CN101160321A - Q3 sparc缺失突变体及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供了具有对应于人SPARC蛋白成熟形式中第三个谷氨酰胺缺失突变的SPARC多肽，编码该多肽的核酸，抗该多肽的抗体以及该多肽、核酸和抗体的使用方法。

Description

Q3 SPARC缺失突变体及其用途

相关申请的交叉参考

本专利申请要求2005年2月18日递交的美国临时专利申请No.60/654,261的权益，特此以其整体引入作为参考。

发明领域

本发明涉及使用识别SPARC的抗体或其他合适的配体来治疗癌症、涉及组织和器官中异常增殖、增生、重塑和炎症活性的其他疾病的方法。本发明还涉及突变SPARC多肽和核酸及其使用方法，以及靶向方法、成像方法和确定哺乳动物肿瘤对抗-SPARC治疗的应答的方法。

发明背景

酸性且富含半胱氨酸的分泌蛋白(也称为骨粘连蛋白、BM40或SPARC)(此后称为“SPARC”)，是引发细胞形状改变、抑制细胞周期进程和影响胞外基质合成的基质相关蛋白(Bradshaw等，Proc.Nat.Acad.Sci.USA 100：6045-6050(2003))。在1986年克隆了鼠SPARC基因(Mason等，EMBO J.5：1465-1472(1986))并在1987年克隆并测序了全长人SPARC cDNA(Swaroop等，Genomics 2：37-47(1988))。SPARC表达在发育上受到调节，并主要于在正常发育过程中经历重塑的组织中表达或应答损伤。例如，在发育的骨和牙齿中表达高水平的SPARC蛋白(参见，例如，Lane等，FASEB J，8，163-173(1994)；Yan&Sage，J.Histochem.Cytochem.47：1495-1505(1999))。

SPARC在几种侵入性癌症中得到增量调节，但是在相应的正常组织中不存在(Porter等，J.Histochem.Cytochem.，43，791(1995))。在多种肿瘤(例如，膀胱、肝脏、卵巢、肾脏、消化道和乳房)中诱导SPARC表达。例如，在膀胱癌中，SPARC表达与晚期癌相关。T2期或更高病期的侵入性膀胱肿瘤已经显示出相对于T1期的膀胱肿瘤(或较小的浅表肿瘤)表达更高水平的SPARC和较差的预后(参见，例如，Yamanaka等，J.Urology.，166，2495-2499(2001))。在脑膜瘤中，SPARC表达只与侵入性肿瘤相关(参见，例如，Rempel等，ClincalCancer Res.，5，237-241(1999))。还在74.5％的原位侵入性乳癌病变(参见，例如，Bellahcene等，Am.J.Pathol.，146，95-100(1995))和54.2％的乳房浸润性导管癌(参见，例如，Kim等，J KoreanMed.Sci.，13，652-657(1998))中检测到SPARC表达。SPARC表达还与乳癌中常见的微钙化相关(参见，例如，Bellahcene等，上文)，表明SPARC表达可能是造成乳房转移瘤对骨的亲和力的原因。

令人惊讶地，还显示出SPARC在一些系统中具有抗肿瘤活性。SPARC是使细胞停止于G₁-中期的强力细胞周期抑制剂(Yan&Sage，J.Histochem.Cytochem.47：1495-1505(1999))，且已经表明SPARC的诱导型表达能抑制体外模型系统中的乳癌细胞增殖(Dhanesuan等，Breast Cancer Res.Treat.75：73-85(2002))。同样，内源SPARC可以以浓度依赖性方式降低HOSE(人卵巢表面上皮)和卵巢癌细胞两者的增殖。此外，SPARC可诱导卵巢癌细胞的凋亡。已经报道了细胞如卵巢上皮细胞上存在SPARC受体的进一步的证据。已经提出SPARC与其受体的结合很可能引发介导其肿瘤抑制功能的组织特异性信号传导途径(Yiu等，Am.J.Pathol.159：609-622(2001))。还报道了纯化的SPARC有效地抑制血管生成且显著削弱体内异种移植模型系统中的成神经细胞瘤肿瘤生长(Chlenski等，Cancer Res.62：7357-7363(2002))。

SPARC还在非肿瘤增殖性疾病中起着一定的作用。系膜细胞增殖是许多肾小球疾病的特有特征并通常先于胞外基质增殖和肾小球硬化症。在实验性系膜增殖性肾小球硬化症的模型中，SPARC mRNA到第7天增加了5倍并通过原位杂交在系膜中进行了鉴定。然而，重组SPARC或合成SPARC肽在体外抑制血小板衍生生长因子诱导的系膜细胞DNA合成(Pichler等，Am.J.Pathol.148(4)：1153-67(1996))。同样，尽管由于增生、肥大和增加细胞间基质引起的肾肿大是人糖尿病的特有特征，但在糖尿病动物中，肾SPARC mRNA水平下降。此外，糖尿病相关肾生长的发生与SPARC mRNA和蛋白质的降低相关(Gilbert等，Kidney Int.，48(4)：1216-25(1995))。

SPARC与动脉粥样硬化病变的发病机理有关。在冠状动脉疾病患者中，血浆SPARC水平升高(Masahiko等，Obesity Res.9：388-393(2001))。血管平滑肌细胞在动脉内膜中的增殖在动脉粥样硬化的发病机理中起着重要作用。SPARC在血管平滑肌细胞和与动脉粥样硬化病变相关的巨噬细胞中得到表达。此外，已经假设SPARC在血管损伤过程中调节血小板衍生生长因子的作用(Masahiko等，Obesity Res.9：388-393(2001)；Raines等，Proc.Nati.Acad.Sci.USA 89：1281-1285(1992))。已经报道了SAPRC在血管损伤部位对内皮PAI-1产生的促进作用(Hasselaar等，J.Biol.Chem.266：13178-13184(1991))并已经假定其加速动脉粥样硬化(Masahiko等，Obesity Res.9：388-393(2001))。

SPARC对各种配体具有亲和性，这些配体包括阳离子(例如，Ca2+、Cu2+、Fe2+)、生长因子(例如，血小板衍生生长因子(PDGF)和血管内皮生长因子(VEGF))、胞外基质(ECM)蛋白(例如，胶原蛋白IV和胶原蛋白IX、玻连蛋白和凝血酶敏感蛋白1)、内皮细胞、血小板、白蛋白和羟磷灰石(参见，例如，Lane等，FASEB J.，8，163-173(1994)；Yan&Sage，J.Histochem.Cytochem.47：1495-1505(1999))。还已知SPARC结合白蛋白(参见，例如，Schnitzer，J.Biol.Chem.，269，6072(1994))。

抗体治疗是控制其中可以鉴定特异性蛋白质标记的疾病的有效方法。实例包括Avastin(抗-VEGF抗体)、B细胞单克隆抗体(Rituxan)(抗-CD20抗体)和Remicade(抗-TNF抗体)。因而，抗SPARC的抗体代表重要的治疗剂，用于治疗人和其它哺乳动物肿瘤，或其他表达SPARC蛋白的增殖、增生、重塑和炎症疾病。

因此，存在对新形式的SPARC以及与这类新形式的SPARC反应的抗体的需要。本发明提供了这样的新SPARC多肽、编码这样的新SPARC多肽的核酸以及这类新的SPARC多肽和核酸的使用方法。本发明另外提供了抗SPARC多肽的抗体。

发明概述

对应于SEQ ID NO：1(未加工的初级翻译产物的序列)中的氨基酸20的谷氨酰胺对应于成熟蛋白质(无17个氨基酸SPARC前导序列的多肽)中氨基酸位置3上的谷氨酰胺(“Q3”谷氨酰胺)。本发明提供了分离的SPARC多肽，该多肽包含其中对应于SEQ ID NO：1中氨基酸20的谷氨酰胺被缺失的氨基酸序列(此后称为“Q3 SPARC缺失突变多肽”)。特别是，本发明提供了分离的人Q 3SPARC缺失突变多肽。本发明还提供了分离的SPARC多肽，其中多肽包括SEQ ID NO：2的氨基酸序列，其对应于成熟的Q3 SPARC缺失突变多肽。本发明进一步提供了编码Q3 SPARC缺失突变多肽的分离核酸分子。特别是，本发明提供了编码人Q3 SPARC缺失突变多肽的分离核酸分子。本发明包括的分离核酸包括，但不限于，包含SEQ ID NO：3序列的核酸。

本发明还提供了包括编码Q3 SPARC缺失突变多肽的核酸分子的载体，包括但不限于，其中载体进一步包括控制Q3 SPARC缺失突变多肽编码核酸序列表达的启动子。此外，本发明提供了包括编码Q3 SPARC缺失突变多肽的核酸分子的细胞，其中细胞是原核细胞或真核细胞。本发明进一步提供了制备Q3 SPARC缺失突变多肽的方法，包括：(a)用编码Q3 SPARC缺失突变多肽的核酸转化细胞；(b)诱导转化细胞对Q3 SPARC缺失突变多肽的表达，和(c)纯化Q3 SPARC缺失突变多肽。

另一个实施方案中本发明提供了包括Q3 SPARC缺失突变多肽或编码Q3 SPARC缺失突变多肽的核酸和药物学上可接受载体的组合物以及治疗疾病的方法，该方法包括给予Q3 SPARC缺失突变多肽和载体。根据本发明可以使用这样的方法来治疗疾病，这些疾病包括但不限于，其中疾病是细胞增殖性疾病(例如，癌症、良性肿瘤、动脉粥样硬化、血管再狭窄)。本发明还提供了敏化疾病的方法，包括给予Q3 SPARC缺失突变多肽，包括其中疾病是细胞增殖性疾病(例如，癌症、良性肿瘤、动脉粥样硬化、血管再狭窄)。此外，本发明提供了包括Q3 SPARC缺失突变多肽的组合物，其中多肽与治疗剂或诊断剂，例如，放射性同位素或放射性核素、药物、多肽或毒素偶联或缀合。另外，Q3 SPARC缺失突变多肽可以与在体内稳定Q3 SPARC缺失突变多肽的分子，例如，聚乙二醇偶联或缀合。可以通过任何合适的途径来给予Q3 SPARC缺失突变多肽或编码Q3 SPARC缺失突变多肽的核酸和药物学上可接受的载体，这些途径包括但不限于，静脉内、腹膜内、肿瘤内或吸入。

一个实施方案中本发明提供了识别SPARC多肽特别是识别Q3SPARC缺失突变多肽的抗体或其片段，和药物学上可接受的载体。根据本发明可以使用这种识别SPARC多肽的抗体来例如介导补体激活和/或对抗肿瘤或其他增殖性疾病的细胞介导的细胞毒性。

再一个实施方案中，本发明提供了组合物，该组合物包括与识别SPARC多肽特别是Q3 SPARC缺失突变多肽的抗体或其片段偶联的治疗剂，和药物学上可接受的载体，包括但不限于，其中所述抗体或其片段是人源化的并包括单价Fab’、二价Fab2、scfv、双特异抗体(diabody)或嵌合体(此后总地称为“抗-Q3 SPARC缺失突变抗体”)。根据本发明制备的抗体可以是单克隆的或多克隆的，在非人动物中生产，并且是人源化的。此外，本发明提供了抗SPARC抗体，特别是，抗Q3 SPARC缺失突变抗体，与治疗剂偶联或缀合，其中治疗剂是化疗药物、放射性核素或肽。合适的治疗剂还包括是生物分子，例如，tTF和TNF的治疗剂。

Q3 SPARC缺失突变多肽或抗-SPARC抗体，例如，抗-Q3 SPARC缺失突变抗体，和药物学上可接受载体可以通过任何合适的途径给药，这些途径包括但不限于，静脉内、腹膜内、肿瘤内或吸入。因此，本发明提供了将治疗剂递送至患病部位例如哺乳动物的肿瘤的方法，该方法包括将治疗有效量的药物组合物给予哺乳动物，其中治疗剂包括与药物学上可接受载体偶联的化疗剂或放射性物质和药物学上可接受的载体。根据本发明可以治疗的合适肿瘤包括，但不限于，位于人或非人动物的膀胱、肝脏、卵巢、肾脏、消化道、脑或乳房中的肿瘤。

本发明另外提供了将诊断剂递送至患病部位例如哺乳动物的肿瘤的方法，该方法包括将诊断有效量的药物组合物给予哺乳动物。合适的组合物包括，但不限于，其中组合物包括与抗-SPARC抗体例如抗-Q3SPARC缺失突变抗体偶联的诊断剂和药物学上可接受的载体。合适的诊断剂包括，但不限于，放射性物质、MRI造影剂、X-射线造影剂、超声造影剂和PET造影剂。

本发明提供了将疾病分类的方法，包括检测其中对应于SEQ IDNO：1中氨基酸位置20的谷氨酰胺缺失的SPARC多肽(即，检测Q3 SPARC缺失突变多肽)，包括但不限于，其中疾病的特征在于细胞增殖，例如，癌症、良性肿瘤、动脉粥样硬化或血管再狭窄。合适的疾病还包括，但不限于，其中出现新血管生成的那些疾病。因此，本发明进一步提供了检测SPARC多肽的方法，其中检测的多肽包括SEQ ID NO：2的氨基酸序列。

本发明另外提供了将疾病分类的方法，包括检测编码Q3 SPARC缺失突变多肽的核酸，其中核酸是DNA或RNA。此外，本发明提供了将疾病分类的方法，包括检测核酸，其中检测的核酸包括SEQ ID NO：3的核酸序列。

附图的几个视图的简述

图1说明了MX 1肿瘤异种移植物中的白蛋白和SPARC染色。

图2说明了紫杉醇穿过内皮细胞单层的转胞吞作用。

图3说明了用于确定分离自人前列腺cDNA文库的SPARC cDNA克隆的SPARC DNA序列的测序策略。

图4A-U公开了图3中所示测序反应的结果。

图5公开了SEQ ID NO：3的DNA序列。

图6公开了SEQ ID NO：4的氨基酸序列，其是SEQ ID NO：5的翻译。

图7公开了SEQ ID NO：2的氨基酸序列，其是SEQ ID NO：6的翻译。

图8A-C说明了SEQ ID NO：3(Query)与野生型SPARC cDNA序列(Sbjct)的DNA序列比对。

图9说明了野生型SPARC氨基酸序列(seq1)与SEQ ID NO：4(seq2)的氨基酸序列比对。

图10A-B公开了SPARC氨基酸序列的种系发生比较。

图11描绘了pVT1000Q3质粒验证性限制酶切消化的凝胶电泳结果。

图12描绘了pVT1000Q3质粒的限制酶图谱。

图13说明了定点诱变方法中所用的诱变引物和所靶向的序列。

图14说明了用于检测编码Q3 SPARC缺失突变多肽和/或野生型SPARC多肽的核酸(“Query”，突变序列；“Sbjct”，野生型序列)存在的PCR引物的位置和序列。

图15描绘了用于检测编码Q3 SPARC缺失突变多肽和/或野生型SPARC多肽的核酸存在的PCR反应的凝胶电泳结果。

发明详述

人SPARC基因编码303个氨基酸的SPARC蛋白质，而成熟SPARC是285个氨基酸的糖蛋白。信号序列切割后，产生32-kD的分泌形式，其由于糖基化在SDS-PAGE上向43kD迁移。晶体学数据表明SPARC蛋白具有三个模块结构域。N-端结构域是酸性的并结合钙。中心“卵泡抑素样结构域”含有参与抑制血管生成和粘着斑形成和(K)GHK血管生成肽的氨基酸。羧基端“E-C结构域”含有参与高亲和性钙结合和细胞散布抑制的氨基酸(Yan&Sage，J.Histochem.Cytochem.7：1495-1505，1999)。

N-端SPARC结构域(17氨基酸信号序列后面的第1-52个残基)是富含天冬氨酸和谷氨酸的酸性区。N-端结构域以低亲和力结合几个钙离子，与羟磷灰石相互作用，并已经假定在骨矿化中起作用。该N-端SPARC结构域还已经显示出抑制细胞散布和趋化性(Yan&Sage，J.Histochem.Cytochem.7：1495-1505，(1999))。此外，N-端结构域含有SPARC的主要免疫抗原决定部位。然而，该结构域是SPARC-样蛋白质家族中的趋异序列，并且还没有发现抗SPARC的抗体与SPARC-样蛋白交叉反应或识别SPARC-样蛋白(Yan&Sage，J.Histochem.Cytochem.7：1495-1505，1999)。

成熟SPARC蛋白质中的氨基酸位置3和4(未加工蛋白质中的氨基酸位置20和21)上的N-端结构域内的两个相邻的谷氨酰胺是酰胺受体位点，它们是转谷氨酰胺酶交联的主要靶。(在单字母氨基酸代子中以“Q”来表示谷氨酰胺，因此，这些氨基酸在成熟SPARC蛋白质中是“Q3”和“Q4”氨基酸。)转谷氨酰胺酶催化肽结合谷氨酰胺残基的γ氨甲酰基团与各种伯胺之间的Ca-依赖性转移反应。已经提出组织特异性翻译后修饰，如转谷氨酰胺酶交联，可以调节一些SPARC的生物学功能(Hohenadl等，J.Biol.Chem.270：23415-23420(1995))。

本发明提供了分离的SPARC多肽，该多肽包括其中对应于SEQ IDNO：1中氨基酸20的谷氨酰胺被缺失的氨基酸序列(Q3 SPARC缺失突变多肽)。特别是，本发明提供了分离的人Q3 SPARC缺失突变多肽。本发明还提供了分离的SPARC多肽，其中多肽包括SEQ ID NO：2的氨基酸序列，其对应于成熟Q3 SPARC缺失突变多肽(无17氨基酸SPARC前导序列的多肽)。

本发明进一步提供了编码Q3 SPARC缺失突变多肽的分离核酸分子。特别是，本发明提供了编码人Q3 SPARC缺失突变多肽的分离核酸分子。本发明包括的分离核酸包括，但不限于，包含SEQ ID NO：3序列的核酸。因此，本发明提供了分离的SPARC多肽，其中多肽包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列，其对应于SEQ ID NO：3DNA序列从核苷酸87至核苷酸922的翻译并且其形成全长Q3 SPARC缺失突变多肽(具有17个氨基酸SPARC前导序列的SPARC多肽)。因此，本发明还提供了具有SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6的DNA序列的分离核酸，其分别编码具有SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：2的氨基酸序列的多肽。SEQ ID NO：6的DNA序列代表SEQ ID NO：3的核苷酸138至992。

本发明提供了分离的SPARC多肽，该多肽包括其中对应于SEQ IDNO：1中氨基酸20的谷氨酰胺被缺失的氨基酸序列。因此，本发明提供了分离的Q3 SPARC缺失突变多肽且其中多肽是至少约10个氨基酸长，优选至少约15个氨基酸长，更优选至少约20个氨基酸长，更优选至少约30个氨基酸长，更优选至少约40个氨基酸长，更优选至少约50个氨基酸长，甚至更优选至少约100个氨基酸长。此外，本发明提供了分离的Q3 SPARC缺失突变多肽，该多肽包括其中不包括对应于SEQ ID NO：1中氨基酸20的谷氨酰胺的序列与SEQ ID NO：1的对应序列至少约80％同源，优选与SEQ ID NO：1的对应序列至少约90％同源，甚至更优选与SEQ ID NO：1的对应序列至少约95％同源，甚至更优选与SEQ ID NO：1的对应序列至少约99％同源的多肽。“SEQ ID NO：1的对应序列”意指与SEQ ID NO：1的序列比对的那些序列，其中比对的区域为至少约10个氨基酸长，优选至少约15个氨基酸长，更优选至少约20个氨基酸长，更优选至少约30个氨基酸长，更优选至少约40个氨基酸长，更优选至少约50个氨基酸长，甚至更优选至少约100个氨基酸长。各种序列比对的方法是生物技术领域中已知的(参见，例如，Rosenberg，BMC Bioinformatics 6：278(2005)；Altschul等，FEBS J.272(20)：5101-5109(2005))。

本发明还提供了分离的SPARC多肽，其中多肽包括SEQ ID NO：2的氨基酸序列，包括含有SEQ ID NO：2的氨基酸序列，而没有任何额外氨基酸添加至氨基或羧基端的多肽，以及包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列，且另外具有至少约1个氨基酸，优选另外具有至少约5个氨基酸，优选另外具有至少约10个氨基酸，更优选另外具有至少约15个氨基酸，更优选另外具有至少约20个氨基酸，更优选另外具有至少约30个氨基酸，更优选另外具有至少约40个氨基酸，甚至更优选另外具有至少约50个氨基酸添加至SEQ ID NO：2的氨基和/或羧基端的多肽。

本发明进一步提供了Q3 SPARC缺失突变多肽，其中在氨基酸序列中已经进行了保守性置换，包括其中置换的氨基酸包括天然和/或非天然氨基酸。为了举例说明保守性置换所表示的意思，以下列出了A-F组。认为以下组的一个成员被相同组的另一个成员置换是保守性置换。

A组包括亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、苏氨酸和具有以下侧链的修饰氨基酸：乙基、异-丁基、-CH₂CH₂OH、-CH₂CH₂CH₂OH、-CH₂CHOHCH₃和CH₂SCH₃。

B组包括甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、苏氨酸和具有乙基侧链的修饰氨基酸。

C组包括苯丙氨酸、苯基甘氨酸、酪氨酸、色氨酸、环己基甲基和具有取代的苄基或苯基侧链的修饰氨基残基。

D组包括谷氨酸、天冬氨酸、谷氨酸或天冬氨酸的取代或未取代的脂肪族、芳香族或苄型酯(例如，甲基、乙基、正-丙基、异-丙基、环己基、苄基或取代的苄基)、谷氨酰胺、天冬酰胺、CO-NH-烷基化的谷氨酰胺或天冬酰胺(例如，甲基、乙基、正-丙基和异-丙基)，和具有-(CH₂)₃COOH侧链的修饰氨基酸、其酯(取代的或未取代的脂肪族、芳香族或苄型酯)、其酰胺及其取代的或未取代的N-烷基化酰胺。

E组包括组氨酸、赖氨酸、精氨酸、N-硝基精氨酸、p-环精氨酸、g-羟基精氨酸、N-脒基瓜氨酸、2-氨基胍基丁酸、赖氨酸的同系物、精氨酸的同系物和鸟氨酸。

F组包括丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸和具有被-OH或-SH取代的C1-C5直链或支链烷基侧链的修饰氨基酸。

A-F组只是举例说明并不是打算来限制本发明。

此外，本发明提供了分离的Q3 SPARC缺失突变多肽，该多肽在SEQ ID NO：1序列中具有约1至约5个氨基酸，优选约1至约3个氨基酸，更优选1个氨基酸的一个或多个氨基酸插入或缺失。

本发明进一步提供了编码Q3 SPARC缺失突变多肽的分离核酸分子。合适的分离核酸分子包括，但不限于，DNA、RNA和肽-核酸。本发明所涵盖的分离核酸包括，但不限于，包含SEQ ID NO：3序列的核酸，没有附加的5’或3’核苷酸或具有另外至少约1个核苷酸，优选另外至少约3个核苷酸，更优选至少约9个核苷酸，更优选至少约20个核苷酸，更优选至少约50个核苷酸，更优选至少约100个核苷酸，甚至更优选至少约1000个核苷酸添加至SEQ ID NO：3的5’和/或3’端。本发明还提供了编码Q3 SPARC缺失突变多肽的分离核酸分子，其中核酸序列与SEQ ID NO：3的对应序列至少约80％同源，优选与SEQ IDNO：3的对应序列至少约90％同源，甚至更优选与SEQ ID NO：3的对应序列至少约95％同源，甚至更优选与SEQ ID NO：3的对应序列至少约99％同源。“SEQ ID NO：3的对应序列”意指与SEQ ID NO：3的序列比对的那些序列，其中比对的区域至少约30个核苷酸长，优选至少约45个核苷酸长，更优选至少约60个核苷酸长，更优选至少约90个核苷酸长，更优选至少约120个核苷酸长，更优选至少约150个核苷酸长，甚至更优选至少约300个核苷酸长。序列比对的各种方法是生物技术领域中已知的(参见，例如，Rosenberg，BMC Bioinformatics6：278(2005)；Altschul等，FEBS J.272(20)：5101-5109(2005))。

此外，本发明提供了编码Q3 SPARC缺失突变多肽的分离核酸分子，其中分离核酸分子在低严格条件下，优选在中度严格条件下，甚至更优选在高度严格条件下与SEQ ID NO：3杂交。“高严格条件”优选允许核酸序列约25％至约5％错配，更优选约15％至约5％错配，且最优选约10％至约5％错配。“中度严格条件”优选允许核酸序列约40％至约15％错配，更优选约30％至约15％错配，且最优选约20％至约15％错配。“低严格条件”优选允许核酸序列约60％至约35％错配，更优选约50％至约35％错配，且最优选约40％至约35％错配。

可以通过使用甚至缺乏部分程度互补性(例如，低于约30％同一性)的第二个靶来测试非特异性结合的不存在；在非特异性结合不存在下，探针将不与第二个非互补靶杂交。可以存在部分同源性或完全同源性(即，同一性)。部分互补序列是至少部分抑制完全互补序列与靶核酸杂交的序列。可以使用低严格条件下的杂交测定(DNA或RNA印迹，溶液杂交等)来检验完全互补序列与靶序列的杂交的抑制。“基本上同源的”序列或探针将竞争并抑制在低严格条件下完全同源的序列与靶的结合(即，杂交)。这并非表示低严格条件就允许非特异性结合；低严格条件需要两个序列彼此间的结合是特异性的(即，选择性的)相互作用。术语“同源性”指的是互补性的程度。

示例性的中度严格条件包括在含有20％甲酰胺、5X SSC(150mMNaCl和15mM柠檬酸三钠)、50mM磷酸钠(pH 7.6)、5X Denhardt’s溶液、10％硫酸葡聚糖和20mg/ml变性剪切鲑精DNA的溶液中37℃孵育过夜，接着在约37-50℃在1X SSC中洗涤，或基本上相似的条件，例如，Sambrook&Russell，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(分子克隆：实验室手册)，Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York(2001)，pp.6.1-6.2中所述的中度严格条件。高严格条件是以下的条件，例如(1)在50℃使用低离子强度和高温进行洗涤，如用含有0.015M氯化钠和0.0015M柠檬酸钠以及0.1％(w/v)十二烷基硫酸钠(SDS)的组合物洗涤，(2)在杂交过程中使用变性剂，如含有甲酰胺的组合物，例如，在42℃使用50％(v/v)甲酰胺与0.1％(w/v)牛血清白蛋白(BSA)、0.1％Ficoll、0.1％聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和50mM pH7.5的含有750mM氯化钠和75mM柠檬酸钠的磷酸钠缓冲液，或(3)在42℃使用含有50％甲酰胺、5X SSC(0.75M NaCl和0.075M柠檬酸钠)、50mM磷酸钠(pH6.8)、0.1％焦磷酸钠、5X Denhardt’s溶液和声波处理的鲑精DNA(50μg/ml)、0.1％SDS和10％硫酸葡聚糖的组合物，其中(i)在42℃0.2X SSC中，(ii)在55℃50％甲酰胺中，和(iii)在55℃0.1X SSC中(优选与EDTA组合)洗涤。

本发明进一步提供了编码具有保守性氨基酸置换的Q3 SPARC缺失突变多肽的核酸，该保守性氨基酸置换包括(a)亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、半胱氨酸或苏氨酸改变成亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、半胱氨酸或苏氨酸，(b)甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、丝氨酸、半胱氨酸或苏氨酸改变成甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、丝氨酸、半胱氨酸或苏氨酸，(c)苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸改变成苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸，(d)谷氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺或天冬酰胺改变成谷氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺或天冬酰胺，(e)组氨酸、赖氨酸或精氨酸改变成组氨酸、赖氨酸或精氨酸，和(f)丝氨酸、苏氨酸或半胱氨酸改变成丝氨酸、苏氨酸或半胱氨酸，和(g)其组合。

此外，本发明提供了编码Q3 SPARC缺失突变多肽的分离核酸，该突变多肽在SEQ ID NO：1序列中具有约1至约5个氨基酸，优选约1至约3个氨基酸，更优选1个氨基酸的一个或多个氨基酸插入或缺失。

可以通过本领域已知的几种方法中的任一种来进行诱变。通常，可以通过将核酸序列克隆至质粒或一些其它的易于操纵序列的载体中来实现诱变。然后，鉴定可以将另外的核酸加入到该核酸序列中的独特限制位点或将其插入到该核酸序列中。双链合成寡核苷酸通常由重叠合成单链正义和反义寡核苷酸形成使得双链寡核苷酸在靶序列两侧引入限制位点，例如，可以用于掺入置换DNA。用限制酶切割质粒或其他载体，并将具有相容粘性末端的寡核苷酸序列连接至质粒或其他载体中以置换初始DNA。

体外位点定向诱变的其他手段是本领域技术人员已知的，并可以实现(特别是，使用重叠序列延伸聚合酶链反应(PCR)，参见，例如，Parikh&Guengerich，Biotechniques 24：428-431(1998))。叠盖住改变部位的互补引物可以用于在含有500mM dNTP、2单位Pfu聚合酶、250ng每种正义和反义引物，和200ng含有编码Q3 SPARC缺失突变多肽的序列的质粒DNA的混合物中PCR扩增整个质粒。PCR理想地包括18个循环，对于每Kb DNA延伸时间为2.5分钟。PCR产物可以用DpnI(其只消化腺嘌呤甲基化质粒DNA)处理并转化至大肠杆菌DH5α细胞中。为了改变的引入，可以通过限制酶消化来筛选转化体，然后通过DNA序列分析来证实。

可以分离编码诱变序列的核酸片段，例如，通过使用5’和3’引物的PCR扩增，优选使用终止于突变核苷酸两侧的另外的独特限制位点的5’和3’引物。以这种方式使用引物结果形成两侧为独特限制位点的扩增序列。独特限制位点可以用于进一步方便地亚克隆片段。

本发明进一步提供了包含编码多肽的核酸序列的重组载体，其中，例如，载体进一步包含控制Q3 SPARC缺失突变多肽编码核酸序列表达的启动子。此外，本发明提供了包含权利要求3的核酸分子的细胞，其中所述细胞是原核细胞或真核细胞。组织培养的方法是本领域技术人员公知的(参见，例如，Sambrook&Russell，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(分子克隆：实验室手册)，Cold Spring HarborLaboratory Press，New York(2001)，pp.16.1-16.54)。因此，本发明进一步提供了制备权利要求1的多肽的方法，包括：(a)用编码权利要求1的多肽的核酸转化细胞；(b)诱导转化细胞对多肽的表达；和(c)纯化多肽。

本发明进一步提供了包含控制元件和可操作地连接控制元件(例如，合适的启动子)的在此所述的Q3 SPARC缺失突变多肽核酸分子的核酸构建体，用于Q3 SPARC缺失突变多肽或在此所述的在Q3 SPARC缺失突变多肽中具有保守氨基酸改变的多肽表达。蛋白质表达取决于RNA转录的水平，后者又受到DNA信号的调控。同样，mRNA的翻译最低限度需要AUG起始密码子，其通常位于信使5’末端的10至100个核苷酸内。已经显示出AUG起始密码子两侧的序列影响其被真核核糖体的识别，与导致最佳翻译的完整Kozak共有序列相一致(参见，例如，Kozak，J.Molec.Biol.196：947-950(1987))。此外，细胞中外源核酸的成功表达可能需要所生成的蛋白质的翻译后修饰。因此，本发明提供了编码Q3 SPARC缺失突变多肽的质粒，其中载体是，例如，pCDNA3.1或其衍生物，包括但不限于，在此公开的pVT1000Q3质粒。

在此所述的核酸分子优选包含可操作连接合适的启动子的编码区，该启动子优选在真核细胞中起作用。本发明中可以使用病毒启动子，诸如，但不限于，RSV启动子和腺病毒主要晚期启动子。合适的非病毒启动子包括，但不限于，磷酸甘油激酶(PGK)启动子和延伸因子1α启动子。非病毒启动子理想地是人启动子。其他合适的遗传元件，其中许多是本领域已知的，也可以连接到、附加到或插入到本发明的核酸和构建体中来提供附加的功能、表达水平或表达模式。还可以使用表达SPARC家族基因的天然启动子，在该事件中，优选不将它们用于天然编码它们的染色体中，除非它们通过实质性改变该染色体的方法得到修饰。这类实质性改变的染色体可以包括通过逆转录病毒载体或相似方法转染的和改变的染色体。另外，这类实质性改变的染色体可以包括人造染色体，如HAC、YAC或BAC。

此外，在此所述的核酸分子可以可操作地连接增强子来促进转录。增强子是刺激邻近基因转录的DNA的顺式作用元件。赋予许多不同细胞类型中的连锁基因以高水平转录的来自许多物种的增强子实例包括但不限于，来自SV40的增强子和RSV-LTR。这样的增强子可以与其他的具有细胞类型特异性作用的增强子结合，或者可以单独使用任何增强子。

为了最佳化蛋白质产生，本发明的核酸分子还可以在该核酸分子编码区的后面包含多腺苷酸化位点。此外，优选将所有适当的转录信号(和翻译信号，如果合适的话)正确地排列，使得该外源核酸在将其引入的细胞中得到正确表达。如果需要，该外源核酸还可以引入剪接位点(即，剪接受体和剪接供体位点)来促进mRNA产生同时维持框内全长转录物。此外，本发明的核酸分子可以进一步包含用于加工、分泌、胞内定位等的合适序列。

可以将核酸分子插入任何合适的载体中。合适的载体包括，但不限于，病毒载体。合适的病毒载体包括，但不限于，逆转录病毒载体、α病毒、痘苗病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒和禽痘病毒载体。载体优选具有转化真核细胞，例如，CHO-K1细胞的天然或基因工程能力。此外，本发明中有用的载体可以是“裸”核酸载体(即，载体几乎不具有包封它们的蛋白质、糖和/或脂质)，如质粒或游离基因，或载体可以与其他分子复合。可以合适地与本发明的核酸结合的其他分子包括但不限于病毒外壳、阳离子脂质、脂质体、多胺、金颗粒，和靶向分子如靶向细胞分子的配体、受体或抗体。

可以将在此所述的核酸分子转化至任何合适的细胞中，通常是真核细胞，例如，CHO、HEK293或BHK，理想地导致Q3 SPARC缺失突变多肽，例如，在此所述的包含SEQ ID NO：2或其变体的多肽的表达。可以培养细胞来为核酸分子的表达作准备，因此，产生Q3 SPARC缺失突变多肽，例如，在此所述的包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列或其变体的多肽。

因此，本发明提供了用在此所述的本发明的核酸分子转化或转染的细胞。用外源DNA分子转化或转染细胞的手段是本领域公知的。例如，但不限于，使用本领域公知的转化或转染技术将DNA分子引入细胞中，如磷酸钙或DEAE-葡聚糖介导的转染、原生质体融合、电穿孔、脂质体和直接显微注射(参见，例如，Sambrook&Russell，MolecularCloning：A Laboratory Manual(分子克隆：实验室手册)，Cold SpringHarbor Laboratory Press，New York(2001)，pp.1.1-1.162，15.1-15.53，16.1-16.54)。广泛使用的转化方法是由磷酸钙或DEAE-葡聚糖介导的转染。根据细胞类型，可以在任一时刻转染多达20％的培养细胞群体。

转化方法的另一个实例是原生质体融合方法，将源自携带高拷贝数目标质粒的细菌的原生质体直接与培养的哺乳动物细胞混合。细胞膜融合后(通常使用聚乙二醇)，细菌的内含物被递送至哺乳动物细胞的细胞质中，并且质粒DNA被转移至核中。原生质体融合对于常用于瞬时表达测定的许多细胞系而言不如转染有效，但是对于其中无法有效地发生DNA胞吞作用的细胞系而言是有用的。原生质体融合时常产生随机整合至宿主染色体中的质粒DNA的多个拷贝。

电穿孔，将短暂的高压电脉冲施加于多种哺乳动物和植物细胞，导致在质膜中形成纳米大小的孔。DNA通过这些孔或作为伴随孔关闭的膜成分再分布的结果直接进入细胞质中。电穿孔是非常有效的并可以用于克隆基因的瞬时表达和用于携带整合的目标基因拷贝的细胞系的建立。

脂质体转化涉及DNA和RNA在脂质体内的包封，接着该脂质体与细胞膜融合。此外，用合成阳离子脂质包被的DNA可以通过融合引入细胞中。另外，直连和/或支链聚乙烯亚胺(PEI)可以用于转染中。

将DNA分子直接显微注射至核中具有不使DNA分子暴露于细胞区室如低pH内体的优势。因此，使用显微注射主要作为建立携带整合的目标DNA拷贝的细胞系的方法。

这样的技术可以用于真核细胞的稳定转化和瞬时转化。稳定转化细胞的分离需要引入选择标记，同时进行用目标基因的转化。这样的选择标记包括具有新霉素抗性的基因以及HPRT阴性细胞中的HPRT基因。选择可能需要在选择培养基中长时期培养，至少约2-7天，优选至少约1-5周(参见，例如，Sambrook&Russell，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(分子克隆：实验室手册)，Cold Spring HarborLaboratory Press，New York(2001)，pp.16.1-16.54)。

本发明中所用的核酸序列还可以通过化学合成来部分或全部产生，例如，通过Beaucage等所述的亚磷酰胺法(Tetra.Letts.22：1859-1862(1987))，或三酯法(Matteucci等，J.Am.Chem.Soc.103：3185(1981))，其可以在商业自动化寡核苷酸合成仪上进行。通过在合适条件下合成互补链并将该链一起退火，或通过使用DNA聚合酶和合适的引物序列合成互补链，可以从化学合成的单链产物获得双链片段。

基因治疗是涉及修饰活细胞的遗传物质来对抗疾病的医学干预。对于许多不同类型的癌症和其他疾病，正在临床试验(使用人的研究)中研究基因治疗。

本发明进一步提供了编码适用于“基因治疗”中的Q3 SPARC缺失突变多肽的分离核酸分子(参见，例如，Patil等，AAPS J.7(1)：E61-77(2005))。合适的核酸包括，但不限于，在此所述的包括SEQID NO：3或其修饰和同源物的核酸。基因治疗的目的之一是向细胞提供改造基因，例如，编码Q3 SPARC缺失突变多肽的分离核酸分子。还作为一种改变细胞怎样起作用的方式正在研究基因治疗；例如，通过刺激免疫系统细胞来攻击癌细胞。

一般而言，使用“载体”如在此所公开的那些将基因递送至细胞中。基因治疗中所用的最常见类型的载体是病毒。用作基因治疗中的载体的病毒是遗传上失能的；它们不能自我复制。大部分基因治疗临床试验依赖于小鼠逆转录病毒来递送所需的基因。用作载体的其他病毒包括腺病毒、腺相关病毒、痘病毒和疱疹病毒。合适的病毒基因治疗载体及其体内和先体外后体内的给药方式是本领域已知的。

基因治疗可以先体外后体内或在体内进行。通常，在先体外后体内基因治疗临床测验中，取出患者血液或骨髓中的细胞并在实验室中培养。将细胞暴露于携带所需基因的病毒。该病毒进入细胞中，且所需基因变成细胞DNA的一部分。使细胞在实验室中生长，然后通过注射至静脉中使其返回到患者体内。在体内基因治疗中，使用载体例如病毒或脂质体将所需的基因递送至患者体内的细胞中。

可以从重组宿主细胞表达并纯化Q3 SPARC缺失突变多肽。重组宿主细胞可以是原核或真核的，包括但不限于细菌如大肠杆菌，真菌细胞如酵母，昆虫细胞，包括但不限于，果蝇和家蚕衍生的细胞系，以及哺乳动物细胞和细胞系。当在细胞例如人细胞中表达Q3 SPARC缺失突变多肽时，不管是在体外还是在体内，对于给定的细胞类型(即，物种)，可以使选择用于该编码Q3 SPARC的多核苷酸的密码子最佳化。密码子最佳化的许多技术是本领域已知的(参见，例如，Jayaraj等，Nucleic Acids Res.33(9)：3011-6(2005)；Fuglsang等，ProteinExpr.Purif.31(2)：247-9(2003)；Wu等，“The Synthetic GeneDesigner：a Flexible Web Platform to Explore Sequence Space ofSynthetic Genes for Heterologous Expression，”(合成基因设计者：研究用于异源表达的合成基因的序列空间的灵活网络平台)csbw，2005 IEEE Computational Systems BioinformaticsConference-Workshops(CSBW’05)，pp.258-259(2005))。

在某些实施方案中，当表达和纯化Q3 SPARC缺失突变多肽时，使用提高蛋白质溶解度的技术来防止内含体(其是不溶性部分)的形成，并因此获得大量的多肽。内含体中累积的SPARC是无活性类型的SPARC，没有保留其生理活性。

可以通过本领域已知的方法来提高纯化的Q3 SPARC缺失突变多肽的溶解度。例如，还可以通过表达功能性片段，而非全长Q3 SPARC缺失突变多肽来提高溶解度。此外，为了提高表达蛋白质的溶解度(例如，在大肠杆菌中)，可以通过降低生长温度、使用较弱的启动子、使用较低拷贝数质粒、降低诱导物浓度、改变生长培养基来降低蛋白质合成的速率，如Georgiou&Valax中所述(Current OpinionBiotechnol.7：190-197(1996))。这降低了蛋白质合成的速率并通常获得更易溶解的蛋白质。还可以添加对于正确折叠或对于蛋白质稳定性必需的辅基或辅因子，或添加缓冲剂来控制生长过程中培养基中的pH波动，或添加1％葡萄糖来抑制乳糖对1ac启动子的诱导，乳糖存在于大多数富集培养基(如LB、2xYT)中。还可以将多元醇(例如，山梨糖醇)和蔗糖加入培养基中，因为由这些添加引起的渗透压的增加导致细胞中渗透压保护剂的累积，这样可使天然蛋白质结构稳定。可以添加乙醇、低分子量硫醇和二硫化物，以及NaCl。此外，陪伴分子和/或折叠酶可以与所需的多肽共同表达。陪伴分子通过与折叠中间产物瞬时的相互作用促进适当的异构化和细胞靶向。大肠杆菌陪伴分子系统包括，但不限于：GroES-GroEL、DnaK-DnaJ-GrpE、CIpB。

折叠酶加速沿着折叠途径的限速步骤。三种类型的折叠酶起重要作用：肽酰脯氨酰顺/反异构酶(PPI’s)、二硫键氧化还原酶(DsbA)和二硫键异构酶(DsbC)，即蛋白质二硫键异构酶(PDI)，其是催化蛋白质半胱氨酸氧化和二硫键异构化的真核蛋白质。这些蛋白质中的一种或多种与靶蛋白质的共同表达可以形成较高水平的可溶性靶蛋白。

可以作为融合蛋白来生产Q3 SPARC缺失突变多肽，以便提高其溶解度和产量。融合蛋白包括Q3 SPARC缺失突变多肽和框内与其融合的第二种多肽。所述第二种多肽可以是本领域已知的融合伴侣以提高与其融合的多肽的溶解度，例如，NusA、细菌铁蛋白(BFR)、GrpE、硫氧还蛋白(TRX)和谷胱甘肽-S-转移酶(GST)。Novagen Inc.(Madison，WI)提供了pET 43.1载体系列，其允许形成NusA-靶融合体。也已经显示出DsbA和DsbC用作融合伴侣时对表达水平的积极效果，因此可以将其用于与SPARC多肽融合来获得较高的溶解度。

在一个实施方案中，作为包含Q3 SPARC缺失突变多肽和融合伴侣硫氧还蛋白的融合多肽来生产Q3 SPARC缺失突变多肽，如美国专利US6,387,664中所述，在此以其整体引入作为参考。可以在大肠杆菌中作为易于配制的可溶性蛋白大量生产硫氧还蛋白-SPARC融合体，而不会丧失生理活性。尽管美国专利US6,387,664提供了融合SPARC蛋白，其中SPARC与硫氧还蛋白的C-端融合，但是应当了解，对于本发明而言，Q3 SPARC缺失突变多肽可以与第二种多肽的N-端或C-端融合，只要保持其敏化功能。

除了提高溶解度，为了易于检测细胞中Q3 SPARC缺失突变多肽的表达，还可以构建包含Q3 SPARC缺失突变多肽的融合蛋白。在一个实施方案中，与Q3 SPARC缺失突变多肽融合的第二种多肽是报道多肽。报道多肽，当用于这样的检测目的时，不一定要与Q3 SPARC缺失突变多肽融合。其可以由也编码Q3 SPARC缺失突变多肽的相同多核苷酸(例如，载体)编码并共同引入靶细胞中和在其中共同表达。

优选，本发明中所用的报道多肽是自发荧光蛋白(例如，GFP、EGFP)。自发荧光蛋白提供了鉴定目标多核苷酸表达(和多肽产物)的简便测定法。因为可以使用流式分选仪定量监测报道多肽的活性(并推断其表达水平)，所以易于按顺序或以大量群体测定许多独立的转染子。然后可以从群体中筛选或选择具有最佳表达的细胞。当选择包含Q3 SPARC缺失突变多肽或多核苷酸的重组细胞用于根据本发明的敏化处理时，这是有用的。

可以从细胞群体的荧光强度分布图来确定定量参数如平均荧光强度和变化(Shapiro，H.，1995，Practical Flow Cytometry，217-228)。本发明中有用的报道分子的非限制性实例包括萤光素酶(来自萤火虫或其他物种)、氯霉素乙酰转移酶、β-半乳糖苷酶、绿色荧光蛋白(GFP)、增强型绿色荧光蛋白(EGFP)和dsRed。

还可以通过免疫测定如ELISA(酶联免疫吸附测定法)(参见，例如，美国专利US5,962,320；US6,187,307；和US6,194,205)、蛋白质印迹或通过本领域中其他的常规方法来直接确定SPARC多肽(自身，或作为融合蛋白)的表达。可以通过检测蛋白质的转录物(例如，通过杂交分析，如RNA印迹或DNA微阵列，或通过PCR)来间接检测Q3 SPARC缺失突变多肽的表达。

在一个实施方案中，通过编码接头多肽的间插接头序列使编码第二个多肽的多核苷酸与编码Q3 SPARC缺失突变多肽的多核苷酸融合。

在另一个实施方案中，接头多肽包括蛋白酶切割位点，该位点包括通过蛋白酶可水解的肽键。结果，可以在表达后通过蛋白酶解使Q3SPARC缺失突变多肽与第二个多肽分离。接头可以在肽键的任一侧包含一个或多个附加的氨基酸，蛋白酶的催化位点也与肽键结合(参见，例如，Schecter&Berger，Biochem.Biophys.Res.Commun.27，157-62(1967))。另外，接头的切割位点可以与蛋白酶的识别位点分隔开，这两个切割位点和识别位点可以被一个或多个(例如，两个至四个)氨基酸分隔开。一个方面中，接头包含至少约2、3、4、5、6、7、8、9、约10、约20、约30、约40、约50或更多个氨基酸。更优选，接头为约5至约25个氨基酸长，最优选，接头为约8至约15个氨基酸长。

在以下参考文献中讨论了根据本发明有用的一些蛋白酶：Hooper等，Biochem.J.321：265-279(1997)；Werb，Cell 91：439-442(1997)；Wolfsberg等，J.Cell Biol.131：275-278(1995)；Murakami&Etlinger，Biochem.Biophys.Res.Comm.146：1249-1259(1987)；Berg等，Biochem.J.307：313-326(1995)；Smyth和Trapani，Immunology Today 16：202-206(1995)；Talanian等，J.Biol.Chem.272：9677-9682(1997)；和Thornberry等，J.Biol.Chem.272：17907-17911(1997)。细胞表面蛋白酶也可以与根据本发明的可切割接头一起使用，包括但不限于：氨基肽酶N；嘌呤霉素敏感性氨基肽酶；血管紧张素转化酶；焦谷氨酰肽酶II；二肽酰肽酶IV；N-精氨酸二碱基转化酶；内肽酶24.15；内肽酶24.16；淀粉样前体蛋白分泌酶α、β和γ；血管紧张素转化酶分泌酶；TGFα分泌酶；TNFα分泌酶；FAS配体分泌酶；TNF受体-I和-II分泌酶；CD30分泌酶；KL1和KL2分泌酶；IL6受体分泌酶；CD43、CD44分泌酶；CD16-I和CD16-II分泌酶；L-选择蛋白分泌酶；叶酸受体分泌酶；MMP 1、2、3、7、8、9、10、11、12、13、14和15；尿激酶血纤维蛋白溶酶原激活物；组织血纤维蛋白溶酶原激活物；血纤维蛋白溶酶；凝血酶；BMP-1(原胶原C-肽酶)；ADAM 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10和11；和粒酶A、B、C、D、E、F、G和H。

依靠细胞伴随蛋白酶的可替换方案是使用自我切割接头。例如，可以将口足病病毒(FMDV)2A蛋白酶用作接头。这是在2A/2B连接处切割FMDV多蛋白的17个氨基酸的短多肽。FMDV 2A前肽的序列是NFDLLKLAGDVESNPGP。切割发生在肽C端最后的甘氨酸-脯氨酸氨基酸对处并且与其他FMDV序列的存在无关，并且甚至在异源序列的存在下也进行切割。

两个蛋白质编码区之间(即，根据本发明的融合蛋白的Q3 SPARC缺失突变多肽和第二个多肽之间)该序列的插入导致自我切割嵌合体的形成，其自我切割成在其N-末端携带2A蛋白酶的C-端脯氨酸的C-端片段和在其C-末端携带2A蛋白酶肽的剩余部分的N-端片段(参见，例如，de Felipe等，Gene Therapy 6：198-208(1999))。PCT公开WO 01/20989中进一步描述了自我切割接头和另外的蛋白酶-接头组合，在此将该PCT公开整体引入作为参考。

编码上述接头序列的多核苷酸可以从编码合适蛋白酶的天然底物的序列克隆或可以使用本领域中的常规方法化学合成。

使用SPARC配体和/或抗-SPARC抗体的亲和色谱法也可以用来纯化根据本发明的SPARC多肽。亲和色谱法可以单独使用或结合离子交换、分子大小排阻或HPLC色谱技术使用。可以使用柱子或以分批形式进行这样的色谱方法。这样的色谱纯化方法是本领域公知的。

本发明提供了针对SPARC，特别是Q3 SPARC缺失突变多肽而产生的抗体的用途，用作对抗其中SPARC起作用的疾病的治疗剂或用作其中SPARC起作用的疾病的成像剂。可以通过在给定的一组条件下比较与合适抗原的结合和与无关抗原或抗原混合物的结合来测试抗体的结合特异性。如果抗体结合合适的抗原比结合无关抗原包括，例如，野生型SPARC多肽，或抗原混合物强至少约2倍，优选至少约5倍，更优选至少约7倍，且更优选至少约10倍，那么认为它是特异性的。此外，本发明提供了抗SPARC多肽，例如Q3 SPARC缺失突变多肽的抗体，其中该抗体既结合Q3 SPARC缺失突变多肽也结合野生型SPARC多肽，但是，其中该抗体结合Q3 SPARC缺失突变多肽比结合野生型SPARC多肽强至少约2倍，优选至少约5倍，更优选至少约7倍，且更优选至少约10倍。确定抗体结合强度的各种方法是本领域普通技术人员已知的(参见，例如，Harlow&Lane，Antibodies，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor(1988))。

任何合适的抗SPARC多肽，例如Q3 SPARC缺失多肽的抗体都可以用于本发明方法中，只要该抗体呈现出与SPARC多肽，例如Q3 SPARC缺失突变多肽特异性结合。该抗体可以是单克隆的或多克隆的；并可以通过动物的免疫来产生或通过重组DNA技术如噬菌体展示和体外诱变或抗体重链和轻链基因可变区的合成来产生。多克隆抗体包括，但不限于，人抗体和源自动物如禽类(例如，鸡)、啮齿动物(例如，大鼠、小鼠、仓鼠、豚鼠)、牛、山羊、绵羊、兔子等的人化抗体。单克隆抗体包括源自产抗体细胞，包括但不限于人细胞的单克隆的抗体，和源自其他动物类型，例如，鸡、兔子、大鼠、小鼠、仓鼠、豚鼠、牛、山羊、绵羊等的细胞的抗体。合成抗体包括使用重组DNA手段通过重链和轻链基因可变区的遗传工程产生的抗体。合成抗体还包括化学合成的具有Q3 SPARC缺失突变多肽的多肽结合活性的抗体片段或源自噬菌体展示或相似技术的抗体。制备抗体的方法是本领域已知的(参见，例如，Harlow&Lane，Antibodies，A Laboratory Manual，Cold Spring  Harbor，pp.1-420(1988))。

对于人的应用，为了避免免疫原性和免疫应答，优选的是使用人化抗-Q3 SPARC缺失突变多肽的多肽抗体或合适的片段如Fc或Fab。例如，使用以下规定的方法中的一种来生产人化抗体或其片段：(1)可以使用可变CDR区替换为抗SPARC抗体的可变CDR区的人IgG主链构建人化抗体，在分开的启动子下独立表达或在具有I RES序列的一个启动子下共同表达重链和轻链；(2)使用工程化而具有人免疫系统的小鼠来产生针对SPARC的人化单克隆抗体；或(3)使用噬菌粒(M13、λ大肠杆菌噬菌体或任何能够表面呈递的噬菌体系统)来产生针对SPARC的人化抗体。为了构建全长抗体，将可变区转移至重链的和轻链的CDR上。在哺乳动物细胞如CHO、293或人骨髓细胞中重链和轻链的共同表达形成全长抗体。同样，可以使用公知的方法制备Fc或Fab片段和单链抗体。

根据本发明制得的针对SPARC多肽，例如Q3 SPARC缺失突变多肽的抗体也不限于整个抗体或保留SPARC多肽，例如Q3 SPARC缺失突变多肽结合位点的抗体片段(例如，Fab和Fab2)。该抗体也不限于任一类别的抗体，例如，IgM、IgA、IgG、IgE、IgD和IgY。该抗体也不限于二价抗体、单价抗体或一价为SPARC而另一价为效应物如tTF或蓖麻毒蛋白A的嵌合体。人化抗体不限于IgG。相同的技术可以用于产生所有其他类别的抗体，如IgE、IgA、IgD、IgM，各自具有适于特定疾病靶的不同ADCC和CDC活性。通过有限蛋白酶解可以产生抗体的功能性片段。这些片段可以是单价的如Fab’或二价的如Fab2。还可以在大肠杆菌中作为单链scfv或双特异抗体来合成片段。

本发明还提供了通过由抗-Q3 SPARC缺失突变多肽抗体引起的细胞介导的免疫应答的补体结合和/或征集破坏SPARC表达组织如肿瘤和再狭窄组织的方法。在这种情况下，和B细胞单克隆抗体(抗-CD20抗体)的情况一样，效应物部分是Fc片段，其可以介导补体激活而直接破坏SPARC表达细胞或介导免疫细胞募集至SPARC表达组织而通过细胞介导的免疫应答破坏组织。

本发明还提供了使用针对SPARC的中和抗体，例如，抗-Q3 SPARC缺失突变多肽的多肽抗体抑制SPARC活性的方法。中和抗体具有阻断SPARC与其效应物在体内相互作用的能力，例如，SPARC与细胞表面成分的相互作用或SPARC与其天然配体如白蛋白、生长因子和Ca²⁺的结合。

本发明提供了确定人或其他哺乳动物肿瘤对抗SPARC治疗(例如，抗-Q3 SPARC缺失突变多肽治疗)的应答的方法。该方法包括(a)从人中分离生物样品，(b)检测生物样品中SPARC蛋白质(包括，例如，Q3 SPARC缺失突变多肽)的表达，和(c)定量生物样品中SPARC蛋白的量。因为抗-SPARC治疗依赖于患病组织中SPARC抗体与SPARC的结合，所以患病组织中SPARC的存在对于活性是必要的。

在本发明的方法中，任何合适的化疗剂都可以用来偶联(或缀合)Q3 SPARC缺失突变多肽或针对SPARC多肽，例如Q3 SPARC缺失突变多肽的抗体。合适的化疗剂包括，但不限于，酪氨酸激酶抑制剂(染料木黄酮)、生物活性剂(TNF或tTF)、放射性核素(¹³¹I、⁹⁰Y、¹¹¹In、²¹¹At、³²P和其他已知的治疗用放射性核素)、阿霉素、袢霉素抗生素、天冬酰胺酶、博来霉素、白消安、顺铂、卡波铂、卡氮芥、卡培他滨、苯丁酸氮芥、阿糖胞苷、环磷酰胺、喜树碱、氮烯唑胺、放线菌素D、柔红霉素、右雷佐生、多烯紫杉醇、亚德里亚霉素、足叶乙甙、埃博霉素、5氟脱氧尿苷、氟达拉滨、氟尿嘧啶、吉西他滨、羟基脲、黄胆素、异环磷酰胺、伊立替康、洛莫司汀、二氯甲基二乙胺、巯基嘌呤、meplhalan、氨甲蝶呤、雷帕霉素(西罗莫司)和衍生物、丝裂霉素、米托坦、米托蒽醌、亚硝基脲、紫杉醇、氨羟二磷酸二钠、喷司他汀、普卡霉素、甲基苄肼、美罗华、链脲霉素、替尼泊甙、硫鸟嘌呤、硫涕巴、紫杉烷、长春花碱、长春新碱、长春瑞滨、泰素、考布他汀、discodermolides、反式铂(transplatinum)、抗血管内皮生长因子化合物(“抗-VEGF”)、抗上皮生长因子受体化合物(“抗-EGFR”)、5-氟尿嘧啶等。可以根据本发明的方法给予一定剂量的一种或多种化疗剂。本发明方法中所用化疗剂的类型和数量将取决于特定肿瘤类型的标准化疗方案。换句话说，尽管可以用单一化疗剂常规治疗特定的癌症，但另一种癌症可以用化疗剂的组合来常规治疗。

在此使用的术语“治疗”和“治疗性处理”指的是治愈性治疗、防御性治疗或预防性治疗。“预防性治疗”的实例是预防或减少靶定疾病(例如，癌症或其他增殖性疾病)或与其相关病症的可能性。需要治疗的对象包括已经患病的那些以及易于患有待预防的疾病或病症的那些。在此所用的术语“治疗”和“治疗性处理”还描述了为了抵抗疾病或相关病症对哺乳动物的处理和护理，并包括给予组合物来减轻症状，副作用或疾病、病症的其他并发症。对于癌症的治疗性处理包括，但不限于，外科手术、化疗、放疗、基因治疗和免疫治疗。

“治疗有效量”意指减轻(某种程度上，如通过熟练的执业医师所判断的)哺乳动物中疾病或病症的一种或多种症状的量。此外，“治疗有效量”意指部分或完全恢复到与疾病或病症相关的或导致疾病或病症的正常生理或生化参数的量。本领域有经验的临床医生可以确定组合物的治疗有效量，以便给药时治疗或预防特定的疾病或病症，如以静脉内、皮下、腹膜内、口服方式或通过吸入给药。除了对许多患者特殊的考虑以外，治疗有效所需要的组合物的精确量将取决于多种因素，例如，活性剂的特定活性、所用的递送装置、药剂的物理特性、给药的意图。必须给予的组合物的治疗有效量的确定是本领域中常规的并且在普通临床医生的技能范围内。

如在此所用的，术语“药剂”或“药物”或“治疗剂”指的是认为具有治疗性能的化合物、化合物的混合物、生物大分子或由生物材料如细菌、植物、真菌或动物(特别是哺乳动物)细胞或组织制成的提取物。药剂或药物可以是纯化的、基本上纯化的或部分纯化的。根据本发明，“药剂”还包括放疗剂。

如在此所用的，术语“毒素”指的是有毒物质，是包括细菌、植物的活生物体的代谢活动的特定产物和其他毒素，例如，白喉毒素、假单胞菌外毒素A、葡萄球菌肠毒素A、相思豆毒蛋白-A毒素、蓖麻毒蛋白A(脱糖基化蓖麻毒蛋白A和天然蓖麻毒蛋白A)、TGF-α毒素、来自中国眼镜蛇(naja naja atra)的细胞毒素和白树毒素(一种植物毒素)；来自植物、细菌和真菌的核糖体失活蛋白，如局限曲菌素(由局限曲霉产生的核糖体失活蛋白)或肥皂草毒蛋白(来自肥皂草的核糖体失活蛋白)。

如在此所用的，术语“增殖性疾病”指的是特征在于细胞增殖(例如，有丝分裂)的疾病，细胞增殖包括克隆增殖(例如，癌症)和多克隆增殖(例如，增生；包括但不限于，子宫内膜异位症、子宫内膜增生、良性前列腺增生(BPH))。

如在此所用的，生物分子是由活生物体的代谢活动产生的具有生物活性的分子，例如，细胞因子、白细胞介素、TNF或组织因子(TF)。如在此所用的，生物分子包括由通常在活细胞中发现的亚单位构成的其他分子或其类似物，如具有生物活性的RNA，例如反义RNA、RNAi、核酶、抑制性肽-核酸等。

本领域中已经充分描述了将合适的治疗剂、化疗剂、放射性核素、多肽等与抗体或其片段偶联或缀合的方法。例如，本发明提供了Q3SPARC缺失突变多肽或抗-Q3 SPARC缺失突变多肽抗体缀合物，例如，SPARC-放射性核素、SPARC-药物、SPARC-免疫调节剂或SPARC-毒素缀合物。可以根据本发明使用任何合适的方法来形成SPARC缀合物。例如，但不限于，SPARC蛋白质中的游离氨基，如赖氨酸的ε氨基，可以与试剂如碳二亚胺或异双功能试剂缀合。另外，例如，SPARC巯基基团可以用于缀合。此外，可以氧化与SPARC糖蛋白或抗-SPARC抗体，例如抗-Q3 SPARC缺失突变多肽抗体结合的糖部分来形成醛基，用于多种本领域已知的偶联方法中。根据本发明形成的缀合物可以是在体内稳定的或不稳定的，如酶可降解的四肽键合或酸不稳定性的顺乌头酸或腙键合。

本发明还提供了SPARC-载体-治疗剂分子或抗-SPARC多肽，例如抗-Q3 SPARC缺失突变多肽抗体缀合物，如SPARC和药物与载体的缀合物。根据本发明适用的载体包括，但不限于，葡聚糖、人血清白蛋白和羟丙基甲基丙烯酰胺。此外，本发明提供了药物载体结构如脂质体包被的SPARC或抗-SPARC抗体，例如抗-Q3 SPARC缺失突变多肽抗体。

本发明提供了与聚乙二醇(PEG)缀合的SPARC分子，包括SPARC多肽和蛋白质以及抗-SPARC抗体，例如抗-Q3 SPARC缺失突变多肽抗体。PEG缀合可以增加蛋白质的循环半衰期，降低蛋白质的免疫原性和抗原性，并提高生物活性。可以使用任何合适的缀合方法，包括但不限于，例如，使甲氧基-PEG与SPARC蛋白质的可利用的氨基或其他反应部位，例如组氨酸或半胱氨酸反应。此外，重组DNA方法可以用来将具有PEG-反应性基团的氨基酸添加至本发明的SPARC分子和抗体中。在使PEG与本发明的SPARC蛋白质反应之前可以对PEG进行处理，例如将连接基团添加至PEG上。此外，根据本发明可以使用可释放的和杂种PEG化策略，例如SPARC的PEG化使得添加至SPARC分子中的某些位点上的PEG分子得以在体内释放。这样的PEG缀合方法是本领域已知的(参见，例如，Greenwald等，Adv.Drug Delivery Rev.55：217-250(2003))。

此外，本发明提供了SPARC融合蛋白，例如包括，但不限于，将SPARC序列融合于诊断上有用的蛋白结构域(如，半抗原、GFP)、免疫活性蛋白结构域(例如，TF或TNF)或毒素结构域的上游或下游。

本发明还提供了或与SPARC识别基团缀合的诊断剂的使用方法，该识别基团例如为如上所述的抗体，包括抗-Q3 SPARC缺失突变多肽抗体，或其片段。该诊断剂包括放射性同位素或放射性核素、MRI造影剂、X-射线造影剂、超声造影剂和PET造影剂。用于缀合的方法是本领域已知的。

可以通过本领域已知的任何合适的方法来检测和定量样品中SPARC蛋白的表达。蛋白检测和定量的合适方法包括蛋白质印迹、酶联免疫吸附测定法(ELISA)、银染色、BCA测定法(Smith等，Anal.Biochem.150，76-85(1985))，Lowry蛋白质测定法(描述于，例如，Lowry等，J.Biol.Chem.193，265-275(1951))，这是基于蛋白质-铜复合物的比色测定法，以及Bradford蛋白质测定法(描述于，例如，Bradford等，Anal.Biochem.72，248(1976))，这取决于蛋白质结合时考马斯蓝G-250吸光度的改变。可以通过前述任一种方法分析肿瘤活组织切片检查或可以通过免疫组织化学，使用抗-SPARC抗体，例如，抗-Q3 SPARC缺失突变多肽抗体，(单克隆的或多克隆的)并结合合适的观察系统(即，HRP底物和HRP-缀合的二抗)来分析。

根据本发明待检测、敏化和/或治疗的肿瘤类型通常是在人和其他哺乳动物中发现的那些。肿瘤也可以是如在实验室动物中接种的结果。在人和其他动物病症中遇到许多类型和形式的肿瘤，但并不打算限制本发明的方法只应用于任何特定的肿瘤类型或种类。肿瘤，如所知的，包括由无控和进行性细胞分裂引起的异常组织团块，通常也称为“新生物”。本发明方法可用于肿瘤细胞和相关的基质细胞、实体瘤以及与软组织相关的肿瘤，如，软组织肉瘤，例如，人中的。肿瘤或癌症可以位于口腔和咽喉、消化系统、呼吸系统、骨和关节(例如，骨转移瘤)、软组织、皮肤(例如，黑素瘤)、乳房、生殖系统、泌尿系统、眼睛和眼眶、脑和中枢神经系统(例如，神经胶质瘤)，或内分泌系统(例如，甲状腺)，并且不必定是原发性肿瘤或癌症。与口腔相关的组织包括，但不限于，舌和口的组织。癌症可发生于消化系统的组织，包括，例如，食道、胃、小肠、结肠、直肠、肛门、肝脏、胆囊和胰腺。呼吸系统的癌症可以影响咽喉、肺和支气管并包括，例如，非小细胞肺癌。肿瘤可发生于子宫颈、子宫体、卵巢、外阴、阴道、前列腺、睾丸和阴茎，这些构成男性和女性的生殖系统，以及膀胱、肾脏、肾盂和输尿管，这些构成泌尿系统。肿瘤或癌症可以位于头部和/或颈部(例如，喉癌和甲状旁腺癌)。肿瘤或癌症还可以位于造血系统或淋巴系统，并包括，例如，淋巴瘤(例如，霍奇金病和非霍奇金淋巴瘤)、多发性硬化或白血病(例如，急性淋巴性白血病、慢性淋巴性白血病、急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病等)。优选，肿瘤位于膀胱、肝脏、卵巢、肾脏、消化道、脑或乳房。

本发明进一步提供了使疾病对治疗敏感的方法，包括将Q3 SPARC缺失突变多肽和药物学上可接受的载体给予患者。需要敏化的合适的这类疾病，包括，但不限于，抗治疗性(例如，抗化疗或放疗性)癌症。如在此所用的，术语“敏化”指的是提高的敏感性或降低癌症样品或哺乳动物响应治疗性处理的抗性。根据本领域中已知的特定治疗方法和下文中所述的方法，包括，但不限于，细胞增殖测定法或细胞死亡测定法来测量对治疗性处理提高的敏感性或降低的敏感性。还可以通过测量一段时间内肿瘤大小的减小来测量动物中的敏感性或抗性，例如，对于人为6个月，对于小鼠为4-6周。如果与组合物或方法不存在下的治疗敏感性或抗性相比较，治疗敏感性的增加或抗性的降低为约25％或更高，例如，约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％，或更高，至约2倍、约3倍、约4倍、约5倍、约10倍、约15倍、约20倍或更高，那么该组合物或方法就敏化了对治疗性处理的响应。对治疗性处理的敏感性或抗性的确定是本领域中常规的并且在本领域普通临床医生的技能范围内。因此，根据本发明使用SPARC进行疾病敏化可以进一步包括给予一种或多种非SPARC治疗剂，例如联合化疗或其他药物。

本发明还提供了将化疗剂递送至哺乳动物肿瘤的方法。该方法包括将治疗有效量的递送剂如药物组合物给予人或其他哺乳动物，其中递送剂(例如，药物组合物)包含与Q3 SPARC缺失突变多肽或抗Q3-SPARC缺失突变多肽抗体偶联的化疗剂。例如，化疗剂可以与SPARC识别基团，如识别SPARC蛋白的抗体偶联，或可以仅仅是SPARC抗体。药物组合物优选包含与SPARC识别基团偶联的化疗剂和药物学上可接受的载体。关于本发明的其他实施方案以上给出的化疗剂、肿瘤、哺乳动物及其成分的描述也适用于上述将化疗剂递送至肿瘤方法的那些相同方面。

在另一个优选的实施方案中，本发明还提供了将药物活性剂(例如，单独的抗-SPARC或抗-Q3 SPARC缺失突变多肽抗体或与抗-SPARC或抗-Q3 SPARC缺失突变多肽抗体偶联或缀合的化疗剂等)递送至患病部位的方法，疾病的特征在于在人或表达该蛋白或标记的其他动物中SPARC的过量表达。这样的疾病包括身体组织(例如，软组织、结缔组织、骨、实体器官、血管等)中增殖、组织重塑、增生和过分的伤口愈合的异常情况。通过给予含有Q3 SPARC缺失突变多肽或抗-SPARC多肽抗体的药物组合物，例如抗-Q3 SPARC缺失突变多肽抗体治疗可以治疗或诊断的疾病实例包括癌症、糖尿病或其他视网膜病、炎症、关节炎、动脉粥样硬化、肾小球膜疾病、血管、人造血管移植物或装置的再狭窄等。

本发明方法包括将治疗有效量的药物组合物给予患有特征在于SPARC过量表达的疾病的哺乳动物，该组合物包含与Q3 SPARC缺失突变多肽或抗-SPARC多肽如抗-Q3 SPARC缺失突变多肽抗体偶联的化疗剂或放射性元素。可以使用任何合适的方法将化疗剂或放射性试剂与识别SPARC的抗体偶联。优选，化疗剂可以通过共价键包括例如二硫键以化学方式与化合物偶联。

对于体内应用，将与治疗剂偶联或缀合的Q3 SPARC缺失突变多肽或抗-SPARC多肽抗体如抗-Q3 SPARC缺失突变多肽抗体理想地配制成含有生理学上可接受载体的药物组合物。任何合适的生理学上可接受的载体都可以用于本发明中，且这样的载体是本领域中公知的。

载体通常是液体的，但也可以是固体的，或液体和固体成分的组合。载体理想地是生理学上可接受的(例如，药物学上可接受的或药理学上可接受的)载体(例如，赋形剂或稀释剂)。生理学上可接受的载体是公知的并且是易于获得的。至少部分地通过靶组织和/或细胞的位置和用于给予组合物的特定方法来决定对载体的选择。

通常，可以将这类组合物制成注射剂，作为液体溶液或悬浮液；还可以制备适用于在注射之前加入液体而制成溶液或悬浮液的固体形式；也可以将制备物乳化。适于注射用的药物制剂包括无菌水溶液或分散体；含有已知蛋白质稳定剂和可溶保护剂(lyoprotectant)的制剂，包括芝麻油、花生油或水性丙二醇的制剂，以及用于无菌注射溶液或分散体临时制备的无菌粉末。在所有情况下，制剂必须是无菌的且必须是达到存在易于注射性这样的程度的流体。其在制备和贮存条件下必须是稳定的且必须受到保护以免受微生物如细菌和真菌的污染作用。可以在水合适地与表面活性剂如羟基纤维素混合的中制备作为游离碱的活性化合物或药物学上可接受盐的溶液。还可以在甘油、液体聚乙二醇及其混合物中和在油中制备分散体。在通常的贮存和使用条件下，这些制剂含有防腐剂以防止微生物的生长。

可以将Q3 SPARC缺失突变多肽或抗-SPARC如抗-Q3 SPARC缺失突变多肽治疗剂配制成中性或盐形式的组合物。药物学上可接受的盐包括酸加成盐(与蛋白质的游离氨基形成的)并且其是与无机酸如盐酸或磷酸或有机酸如乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等形成的。与游离羧基形成的盐也可以源自无机碱，例如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化铁，和源自有机碱如异丙胺、三甲胺、组氨酸、普鲁卡因等。

组合物可以进一步包含任何其他合适的成分，尤其是用于增加组合物的稳定性和/或其最终用途。因此，存在多种本发明组合物的合适制剂。以下制剂和方法只是示例性的而决不是限制性的。

适用于通过吸入给药的制剂包括气溶胶制剂。可以将气溶胶制剂置于加压的可接受的推进剂，如二氯二氟甲烷、丙烷、氮等中。还可以将它们配制成非加压的制剂，用于由雾化器或喷雾器递送。

适用于非肠道给药的制剂包括水性和非水性的等渗无菌注射溶液，其可以含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和使得制剂与指定接受者血液等渗的溶质，以及可以包括悬浮剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂和防腐剂的水性和非水性无菌悬浮液。制剂可以存在于单位剂量或多剂量的密封容器中，如安瓿和小瓶，并可以贮存于冷冻干燥(冻干)条件下，在临使用之前，只需要加入用于注射的无菌液体赋形剂，例如，水。可以从前面所述类型的无菌粉末、颗粒和片剂制备临时注射溶液和悬浮液。在本发明的优选实施方案中，配制Q3 SPARC缺失突变多肽或抗-SPARC如抗Q3 SPARC缺失突变多肽治疗剂用于注射(例如，非肠道给药)。在这点上，制剂理想地是适于肿瘤内给药，而且可以配制用于静脉内注射、腹膜内注射、皮下注射等。

可以通过将活性成分与各种基料如乳化基料或水溶性基料混合，将适用于肛门给药的制剂制成栓剂。适用于阴道给药的制剂可以呈现为阴道栓剂、卫生棉条、霜剂、凝胶、糊剂、泡沫或喷雾配方，其除了活性成分以外，还含有如本领域已知的合适的载体。

此外，本发明的组合物可以包含另外的治疗剂或生物活性剂。例如，可以存在特定适应症治疗中有用的治疗因子。控制炎症的因子，如异丁苯丙酸或类固醇，可以是组合物的一部分以减轻与体内给予药物组合物和生理病痛相关的肿胀和炎症。

本发明进一步提供了将疾病分类的方法，包括检测缺失了对应于SEQ ID NO：1中氨基酸位置20的谷氨酰胺的SPARC多肽。该分类可以，例如，但不限于，表明疾病的存在，提供有关疾病病期的信息，是给定患者预后的信息或预测对治疗的响应。合适的疾病包括，但不限于，涉及新血管生成的疾病(例如，癌症或视网膜病)或增殖性疾病(例如，癌症、良性肿瘤、肾小球病、动脉粥样硬化和增殖性血管再狭窄)。合适的SPARC多肽包括，但不限于，其中检测的突变SPARC多肽包括SEQ ID NO：2的氨基酸序列。

在本发明方法中，可以从哺乳动物分离任何合适的生物样品，并用于多肽和/或核酸分析。优选，从肿瘤中分离生物样品，如通过肿瘤活组织切片检查。使用本领域已知的方法从哺乳动物中分离生物样品。另外，可以从哺乳动物体液中分离生物样品，包括，例如，脑脊髓液、血液、血浆、血清或尿液。特别是，许多蛋白质纯化技术是本领域已知的(参见，例如，Harlow&Lane，Antibodies，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor，pp.421-696(1988))。

根据本发明可以使用任何合适的用于检测缺失了对应于SEQ IDNO：1中氨基酸位置20的谷氨酰胺的SPARC多肽的方法，包括但不限于使用抗-Q3 SPARC缺失突变抗体(例如蛋白质印迹，ELISA)，使用SPARC特异性结合蛋白(例如，放射性标记SPARC配体，ELISA样测定法)或部分纯化或纯化SPARC多肽的直接测序(例如Sanger测序、HPLC肽图谱和Edman降解、质谱技术、酶促降解)(参见，例如，Harlow&Lane，Antibodies，A Laboratory Manual Cold Spring Harbor，pp.421-696(1988)；Kirkpatrick等，Nature Cell Biol.7(8)：750-7(2005)；Tomita等，J.Biol.Chem.279(52)：54161-72(2004))。

本发明还提供了将疾病分类的方法，包括检测编码缺失了对应于SEQ ID NO：1中氨基酸位置20的谷氨酰胺的SPARC多肽的核酸，包括其中核酸是DNA或RNA。此外，本发明提供了将疾病分类的方法，包括但不限于，其中检测的突变SPARC核酸包含SEQ ID NO：3的核酸序列。该分类可以，例如但不限于，表明疾病的存在、提供关于疾病病期的信息，是给定患者预后的信息或预测对治疗的响应。合适的疾病包括，但不限于，涉及新血管形成的疾病(例如癌症或视网膜病)或增殖性疾病(例如癌症、良性肿瘤、肾小球病、动脉粥样硬化和增殖性血管再狭窄)。

根据本发明可以使用任何合适的方法来检测编码缺失了对应于SEQ ID NO：1中氨基酸位置20的谷氨酰胺的SPARC多肽的核酸。

可以以多种不同的方式从含有遗传物质的生物样品获得核酸序列信息，特别是，含有目标序列的核酸(遗传物质)。用于从生物样品中提取核酸的许多方法是本领域已知的。存在许多已知的用于从生物样品中分离或同时DNA和RNA的方法。通常，当根据各种多步骤方案中的任何一种首先裂解样品然后从裂解物中分离DNA时，可以从生物样品中分离DNA，其可能花费不同长度的时间。DNA分离方法可以涉及苯酚的使用(参见，例如，Sambrook&Russell，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，(分子克隆：实验室手册)，Cold Spring HarborLaboratory Press，New York(2001)，pp.6.1-6.62)。例如，在去污剂溶液中裂解生物样品，并用蛋白酶消化裂解物的蛋白质成分12-18小时。接着，用苯酚提取裂解物以除去大部分细胞成分，进一步处理剩余的水相以分离DNA。在另一种方法中，描述于van Ness等(美国专利US5,130,423)中，将非腐蚀性苯酚衍生物用于分离核酸，结果形成RNA和DNA混合物的制剂。

用于DNA分离的其他方法利用非腐蚀性的离液剂。这些方法，其基于使用胍盐、脲和碘化钠，涉及生物样品在离液水溶液中的裂解和随后用低级醇沉淀粗DNA级分(参见，例如，Analects，(1994)Vol22，No.4，Pharmacia Biotech；美国专利US5,128,247)。用于分离RNA和DNA的多种其他方法是本领域已知的，如Chomczynski描述的方法(美国专利US5,945,515)，借此可以有效地在二十分钟的短时间内提取遗传物质。

一旦从受治疗者中获得受治疗者的核酸，就可以进一步分析来检测或确定目标序列中一种或多种多态性或突变的存在或不存在，只要获得的遗传物质含有目标序列。特别是，本领域技术人员可以检测编码SPARC多肽的核酸序列，该多肽包含其中缺失了对应于SEQ ID NO：1中氨基酸20的谷氨酰胺的氨基酸序列。目标序列还可以包含其他突变，或还可以含有一些围绕目标突变的序列。

核苷酸同一性或一种或多种单核苷酸多态性存在(SNP分型)的检测或确定，可以通过本领域已知的多种方法或测定法中的任何一种来实现。许多DNA分型方法是有用的SNP检测，包括但不限于，序列特异性杂交、引物延伸、寡核苷酸连接和侵入性切割方法。合适的反应可以发生在溶液中或固体支持物，如载玻片、芯片、珠子等上。

序列特异性杂交涉及杂交探针，其能够通过杂交区分一个核苷酸位置上不同的两个DNA靶。在一种方法中，“分子标志”，杂交探针具有3’和5’报道分子和淬灭分子以及互补的3’和5’序列，使得不存在对于间插序列合适的结合靶时，探针将形成发夹环。发夹环使报道分子和淬灭剂保持紧密邻近，导致荧光团的淬灭，这减少了荧光发射。在与靶杂交时，荧光团和淬灭剂充分分开以使荧光从荧光团发射出来。引物延伸反应(即，微型测序、核苷酸特异性延伸或简单PCR扩增)也可用于序列鉴别反应中。

寡核苷酸连接测定需要每个SNP具有两个序列特异性探针和一个普通连接探针。普通连接探针接近序列特异性探针杂交并且当存在合适序列特异性探针的完全匹配时，连接酶连接序列特异性探针和普通探针。

侵入性切割方法需要称为“Invader^”(Third WaveTechnologies)的寡核苷酸探针和序列特异性探针来与具有一个核苷酸重叠的靶DNA退火。当序列特异性探针与多形性碱基互补时，Invader寡核苷酸3’端的重叠形成被Flap内切核酸酶识别和切割的结构，释放等位基因特异性探针的5’臂。

5’外切核酸酶活性或“TaqMan^”测定法(Applied Biosystems)是基于Taq聚合酶的5’核酸酶活性，Tag聚合酶替代并切割与靶DNA杂交的寡核苷酸探针，产生荧光信号。需要具有两个在多形性位点上不同的探针，其中一个探针与“正常”序列互补而另一个与目标突变互补。这些探针具有连接于5’端的不同荧光染料和连接于3’端的淬灭剂，当探针是完整的时候，淬灭剂与荧光团通过荧光共振能量转移(FRET)相互作用来淬灭探针的荧光。在PCR退火步骤的过程中，杂交探针与靶DNA杂交。在延伸步骤中，通过Taq聚合酶的5’核酸酶活性切割5’荧光染料，导致报道染料的荧光增强。错配的探针被替代而没有片段化。通过测量这两个不同染料的信号强度来确定样品中突变的存在。

此外，存在多种其他序列鉴别和检测方法，如可以在微阵列上进行阵列引物延伸微型测序、标记物微阵列和序列特异性延伸。一种这样的基于阵列的基因型分型平台是基于微球体的“tag-it”高通量基因型分型阵列(Bortolin等，Clinical Chemistry 50(11)：2028-36(2004))。

突变检测方法还可以包括但不限于以下方法：

限制性片段长度多态性(RFLP)策略-基于RFLP凝胶的分析，可以用来表示基因内的多态性位点上特异性突变的存在或不存在，基于限制位点的存在或不存在；

测序-例如，用于测序的Maxam-Gilbert技术(Maxam&Gilbert，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 74(4)：560-564(1977))或Sanger等公开的双脱氧测序法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 74(12)：5463-5467(1977))。此外，RNA测序法也是已知的。例如，逆转录酶和双脱氧核苷酸已经用于测序脑心肌炎病毒RNA(Zimmern&Kaesberg，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 75(9)：4257-4261(1978))。Mills和Kramer(Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1979)76(5)：2232-2235)描述了使用Qβ复制酶和核苷酸类似物肌苷以链终止机制测序RNA。测序RNA的直接化学方法也是已知的(例如Peattie，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 76(4)：1760-1764(1979))。也可以通过用激光刺激切割核苷酸的天然荧光来阅读核酸序列，同时在荧光增强基质中含有单核苷酸(美国专利US5,674,743)；

鉴定单核酸多态性或涉及少数核苷酸的其他突变的杂交方法描述于美国专利US6,270,961&6,025,136中；

Freeman等描述了模板指引的染料终止剂掺入与荧光偏振检测(TDI-FP)方法(J.Mol.Diagnostics 4(4)：209-215(2002))；

寡核苷酸连接测定法(OLA)是基于探针和检测剂寡核苷酸退火到聚合酶链反应扩增子链的连接与通过酶免疫测定法的检测(参见，例如，Villahermosa，J.Hum.Virol.4(5)：238-48(2001))；

连接-滚环扩增(L-RCA)也已经成功地用于基因型分型单核苷酸多态性，如Qi等所述(Nucleic Acids Res.29(22)：E116(2001))；

5’核酸酶测定法也已经成功地用于基因型分型单核苷酸多态性(Aydin等，Biotechniques(4)：920-2，924，926-8(2001))；

聚合酶校读方法用于确定SNP同一性，如PCT公开WO 01/81631中所述；

通过酶放大电子转导对单碱基对DNA突变的检测描述于Patolsky等，Nature Biotech.(2001)19(3)：253-257(2001)；

也已知基因芯片技术用于单核苷酸多态性鉴别，借此可以在单阵列上同时测试多种多态性(参见，例如，Gilles等，Nat.Biotechnology17(4)：365-70(1999))；

基质辅助激光解吸离子化-飞行时间(MALDI-TOF)质谱学也用于通过分析微测序产物基因型分型单核苷酸多态性(参见，例如，Haff&Smirnov，Nucleic Acids Res.25(18)：3749-50(1997))。

序列特异性PCR方法也已经成功地用于基因型分型单核苷酸多态性(Hawkins等，Hum.Mutat.(2002)19(5)：543-553)。因此，本发明提供了一种方法，其中使用包括聚合酶链反应(PCR)的方法检测编码Q3 SPARC缺失突变多肽的核酸。此外，本发明提供了一种方法，其中使用包括PCR的方法检测突变和非突变SPARC核酸，其中一个或多个正向引物选自包含SEQ ID NOS：7-9序列的引物而反向引物包含SEQ ID NO：10的序列。

另外，如果受治疗者的基因序列数据已经是已知的，那么获取可以涉及从数据库检索受治疗者的核酸序列数据，随后通过阅读受治疗者的多态性位点上的核酸序列确定或检测多态性位点上的核酸或基因型的同一性。

本发明还提供了将治疗组合物转运穿过内皮屏障从血管进入肿瘤间质组织的手段。抗体治疗和化疗中的主要障碍是穿过内皮屏障进入肿瘤间质组织的转移。白蛋白利用白蛋白受体转运机制穿过内皮屏障。这种转运机制可能与文献中报道的那些相同(gp60和albondin)或是通过其他机制。白蛋白上附带的治疗剂呈现出提高的肿瘤摄取(实例-ABI-007肿瘤摄取和转吞胞作用)。使用生理性白蛋白转运机制可以获得提高的穿过内皮屏障的转移。

对于小分子，可以进行修饰，以便提高药物对白蛋白的亲和力。对于小分子的配制，可以除去防止药物与白蛋白结合的溶剂。另外，可以将小分子与白蛋白、抗白蛋白抗体、其片段或白蛋白-受体的配体连接，如下所述。

对于生物分子，如蛋白质、抗体和片段，可以用白蛋白结合肽工程化生物制品，使得生物制品呈现出对白蛋白的亲和力。肽可以是白蛋白结合序列、抗白蛋白的抗体或抗体片段、抗白蛋白载体的抗体或抗体片段，如gp60/albondin/清除剂受体/或TGF-β受体，或细胞膜穴样内陷(白蛋白转运体)中发现的任一种蛋白质的抗体。本发明还包括制备成嵌合体的抗体或其合适的片段，嵌合体中一价为SPARC而另一价为经内皮转运的效应物如gp60/albondin/清除剂受体/或TGF-β受体，或针对内皮细胞的细胞膜穴样内陷中发现的任一种蛋白质的抗体或其合适的片段。

以下实施例进一步说明了本发明，但是，当然不应当以任何方式构成对其范围的限制。

实施例1

该实施例说明了SPARC与白蛋白在MX-1肿瘤异种移植物中的共同定位。

紫杉醇白蛋白纳米颗粒(Abraxane，ABX或ABI-007)已经显示出在3期转移性乳腺癌试验中具有提高的超过红豆杉醇(TAX)的反应(33％对19％，p＜0.0001)(参见，例如，O’Shaughnessy，SABCS 2003)。就ABX对TAX而言，最近证实了白蛋白介导的紫杉醇(P)的经内皮转运和提高的紫杉醇的肿瘤内累积(参见，例如，Desai，SABCS 2003)。白蛋白与SPARC结合(参见，例如，Schnitzer，J.Biol.Chem.269：6072-82(1994))。

MX-1肿瘤细胞系源自人乳腺癌。将人MX-1肿瘤异种移植物、人原发性乳房肿瘤组织(n＝141)和正常人乳房组织(n＝115)的连续冷冻切片免疫染色并对白蛋白、SPARC(使用抗-SPARC抗体)和窑蛋白-1染色进行评分(0-4)。还将培养的MX-1细胞对SPARC进行了免疫染色。用放射性紫杉醇(P)(20mg/kg IV)制备紫杉醇白蛋白纳米颗粒(Abraxane、ABX和ABI-007)和Taxol(TAX)，并用于确定紫杉醇在无胸腺小鼠的正常组织中的生物分布。

MX-1肿瘤中的白蛋白染色是病灶性的并与SPARC共同定位(图1)。窑蛋白-1染色证实了含白蛋白区域的血管密度与无白蛋白区域几乎没有差别。通过使用抗-SPARC抗体进行阳性染色证实了MX-1培养细胞对SPARC的表达。就7/10组织而言，与TAX相比较，正常组织(SPARC阴性)中的紫杉醇累积对于ABX显著较低(p＜0.004)。46％的人原发性乳房肿瘤与1％的正常组织相比呈现出强烈的SPARC染色(分数＞2)(p＜0.0001)。在50个肿瘤组织的亚组中，SPARC表达与染色、ER状态或PgR状态无关；然而在p53-阴性肿瘤中存在高SPARC表达的趋势。

白蛋白和SPARC的共同定位表明了SPARC，因其白蛋白结合活性，可以作为乳房肿瘤中白蛋白结合的肿瘤内靶。因为紫杉醇在ABX中的转运依赖于白蛋白(参见，例如，Desai SABCS，2003)，所以这可以解释ABX与TAX相比提高的肿瘤累积。正常组织中的ABX累积低于TAX累积，与正常组织中缺乏SPARC表达相一致。筛选患者中的SPARC允许鉴定对ABX反应性更大的患者。这些肿瘤中SPARC的存在允许使用抗-SAPRC抗体来靶向和治疗。

实施例2

该实施例说明了内皮受体(gp60)介导的紫杉醇白蛋白纳米颗粒(ABI-007)的细胞膜穴样内陷转吞胞作用。

证明了紫杉醇(P)白蛋白纳米颗粒(Abraxane、ABX或ABI-007)在III期转移性乳腺癌试验中超过Taxol的提高的反应率(33％对19％，p＜0.0001)(SABCS，O’Shaughnessy等，2003)。Taxol(TAX)中的克列莫佛将P捕获于血浆中的胶束中，降低了细胞分配可利用的紫杉醇(参见，例如，Sparreboom等，Cancer.Res.59，1454(1999))。在无胸腺小鼠中的研究已经显示出与等剂量的TAX相比较，使用ABX的肿瘤内紫杉醇浓度高30-40％(SABCS，Desai等，2003)。通过特异性受体(gp60)介导的细胞膜穴样内陷转运将白蛋白转运穿过内皮细胞(EC)(参见，例如，John等，Am.J.Physiol.284，L187(2001))。假设ABX中白蛋白结合的紫杉醇可以通过gp60转运穿过肿瘤微血管EC，且与TAX相比较，这种机制对于ABX可能特别有效。

进行了一系列实验来评价对于ABX和TAX来说，紫杉醇通过人脐带静脉内皮细胞(HUVEC)和人肺微血管内皮细胞(HLMVEC)的结合和转运。将荧光紫杉醇(FP)用作探针，并用FP配制荧光ABX和TAX来探测紫杉醇穿过生长于transwell装置中的EC单层的结合和转运。

紫杉醇与细胞(HUVEC)的结合对于ABX比TAX高10倍。与TAX相比，对于HUVEC和HMVEC来说，紫杉醇从ABX转运穿过EC单层分别提高了2-3倍和2-4倍。转运依赖于白蛋白。紫杉醇从ABX的转运因抗SPARC抗体的存在而受到抑制，已知该抗体结合gp60，gp60是细胞膜穴样内陷白蛋白转吞胞作用所需要的受体。已知的细胞膜穴样内陷转吞胞作用的抑制剂NEM和β-甲基环糊精(BMC)也抑制了紫杉醇从ABX穿过内皮单层的转运(图2)。细胞膜穴样内陷转运的抑制使P从ABX的转运减少到TAX转运的水平。

这些结果证明了来自ABX的紫杉醇通过gp60-介导的细胞膜穴样内陷转吞胞作用被有效地转运穿过EC，而来自TAX的P似乎主要通过细胞旁(paracellular)(非细胞膜穴样内陷)机制以低2-4倍的比率被转运。该途径可能部分引起对于ABX相对于TAX所看到的增加的肿瘤内紫杉醇浓度。TAX中的克列莫佛抑制了紫杉醇穿过内皮细胞的转吞胞作用。

实施例3

该实施例说明了MX-1肿瘤细胞中表面SPARC的表达。

使用本领域已知的方法，在盖玻片上培养MX-1细胞，用抗人SPARC的抗体染色。观察抗体染色，这表明了MX-1正在表达SPARC。这些结果表明在MX-1肿瘤细胞中检测到的SPARC表达是MX-1肿瘤细胞分泌SPARC的结果。染色对MX-1肿瘤细胞比对正常初级细胞如HUVEC(人脐带静脉内皮细胞)、HLMVEC(人肺微血管内皮细胞)和HMEC(人乳房上皮细胞)更强烈。尽管大部分SPARC染色是内部SPARC，但也检测到显著水平的表面SPARC，如通过共焦显微镜检查和未透化细胞染色所表明的。

实施例4

该实施例说明了标记的白蛋白进入到MX-1肿瘤细胞中的内在化以及在MX-1细胞内与胞内SPARC表达的共同定位。

在盖玻片上培养MX-1细胞，并用合适的试剂透化。将细胞暴露于荧光白蛋白并在洗涤后暴露于SPARC抗体。接着暴露于具有不同于白蛋白的荧光标记的二抗。令人惊讶地观察到标记的白蛋白与细胞内存在的SPARC共同定位，表明白蛋白快速内在化并靶向胞内SPARC。

实施例5

该实施例说明了与Taxol相比含有紫杉醇和白蛋白的药物组合物通过gp60(白蛋白受体)的内皮转吞胞作用的增加。

在transwell上使人肺微血管内皮细胞(HLMVEC)生长至汇合。将本发明的含有紫杉醇和白蛋白的药物组合物，或含有20μg/mL浓度的荧光紫杉醇(Flutax)的Taxol加入到transwell的上室中。

使用荧光计连续监测紫杉醇通过转吞胞作用从上室至下室的转移。还使用了只含有Flutax而不含白蛋白的对照。含有Flutax的对照显示出没有转移，证实了汇合HLMVEC单层的完整性。在5％HSA(生理浓度)的存在下，来自白蛋白-紫杉醇组合物的紫杉醇比来自Taxol的紫杉醇转移快。白蛋白-紫杉醇组合物和Taxol的转移速率常数(Kt)分别是1.396h^-1和0.03h^-1。穿过单层转移的紫杉醇总量对于白蛋白-紫杉醇组合物来说比Taxol高三倍。因此，使用白蛋白或其他合适的模拟物，包括抗gp60受体或其他内皮细胞受体的抗体或片段，可以有助于所需的治疗剂穿过内皮屏障转移至肿瘤间质组织中。

实施例6

该实施例说明了SPARC蛋白在人乳腺癌细胞中的过量表达。

使用来自Cybrdi，Inc.(Gaithersburg，MD)的肿瘤阵列来确定人乳腺癌细胞中的SPARC表达。该分析的结果列于表1中。从“负”到4+来评价染色强度，较高的数值对应于较大的过量表达强度。与1％的正常组织相比49％的乳腺癌对于SPARC的染色为阳性(2+以及2+以上)，(p＜0.0001)。

表1

实施例7

该实施例说明了抗-SPARC抗体与SPARC的特异性结合。

通过声波处理由HUVEC细胞制备完整细胞提取物。通过5-15％SDS-PAGE分离蛋白质，转移至PVDF膜上并用抗SPARC的多克隆抗体和抗SPARC的单克隆抗体显现。两种抗体都对38kDa的单一条带有反应，38kDa是SPARC的正确分子量。当通过相同方法分析MX-1时，在澄清的细胞裂解物或富含膜的膜部分中都检测到SPARC。

实施例8

该实施例说明了使用白蛋白结合紫杉醇的纳米颗粒(ABI-007)在鳞状头颈癌中SPARC过量表达与高反应率的相关性。

在头颈部(H&N)和肛门管鳞状细胞癌(SCC)患者的I期和II期临床研究中，对于动脉内递送的白蛋白结合紫杉醇纳米颗粒(Abraxane、ABX或ABI-007)，分别观察到78％和64％的反应率(参见，例如，Damascelli等，Cancer，92(10)，2592-2602(2001)和Damascelli等，AJR，181，253-260(2003))。在比较ABX和Taxol(TAX)的体外细胞毒性中，就ABX(0.004μg/ml)相对于TAX(0.012μg/ml)而言，我们观察到鳞状颈部(A431)系表明了提高的IC₅₀。最近证明了就ABX相对于TAX而言，白蛋白介导的紫杉醇(P)经内皮细胞膜穴样内陷转移和增加的P的肿瘤内累积(参见，例如，Desai，SABCS 2003)。

将人H&N肿瘤组织(n＝119)和正常人H&N组织(n＝15)免疫染色，并使用肿瘤和正常组织阵列对SPARC染色评分(0-4)。使用多克隆兔抗SPARC抗体进行免疫染色。相对于0％(0/15)的正常组织在60％(72/119)的H&N肿瘤中SPARC被过量表达(分值＞2)(p＜0.0001)。这可以解释之前在鳞状H&N癌中看到的ABX的高单一试剂活性是由于白蛋白结合紫杉醇与这些肿瘤中表达的SPARC的结合。

在新的I期剂量递增研究中(在30分钟内IV给予ABX q3w)，分析头颈部癌患者亚组(n＝3)对ABX的反应。在I期研究中，2/3H&N癌患者在以135mg/m²(1pt)和225mg/m²(1pt)剂量水平进行2个循环的治疗后获得部分反应(PR)。三分之一患者以260mg/m²进行。将来自这些患者的肿瘤组织对SPARC染色，1名有反应的患者显示出强烈的SPARC过量表达。

在另一项用动脉内Abraxane治疗的头颈部(H&N)鳞状细胞癌(SCC)患者的II期研究中，注意到68％的总反应率。在分析其组织中的SPARC染色的10名有反应的患者中，发现70％强烈过量表达SPARC。

实施例9

该实施例说明了编码Q3 SPARC缺失突变多肽的人SPARC cDNA的克隆和测序。

使用如美国专利US6,316,193中所述的高通量筛选方法筛选正常人前列腺cDNA文库中含有SPARC cDNA的克隆。分离SPARC cDNA克隆并使用沿着其长度分布的引物测序来获得完整的cDNA序列(参见图3)。使用载体NTI程序汇编测序数据。人SPARC cDNA的参照Genebank序列(NM 003118[gi：48675809]，最近更新于2005年12月4日)用于汇编。每个引物的测序数据的分布显示于表3中，各个序列反应的结果显示于图4中。

汇编的2,956个碱基对的cDNA全序列，SEQ ID NO：3，显示于图5中。图5中的粗体/下划线三核苷酸分别是编码的Q3 SPARC缺失突变多肽的翻译起始位点和编码的成熟Q3 SPARC缺失突变多肽(17个氨基酸前导序列后的氨基酸序列)中的第一个密码子。SEQ ID NO：3可读框编码缺失了对应于野生型SPARC氨基酸序列(SEQ ID NO：1)中位置20的谷氨酰胺的全长SPARC蛋白。

编码Q3 SPARC  失突变多肽的来自SEQ ID NO：3的全长可读框的翻译显示于图6中。该可读框的起始密码子位于SEQ ID NO：3的核苷酸87，并且可读框终止于SEQ ID NO：3的核苷酸992。翻译的氨基酸序列为302个密码子长并且由SEQ ID NO：4来公开。全长可读框的DNA序列由SEQ ID NO：5来公开。

图7显示了由SEQ ID NO：3编码的成熟Q3 SPARC缺失突变多肽的氨基酸序列(没有17个氨基酸前导序列的序列)。这是由SEQ ID NO：3的核苷酸138至992的翻译形成的。成熟Q3 SPARC缺失突变多肽是SEQ ID NO：2并且编码该成熟Q3 SPARC缺失突变多肽的DNA序列是SEQ ID NO：6。

实施例10

该实施例说明了由SEQ ID NO：3编码的SPARC多肽(“Q3 SPARC缺失”)中野生型SPARC氨基酸序列(SEQ ID NO：1)的位置20上的谷氨酰胺缺失的鉴定。

SEQ ID NO：3 DNA序列与Genebank中存储的人SPARC cDNA序列的比对(图8)证明了SEQ ID NO：3含有对应于编码成熟SPARC蛋白的Q3的密码子的3个碱基对缺失(粗体)。此外，来自SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：4的翻译的SPARC可读框的比对证明了野生型SPARC氨基酸序列中位置20上的谷氨酰胺(Q3氨基酸)的缺失(图9)。

实施例11

该实施例说明了成熟SPARC蛋白的氨基酸位置3和4上的谷氨酰胺残基(“Q3Q4”氨基酸)的进化保守性。

沿着系统发生树对SPARC氨基酸序列的观察揭示了在哺乳动物和两栖动物中Q3Q4的保守性。在大鼠和鸡中只观察到单个谷氨酰胺。在鱼中既没有观察到Q3也没有观察到Q3Q4。鱼和鸟的骨骼结构比哺乳动物和两栖动物的轻得多，表明该转谷氨酰胺酶位点参与高度交联和结构致密的骨骼结构的形成。仅具有Q3的SPARC能够自由参与非骨骼功能，如血管形成、肿瘤生长、白蛋白结合等。

高等生物中谷氨酰胺的Q3Q4对的保守性表明Q3 SPARC缺失突变多肽可具有新的特性。

实施例12

该实施例说明了编码Q3 SPARC缺失突变多肽的cDNA亚克隆至表达载体中。

用Not I切离SPARC cDNA并亚克隆至pCDNA3.1的Not I位点中以产生pVT1000Q3。通过限制酶切消化(Not I、Eco RV、Eco RI、SspI)和测序证实了插入片段相对于CMV启动子的取向。限制酶切消化对于所有四种限制性酶产生了具有预测大小的片段(图11)。pVT1000Q3构建体的限制酶图谱显示于图12中。

本发明人预期使用本领域普通技术人员公知的转染方法，pVT1000Q3易于转染CHO、MDA-MB-231、PC3、HT29和MX-1细胞系。

实施例13

该实施例说明了引物指引的诱变，通过将Q3插入pVT1000Q3中产生编码野生型SPARC多肽的序列。

在本领域普通技术人员公知的引物指引的诱变方法中使用含有Q3密码子的聚合酶链反应(PCR)引物(参见图13)。所得到的质粒，pVT1000wt，呈现出预期的野生型Q3Q4 SPARC序列。

实施例14

该实施例说明了编码Q3 SPARC缺失突变多肽，即“Q3突变”的核酸的PCR检测。

设计用于检测SPARC cDNA的Q3突变和野生型形式的引物的位置和序列显示于图14中。本发明的PCR引物SPARC-FQ3、SPARC-FWT和SPARC-FQ3&W(分别为SEQ ID NO：7-9)作为正向引物和本发明的分子SPARC-RQ3&W(SEQ ID NO：10)作为本发明的反向PCR引物，用于本领域普通技术人员公知的标准逆转录PCR(RT-PCR)反应中。在PCR反应中使用本发明的引物接着进行凝胶电泳来区分Q3突变和野生型序列，如图2中所示。

表2

反应混合物	引物	Q3突变的结果	野生型的结果
				#1	FQ3+RQ3&WT	309个碱基对条带	没有产物
#2	FQ3+FQ3&W+RQ3&WT	309+222个碱基对条带	222个碱基对条带
				#3	FW+RQ3&WT	没有产物	309个碱基对条带
#4	FW3+FQ3&WT+RQ3&WT	222个碱基对条带	309+222个碱基对条带

所用的PCR扩增条件是：95℃热启动10分钟，接着95℃30秒、62℃30秒、72℃40秒的30个循环，最后在72℃延伸10分钟。pVT1000Q3，其携带Q3突变，和pVT1000wt，其携带野生型SPARC，用作对照。根据使用反应混合物#3和#4的309个碱基对产物的不存在和使用反应混合物#1和#2的309个碱基对产物的存在来检测Q3突变。根据使用反应混合物#3和#4的309个碱基对产物的存在和使用反应混合物#2的309个碱基对产物的不存在来检测野生型序列。使用反应混合物#1，野生型序列产生了309个碱基对产物，但是其水平比使用反应混合物#3和#4的弱得多。因此，反应混合物#3对于检测野生型SPARC序列(非-Q3突变序列)更强(图15)。

在此引用的所有参考文献，包括出版物、专利公开和专利，特此引入作为参考，其程度如同每篇参考文献单独和特意引入作为参考并在此以其整体列出一样。

在描述本发明的情况下(尤其在以下权利要求的情况下)术语“a”和“an”和“the”以及相似指代的使用应被解释为涵盖单数和复数，除非在此另外指明或者与上下文明显相矛盾。术语“包含”、“具有”、“包括”和“含有”应被解释为开放式术语(即，意指“包括但不限于”)，除非另外指明。在此对数值范围的叙述只是作为单独引用该范围内每个单独的数值的简化方法，除非在此另外指明，并且每个单独的数值被引入说明书中如同在此单个引用一样。可以以任何合适的次序进行在此所述的所有方法，除非在此另外指明或与上下文明显相矛盾。在此提供的所有实施例或示例性语言(例如，“如”)的使用，只是用来更好地说明本发明并不是限制本发明的范围，除非另外说明。说明书中没有任何语言应被解释为表示任何非要求的要素为实施本发明所必要的。

在此描述了本发明的优选实施方案，包括本发明人已知的实施本发明的最佳方式。对那些优选实施方案的改变是本领域普通技术人员经过阅读前面的描述后显而易见的。本发明人预期适当时本领域技术人员会使用这样的改变，并且本发明人希望以在此特意描述之外的方式来实施本发明。因此，本发明包括附加权利要求中引用主题的所有改变和等价物，如适用法律所允许的。此外，本发明包括其所有可能改变中上述要素的任何组合，除非在此另外指明或另外与上下文明显相矛盾。

序列表

<110>American BioScience，Inc.

     Trieu，Vuong

     Desai，Neil P.

     Soon-Shiong，Patrick

<120>Q3 SPARC缺失突变体及其用途

<130>250901

<150>US 60/654,261

<151>2005-02-18

<160>10

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>303

<212>PRT

<213>智人

<400>1

Met Arg Ala Trp Ile Phe Phe Leu Leu Cys Leu Ala Gly Arg Ala Leu

1               5                   10                  15

Ala Ala Pro Gln Gln Glu Ala Leu Pro Asp Glu Thr Glu Val Val Glu

            20                  25                  30

Glu Thr Val Ala Glu Val Thr Glu Val Ser Val Gly Ala Asn Pro Val

        35                  40                  45

Gln Val Glu Val Gly Glu Phe Asp Asp Gly Ala Glu Glu Thr Glu Glu

    50                  55                  60

Glu Val Val Ala Glu Asn Pro Cys Gln Asn His His Cys Lys His Gly

65                  70                  75                  80

Lys Val Cys Glu Leu Asp Glu Asn Asn Thr Pro Met Cys Val Cys Gln

                85                  90                  95

Asp Pro Thr Ser Cys Pro Ala Pro Ile Gly Glu Phe Glu Lys Val Cys

            100                 105                 110

Ser Asn Asp Asn Lys Thr Phe Asp Ser Ser Cys His Phe Phe Ala Thr

        115                 120                 125

Lys Cys Thr Leu Glu Gly Thr Lys Lys Gly His Lys Leu His Leu Asp

    130                 135                 140

Tyr Ile Gly Pro Cys Lys Tyr Ile Pro Pro Cys Leu Asp Ser Glu Leu

145                 150                 155                 160

Thr Glu Phe Pro Leu Arg Met Arg Asp Trp Leu Lys Asn Val Leu Val

                165                 170                 175

Thr Leu Tyr Glu Arg Asp Glu Asp Asn Asn Leu Leu Thr Glu Lys Gln

            180                 185                 190

Lys Leu Arg Val Lys Lys Ile His Glu Asn Glu Lys Arg Leu Glu Ala

        195                 200                 205

Gly Asp His Pro Val Glu Leu Leu Ala Arg Asp Phe Glu Lys Asn Tyr

    210                 215                 220

Asn Met Tyr Ile Phe Pro Val His Trp Gln Phe Gly Gln Leu Asp Gln

225                 230                 235                 240

His Pro Ile Asp Gly Tyr Leu Ser His Thr Glu Leu Ala Pro Leu Arg

                245                 250                 255

Ala Pro Leu Ile Pro Met Glu His Cys Thr Thr Arg Phe Phe Glu Thr

            260                 265                 270

Cys Asp Leu Asp Asn Asp Lys Tyr Ile Ala Leu Asp Glu Trp Ala Gly

        275                 280                 285

Cys Phe Gly Ile Lys Gln Lys Asp Ile Asp Lys Asp Leu Val Ile

    290                 295                 300

<210>2

<211>285

<212>PRT

<213>智人

<400>2

Ala Pro Gln Glu Ala Leu Pro Asp Glu Thr Glu Val Val Glu Glu Thr

1               5                   10                  15

Val Ala Glu Val Thr Glu Val Ser Val Gly Ala Asn Pro Val Gln Val

            20                  25                  30

Glu Val Gly Glu Phe Asp Asp Gly Ala Glu Glu Thr Glu Glu Glu Val

        35                  40                  45

Val Ala Glu Asn Pro Cys Gln Asn His His Cys Lys His Gly Lys Val

    50                  55                  60

Cys Glu Leu Asp Glu Asn Asn Thr Pro Met Cys Val Cys Gln Asp Pro

65                  70                  75                  80

Thr Ser Cys Pro Ala Pro Ile Gly Glu Phe Glu Lys Val Cys Ser Asn

                85                  90                  95

Asp Asn Lys Thr Phe Asp Ser Ser Cys His Phe Phe Ala Thr Lys Cys

            100                 105                 110

Thr Leu Glu Gly Thr Lys Lys Gly His Lys Leu His Leu Asp Tyr Ile

        115                 120                 125

Gly Pro Cys Lys Tyr Ile Pro Pro Cys Leu Asp Ser Glu Leu Thr Glu

    130                 135                 140

Phe Pro Leu Arg Met Arg Asp Trp Leu Lys Asn Val Leu Val Thr Leu

145                 150                 155                 160

Tyr Glu Arg Asp Glu Asp Asn Asn Leu Leu Thr Glu Lys Gln Lys Leu

                165                 170                 175

Arg Val Lys Lys Ile His Glu Asn Glu Lys Arg Leu Glu Ala Gly Asp

            180                 185                 190

His Pro Val Glu Leu Leu Ala Arg Asp Phe Glu Lys Asn Tyr Asn Met

        195                 200                 205

Tyr Ile Phe Pro Val His Trp Gln Phe Gly Gln Leu Asp Gln His Pro

    210                 215                 220

Ile Asp Gly Tyr Leu Ser His Thr Glu Leu Ala Pro Leu Arg Ala Pro

225                 230                 235                 240

Leu Ile Pro Met Glu His Cys Thr Thr Arg Phe Phe Glu Thr Cys Asp

                245                 250                 255

Leu Asp Asn Asp Lys Tyr Ile Ala Leu Asp Glu Trp Ala Gly Cys Phe

            260                 265                 270

Gly Ile Lys Gln Lys Asp Ile Asp Lys Asp Leu Val Ile

        275                 280                 285

<210>3

<211>2956

<212>DNA

<213>智人

<400>3

ctccacattc ccgcggtcct tcagactgcc cggagagcgc gctctgcctg ccgcctgcct    60

gcctgccact gagggttccc agcaccatga gggcctggat cttctttctc ctttgcctgg    120

ccgggagggc cttggcagcc cctcaagaag ccctgcctga tgagacagag gtggtggaag    180

aaactgtggc agaggtgact gaggtatctg tgggagctaa tcctgtccag gtggaagtag    240

gagaatttga tgatggtgca gaggaaaccg aagaggaggt ggtggcggaa aatccctgcc    300

agaaccacca ctgcaaacac ggcaaggtgt gcgagctgga tgagaacaac acccccatgt    360

gcgtgtgcca ggaccccacc agctgcccag cccccattgg cgagtttgag aaggtgtgca    420

gcaatgacaa caagaccttc gactcttcct gccacttctt tgccacaaag tgcaccctgg    480

agggcaccaa gaagggccac aagctccacc tggactacat cgggccttgc aaatacatcc    540

ccccttgcct ggactctgag ctgaccgaat tccccctgcg catgcgggac tggctcaaga    600

acgtcctggt caccctgtat gagagggatg aggacaacaa ccttctgact gagaagcaga    660

agctgcgggt gaagaagatc catgagaatg agaagcgcct ggaggcagga gaccaccccg    720

tggagctgct ggcccgggac ttcgagaaga actataacat gtacatcttc cctgtacact    780

ggcagttcgg ccagctggac cagcacccca ttgacgggta cctctcccac accgagctgg    840

ctccactgcg tgctcccctc atccccatgg agcattgcac cacccgcttt ttcgagacct    900

gtgacctgga caatgacaag tacatcgccc tggatgagtg ggccggctgc ttcggcatca    960

agcagaagga tatcgacaag gatcttgtga tctaaatcca ctccttccac agtaccggat    1020

tctctcttta accctcccct tcgtgtttcc cccaatgttt aaaatgtttg gatggtttgt    1080

tgttctgcct ggagacaagg tgctaacata gatttaagtg aatacattaa cggtgctaaa    1140

aatgaaaatt ctaacccaag acatgacatt cttagctgta acttaactat taaggccttt    1200

tccacacgca ttaatagtcc catttttctc ttgccatttg tagctttgcc cattgtctta    1260

ttggcacatg ggtggacacg gatctgctgg gctctgcctt aaacacacat tgcagcttca    1320

acttttctct ttagtgttct gtttgaaact aatacttacc gagtcagact ttgtgttcat    1380

ttcatttcag ggtcttggct gcctgtgggc ttccccaggt ggcctggagg tgggcaaagg    1440

gaagtaacag acacacgatg ttgtcaagga tggttttggg actagaggct cagtggtggg    1500

agagatccct gcagaaccca ccaaccagaa cgtggtttgc ctgaggctgt aactgagaga    1560

aagattctgg ggctgtgtta tgaaaatata gacattctca cataagccca gttcatcacc    1620

atttcctcct ttacctttca gtgcagtttc ttttcacatt aggctgttgg ttcaaacttt    1680

tgggagcacg gactgtcagt tctctgggaa gtggtcagcg catcctgcag ggcttctcct    1740

cctctgtctt ttggagaacc agggctcttc tcaggggctc tagggactgc caggctgttt    1800

cagccaggaa ggccaaaatc aagagtgaga tgtagaaagt tgtaaaatag aaaaagtgga    1860

gttggtgaat cggttgttct ttcctcacat ttggatgatt gtcataaggt ttttagcatg    1920

ttcctccttt tcttcaccct cccctttttt cttctattaa tcaagagaaa cttcaaagtt    1980

aatgggatgg tcggatctca caggctgaga actcgttcac ctccaagcat ttcatgaaaa    2040

agctgcttct tattaatcat acaaactctc accatgatgt gaagagtttc acaaatcctt    2100

caaaataaaa agtaatgact tagaaactgc cttcctgggt gatttgcatg tgtcttagtc    2160

ttagtcacct tattatcctg acacaaaaac acatgagcat acatgtctac acatgactac    2220

acaaatgcaa acctttgcaa acacattatg cttttgcaca cacacacctg tacacacaca    2280

ccggcatgtt tatacacagg gagtgtatgg ttcctgtaag cactaagtta gctgttttca    2340

tttaatgacc tgtggtttaa cccttttgat cactaccacc attatcagca ccagactgag    2400

cagctatatc cttttattaa tcatggtcat tcattcattc attcattcac aaaatattta    2460

tgatgtattt actctgcacc aggtcccatg ccaagcactg gggacacagt tatggcaaag    2520

tagacaaagc atttgttcat ttggagctta gagtccagga ggaatacatt agataatgac    2580

acaatcaaat ataaattgca agatgtcaca ggtgtgatga agggagagta ggagagacca    2640

tgagtatgtg taacaggagg acacagcatt attctagtgc tgtactgttc cgtacggcag    2700

ccactaccca catgtaactt tttaagattt aaatttaaat tagttaacat tcaaaacgca    2760

gctccccaat cacactagca acatttcaag tgcttgagag ccatgcatga ttagtggtta    2820

ccctattgaa taggtcagaa gtagaatctt ttcatcatca cagaaagttc tattggacag    2880

tgctcttcta gatcatcata agactacaga gcacttttca aagctcatgc atgttcatca    2940

tgttagtgtc gtattt                                                    2956

<210>4

<211>302

<212>PRT

<213>智人

<400>4

Met Arg Ala Trp Ile Phe Phe Leu Leu Cys Leu Ala Gly Arg Ala Leu

1               5                   10                  15

Ala Ala Pro Gln Glu Ala Leu Pro Asp Glu Thr Glu Val Val Glu Glu

            20                  25                  30

Thr Val Ala Glu Val Thr Glu Val Ser Val Gly Ala Asn Pro Val Gln

        35                  40                  45

Val Glu Val Gly Glu Phe Asp Asp Gly Ala Glu Glu Thr Glu Glu Glu

    50                  55                  60

Val Val Ala Glu Asn Pro Cys Gln Asn His His Cys Lys His Gly Lys

65                  70                  75                  80

Val Cys Glu Leu Asp Glu Asn Asn Thr Pro Met Cys Val Cys Gln Asp

                85                  90                  95

Pro Thr Ser Cys Pro Ala Pro Ile Gly Glu Phe Glu Lys Val Cys Ser

            100                 105                 110

Asn Asp Asn Lys Thr Phe Asp Ser Ser Cys His Phe Phe Ala Thr Lys

        115                 120                 125

Cys Thr Leu Glu Gly Thr Lys Lys Gly His Lys Leu His Leu Asp Tyr

    130                 135                 140

Ile Gly Pro Cys Lys Tyr Ile Pro Pro Cys Leu Asp Ser Glu Leu Thr

145                 150                 155                 160

Glu Phe Pro Leu Arg Met Arg Asp Trp Leu Lys Asn Val Leu Val Thr

                165                 170                 175

Leu Tyr Glu Arg Asp Glu Asp Asn Asn Leu Leu Thr Glu Lys Gln Lys

            180                 185                 190

Leu Arg Val Lys Lys Ile His Glu Asn Glu Lys Arg Leu Glu Ala Gly

        195                 200                 205

Asp His Pro Val Glu Leu Leu Ala Arg Asp Phe Glu Lys Asn Tyr Asn

    210                 215                 220

Met Tyr Ile Phe Pro Val His Trp Gln Phe Gly Gln Leu Asp Gln His

225                 230                 235                 240

Pro Ile Asp Gly Tyr Leu Ser His Thr Glu Leu Ala Pro Leu Arg Ala

                245                 250                 255

Pro Leu Ile Pro Met Glu His Cys Thr Thr Arg Phe Phe Glu Thr Cys

            260                 265                 270

Asp Leu Asp Asn Asp Lys Tyr Ile Ala Leu Asp Glu Trp Ala Gly Cys

        275                 280                 285

Phe Gly Ile Lys Gln Lys Asp Ile Asp Lys Asp Leu Val Ile

    290                 295                 300

<210>5

<211>909

<212>DNA

<213>智人

<400>5

atgagggcct ggatcttctt tctcctttgc ctggccggga gggccttggc agcccctcaa    60

gaagccctgc ctgatgagac agaggtggtg gaagaaactg tggcagaggt gactgaggta    120

tctgtgggag ctaatcctgt ccaggtggaa gtaggagaat ttgatgatgg tgcagaggaa    180

accgaagagg aggtggtggc ggaaaatccc tgccagaacc accactgcaa acacggcaag    240

gtgtgcgagc tggatgagaa caacaccccc atgtgcgtgt gccaggaccc caccagctgc    300

ccagccccca ttggcgagtt tgagaaggtg tgcagcaatg acaacaagac cttcgactct    360

tcctgccact tctttgccac aaagtgcacc ctggagggca ccaagaaggg ccacaagctc    420

cacctggact acatcgggcc ttgcaaatac atcccccctt gcctggactc tgagctgacc    480

gaattccccc tgcgcatgcg ggactggctc aagaacgtcc tggtcaccct gtatgagagg    540

gatgaggaca acaaccttct gactgagaag cagaagctgc gggtgaagaa gatccatgag    600

aatgagaagc gcctggaggc aggagaccac cccgtggagc tgctggcccg ggacttcgag    660

aagaactata acatgtacat cttccctgta cactggcagt tcggccagct ggaccagcac    720

cccattgacg ggtacctctc ccacaccgag ctggctccac tgcgtgctcc cctcatcccc    780

atggagcatt gcaccacccg ctttttcgag acctgtgacc tggacaatga caagtacatc    840

gccctggatg agtgggccgg ctgcttcggc atcaagcaga aggatatcga caaggatctt    900

gtgatctaa                                                            909

<210>6

<211>858

<212>DNA

<213>智人

<400>6

gcccctcaag aagccctgcc tgatgagaca gaggtggtgg aagaaactgt ggcagaggtg    60

actgaggtat ctgtgggagc taatcctgtc caggtggaag taggagaatt tgatgatggt    120

gcagaggaaa ccgaagagga ggtggtggcg gaaaatccct gccagaacca ccactgcaaa    180

cacggcaagg tgtgcgagct ggatgagaac aacaccccca tgtgcgtgtg ccaggacccc    240

accagctgcc cagcccccat tggcgagttt gagaaggtgt gcagcaatga caacaagacc    300

ttcgactctt cctgccactt ctttgccaca aagtgcaccc tggagggcac caagaagggc    360

cacaagctcc acctggacta catcgggcct tgcaaataca tccccccttg cctggactct    420

gagctgaccg aattccccct gcgcatgcgg gactggctca agaacgtcct ggtcaccctg    480

tatgagaggg atgaggacaa caaccttctg actgagaagc agaagctgcg ggtgaagaag    540

atccatgaga atgagaagcg cctggaggca ggagaccacc ccgtggagct gctggcccgg    600

gacttcgaga agaactataa catgtacatc ttccctgtac actggcagtt cggccagctg    660

gaccagcacc ccattgacgg gtacctctcc cacaccgagc tggctccact gcgtgctccc    720

ctcatcccca tggagcattg caccacccgc tttttcgaga cctgtgacct ggacaatgac    780

aagtacatcg ccctggatga gtgggccggc tgcttcggca tcaagcagaa ggatatcgac    840

aaggatcttg tgatctaa                                                  858

<210>7

<211>22

<212>DNA

<213>智人

<400>7

agggccttgg cagcccctca ag                                             22

<210>8

<211>23

<212>DNA

<213>智人

<400>8

agggccttgg cagcccctca gca                                            23

<210>9

<211>23

<212>DNA

<213>智人

<400>9

gaaactgtgg cagaggtgac tga                                            23

<210>10

<211>25

<212>DNA

<213>智人

<400>10

gttgtcattg ctgcacacct tctca                                          25

Claims (64)

1.一种分离的SPARC多肽，包括其中缺失了对应于SEQ ID NO：1中氨基酸20的谷氨酰胺的氨基酸序列。

2.权利要求1的SPARC多肽，其中多肽包括SEQ ID NO：2的氨基酸序列。

3.编码权利要求1的SPARC多肽的分离核酸分子。

4.权利要求3的核酸分子，其中核酸序列包括SEQ ID NO：3的核酸序列。

5.包括权利要求3的核酸序列的载体。

6.权利要求5的载体，进一步包括控制SPARC多肽编码核酸序列表达的启动子。

7.包括权利要求3的核酸分子的细胞。

8.权利要求7的细胞，其中细胞是原核细胞。

9.权利要求7的细胞，其中细胞是真核细胞。

10.制备权利要求1的多肽的方法，包括：

a.用编码权利要求1多肽的核酸转化细胞，

b.诱导转化细胞对多肽的表达，和

c.纯化多肽。

11.含有权利要求1的多肽和药物学上可接受载体的组合物。

12.治疗哺乳动物疾病的方法，包括将权利要求1的多肽给予哺乳动物。

13.权利要求12的方法，其中疾病是细胞增殖性疾病。

14.敏化哺乳动物疾病的方法，包括将权利要求1的多肽给予哺乳动物。

15.权利要求14的方法，进一步包括给药一种或多种治疗剂。

16.权利要求14的方法，其中疾病是癌症。

17.权利要求11的组合物，其中将多肽与治疗剂偶联。

18.权利要求17的组合物，其中治疗剂是放射性核素、药物、多肽或毒素。

19.权利要求11的组合物，其中将多肽与聚乙二醇偶联。

20.包括识别权利要求1的多肽的抗体或其片段和药物学上可接受载体的组合物。

21.权利要求20的组合物，其中将治疗剂与抗体或其片段偶联。

22.权利要求20的组合物，其中所述抗体或其片段是人源化的并包括单价Fab’、二价Fab2、scfv、双特异抗体或嵌合体。

23.权利要求20的组合物，其中所述治疗剂是药物、放射性核素、多肽或毒素。

24.权利要求20的组合物，其中抗体是多克隆的并且是在非人动物中生产的。

25.权利要求20的组合物，其中抗体是人源化的。

26.权利要求20的组合物，其中抗体是单克隆的并且通过产生抗-SPARC抗体的单细胞系和骨髓瘤细胞系融合生产。

27.权利要求20的组合物，其中抗体是通过肽合成仪或通过展示噬菌体转化成抗体或抗体重链和轻链可变区基因的诱变/合成而在体外制成的。

28.权利要求20的组合物，其中抗体是单价的或多价的，其中抗体进一步是单特异性的或双特异性的。

29.权利要求20的组合物，其中治疗剂是细胞毒性紫杉醇、阿霉素或喜树碱。

30.权利要求20的组合物，其中治疗剂是激酶抑制剂。

31.权利要求20的组合物，其中治疗剂是生物分子。

32.权利要求20的组合物，其中治疗剂是放射性核素。

33.权利要求20的组合物，其中治疗剂是抗体自身并且其中抗体介导补体激活、抗肿瘤的细胞介导的细胞毒性或其组合。

34.权利要求20的组合物，其中给药途径是静脉内、腹膜内、肿瘤内或吸入。

35.将治疗剂递送至哺乳动物肿瘤的方法，包括将治疗有效量的药物组合物给予哺乳动物，该组合物包括治疗剂和药物学上可接受的载体，所述治疗剂包括与识别权利要求1的多肽的抗体偶联的化疗剂或放射性试剂。

36.权利要求35的方法，其中抗体是多克隆的并且在非人动物中生产。

37.权利要求35的方法，其中抗体是人源化的。

38.权利要求35的方法，其中抗体是单克隆的并且通过产生抗-SPARC抗体的单细胞系和骨髓瘤细胞系融合生产。

39.权利要求35的方法，其中抗体是通过肽合成仪或通过展示噬菌体转化成抗体或抗体重链和轻链可变区基因的诱变/合成而在体外制成的。

40.权利要求35的方法，其中抗体是单价的或多价的，其中抗体进一步是单特异性的或双特异性的。

41.权利要求35的方法，其中治疗剂是紫杉醇、阿霉素或喜树碱。

42.权利要求35的方法，其中治疗剂是激酶抑制剂。

43.权利要求35的方法，其中治疗剂是生物分子。

44.权利要求35的方法，其中治疗剂是放射性核素。

45.权利要求35的方法，其中治疗剂是抗体自身并且其中抗体介导补体激活、抗肿瘤的细胞介导的细胞毒性或其组合。

46.权利要求35的方法，其中肿瘤位于膀胱、肝脏、卵巢、肾脏、消化道、脑或乳房。

47.权利要求35的方法，其中哺乳动物是人。

48.权利要求35的方法，其中给药途径是静脉内、腹膜内、肿瘤内或吸入。

49.将诊断剂递送至哺乳动物肿瘤的方法，包括将治疗有效量的药物组合物给予哺乳动物，该组合物包括与识别权利要求1的多肽的抗体偶联的诊断剂和药物学上可接受的载体。

50.权利要求49的方法，其中所述诊断剂包括放射性试剂、MRI造影剂、造影剂、超声造影剂和PET造影剂。

51.权利要求20的组合物，其中抗体还结合野生型SPARC多肽。

52.将疾病分类的方法，包括检测在对应于SEQ ID NO：1中氨基酸位置20处缺失谷氨酰胺的SPARC多肽。

53.权利要求52的方法，其中疾病涉及新血管生成。

54.权利要求52的方法，其中疾病是增殖性疾病。

55.权利要求54的方法，其中增殖性疾病是癌症。

56.权利要求52的方法，其中检测的突变SPARC多肽包括SEQ IDNO：2的氨基酸序列。

57.将疾病分类的方法，包括检测编码在对应于SEQ ID NO：1的氨基酸位置20处缺失谷氨酰胺的SPARC多肽的核酸。

58.权利要求57的方法，其中疾病涉及新血管生成。

59.权利要求57的方法，其中疾病是增殖性疾病。

60.权利要求59的方法，其中增殖性疾病是癌症。

61.权利要求57的方法，其中核酸是DNA或RNA。

62.权利要求57的方法，其中检测的突变SPARC核酸包括SEQ IDNO：3的核酸序列。

63.权利要求57的方法，其中使用包括聚合酶链反应的方法检测编码SPARC多肽的核酸。

64.权利要求63的方法，其中聚合酶链反应使用一个或多个选自包括SEQ ID NO：7-9序列的引物的正向引物和包括SEQ ID NO：10序列的反向引物。

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