纯化配体与被修饰Bouganin蛋白的化学交联也可以考虑,并且落入本发明的范围。
在另一种实施方式中,本发明的被修饰Bouganin蛋白可用作包含比如羟基丙基甲基丙烯酰胺这样的水溶性聚合物或其它聚合物的复合物,其中被修饰Bouganin蛋白与聚合物共价结合或与聚合物以非共价结合互 作。这样的一种实施方式还可以包括与聚合物bouganin复合物结合的比如抗体或抗体片段这样的抗原结合结构域。
(C)细胞毒素的用途
本发明的被修饰Bouganin蛋白可用于特异性抑制或破坏感染癌症的哺乳动物细胞。允许RIP进入细胞并能有效杀死癌症细胞,这是具有较低免疫原性的本发明细胞毒素的优点。因此,该细胞毒素可用于特异性靶向癌细胞。一旦进入癌细胞,bouganin则会使主要核糖体RNA脱嘌呤,由此破坏核糖体并导致蛋白质合成停止和细胞死亡。
相应地,在一种实施方式中,本发明提供一种抑制或破坏癌症细胞的方法,包括向需要本发明细胞毒素的动物施用本发明的细胞毒素。本发明还包括本发明细胞毒素用于抑制或破坏癌细胞的用途。本发明还包括本发明的细胞毒素在制备抑制或破坏癌细胞的药物中的用途。该细胞毒素所抑制或破坏的癌细胞类型可以通过其抗体部分的抗原特异性来确定。
在另一种实施方式中,本发明提供一种抑制或破坏癌细胞的方法,包括制备本发明的细胞毒素并向细胞施用该细胞毒素的步骤。癌症可以是任何类型的癌症,包括但不限于结肠直肠癌、乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌、头颈癌、膀胱癌、肝癌、肾癌、黑素瘤、胃肠癌、前列腺癌、小细胞和非小细胞肺癌、肉瘤、神经胶质瘤、和T-和B-细胞淋巴瘤。
可以利用动物癌细胞系容易地在体外测试本发明细胞毒素选择性抑制或破坏癌细胞的能力。本发明细胞毒素的选择性抑制效果可以,例如,通过证实选择性抑制癌细胞的增殖来确定。
可根据细胞活力来测定毒性,例如可以比较暴露于细胞毒素的正常和癌性细胞培养物的活力。可以用已知技术来评估细胞活力,比如苔酚兰排斥检测法。
在另一个例子中,许多模型可用于测试细胞毒素的细胞毒性。Thompson,E.W等人(Breast Cancer Res.Treatment 31:357-370(1994))描述了一种通过测定肿瘤细胞介导的胞外基质酶解以及肿瘤 细胞入侵重构的基底膜(胶原蛋白、层粘连蛋白、纤连蛋白、Matrigel或明胶)来体外确定人乳腺癌细胞入侵的模型。其它的可应用的癌细胞模型包括培养的卵巢腺瘤细胞(Young,T.N.等人,Gyneco.L.Oncol.62:89-99(1996);Moore,D.H.等人,Gyneco.L.Oncol.65:78-82(1997))、人滤泡甲状腺癌细胞(Demeure,M.J.等人,World J.Surg.16:770-776(1992))、人黑素瘤(A-2058)和纤维肉瘤(HT-1080)细胞系(Mackay,A.R.等人Lab.Invest.70:781-783(1994))、和肺鳞片状(HS-24)和腺癌(SB-3)细胞系(Spiess,E.等人,J.Histochem.Cytochem.42:917-929(1994))。包括肿瘤移植和测定无胸腺节小鼠中的肿瘤生长和转移的体内测试系统(Thompson,E.W等人,Breast CancerRes.Treatment 31:357-370(1994);Shi,Y.E等人,Cancer Res.53:1409-1415(1993))也已得到描述。
本发明还涉及治疗癌症的方法,包括向有需要的动物施用有效量的一种或多种本发明细胞毒素。本发明包括本发明细胞毒素治疗癌症的用途。本发明还包括本发明细胞毒素在制备治疗癌症的药物中的用途。
术语“动物”包括动物界的所有成员,其中包括人在内。
术语“治疗癌症”指对癌细胞复制、癌症扩散(转移)、肿瘤生长的抑制,癌细胞数量和肿瘤生长的减少,癌症恶性级别的降低或癌症相关症状的改善。
在一种优选实施方式中,动物是人。在另一种实施方式中,癌症选自结肠直肠癌、乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌、头颈癌、膀胱癌、肝癌、肾癌、黑素瘤、胃肠癌、前列腺癌、小细胞和非小细胞肺癌、肉瘤、神经胶质瘤、和T-和B-细胞淋巴瘤。
用本发明细胞毒素治疗癌症的临床结果易于由本领域技术人员,例如医师,来确定。例如,用于测量癌症临床标记的标准临床实验可以是治疗效果的强指示剂。这样的实验可包括,不限于,物理检查、performance scales、疾病标记、12-lead ECG、tumor measurements、活组织切片检查、细胞检查、细胞学、计算肿瘤最大直径、放射线照相术、肿瘤数字成像、vital signs、重量、不利事件记录、感染期评定、附随药 物评定、疼痛评定、血液或血清化学、尿液分析、CT扫描、和药物动力学分析。此外,包括细胞毒素和另一癌症治疗剂的组合物疗法的协同效果可以通过与未接受治疗的患者的比较研究确定。
可以用本领域技术人员接受的标准评估恶性肿瘤的去除。参见例如,Therasse等人,2000,“New guidelines to evaluate the response totreatment in solid tumors,European Organization for Research and Treatmentof Cancer,National Cancer Institute of the United States,National CancerInstitute of Canada,”J Natl Cancer Inst.Feb 2;92(3):205-16。
特定细胞毒素构建体的有效剂量依赖于各种因素,包括癌症类型、肿瘤大小、癌症阶段、细胞毒素对患者的毒性、对癌细胞的靶特异性、以及患者的年龄、体重和健康。
可以根据细胞毒素在灌注物中的剂量和浓度,以i.v.灌注的方式以分钟至时间间隔施用包含被修饰Bouganin的细胞毒素。
在一种实施方式中,细胞毒素以3小时的时间间隔灌注。
在一种实施方式中,i.v.灌注施用细胞毒素的有效剂量范围是约1至100mg/kg/剂。在其它实施方式中,该剂量范围是约2至5mg/kg/剂。在特定实施方式中、该剂量可以是至少约2、4、8、13、20、28、40、50mg/kg/剂。
在一种实施方式中,约每周单次给药,施用约1、2、3、4、5或6周。单次给药可以在连续周施用,或者作为选择,可以跳过一或多周。这一循环之后,约1、2、4、6或12周后可以开始下一循环。治疗方案可包括1、2、3、4、5、6或更多循环,各循环间间隔约1、2、4、6或12周。
在另一种实施方式中,每月给药一次,给药约1、2、3、4、5或6连续月。该循环后,约1、2、4、6或12个月后可以开始下一循环。治疗方案包括1、2、3、4、5、6或更多循环,各循环间间隔约1、2、4、6或12个月。
在一定特定的非限制性实施方式,细胞毒素的有效剂量在约1和50 mg/kg/肿瘤/日之间,其中对患者每天给药一次。约每日单次给药(可选地跳过一或多天),给药约1、2、3、4、5、6或7连续日。该循环后,约1、2、3、4、5或6周后开始下一循环。治疗方案可包括1、2、3、4、5、6或更多循环,各循环间间隔约1、2、3、4、5或6周。
注射体积优选至少为有效量,它是对于肿瘤的类型和/或位置而言的适宜量。单次给药的最大体积介于约肿瘤体积的25%和75%之间,例如所估计的靶肿瘤体积的约四分之一、三分之一、或四分之三。在一种特定的非限制性实施方式中,单次给药的最大注射体积约为肿瘤体积的30%。
在另一种实施方式中,以每小时100cc的速率灌注包含1至10mg细胞毒素/mL的溶液三小时。细胞毒素可稀释于适宜的生理相容性溶液。
循环中与细胞毒素一起给药的另一种癌肿治疗剂的有效剂量也根据给药方式变化。一或多种癌症治疗剂可运送至肿瘤内,或者通过其它的方式给药。典型地,化疗剂是全身给药的。标准剂量和治疗方案是本领域已知的(参见例如,Merck Index和the Physician′s Desk Reference的最新版本;NCCN Practice Guidelines in Oncology))。
细胞毒素的组合疗法可以使癌症或肿瘤对施用其它癌症治疗剂变得敏感。相应地,本发明考虑用于预防、治疗和/或预防癌症复发的组合疗法,包括在施用剂量降低的癌症治疗机之前、之后、或同时施用有效量的细胞毒素。例如,用细胞毒素进行的初期治疗可以提高癌症或肿瘤对随后施用癌症化疗剂的敏感性。该剂量接近、或低于单独施用癌症治疗剂时、或不存在细胞毒素时使用的标准剂量的下限范围。同时施用时,细胞毒素可与癌症治疗剂分别施用,可选择地,通过不同的给药方式。
在另一种实施方式中,细胞毒素与至少一种其它免疫治疗剂组合施用。
在另一种实施方式中,细胞毒素与放射疗法方案组合施用。该疗法还可以包括外科手术和/或化疗。例如,细胞毒素可与放射疗法以及顺铂(Platinol)、氟尿嘧啶(5-FU,Adrucil)、卡铂(Paraplatin)、和/或紫杉醇(Taxol)组合施用。用细胞毒素治疗也可以使用较低的放射剂量和/ 或较不频繁的放射治疗,这可以例如减少阻碍吞咽功能并由此潜在地导致体重下降或脱水的严重咽喉疼痛的发病率。
在另一种实施方式中,细胞毒素与一或多种细胞因子组合给药,细胞因子包括,不限于,淋巴因子、肿瘤坏死因子、肿瘤坏死因子样细胞因子、淋巴毒素、干扰素、巨噬细胞炎症蛋白质、粒细胞单核细胞集落刺激因子、白介素(包括但不限于白介素-1、白介素-2、白介素-6、白介素-12、白介素-15、白介素-18)、及其变体,包括其药学可接受盐。
在又一种实施方式中,细胞毒素与癌症疫苗组合给药,癌症疫苗包括但不限于自体细胞或组织、非-自体细胞或组织、癌胚抗原、α-胎儿蛋白、人绒毛膜促性腺激素、BCG活疫苗、黑色素瘤细胞谱系蛋白、和突变的肿瘤肿瘤特异性抗原。
在又一种实施方式中,细胞毒素与激素疗法组合给药。激素治疗剂包括,不限于,激素显效剂、激素拮抗剂(例如,氟硝丁酰胺、三苯氧胺、leuprolide acetate(LUPRON))和类固醇(例如,地塞米松、类维生素A、倍他米松、氢化可的松、可的松、强的松、去氢睾酮、糖皮质激素、盐皮质激素、雌激素、睾丸激素、孕酮)。
在又一种实施方式中,细胞毒素与治疗或预防癌症的基因治疗方案组合施用。
在又一种实施方式中,Ep-CAM-靶向的细胞毒素与一或多种提高Ep-CAM在目的肿瘤细胞中表达的试剂组合给药。优选Ep-CAM表达得到提高以使得肿瘤细胞表面有更大数量的Ep-CAM分子表达。例如,该试剂可以抑制正常循环的Ep-CAM抗原内吞作用。这样的组合治疗可以改善Ep-CAM-靶向的细胞毒素的单独临床效果,或者与其它癌症治疗剂或放射疗法的临床效果。在特定的非限制性实施方式中,提高Ep-CAM在肿瘤细胞中的表达的试剂是vinorelbine tartrate(Navelbine)和/或paclitax(Taxol)。参见例如,Thurmond等人,2003,“Adenocarcinoma cellexposed in vitro to Navelbine或Taxol increase Ep-CAM expression through anovel mechanism.”Cancer Immunol Immunother.Jul;52(7):429-37。
由此组合疗法可以提高癌症或肿瘤对所施用的细胞毒素和/或其它癌 症治疗剂的敏感度。以这种方式,有可能只需要较短的治疗循环从而减少毒性事件。相应地,本发明提供一种治疗或预防的方法,包括向有需要的患者施用一个短治疗循环的有效量的细胞毒素和至少一种其它癌症治疗剂。循环持续时间可根据所使用的特定癌症治疗剂而变化。本发明还考虑持续或不持续给药,或者分成几个部分施用的日给药。本领域技术人员将理解特定癌症治疗剂的适宜循环持续时间,本发明考虑对各癌症治疗剂的最理想治疗时间进行持续评估。特定指导方针是本领域技术人员已知的。参见例如,Therasse等人,2000,“New guidelines toevaluate the response to treatment in solid tumors。European Organization forResearch和Treatment of Cancer,National Cancer Institute of the UnitedStates,National Cancer Institute of Canada,”J Natl Cancer Inst.Feb 2;92(3):205-16。
作为选择,有可能需要更长的治疗循环。相应地,循环持续时间可以在约10至56、12至48、14至28、16至24、或18至20天间变化。循环持续时间可以根据所使用的癌症治疗剂进行变化。
本发明考虑至少一个循环,优选多于一个循环,期间施用了一种癌症治疗剂或一系列治疗剂。本领域技术人员可以理解适当的循环总数和循环间隔。循环数可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21个循环。循环间隔可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21天。本发明考虑对各细胞毒素和其它癌症治疗剂的最佳治疗时程进行持续评估。
在另一种实施方式中,提供一种制备治疗患癌哺乳动物的药物的方法,包括步骤:鉴定具有减弱的激活T-细胞倾向的bouganin T-细胞表位;制备带有一个或多个T-细胞表位的本发明细胞毒素和将该蛋白质悬于药学可接受载体、稀释剂或赋形剂中。
本发明还提供包含本发明细胞毒素和药学可接受载体、稀释剂或赋形剂的治疗患癌哺乳动物的药物组合物。
本发明细胞毒素可配制成向受试者施用的适于体内给药的生物相容 形式的药物组合物。“适于体内给药的生物相容形式”意指治疗效果超过了任何毒性效果的给药物质形式。这些物质可施用给包括人和动物在内的活生物体。施用治疗活性量的本发明药物组合物其定义为,在为达到目的结果所需的剂量和持续时间下的有效量。例如,物质的治疗活性量可根据比如疾病状态、年龄、性别、个体体重、以及抗体在个体中引发目的应答的能力这样的因素变化。可以对剂量方案作出调整从而提供最理想的治疗应答。例如,可以每天分几次给药,或者根据治疗状况的紧急程度适当减少剂量。
活性物质可以通过比如注射(皮下、静脉内、肌内等)、口服给药、吸入、经皮给药(比如局部涂霜或膏等)、或栓剂这样的便利方式施用。根据给药途径,可将活性物质包被在物质中以保护该化合物免受酶、酸和其它会使该化合物失活的天然条件的作用。
本文作描述的组合物可以通过已知的制备可向受试者施用的药学可接受组合物的方法制备,由此将有效量的活性物质与药学可接受载体组合成混合物。适宜载体描述于,例如,Remington′s PharmaceuticalSciences(Remington′s Pharmaceutical Sciences,Mack PublishingCompany,Easton,Pa.,USA 1985)。基于此,该组合物包括,虽然不是专门限制,与一或多种药学可接受载体、稀释剂一起、包含在具有适宜pH和与生理液等渗的缓冲液中物质。
该药物组合物可用于治疗包括哺乳动物,优选人,在内的动物的癌症。预期这些组合物尤其适于治疗结肠直肠癌、乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌、头颈癌、膀胱癌、肺癌、肾癌、黑素瘤、胃肠癌、前列腺癌、小细胞和非小细胞肺癌、肉瘤、神经胶质瘤、和T-和B-细胞淋巴瘤。所施用的细胞毒素的剂量和类型依赖于易于在人受体中监控各种因素。这样的因素包括瘤形成的病理学和严重程度(级别和阶段)。
适合直接施用的药物组合物包括,不限于,冻干粉末或水性或非水性无菌注射液或悬液,其还可以进一步包含抗氧化剂、缓冲液、抑菌剂和使得该组合物与目的受体的血液基本等渗的溶质。可存在于这样的组合物中的其它成分包括,例如,水、乙醇、多元醇、丙三醇和植物油。 临时注射液和悬液可从无菌粉末、颗粒或片剂制得。细胞毒素可以,但不限于此,在向患者使用前与无菌水或盐溶液重配的冻干粉的形式应用。
本发明的药物组合物可包括药学可接受载体。适宜的药学可接受载体包括不干扰药物组合物的生物活性的有效性的基本为化学惰性的非毒性组合物。适宜的药学载体的例子包括,但不限于,水、盐溶液、丙三醇溶液、乙醇、N-(1(2,3-dioleyloxy)propyl)N,N,N-三甲基氯化铵(DOTMA)、diolesylphosphotidyl-乙醇胺(DOPE)、和脂质体。这样的组合物应当包含治疗有效率的化合物,以及适宜量的载体,从而得到向患者直接给药的形式。
在另一种实施方式中,药物组合物包含细胞毒素和一或多种附加的癌症治疗剂,可选地包含在药学可接受载体中。
组合物可以是药学可接受盐形式,包括,不限于,那些用比如源自盐酸、磷酸、醋酸、酢浆草的、酒石酸等的自由氨基形成的盐,那些用比如源自钠、钾、胺、钙、氢氧化铁、异丙胺、三乙胺、2-ethylarninoethanol、组氨酸、普鲁卡因等的自由羧基形成的盐。
本发明涉及被修饰Bouganin,包含这样的被修饰Bouganin蛋白或被修饰Bouganin蛋白的片段的组合物及相关组合物应视为落入本发明范围。这方面的一个相关例子是开发由肽介导的耐受诱导策略,其中以免疫治疗目的向患者施用一种或多种公开的肽。相应地,合成肽分子,例如包含上述表位区R1~R3中任一的全部或部分的多种合成肽中的一种。这样的肽视为本发明的实施方式。
本发明又一方面涉及用被修饰Bouganin组合物治疗人的方法。为向个体给药,任何一种被修饰组合物都应被制成优选至少80%纯且不含热原和其它污染物。
本发明还提供包含有效量细胞毒素的试剂盒,可选地,还包含一或多种其它癌症治疗剂,以及用其治疗癌症的说明书。
(D)T-细胞表位肽
本发明的另外一种实施方式是T-细胞表位肽。该实施例中,T-细胞表位肽在T-细胞检测中能够激发大于1.8的刺激指数,更优选2.0。本发明的T-细胞表位肽能够与II类MHC结合。
在本发明的一种实施方式中,该T-细胞表位肽包含R1、R2或R3(上述)任一序列的至少9个连续氨基酸残基。在另一种实施方式中,T-细胞表位肽序列与肽序列R1、R2或R3之中任一具有大于90%的氨基酸同一性;更优选T-细胞表位肽与肽序列R1、R2或R3之中任一具有大于80%的氨基酸同一性。
本文所使用的术语“肽”是一种包括两个及更多氨基酸的化合物。这些氨基酸通过肽键(如下文定义)相连。肽的生物合成中涉及20种不同的天然氨基酸,任何数量的这些氨基酸可以以任意顺序相连形成肽链或肽环。肽的生物合成中所涉及的天然存在的氨基酸均为L-构型。可用L-氨基酸、D-氨基酸、或具有两种不同构型的各种不同的氨基酸组合用常规方法制备合成肽。短肽,例如,具有少于十个氨基酸单位的短肽,通常称为“寡肽”。其它肽包含大量氨基酸残基,例如多达100个或更多,称为“多肽”。按照常规,“多肽”被视为包含三个或更多氨基酸的任何肽,而“寡肽”通常被视为“短”的特殊类型。因此,如本文所使用的,可以理解,所提到的任何“多肽”都包括寡肽。此外,所提到的任何“肽”都包括多肽、寡肽、和蛋白质。氨基酸的各种不同排列形成不同的多肽和蛋白质。可以形成的多肽的数量——以及由此可形成的不同蛋白质的数量——在实践中是无限的。
本发明的另一实施方式是本发明的T-细胞表位肽制备本发明的被修饰Bouganin蛋白和被修饰T-细胞表位肽的用途。
本发明的又一实施方式是被修饰T-细胞表位肽,其经过修饰从而使得被修饰T-细胞表位肽与非-被修饰T-细胞表位肽相比具有减弱的激活人T细胞的倾向。在一个实施例中,本发明的改良T-细胞表位肽包含使得该表位肽在T-细胞检测中进行测试时能够激发与非-改良的T-细胞表位肽相比更低的刺激指数的修饰。
在一种实施方式中本发明的改良T-细胞表位肽具有以下序列:
AKX1DKX2LX3LGVX4KL
其中X1、X2、X3、和X4中的至少一种从非-被修饰序列修饰而来,如下:
X1是T或A或Q;
X2是G或A;
X3是Q或G;和
X4是N或D或T或A或R或Q或E或G或H或K或S(SEQ IDNO:8)。
在另一种实施方式中本发明的改良T-细胞表位肽具有以下序列:
LGVX4KLEFSIEAIHG
其中X4是N或D或T或A或R或Q或E或G或H或K或S(SEQID NO:9)。
在另一种实施方式中本发明的改良T-细胞表位肽具有以下序列:
NGQEX5AKFFLIVIQM
其中X5是Q或A(SEQ ID NO:10)。
本发明还提供编码本发明的T-细胞表位肽或改良T-细胞表位肽的核酸序列。
提供以下附图、序列表和实施例以帮助理解本发明。可以理解,可以对所给出的方法作出修改而不背离本发明的精神。
以下的非限制性实施例是本发明的例证:
实施例1:用naive人T-细胞增殖实验对bouganin中的表位作图的方法
根据Den Hartog等人[ibid]所述合成覆盖成熟Bouganin蛋白序列的肽。各肽的长度为15个氨基酸,且相继肽重叠12个残基。这些肽的序列和它们的编号示于表1。
将这些肽与来自naive供体(也即没有已知的bouganin致敏)的PBMC(外周血单核细胞)用于T-细胞增殖实验。收集了20份供体PBMC以获得最理想的II类MHC同种异型覆盖率。同种异型覆盖率超过85%。HLA-DR同种异型示于表2中。
在根据3H-胸腺嘧啶(3H-Thy)掺入测定增殖前,在三份培养物中用各单个肽刺激PBMC 7天。所有的肽均测试两个不同的浓度(1μM和5μM)。刺激指数(S.I.)根据3H掺入量除以假刺激对照细胞中的3H掺入量来计算。
保存时间不超过12小时的人血液暗黄层获自National Blood Service(Addenbrooks医院,剑桥,英国)。Ficoll-paque获自AmershamPharmacia Biotech(Amersham,英国)。用于培养初级人淋巴细胞的包含L-谷氨酸、50μg/ml链霉素、10μg/ml庆大霉素和0.1%人血清白蛋白的无血清AIM V培养基Gibco-BRL(Paisley,英国)。合成肽获自Eurosequence(Groningen,The Netherlands荷兰)和Babraham Technix(剑桥,英国)。
通过对暗黄层进行温和离心从血浆和血小板中分离得到红血球和白细胞。除去并丢弃最上相(包含血浆和血小板)。在将红血球和白细胞铺至15ml ficoll-paque(Amersham Pharmacia,Amersham UK)上之前,将其在磷酸缓冲盐(PBS)中以1∶1稀释。根据厂商推荐的条件进行离心,从血清+PBS/ficoll paque表面收获PBMC。将PBMC与PBS混合(1∶1)并离心收集。除去并丢弃上清液,将PBMC块重悬于50ml PBS中。再次将细胞离心成块,丢弃PBS上清液。用50ml AIM V培养基重悬细胞,此时进行计数并用苔酚兰染料排斥法评估活力。再次离心收集细胞并丢弃上清。重悬细胞,以3×107每毫升低温保存。保存培养基为90%(v/v)热失活AB人血清(Sigma,Poole,英国)和10%(v/v)DMSO(Sigma,Poole,英国)。将细胞转移至受调控的冷冻容器(Sigma),并置于-70℃过夜。需要使用时,在将细胞转移至10ml预热的AIM V培养基中之前,在37℃水浴中使细胞快速解冻。
用蛋白质和肽抗原在96孔平底板板中刺激密度为2×105每孔的 PBMC。用3H-Thy(Amersham-Pharmacia,Amersham,英国)脉冲之前,将PBMC在37℃下培养7天。各供体实验中,使用了两个事先已经显示免疫原性的命名为C-32和C-49的对照肽以及一个潜在的全蛋白非-回忆抗原匙孔戚血蓝蛋白(KLH)。C-32=来自血球凝集素残基307-319的序列PKYVKQNTLKLAT(SEQ ID NO:127)。C-49=来自衣原体HSP60的序列KVVDQIKKISKPVQH(SEQ ID NO:128)。
将肽溶于DMSO至终浓度10mM,之后将这些贮存液在AIM V培养基中稀释500倍(终浓度20μM)。将肽加入到平底96孔板中,至终浓度为1和5μM,体积100μl。用苔酚兰染色排斥法评估熔融PBMC的活力,之后将细胞重悬至密度2×106细胞/ml,并将100μl(2×105PBMC/孔)转移至含有肽的各孔中。各肽浓度均测定了三孔培养物。37℃下,将板在含5%CO2的湿润环境下培养7天。将细胞收获至滤膜片上之前,以1μCi 3H-Thy/孔对其脉冲18-21小时。用Wallac microplate beta topplate counter(Perkin Elmer)测定CPM值。以刺激指数表示结果,刺激指数得自将对测试肽测定的增殖分数(例如每分钟放射活性计数)除以对未接触测试肽的细胞测定的分数。
对上述实验结果的分析揭示存在四种T细胞表位,它们对应于蛋白质的成熟加工区域中的肽41、44和50和未加工形式中的肽88。由于肽88不是成熟肽的一部分,因此在本发明的方案中将其忽略。
对于肽41(命名为表位区域R1),对应于该肽的供体有四个;供体4、5、10和11。它们在5μM的S.I.分别为3.6、4.9、2.1和2.0。
对于肽44(命名为表位区域R2),对应于该肽的供体有两个;供体4(S.I.=3.5)和11(S.I.=2.3)。相邻的肽43和45由于与肽44有12个氨基酸的重叠,因此诱导出较低水平的T细胞增殖。
对于肽50,对应于该肽的供体有两个;供体4(S.I.=2.9)和14(S.I.=2.0)。肽51在供体14中诱导出较低水平的T细胞增殖(S.I.>1.9)。
所有PBMC样品的组织类型均用可商业获得的试剂系统进行测定(Dynal,Wirral,英国)。根据供应商推荐的程序、标准辅助试剂和琼 脂糖电泳系统完成测定。各对应供体样品的同种异型特异性示于表2。
实施例2:从Bougainvillea spectabilis克隆bouganin
用‘SV总RNA分离系统和供应商(Promega,南安普敦,英国)提供的程序从Bougainvillea spectabilis叶中分离总RNA。在液氮下将新鲜叶组织研磨成细粉,并取约50mg研磨组织用于RNA分离。通过在1%琼脂糖凝胶中可视化检查RNA质量和数量,并利用“Access RT-PCR System”(Promega)和特异引物OL1032和OL1033从总RNA中扩增bouganin基因,各反应使用约1μg RNA。引物序列示于下表3。该反应产生了一个1242bp片段,包括天然引导序列和全长bouganin序列。按照试剂盒说明将该片段克隆进pGEM-T Easy载体(Promega),并将其命名为pBou1。通过DNA测序验证序列。
以pBou1质粒为模板,将bouganin基因经PCR转化进pET21a(Novagen,诺丁汉,UK)。将pelB(pectate lyase果胶酶?)引导序列添加到5′末端,并将编码6×组氨酸标签的序列添加到bouganin编码序列3′末端。pelB引导序列是用引物OL1322(掺入了一个Nde1位点)和引物OL1067从载体pPMI-his扩增来的[Molloy,P.等人,(1995)J.Applied Bacteriology,78:359-365]。bouganin-his片段是用OL1068和OL1323(掺入了一个Not1位点)从pBou1扩增而来的。用重叠PCR将pelB引导序列融合进bouganin-his片段框,并将所得片段扩增进pGEM-TEasy(Promega)。经序列验证后,将pelB-bouganin-his片段作为Nde1-Not1片段克隆进经Nde1-Not1消化的pET21a。将该克隆命名为pBou32。
实施例3:构建突变bouganin蛋白
利用由T-细胞表位作图方法提供的数据和利用能够模拟肽与人类II类MHC结合沟间的结合的软件,设计了许多种被修饰(突变)bouganin蛋白。后一种方法在其它地方有详细描述[WO 02/069232]。构建了变体基因,并测试了突变蛋白的功能活性。通常,首先构建和测试各仅包含一 个氨基酸取代的“单突变”蛋白,之后将有活性的被修饰蛋白的基因进行组合来制备多重取代被修饰蛋白。
通过重叠PCR方法构建了突变基因,该方法利用“重叠引物”中的突变将突变氨基酸密码子引入基因。这一流程是本领域熟知的,在其它地方有详细描述[Higuchi,等人(1900)Nucl.Acids Res.16:7351]。共构建和测试了37个保留功能活性的单突变被修饰蛋白。此外,在所有实验中还构建和测试了一个包含Y70A取代的阴性对照被修饰蛋白。实际上,在这37个“单突变”被修饰蛋白中有一个包含了两个相邻取代(E151T和I152E),它在本文中也计为单突变。所测试的取代及相应的活性值示于表4。
共构建和测试了11个保留活性的多重取代被修饰蛋白。所测试的突变和对应活性值示于表5。
表6描述取代被修饰蛋白的序列。表7列出一些特定序列。
在所有实施例中,均按照以下实施例4和5中给出的程序进行蛋白质纯化和测试。
实施例4:Bouganin蛋白的表达和纯化
按照生产商的说明,将质粒pBou32转化进BL21(DE3)(Novagen)竞争细胞,并在包含50μg/ml羧苄青霉素的LB(Invitrogen,Paisley,英国)板上进行选择。用从该转化得到的一个新鲜克隆接种5ml 2×YT(Invitrogen)液体培养基,不含抗生素,37℃下以250rpm振荡培养至OD600=1.5-2.0。之后于室温下以2500rpm离心培养物15分钟,并将细胞重悬于5ml加有1mM IPTG的新鲜2×YT中。将该培养物在30℃下以300rpm振荡培养1.5小时,离心收集细胞,弃上清。
将细胞团重悬于1ml PEB2(50mM Tris-HCl pH8,20%蔗糖,1mg/ml溶菌酶,1×Complete Protease Inhibitor Tablet(Roche,Lewes,英国))中,在冰上温和搅拌培养1小时。4℃下14000rpm离心细胞碎片,弃去离心块。所得上清即为“周质级分”。用商业可获得的“spincolumn”,按照生产商(Qiagen,Crawley,英国)的说明通过镍亲和柱层 析从周质级分中分离Bouganin蛋白。4℃下用10000分子量的cut-off‘Slide-A-Lyzer’(Pierce,Chester,英国)将所得物质对4升磷酸缓冲盐溶液(0.138M NaCl,0.0027M KCl,pH 7.4)透析过夜。透析后,用Micro BCA检测试剂盒(Pierce)估计蛋白质浓度,并将样品保存于-20℃。
用基于ELISA的检测系统进一步确定Bouganin蛋白浓度。简言之,通过用表达bouganin的质粒对两只大鼠进行遗传免疫,产生抗bouganin的抗血清(Genovac,Freiburg,德国)。为进行ELISA,将重组bouganin通过其His-tag捕获至Ni-琼脂糖包被板上,之后用大鼠抗血清和二级HRP-偶联的抗-大鼠Fc抗体(Sigma,Poole,英国)进行检测。作为标准,在各次测定中使用了大量制备的在大肠杆菌中表达并用总蛋白检测法定量的野生型bouganin。
实施例5:bouganin活性测定
通过测定野生型和被修饰(突变)bouganin蛋白在无细胞蛋白质合成测定中合成蛋白质的能力测试了它们的活性。
将终体积为12.5μl的10μl TNT转录/翻译联合混合物(Promega)、20μM甲硫氨酸、120ng pT7荧光素酶DNA(Promega)以及WT和突变Bouganin蛋白系列稀释液的混合物于30℃培养一小时,之后通过加入100μl“SteadyGlow”荧光素酶检测试剂使反应终止(Promega)。用Wallac发光计测定荧光素酶活性。有活性的Bouganin蛋白检测为所测荧光素酶活性降低。各被修饰Bouganin蛋白测试至少5个浓度,各数据点设一重复。各实验中包括阳性和阴性对照。
单突变蛋白质的结果示于表4。多重突变被修饰Bouganin蛋白的结果示于表5。在各情况中,结果表达为相对于野生型蛋白活性。所有的测定都包括一个带有Y70A取代的失活突变Bouganin蛋白。
此外,也可以将荧光素酶测定结果作图,显示相对于对照的%荧光素酶活性与所添加的bouganin的蛋白质浓度。这样的图的例子示于附图1,它描绘了对两个不同的多重突变bouganin蛋白测定的结果。
实施例6:测定变体bouganin序列的T-细胞表位缺失。
选择命名为Bou156的多重修饰蛋白通过免疫原性测定作进一步测试。该变体包含取代V123A、D127A、Y133N和I152A。免疫原性测试包括使用可以被采用全Bouganin蛋白所作的测试破坏的活细胞,因此利用包含变体Bou156中所掺入的取代的合成肽来完成这些测定。所测试的肽列于表8。根据实施例1(上述)中所描述的程序利用20位个体的PBMC供体池完成这些测定。这些肽以两个不同的肽终浓度(1μM和5μM)对各供体样品重复三次。
结果表示为SI每肽每供体样品,且示于附图2。DeI-41是肽序列AKADRKALELGVNKL(SEQ ID NO:29)。Del-44是肽序列LGVNKLEFSIEAIHG(SEQ ID NO:30)。DeI-50是肽序列NGQEAAKFFLIVIQM(SEQ ID NO:31)。所有被修饰的肽在任一供体中都未诱导出T细胞应答(S.I.<2)。相反,免疫原性对照肽刺激了6位供体的T细胞(S.I.>2)。
实施例7:VB6-845:用于最理想地运送脱免疫bouganin(De-bouganin)的Ep-CAM-特异性Fab抗体的重组工程。
对本实施例和实施例8,所使用的脱免疫bouganin是Bou156。
肿瘤靶向细胞毒素由与细菌、真菌或植物毒素相连的抗体可变区组成。本研究对本发明的脱免疫bouganin构建体作举例说明,包括连接于靶部分的的脱免疫bouganin具有降低的免疫原性,而同时仍然保持它们的生物活性。表12证明了Ep-CAM抗体与几种类型的肿瘤的结合,且由此显示它能够用于治疗这些类型的癌症。
脱免疫Bouganin构建体:与de-bouganin相连的Ep-CAM指向的靶部分
将VB5-845,抗-Ep-CAM scFv抗体的Fab version,遗传连接于bouganin的脱免疫形式(de-bouganin),Bou 156,一种有效的、植物来 源的、I型核糖体失活蛋白(RIP),形成抗体-毒素构建体VB6-845。附图3图示了构建体VB6-845。附图3A图示pro-VB6-845带pelB引导序列的双顺反单元。附图3B提供氨基酸序列(SEQ ID NO:16)和核酸编码序列(SEQ ID NO:15)。附图3C图示组装VB6-845蛋白,以下将对其进行详细描述。对该构建体的测试说明,该构建体保留了其生物活性(细胞毒性)和靶部分的特异性(Ep-CAM抗体)。
脱免疫bouganin构建体的0rientation取向
为确定最理想的抗体-de-bouganin取向,产生、表达了几种形式的双顺反子表达单元,并测试了它们的效力。
在各种情况中,将双顺反子单元克隆进pING3302载体(附图4)使其处于树胶醛糖-可诱导的araBAD启动子的控制下,并将其转化进E104大肠杆菌。诱导时,pelB引导序列的存在指导Fab-de-bouganin融合蛋白分泌进培养物上清液。可切割接头使de-bouganin能够从靶部分切割下来,并发挥其生物活性。在一种实施方式中,该接头是成对碱性氨基酸蛋白酶接头,尽管本领域技术人员能够理解其它的可切割接头也可能是适宜的。优选接头可以根据靶特异性、和环境进行选择。构建体样品的制备和测试按照如下进行:
附图3:VB6-845,其中de-bouganin(Bou156)通过成对碱性氨基酸蛋白酶接头与CH结构域的C-末端相连。附图3A显示原序列的双顺反子单元,附图3B显示原序列的核酸编码序列(SEQ ID NO:15)和氨基酸序列(SEQ ID NO:16)以及附图3C显示不含pelB序列的组装VB6-845蛋白。
附图5显示不含植物毒素的对照Fab抗-Ep-CAM构建体,de-bouganin(VB5-845)。附图5A显示原序列的双顺范子单元,附图5B显示原序列的核酸编码序列(SEQ ID NO:17)和氨基酸序列(SEQ IDNO:18),以及附图5C显示所组装的不含pelB序列的VB5-845蛋白。
附图6显示Fab抗-Ep-CAM de-bouganin构建体,VB6-845-CL-de-bouganin,其中Bou156连接于CL结构域的C-末端。附图6A显示原序 列的双顺范子单元,附图6B显示原序列的核酸编码序列(SEQ IDNO:19)和氨基酸序列(SEQ ID NO:20),以及附图6C显示不含pelB序列的组装VB6-845-CL-de-Bouganin蛋白。
附图7显示Fab抗Ep-CAM,de-bouganin构建体,VB6-845-NVH-de-bouganin,其中Bou156连接于VH结构域的N-末端。附图7A显示编码原序列的双顺范子单元,附图7B显示原序列的核酸编码序列(SEQ IDNO:21)和氨基酸序列(SEQ ID NO:22),以及附图7C显示不含pelB序列的组装VB6-845-NVH-de-Bouganin蛋白。
附图8显示Fab抗-Ep-CAM de-bouganin构建体,VB6-845-NVL-de-bouganin,其中Bou156连接于VL结构域的N-末端。附图8A显示编码原序列的双顺范子单元,附图8B显示原序列的核酸编码序列(SEQ IDNO:23)和氨基酸序列(SEQ ID NO:24),以及附图8C显示不含pelB序列的组装VB6-845-NVL-de-Bouganin蛋白。
在一种实施方式中,de-bouganin分子与重链或轻链C-末端相连。最理想的构型包括与VH-CH结构域相邻的pelB引导序列和N-末端组氨酸亲和标签作为第一个单元。紧接着的是包括通过一个蛋白酶敏感接头与de-bouganin相连的pelB-VL-CL结构域的第二单元。(附图6)对于其中de-bouganin重定位于N-末端的构建体,蛋白质印迹分析显示没有可探测的产物,只有C-末端连接的de-bouganin(附图3和6的构建体)产生了一个完整的与Ep-CAM-阳性细胞系具有良好结合特性的可溶蛋白(附图9),正如通过流式细胞术检测的反应性实验中所显示的。在蛋白质印迹分析中,附图9显示在实验室水平VB6-845和VB6-845CL-de-bouganin在所诱导的E104细胞上清液中的表达。在非诱导条件下,将16微升的上清液等分量载样到SDS-PAGE丙烯酰胺凝胶中,并利用兔多克隆抗-4D5抗体及之后的山羊抗-兔(1/2000)、或利用山羊抗-人κ-轻链-HRP抗体(1/1000)作蛋白质印迹分析,来验证重组蛋白质的同一性和大小。箭头指示全长VB6-845(的构建体附图3)和VB6-845-CL-de-bouganin(的构建体附图6)。对非-诱导的E104培养物上清液的蛋白质印迹显示无对应条带,这证明了抗体的特异性(未显示)。
VB6-845(附图3)和VB6-845-CL-de-bouganin(附图6)与对照(Ep-CAM-阴性细胞系,A-375)相比对Ep-CAM阳性细胞系CAL 27和NIH:OVCAR-3的反应性实验结果示于附图10A。这些结果与用另一抗-Ep-CAM构建体,VB6-845-白树毒蛋白,所作的相同反应性实验相当,在该构建体中用另一植物毒素白树毒蛋白取代了de-bouganin(参见显示其氨基酸序列(SEQ ID NO:26)和核酸序列(SEQ ID NO:25)的附图14C)。用白树毒蛋白构建体作的反应性实验结果示于附图10B。在具有最理想取向的分子中加入第二个de-bouganin结构域未产生产物。
在冰上将构建体或对照与0.45×106细胞培养一小时完成流式细胞术实验。洗涤后,用兔抗-bouganin(附图10A)或小鼠抗-His标签(附图10B)在冰上对结合有构建体的细胞表面进行检测。洗涤细胞,并将之与FITC-缀合的绵羊抗-兔IgG(附图10A)和FITC-缀合的绵羊抗-小鼠(IgG)(附图10B)在冰上培养30分钟。之后洗涤细胞,将之重悬于包含碘化丙啶的PBS 5%FCS中用于通过流式细胞术进行抗体结合评估。VB6-845和VB6-845-CL-de-bouganin与A-375培养之后未探测到荧光中值的改变。相反,用Ep-CAM阳性细胞系,CAL 27和NIH:OVCAR-3观察到了荧光中值的显著变化(附图10A)。如上述,VB6-845的结果与白树毒蛋白构建体的结果相似(附图10B)。
Ep-CAM特异性
VB6-845(的构建体附图3)与ProxiniumTM,ProxiniumTM是VB6-845的一种scFv形式,但其包含假单胞杆菌外毒素A,的竞争性实验证明当VB6-845被工程化为Fab形式中时其Ep-CAM特异性未发生改变(附图11)。
附图11图示了竞争性实验的流式细胞术结果,1和10μg/mL的VB6-845和浓度逐渐升高(浓度范围未0至100μg/mL)的ProxiniumTM与NIH:OVCAR-3细胞(Ep-CAM阳性肿瘤细胞系)共培养。4℃下培养一小时后,洗涤细胞,用生物素化兔抗-bouganin及随后用链霉抗生物素蛋白检测结合的VB6-845。用作为阴性对照的4B5-PE做了相同的实验。 反应条件示于附图11。
效力(生物活性)
此外,无细胞(附图12)和MTS(附图13A和B)测定证明,当de-bouganin与Fab片段耦联后仍保持其效力。用本领域已知的标准技术来完成用于测定效力的MTS测定法,其更详细地描述于以下实施例8。用Ep-CAM-阳性细胞系,CAL 27和NIH:OVCAR-3,VB6-845的IC50分别是3至4nM和2至3nM。对于VB6-845-CL-de-bouganin,测定了其对于1至2nM的CAL 27的效力以及对于NIH:OVCAR-3的效力。其中包括与脱免疫bouganin连接的人肿瘤靶抗体片段的Fab抗-Ep-CAM构建体的开发,应当允许该药重复系统的施用,且由此能够产生较大的临床益处。
构建体的收获
可以用本领域已知的技术从细胞培养物中分离构建体。例如,如果His标签位于肽构建体的N-末端,可以用Ni2+-螯合捕获法纯化Fab-Bouganin蛋白。例如可以采用以下方案。
用TB培养基在15L CHEMAP发酵器中完成对VB6-845变体的补料分批发酵培养。OD600为20时(mid-log),用饲料和包含50%丙三醇和200g/l L-树胶醛糖的诱导剂对培养物进行诱导。诱导后30小时,收集培养物,8000rpm离心30分钟min,以及用CM琼脂糖凝胶和Metal-Charged螯合琼脂糖凝胶柱、以及之后用大小排阻柱纯化VB6-845变体。简言之,浓缩上清液,并相对于20mM磷酸钠pH 6.9±0.1进行渗滤。之后将渗滤浓缩上清液加入到用20mM磷酸钠平衡的CM琼脂糖凝胶柱上,25mM NaCl pH 6.9±0.1。用20mM磷酸钠,25mM NaCl pH 6.9±0.1,洗涤柱,之后用20mM磷酸钠,150mM NaCl pH 7.5±0.1将结合的VB6-845洗脱。调节CM琼脂糖凝胶洗脱物使其包含终浓度为0.25%的Triton-X100,并将该洗脱物用于带电螯合琼脂糖凝胶柱。之后从20mM磷酸钠、150mM NaCl、0.25%triton-X100pH 7.5±0.1,之后用20mM 磷酸钠、150mM NaCl pH 7.5±0.1,接着用20mM磷酸钠、150mMNaCl、10mM咪唑pH 7.5±0.1依次用3个不同浓度的洗涤缓冲液洗涤螯合琼脂糖凝胶柱。之后用20mM磷酸钠、150mM NaCl、250mM咪唑pH 7.5±0.1将VB6-845洗脱,并在2mL级分中对其进行收集。为使纯度>80%,测定了各级分在A280的吸收,并将各级分以及所收集的物质应用于大小排阻柱S200上。在一种实施方式中,为提高蛋白质纯度和除去内毒素,将所收集的SEC级分用20mM NaPO4,pH 7.5稀释五倍,并以约5ml/min的速率通过用20mM NaPO4,25mM NaCl pH 7.5平衡的Q-琼脂糖凝胶15ml快流柱。样品过柱后,用10CV平衡缓冲液洗涤柱,将洗液与最初Q-琼脂糖凝胶流经液混合收集。用30kDa MWCO膜(Sartorius hydrosart membrane)将流出物浓缩十倍使终浓度达到7.5mg/ml。之后加入终浓度为0.1%Tween-80。终产物过滤灭菌,保存于-80℃。与抗-4D5抗体免疫杂交后用蛋白质印迹法分析该方法中各步骤所使用的样品。胶质兰染色验证纯度。蛋白质印迹分析和ELISA测定VB6-845变体的表达水平。
实施例8:与脱免疫Bouganin(de-bouganin)遗传连接的重组Ep-CAM-特异性Fab抗体,VB6-845的功能和生物学特征。
化疗剂是高细胞毒性试剂,其常常代表许多固体肿瘤癌症治疗中的care标准。这些药物的细胞毒性作用迅速靶向分裂细胞,无论是正常的还是肿瘤细胞,因此引发各种临床副作用。VB6-845是一种连接于植物来源毒素的bouganin的脱免疫形式的Fab抗体。不同于缺少精确肿瘤靶特异性的化疗剂,VB6-845只将其细胞毒性效应限制于Ep-CAM-阳性肿瘤靶。本研究中,测定了流式细胞分析和细胞毒性以评估VB6-845的效力和选择性。
流式细胞术
本研究中所使用的肿瘤细胞系购自ATCC,并按照ATCC的推荐进行增殖,除了分别在补加有10%FCS的RPMI 1640或DMEM中生长的细 胞系C-4I和TOV-112D。铺满率达到60-70%、活力超过90%时收集肿瘤细胞。人正常乳腺上皮细胞(HMEC)购自CAMBREX,并根据CAMBREX提供的程序在特定培养基中维持。铺满率达到70%、活力超过90%时收集细胞。
在流式细胞仪上测试来自子宫内膜卵巢和宫颈癌迹象的妇科细胞系与VB6-845的结合(表9)。向各细胞系(3×105细胞)中加入10微克/mL VB6-845,并于4℃培养2小时。A-375和CAL 27分别用作阴性和阳性细胞系对照。洗掉未结合物质后,加入在含10%FCS的PBS中稀释了800倍的小鼠单克隆抗-组氨酸抗体(Amersham Pharmacia,Cat#27471001),在4℃继续培养1小时。之后加入在PBS-10%FCS中稀释了100倍的FITC-标记的抗-小鼠IgG(The Binding Site,Cat#AF271),培养30分钟。最后,经碘化丙啶染色除去死细胞后,在FACS Calibur上分析细胞。
细胞毒性
流式细胞研究中列出的VB6-845在细胞中的杀伤水平示于表10,表明该构建体保留了其对抗Ep-CAM-阳性细胞系的de-bouganin细胞毒性活性。该细胞毒性与另一包含一个不同的植物来源的毒素,白树毒蛋白的Fab VB6-845变体的活性相当(附图14)。附图14A比较了白树毒蛋白,Fab抗-Ep-CAM-白树毒蛋白构建体(VB6-845-白树毒蛋白)和Fab抗-Ep-CAM-de-bouganin(Bou156)构建体(VB6-845)在CAL 27(附图14A)和NIH:OVCAR-3细胞(附图14B)中的毒性。VB6-845-白树毒蛋白构建体的核酸和氨基酸序列示于附图14C。
为研究VB6-845的特异性和选择性(附图3的构建体),测试了VB6-845(90%纯度)以及17种化疗药物(LKB Laboratories Inc.)对Ep-CAM-阳性(NIH:OVCAR-3)和Ep-CAM-阴性(HMEC,DAUDI,A-375)细胞系的细胞毒性(表11)。
用本领域已知的标准技术完成MTS检测。具体是,每孔接种50微升细胞(2×104细胞/ml),37℃下将板在5%CO2中培养2小时。之后向培养基 中加入50微升浓度逐渐升高的spiked drug(也即construct to be tested或control)。分别以含或不含细胞的培养基作为阳性和阴性对照。将板在37℃、5%CO2下保留5天。第5天时,通过加入20微升MTS试剂(Promega,Cat#G5430)来评估对细胞增殖的抑制。将板继续在37℃、5%CO2中培养2小时,用plate reader spectrophotometer读取490nm处的OD值。将对各浓度得到的样品值中减掉背景值,结果以活细胞的百分数表示。计算各药物对细胞系的IC50。
当用一组标准化疗剂,测定对NIH:OVCAR-3(一种Ep-CAM-阳性卵巢肉瘤)的细胞毒性时,VB6-845比这被测试的17种中的12中更有效(表11)。尽管有五种化疗剂更具细胞毒性,但由于它们缺少任何细胞特异性杀伤因而显示出更强的毒性。在所推荐的五种用于治疗卵巢癌的化疗剂(紫杉醇、卡铂、顺铂、阿霉素和拓扑替康)中,只有两种(紫杉醇和拓扑替康)更具细胞毒性。尽管VB6-845在1至2nM证实了更有效的溶细胞活性,这一有效杀伤仅限于对Ep-CAM-阳性肿瘤细胞系NIH:OVCAR-3。尽管VB6-845对Ep-CAM-阴性细胞系表现了一些杀伤,但其细胞毒性效应至少低220倍和至多低大于1000倍。VB6-845因此代表了替代与其它较低毒性的profile组合使用的化疗剂的一种有效的抗体导向治疗剂,在对许多不同类型的固体肿瘤的治疗中极具前景。
实施例9:VB6-011:用于最理想地运送脱免疫bouganin(De-bouganin)的肿瘤相关抗原特异性Fab抗体的重组工程。
肿瘤靶向细胞毒素由连接于细菌、真菌或植物毒素的可变区构成。本研究说明,本发明的脱免疫bouganin构建体,包括与靶部分相连的脱免疫bouganin,具有降低的免疫原性,而同时仍然保持其生物活性。表13证明了肿瘤相关抗原抗体与几种类型的肿瘤的结合,并由此显示它可用于治疗这些类型的癌症。
脱免疫Bouganin构建体:与de-bouganin相连的肿瘤相关抗原导向的靶部分
H11抗体,将一种识别肿瘤相关抗原的单克隆抗体,遗传连接于 bouganin的一种脱免疫形式(de-bouganin),Bou 156,一种有效的、植物来源的、I型核糖体失活蛋白(RIP),从而形成抗体-毒素构建体VB6-011。附图15显示核酸编码序列和氨基酸序列。对该构建体的测试说明,该构建体保持了其生物活性(细胞毒性)。
效力(生物活性)
MTS检测证实,de-bouganin与Fab片段耦联后仍保持其效力(附图16)。用于测定效力的MTS检测是用本领域标准技术完成的,如实施例8中详细描述。
细胞毒性
为研究VB6-011的特异性和和选择性,测试了其对MB-435S细胞的细胞毒性活性。用本领域已知的标准技术完成MTS检测。具体是,每孔接种50微升细胞(2×104细胞/ml),37℃下将板在5%CO2中培养2小时。之后向培养基中加入50微升浓度逐渐升高的spiked drug(也即construct to be tested或control)。分别以含或不含细胞的培养基作为阳性和阴性对照。将板在37℃、5%CO2下保留5天。第5天时,通过加入20微升MTS试剂(Promega,Cat#G5430)来评估对细胞增殖的抑制。将板继续在37℃、5%CO2中培养2小时,用plate readerspectrophotometer读取490nm处的OD值。将对各浓度得到的样品值中减掉背景值,结果以活细胞的百分数表示。结果显示,VB6-011的IC50值是350nM。
尽管已经参照目前认为的本发明优选实施例对本发明进行描述,应当理解,本发明不限于所公开的这些例子。相反,本发明意欲覆盖在本发明所权利要求的精神和范围内的各种修饰和等同安排。
所有公开文献、专利、专利申请均以其全文引入本文作为参考,如同各独立的公开文献、专利和专利申请被特别或单独指出以其全文作为参考。
表1
Bouganin序列肽。下划线残基在成熟肽中不含。
表2
供体编号 | 供体贮存代码 | 同种异型 |
1 | BC63 | DRB1*04,DRB1*07,DRB4*01 |
2 | BC86 | DRB1*04,DRB1*15,DRB5 |
3 | BC90 | DRB1*07,DRB1*15,DRB4*01,DRB5 |
4 | BC134 | DRB1*01,DRB1*03,DRB3 |
5 | BC167 | DRB1*01,DRB1*07和DRB4*01 |
6 | BC216 | DRB1*14,DRB1*15,DRB3,DRB5 |
7 | BC217 | DRB1*04,DRB1*12,DRB3,DRB4*01 |
8 | BC233 | DRB1*04,DRB1*11和DRB3,DRB4*01 |
9 | BC241 | DRB1*07,DRB1*11,DRB3,DRB4*01 |
10 | BC246 | DRB1*01,DRB1*13和DRB3 |
11 | BC262 | DRB1*03,DRB1*07,DRB3,DRB4*01 |
12 | BC292 | DRB1*07,DRB1*13,DRB3,DRB4*01 |
13 | BC293 | DRB1*04,DRB1*10,DRB4*01 |
14 | BC231 | DRB1*03或DRB1*03,DRB1*13和DRB3 |
15 | BC301 | DRB1*07,DRB1*14,DRB3 |
16 | BC326 | DRB1*03,DRB1*15,DRB3,DRB5 |
17 | BC316 | DRB1*13,DRB1*15,DRB3,DRB5 |
18 | BC321 | DRB1*01,DRB1*15,DRB5 |
19 | BC382 | DRB1*04,DRB1*08,DRB4*01 |
20 | BC336 | DRB1*01,DRB1*11,DRB3 |
PBMC供体的MHC同种异型
表3
引物SEQ ID NO序列
OL1032 121 CATTACAAACGTCTACCAAGTTT
OL1033 122 TTACAAAAGTAGATAAGTAATGTG
OL1322 123 GATATACATATGAAATACCTATTGCCTACG
OL1067 124 TGACACAGTGTTGTACGCTGGTTGGGCAGCGAGTAA
OL1068 125 GCTGCCCAACCAGCGTACAACACTGTGTCATTTAAC
OL1323 126 CGAGTGCGGCCGCTCAATGGTGATGGTGATGGTGT
构建WT bouganin基因中所使用的引物序列
表4
所构建和测试的单取代bouganin变体。
*荧光素酶测定中的活性:
++=等于或高于WT蛋白。+=WT活性的2倍以内。+/-=WT活性的3倍以内。--=少于WT活性的三分之一。WT=野生型蛋白。
**克隆ID。只对有功能活性的变体命名。
表5
所构建和测试的多取代bouganin变体。
*荧光素酶测定中的活性:
++=等于或高于WT蛋白。+=WT活性的2倍以内。+/-=WT活性的3倍以内。--=少于WT活性的三分之一。WT=野生型蛋白。
表6
克隆ID | 取代* | 蛋白质 |
Bou32 | WT | SEQ ID No 1 |
Bou156 | V123A、D127A、Y133N,I152A | SEQ ID No 13 |
Bou157 | V123A、D127A、Y133Q,I152A | SEQ ID No 14 |
Bou143 | V123Q,Y133Q,I152Q | |
Bou144 | V123A,Y133N,I152A | |
Bou145 | V123A,Y133Q,I152A | |
Bou146 | V123A,D127G | |
Bou147 | V123A,D127A | |
Bou148 | V123Q,D127G | |
Bou149 | V123Q,D127A | |
Bou150 | V123Q,E129G | |
Bou151 | V123A,E129G | |
Bou2 | V123T | |
Bou3 | V123A | |
Bou4 | V123Q | |
Bou5 | D127G | |
Bou6 | D127A | |
Bou7 | E129Q | |
Bou8 | E129G | |
Bou9 | Y133N | |
Bou10 | Y133T | |
Bou11 | Y133A | |
Bou12 | Y133R | |
Bou13 | Y133D | |
Bou14 | Y133E | |
Bou15 | Y133Q | |
Bou16 | Y133G | |
Bou17 | Y133H | |
Bou18 | Y133K | |
Bou19 | Y133S | |
Bou20 | I152Q | |
Bou21 | I152A |
*从bouganin阅读框的残基1开始的编号,由此排除了在大多数构建体中所包括的PelB引导序列。
表7
SEQ ID No 1
蛋白质
YNTVSFNLGEAYEYPTFIQDLRNELAKGTPVCQLPVTLQTIADDKRFVLVDITTTSKKTVKVAIDVTDVYVVGYQDKWDGKDRAVFLDKVPTVATSKLFPGVTNRVTLTFDGSYQKLVNAAKVDRKDLELGVYKLEFSIAIHGKTINGQEIAKFFLIVIQMVSEAARFKYIETEVVDRGLYGSFKPNFKVLNLENNWGDISDAIHKSSPQCTTINPALQLISPSNDPWVVNKVSQISPDMGILKFKSSK
SEQ ID No 13
蛋白质
YNTVSFNLGEAYEYPTFIQDLRNELAKGTPVCQLPVTLQTIADDKRFVLVDITTTSKKTVKVAIDVTDVYVVGYQDKWDGKDRAVFLDKVPTVATSKLFPGVTNRVTLTFDGSYQKLVNAAKADRKALELGVNKLEFSIAIHGKTINGQEAAKFFLIVIQMVSEAARFKYIETEVVDRGLYGSFKPNFKVLNLENNWGDISDAIHKSSPQCTTINPALQLISPSNDPWVVNKVSQISPDMGILKFKSSK
表8
在T细胞检测中进一步测试的被修饰和WT Bouganin。
*被取代(突变)的残基用下划线表示。
表9
VB6-845经流式细胞仪与妇科细胞系的结合
结果以MF±SEM.表示增殖倍数
指征 | 细胞系 | VB6-845(增殖倍数MF±SEM) |
子宫内膜 | HEC-1-A | 42.3±0.9 |
RL95-2 | 4.9±0.7 | |
SK-UT-1 | 1.1±0.1 | |
卵巢 | NIH:OVCAR-3 | 33.6±6.0 |
SK-OV-3 | 4.3±1.0 | |
TOV-112G | 1.1±0.1 | |
宫颈 | HT-3 | 29.1±1.2 |
C-4I | 6.8±0.6 | |
C-33A | 1.1±0.0 | |
黑素瘤 | A-375 | 1.1±0.1 |
表10
通过MTS实验测定的VB6-845-介导的细胞毒性
表11
VB6-845相比化疗剂的特异性和选择性
表12:VB6-845肿瘤细胞指征
1N表示每个指征中所测试的细胞系的数量。
2意指各指征中来自所有细胞系的中值荧光对对照抗体的增殖倍数。
表13:VB6-011肿瘤细胞指征
1N表示每个指征中所测试的细胞系的数量。
2值表示从各指征中来自所有细胞系的中值荧光对对照抗体的平均增殖倍数的总数计算得到的平均值。零值意味着相对于对照活性没有可测量的活性。
Claims (16)
1.一种被修饰Bouganin蛋白,其中所述的Bouganin蛋白具有减弱的激活T-细胞的倾向,并且被修饰Bouganin蛋白的氨基酸序列由以下序列组成:
YNTVSFNLGEAYEYPTFIQDLRNELAKGTPVCQLPVTLQTIADDKRFV
LVDITTTSKKTVKVAIDVTDVYVVGYQDKWDGKDRAVFLDKVPTVAT
SKLFPGVTNRVTLTFDGSYQKLVNAAKX1DRKX2LX3LGVX4KLEFSIEAIHGKTINGQEX5AKFFLIVIQMVSEAARFKYIETEVVDRGLYGSFKPNFKVLNLENNWGDISDAIHKSSPQCTTINPALQLISPSNDPWVVNKVSQISPDMGILKFKSSK(SEQ IDNO:11),其中:
X1是T或A或Q;
X2是G或A;
X3是Q或G;
X4是N或D或T或A或R或Q或E或G或H或K或S;和
X5是Q或A。
2.根据权利要求1的被修饰Bouganin蛋白,其中被修饰Bouganin蛋白由以下序列组成:
YNTVSFNLGEAYEYPTFIQDLRNELAKGTPVCQLPVTLQTIADDKRFV
LVDITTTSKKTVKVAIDVTDVYVVGYQDKWDGKDRAVFLDKVPTVAT
SKLFPGVTNRVTLTFDGSYQLVNAAKADRKALELGVNKLEFSIEAIH
GKTINGQEAAKFFLIVIQMVSEAARFKYIETEVVDRGLYGSFKPNFKVL
NLENNWGDISDAIHKSSPQCTTINPALQLISPSNDPWVVNKVSQISPD
MGILKFKSSK(SEQ ID NO:13)。
3.一种细胞毒素,包含
(a)根据权利要求1或2的被修饰Bouganin蛋白;
(b)附着于(a)的靶部分。
4.一种细胞毒素,包含
(a)根据权利要求1或2的被修饰Bouganin蛋白;
(b)附着于(a)的能够结合癌细胞的配体。
5.权利要求4的细胞毒素,其中的配体是与癌细胞结合的抗体或抗体片段。
6.权利要求5的细胞毒素,其中的抗体或抗体片段与癌细胞表面的Ep-CAM结合。
7.权利要求6的细胞毒素,包含SEQ ID NO:16中所示的氨基酸序列。
8.权利要求5的细胞毒素,其中的抗体或抗体片段结合癌细胞表面的肿瘤相关抗原。
9.权利要求8的细胞毒素,包含SEQ ID NO:28中所示的氨基酸序列。
10.根据权利要求3~9之中任一的细胞毒素在制备抑制或破坏癌细胞的药物中的用途。
11.权利要求10的用途,其中癌细胞选自下列癌的细胞:结肠直肠癌、乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌、头颈癌、膀胱癌、肝癌、肾癌、黑素瘤、胃肠癌、前列腺癌、小细胞和非小细胞肺癌、肉瘤、神经胶质瘤、和T-和B-细胞淋巴瘤。
12.根据权利要求3~9之中任一的细胞毒素在制备治疗癌症的药物中的用途。
13.权利要求12的用途,其中癌症选自结肠直肠癌、乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌、头颈癌、膀胱癌、肝癌、肾癌、黑素瘤、胃肠癌、前列腺癌、小细胞和非小细胞肺癌、肉瘤、神经胶质瘤、和T-和B-细胞淋巴瘤。
14.包含根据权利要求3~9之中任一的细胞毒素和药学可接受载体、稀释剂或赋形剂的药物组合物。
15.编码根据权利要求1或2的被修饰Bouganin蛋白的核酸分子。
16.编码根据权利要求3~9中任一的细胞毒素的核酸分子。
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MARCEL T. DEN HARTOG, ET AL,.CLONING AND EXPRESSION OF CDNA CODING FORBOUGANIN A TYPE-1 RIBOSOME-INACTIVATINGPROTEIN FROM BOUGAINVILLEA SPECTABILIS WILLD.EUR.J.BIOCHEM.269 6.2002,269(6),1772-1779. |
MARCEL T. DEN HARTOG, ET AL,.CLONING AND EXPRESSION OF CDNA CODING FORBOUGANIN A TYPE-1 RIBOSOME-INACTIVATINGPROTEIN FROM BOUGAINVILLEA SPECTABILIS WILLD.EUR.J.BIOCHEM.269 6.2002,269(6),1772-1779. * |
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