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CN1823794A - 制剂 - Google Patents

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CN1823794A
CN1823794A CNA2005101380761A CN200510138076A CN1823794A CN 1823794 A CN1823794 A CN 1823794A CN A2005101380761 A CNA2005101380761 A CN A2005101380761A CN 200510138076 A CN200510138076 A CN 200510138076A CN 1823794 A CN1823794 A CN 1823794A
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ecteinascidin
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disaccharide
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M·托比奥巴雷拉
J·H·贝南
B·纽詹
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Pharmamar SA
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Abstract

本发明提供了海鞘素制剂、其制备方法、含这种制剂的生产的产品和药盒，和采用相同制剂治疗增生性疾病的方法。

Description

制剂
本发明涉及制剂。更特别地，涉及海鞘素(ecteinascidin)如海鞘素743的组合物和制剂。
发明背景
海鞘素已被鉴定，其结构上的特征和制备的合成方法已有描述。参见，例如R.Sakai等，1992，Prco.Natl.Acad.Sci.USA 89，第11456-11460页，“Additionalantitumor ecteinascidins from Caribbean tunicate：Crystal structures and activities invivo”；R.Menchaca等，2003，J.Org.Chem.68(23)，第8859-8866页，“Synthesis ofnatural ecteinascidins(ET-729，ET-745，ET-759B，ET-736，ET-637，ET-594)fromcyanosafracin B”；和I.Manzanares等，2001，Curr.Med.Chem.-Anti-Cancer Agents，1，第257-276页，“Advances in the Chemistry and Pharmacology of Ecteinascidins，A Promising New Class ofAnticancer Agents”；和其中的参考文献。这些参考文献描述了海鞘素类化合物。提供的海鞘素类化合物的例子为：ET-743、ET-729、ET-745、ET-759A、ET-759B、ET-759C、ET-770、ET-815、ET-731、ET-745B、ET-722、ET-736、ET-738、ET-808、ET-752、ET-594、ET-552、ET-637、ET-652、ET-583、ET-597、ET-596、ET-639、ET-641和它们的衍生物，例如乙酰化形式、甲酰基化形式、甲基化形式和氧化物形式，例如N-氧化物形式。
这种海鞘素类化合物的结构特征在此不再明确地给出，因为从在此提供的参考和引用文献的详细描述中，任何本领域的普通技术人员能从在此引用的和相关的文献中直接获得这样的信息。
至少一种海鞘素类化合物，ET-743已被广泛地研究，在此，特别地，它将被提及用于说明本发明的特征。
海鞘素743(ET-743)是从海生的被囊动物Ecteinascidia turbinata中分离的四氢异喹啉生物碱，且具有如下结构：
US 5,256,663请求保护一种药物组合物，其含有ET-743与药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
ET-743、其化学性质、作用机理和临床前和临床进展的最近综述见vanKesteren，Ch.等，2003，Anti-Cancer Drugs，14(7)，第487-502页：“Yondelis(trabectedin，ET-743)：the development of an anticancer agent of marine origin”，和其中的参考文献。
ET-743对生长在无胸腺小鼠上的多种人类肿瘤异种移植物，包括黑素瘤与卵巢和乳腺癌具有有效的抗肿瘤活性。
在ET-743的I期临床研究中，在恶性毒瘤和卵巢和乳腺癌的患者身上观察到前途有望的效应。因此，这个新药现在在患有多种肿瘤疾病的癌症患者的数个II期临床试验中被深入研究。
如在WO 0069411中有解释说明，其全文并入作为参考，ET-743以无菌的冻干产品供应和储存，产品含有ET-743，甘露醇和磷酸盐缓冲剂。优选制剂由0.9％氯化钠或其它合适的输注载体，250μgET-743与250mg甘露醇，34mg磷酸二氢钾和调节pH的磷酸制得。然后将此制剂重新构成和稀释用于静脉注射。
ET-743是一种复杂的化学物质，如同其结构特征所显示。另外，ET-743显示有限的水溶性，并且其稳定性，尤其是在生物相容的形式和制剂中，是难于预测和实现的。这些特点挑战本领域的普通技术人员和常规的方法，尤其是当需要制备一种能够容易地用于医疗目的的ET-743制剂时。优选地，上述用途依赖于制剂，其特征包括以下一个或多个：生物相容性，在环境条件下或尽可能接近于环境条件下的稳定性，具有尽可能长的半衰期，和易于重新构成的能力以形成在环境条件下或接近于环境条件下有尽可能长时间的稳定性的重新构成的溶液。
然而，常规的制剂和制备这种制剂的方法不能提供如上面提及的所需的特点和特征。例如，引用的van Kesteren Ch.等2003年的综述报道了：
ET-743具有有限的水溶性。然而，通过调节pH至4，能达到适当的ET-743浓度。ET-743在水溶液中的不稳定性需要冻干以增加此药用产品的贮藏时的稳定性。为了稳定ET-743，一般将ET-743制备成无菌冻干产品，其每剂量单位含有250μg活性物质，250mg的甘露醇作为填充剂和pH为4的0.05M磷酸盐缓冲液。这种制剂在冰箱和室温下长期贮藏时是不稳定的，因此，应该避光贮藏在-15到-25℃之间。在静脉输注前，加5ml注射水重新构成，随后用标准生理盐水稀释。重新构成的溶液在环境温度下稳定最长达24小时。
实际上含有250μg ET-743的产品是通过在模制瓶中将含有ET-743、甘露醇、磷酸盐缓冲剂和水的5ml溶液冷冻干燥制成的。含有1mg ET-743的模制瓶也是通过将20ml的此溶液冷冻干燥制成的。
冷冻干燥通常包括冷冻溶液，在第一干燥期减少压力，以将水蒸汽通过升华从被冷冻的物质中除去，得到半干燥物质，和在第二干燥期提高温度，以将残留水分从半干燥物质中除去。然后将管瓶封口。
上面描述的常规的ET-743制剂有几个缺点。其中之一是为了实现至少18个月的贮藏期，冻干的ET-743制剂必须贮藏在约-20℃以防止ET-743的分解。
另外，ET-743制剂面临形成相对大量的作为杂质的ET-701的问题。ET-701是ET-743制剂冻干过程和贮藏中主要的杂质。它来自ET-743的水解且其结构如下：
Figure A20051013807600061
然而，杂质的形成减少或甚至阻碍使制剂符合标准的能力。因此，期望能提供制剂和其制备方法，其提供的实施方案中的组分不会轻易地和不可预期地被不能控制的杂质形成改变。
此外，上面描述的常规ET-743制剂方法的另一缺点是为了获得冻干制剂必须冷冻干燥相对大量的5-20ml灌装体积的溶液。相反，应期望开发一种含有如ET-743一样复杂化合物的制剂的制造方法，使制成的制剂含有更高的活性物质浓度，以便因此减少要处理的体积。考虑到相对高的5或20ml的灌装体积，在冷冻干燥步骤的常规方法中需要时间和能量。随同时间和能量一起，尤其在第二干燥期，还有ET-743分解的风险。
考虑到ET-743制剂作为抗肿瘤剂的潜力，需要提供一种制剂，其能解决常规制剂和制备方法不能达到或不能完全解决的问题。这些问题包括ET-743稳定性问题。ET-743制剂的实施方案应该优选显示有利的冷冻干燥特性，应该优选易于重新构成，和应该优选显示稀释特性，如用输注液体稀释，同时呈现出与此处提及的用于医疗用途的制剂一样多的所需特性。如上所述，ET-743制剂的实施方案应该在长期贮藏期间稳定。另外，该制剂及其制造方法应该满足生物相容性标准，并应该至少在用于输液的浓度下，有效使用无毒的制剂载体。
Akers，MJ，在Journal of Pharmaceutical Sciences，91，2002，2283-2300中提供了胃肠外用药物制剂中赋形剂-药物之间的相互作用的综述。这篇参考提供，尤其是，关于填充剂和冻干保护剂(lyoprotectants)的章节，包括这种冻干的主题。
除了ET-743以外，可以设想本发明中开发的制剂和方法还能应用到其它海鞘素。
发明目的
本发明目的之一是提供稳定的海鞘素制剂，及制备这种制剂的方法。
本发明一个特定目的是提供一种新的稳定的ET-743制剂。特别地，需要具有更高的贮藏稳定性的制剂。特别地，需要避免杂质的形成。特别地，期望提供基本上不含ET-701的制剂的实施方案。
另外，本发明的其它目的涉及制备方法的开发，其允许制备具有高于常规方法能达到的ET-743浓度的ET-743制剂。其它目的涉及提高像ET-743一样复杂的化合物的溶解度的方法的开发，最终提高用于冻干的溶液中ET-743的浓度，这样就能减少制剂冻干前管瓶中的灌装体积。
发明概述
依照本发明，提供ET-743组合物，它包含ET-743和二糖，及制备这种组合物的方法。这种组合物优选的实施方案是具有药学纯度。
本发明的其它实施方案提供包含海鞘素和二糖的组合物。
这种组合物的一些实施方案提供了包含如ET-743的海鞘素和二糖的冻干制剂。提供了这种制剂的制备方法。
本发明提供了减少，或甚至基本上消除在ET-743制剂中杂质形成的方法。一些实施方案包括减少，或甚至基本上消除在ET-743制剂中ET-701形成的方法。
本发明也提供了更有效处理如ET-743的海鞘素的制剂的方法，包括制备更高浓度制剂的方法，和当生产冻干制剂时，减少管瓶中的灌装体积的方法。
本发明也提供了复杂化合物，如海鞘素，包括但不限于ET-743的增溶方法。这样的方法允许制备用于冻干的本体溶液中更高浓度的ET-743溶液，导致灌装体积减少。
发明详述
我们发现在本发明中二糖使海鞘素制剂稳定。海鞘素，包括ET-743，是复杂的化合物，在制剂中其性能不能根据其它不相关的化学物质的性能预料。为满足生物相容性标准，包括医疗标准，当制剂中包含至少一种作为活性物质的海鞘素时这样的性能更难预料。我们进一步发现在ET-743组合物的冻干过程和贮藏期间，二糖作为填充剂的使用能显著减少杂质的形成。
当本发明的实施方案提供ET-743制剂，其基本上不含其它的例如ET-701的海鞘素，或至少ET-701的含量尽可能低时，则ET-701被认作是一种杂质，至少应该减少它在组合物中的存在。
另外，二糖的使用也改善贮藏条件，允许冻干制剂在广泛的温度范围内，包括冷藏条件和室温，长期贮藏。在此使用的术语“稳定”，例如“一种稳定的ET-743制剂”的表达，指的是一种能满足如在此所报道的稳定性特点的制剂，和它的等价物，这是常规制剂不具有的和当制剂采用常规的制备方法制备时所不能实现的。
本发明实施方案的实施例提供新的药学上可接受的组合物，其包含例如ET-743的海鞘素和二糖。
正如在介绍中所述，海鞘素已被广泛的描述。它们有如下的通式(I)的结构：
Figure A20051013807600091
其中：
R5是OH、烷氧基或烷酰氧基；
R6是氢、烷基、烯基、炔基或芳基；
R12是氢、烷基、烯基、炔基或芳基；
R16是氢、烷基、烯基、炔基或芳基；
R17是OH、烷氧基或烷酰氧基；
R18是OH、烷氧基或烷酰氧基；
R21是H、OH、CN或其它亲核基团；和
Ra是氢且Rb是任选取代的氨基，或
Ra同Rb形成一个羰基官能团＝O，或
Ra、Rb和它们连接的碳形成一个四氢异喹啉基。
在这些化合物中，取代基能依照如下的指导进行选择：
烷基和烷氧基优选有1-12个碳原子。烷基和烷氧基更优选的一类有1至约6个碳原子，最优选1、2、3或4个碳原子。本发明的化合物中的烷基特别地优选为甲基、乙基和丙基，包括异丙基。本发明的化合物中的烷基特别地优选为甲氧基、乙氧基和丙氧基，包括异丙氧基。烷基和烷氧基另一类更优选的基团有4至约12个碳原子，更优选有5至约8个碳原子，和最优选5、6、7或8个碳原子。在此应用的术语烷基，除非另外指明，指的是环状的和非环状的基团，尽管环状基团将包含至少3个环碳。
本发明的化合物中优选的烯基和炔基有一个或多个不饱和的键，和2至约12个碳原子。烯基或炔基更优选的一类有2至约6个碳原子，和最优选2、3或4个碳原子。烯基或炔基另一类更优选的基团有4至约12个碳原子，更优选5至约8个碳原子，和最优选5、6、7或8个碳原子。在此应用的术语烯基和炔基指的是环状的和非环状的基团。
本发明化合物中合适的芳基包括单环或多环化合物，包括含有分离的和/或稠合的芳基的多环化合物。典型的芳基含有1到3个分离或稠合的环和6至约18个碳环原子。特别优选的芳基包括取代的或非取代的苯基、萘基、联苯基、菲基和蒽基。
合适的烷酰氧基和烷酰基有2至约20个碳原子，更优选有2至约8个碳原子，还更优选有2至约6个碳原子，最优选2个碳原子。烷酰氧基的另一类优选基团有12至约20个碳原子，还更优选有14至约18个碳原子，和最优选15、16、17或18个碳原子。
上面提到的基团可以在一个或多个可用的位置被一个或多个合适的基团取代，该基团如：OR′、＝O、SR′、SOR′、SO2R′、NO2、NHR′、N(R′)2、＝N-R′、NHCOR′、N(COR′)2、NHSO2R′、CN、卤素、C(＝O)R′、CO2R′、OC(＝O)R′，其中每个R′独立的选自H、OH、NO2、NH2、SH、CN、卤素、＝O、C(＝O)H、C(＝O)CH3、CO2H、取代或非取代的C1-C12烷基、取代或非取代的C2-C12烯基、取代或非取代的C2-C12炔基和取代或非取代的芳基。本发明的化合物中合适的卤素包括F、Cl、Br和I。
本发明的优选化合物是通式(I)的那些化合物，其中一个或多个下面的定义将被应用：
R5是烷酰氧基；
R6是甲基；
R12是甲基；
R16是甲基；
R17是甲氧基；
R18是OH；
R21是H、OH、CN；和
Ra是氢且Rb是酰氨基，或
Ra同Rb形成＝O，或
Ra、Rb和它们连接的碳形成式(II)的一个基团：
Figure A20051013807600111
本发明的化合物的例子包括天然的海鞘素，例如海鞘素743和其它的1，4桥接的稠合海鞘素化合物，公开在例如US 5,089,273、US 5,478,932、US5,654,426、US 5,721,362、US 6,124,293、US 5,149,804、US 09/546,877、US5,985,876和WO 01/77115中。
特别地，优选下面式(III)的化合物：
Figure A20051013807600112
其中
Ra是氢且Rb是式-NHRf-的酰氨基，其中Rf是烷酰基，或
Ra同Rb形成＝O，或
Ra、Rb和它们连接的碳形成式(II)的一个基团：
Figure A20051013807600121
Rd是烷酰基；和
R21是H、OH或CN。
烷酰基可以是乙酰基或更高级，例如最高达C20烷酰基。
因此，本发明优选的化合物包括：
           ET743                                     ET637衍生物A
           ET594                                      ET743衍生物A
Figure A20051013807600131
     ET637衍生物B          或                ET745
和相关的具有不同酰基的化合物。
特别地，优选海鞘素743，其也已知为ET743或海鞘素743。
本发明组合物中合适的二糖的例子包括乳糖、海藻糖、蔗糖和它们的组合。本发明的一些实施方案能使用的二糖的其它例子包括麦芽糖、异麦芽糖、纤维二糖、异蔗糖、异海藻糖、山梨糖、松二糖、蜜二糖、龙胆二糖和它们的混合物中至少一种。一般优选蔗糖。
在本发明其它实施方案中，组合物包含如ET-743的海鞘素和不含乳糖的二糖。在本发明其它实施方案中，该组合物包含如ET-743的海鞘素和不含海藻糖的二糖。在本发明其它实施方案中，组合物包含如ET-743的海鞘素和不含蔗糖的二糖。在本发明其它实施方案中，组合物包含如ET-743的海鞘素和不含麦芽糖的二糖。在本发明其它实施方案中，组合物包含如ET-743的海鞘素和不含异麦芽糖的二糖。在本发明其它实施方案中，组合物包含如ET-743的海鞘素和不含纤维二糖的二糖。在本发明其它实施方案中，组合物包含如ET-743的海鞘素和不含异蔗糖的二糖。在本发明其它实施方案中，组合物包含如ET-743的海鞘素和不含异海藻糖的二糖。在本发明其它实施方案中，组合物包含如ET-743的海鞘素和不含山梨糖的二糖。在本发明其它实施方案中，组合物包含如ET-743的海鞘素和不含松二糖的二糖。在本发明其它实施方案中，组合物包含如ET-743的海鞘素和不含蜜二糖的二糖。在本发明其它实施方案中，组合物包含如ET-743的海鞘素和不含龙胆二糖的二糖。
因此，在一些实施例中，本发明的组合物含有小于2％或小于1％或小于0.5％或小于0.2％或小于0.1％重量的乳糖、海藻糖、蔗糖、麦芽糖、异麦芽糖，纤维二糖、异蔗糖、异海藻糖、山梨糖、松二糖、蜜二糖、和龙胆二糖中至少一种，优选每一种。
在此使用的术语“它们的混合物”和“它们的组合”指的是先前的为术语“它们的混合物”和“它们的组合”所提供的化合物中的至少两种。由下述方法说明，但不受其限制，术语“包含A、B、C和它们的混合物中的至少一种的产品”指的是符合以下任何一项要求的产品的实施方案：A在产品中；B在产品中；C在产品中；A和B在产品中；A和C在产品中；B和C在产品中；A、B和C在产品中。
另外，在此应用到化合物中术语如“反应”，“形成”，和相关的术语理解为下面的任何一个：(a)这样的化合物，和(b)以一种形式存在的化合物，这样的化合物存在于反应介质中。类似地，命名一个在操作和反应步骤中的化合物或给出它的分子式，或命名一个存在于介质，不管是固体或液体，包括产品、制剂和组合物中的化合物或给出它的分子式，在此指的是以下任一个：(a)这样的化合物，和(b)以一种形式存在的化合物，这样的化合物存在于介质中。例如，在此命名一种酸性化合物指的是在其被命名的内容中以任何形式存在的这种化合物。作为说明，但不受其限制，如果它是存在于相关的介质中的氯化钠的形式，命名一种化合物“氯化钠”或提供它的化学分子式在此指的是作为双原子分子的化合物NaCl；如果在相关的介质中的氯化钠完全或部分离解，也指非离解和/或离解的化合物，包括在这样介质中被溶剂化，笼状化合物的部分，同其它物质缔合的物质等。
在此指的任何化合物意图代表这种特定的和有确定的变化或形式的化合物。特别地，在此指的化合物可以有不对称的中心，因此以不同的对映异构体形式存在。在此指的化合物的所有光学异构体和立体异构体，和它们的混合物，都被认为在本发明的制剂和方法的范围内。因此，在此指的任何特定的化合物意图代表任何一个外消旋化合物、一个或多个对映异构体形式、一个或多个非对映异构体形式、一个或多个阻转异构体形式，和它们的混合物。
另外，在此指的化合物可以以几何异构体(即顺式和反式异构体)、互变异构体或阻转异构体存在。另外，当介质中存在这样的形式时，在此指的任何化合物，意图代表水合物、溶剂化物和多晶型物，和它们的混合物。另外，在此指的化合物可以以同位素标记的形式存在。在此指的化合物的所有几何异构体、互变异构体、阻转异构体、水合物、溶剂化物、多晶型物和同位素标记的形式，和它们的混合物，都被认为在本发明的制剂和方法的范围内。
为了提供更简明的描述，在此给出的一些定量表达不用术语“约”限制。可以理解，不管术语“约”是否明确地使用，在此给出的每个量意指实际给出的值，也意指这种给出的值的近似值，其可基于本领域普通技术人员合理的推知，包括由于这种给出值的实验和/或测量条件得到的等价值和近似值。
本发明中的活性物质可以是天然的、半合成的或合成的来源，包括这些来源的组合。在活性物质是一种如ET-743的海鞘素的实施方案中，ET-743可以是天然来源，从例如海鞘类被囊动物中，优选Ecteinascidia turbinata中分离得到的。ET-743可以是半合成的或合成的来源。参考文献如WO 0069862和WO0187895，此两篇参考文献全文引入参考。
本发明实施方案中活性物质与填充剂的比例取决于填充剂的溶解性和填充剂在制剂冷冻干燥时的冷冻干燥的能力。可以设想此比例(w/w)在一些实施方案中可以是约1∶1，在另一些实施方案中是约1∶5，在另一些实施方案中是约1∶10，而其它实施方案说明了比例范围从约1∶10至约1∶1。可以设想其它实施方案比例范围从约1∶10至约1∶100，还有的实施方案比例范围从约1∶100至约1∶1500。当活性化合物是ET-743时，ET-743与填充剂的比例(w/w)典型地为从约1∶100至约1∶1500，优选从约1∶200至约1∶800，更优选从约1∶250至约1∶600，最优选约1∶400。
冻干的材料通常置于管瓶中，管瓶中含有一定量的海鞘素或活性化合物。当活性化合物是ET-743时，标明活性量是250μg和1mg。
本发明不受特定容器形式和设计所限制，只要容器满足其所需的用途和标准。本发明的实施方案提供了置于管瓶中，优选管型瓶中的制剂。
本发明的冻干的制剂能重新构成和稀释，得到用于准备供静脉注射的溶液形式的本发明组合物。实际重新构成的液体量不受本发明实施方案特征的限制。作为说明，但不受其限制，依照本发明冻干制剂的实施方案是用一定体积的水重新构成的。这样的体积大都不超过约20ml，优选的体积范围在约1ml到约15ml，更优选的体积范围在约1ml到约10ml，和最优选的体积范围在约1ml到约4ml。当采用活性物质ET-743，在这样实施方案中的重新构成的液体包含最高达500μg/ml、约50μg/ml、约100μg/ml和优选约250μg/ml的ET-743浓度。
本发明重新构成的实施方案，如果期望如此的话，能进一步被稀释，这种进一步稀释不受本发明限制。这种进一步稀释优选用水系统，通常是0.9％的氯化钠或5％葡萄糖进行。重新构成的溶液将根据重新构成的溶液浓度和所期望的稀释溶液浓度进行稀释。
依照本发明ET-743制剂的实施方案能用于治疗各种癌症，包括治疗肉瘤、平滑肌肉瘤、脂肉瘤、骨肉瘤、卵巢癌、乳腺癌、黑素瘤、结肠直肠癌、间皮瘤、肾癌、子宫内膜癌和肺癌中的任一种，和大多数上述癌症的状况。可以理解，本文的“治疗”指的是一种导致癌症状况改善的作用。依照本发明ET-743制剂的实施方案也能用于治疗对其它治疗不能产生有利反应的难治性癌症的状况。另外，依照本发明组合物的实施方案能用于实验室的组织试验，包括但不限制为临床试验、分析试验和模型分析。
本发明的包含如ET-743的海鞘素的实施方案优选输液给药。输液步骤通常循环重复，这可以是适当地重复如1-20个循环。此循环包括一个输注ET-743制剂期，通常也包括一个不输注ET-743期。通常，此循环通常进行数周，因此，循环通常包含一或多周的ET-743输注期，一或多周的循环完成期。优选3周一循环，但也可为1-6周。输注期本身可以是每次循环的1-72小时，更常用的是约1、3或24小时内的一次给药；或者每天输液的循环输注期优选1-5小时，特别地1或3小时；或者每周输液的循环输注期优选1-3小时，特别地2或3小时。在每个循环开始单次给药是优选的。输注时间优选约1、3或24小时。
重新构成的和稀释的溶液举例说明了本发明实施方案。重新构成的和稀释的制剂能使用可行的方案静脉给药。剂量将依照剂量时间表选择，并考虑现有剂量限制的毒性数据，这参见如：WO 0069441、WO 0236135和WO 0339571，以及van Kesteren，Ch.等.，2003，Anti-Cancer Drugs，14(7)，第487-502页。这三篇WO专利说明书和van Kesteren的文章作为特定的参考并入。
优选的剂量方案包括：
a)约1.5mg/m2体表面积，静脉输液给药24小时以上，循环之间间隔3周；
b)约1.3mg/m2体表面积，静脉输液给药3小时以上，循环之间间隔3周；
c)约0.580mg/m2体表面积，3周内每周一次，静脉输液给药3小时以上，和1周的休息期。
如ET-743的海鞘素能与其它药联用。例如，能与另一种抗肿瘤药一起给药。读者可参考WO 0069441和WO 0236135中的列表，其作为特定的参考在此并入。其它药物的例子包括阿霉素、顺铂、紫杉醇、卡铂、PEG修饰的阿霉素脂质体、多西紫杉醇、卡培他滨和吉西他滨。其它作用方式的药物，包括地塞米松也能使用。其它药物的给药能在如ET-743的海鞘素的给药之前，期间或之后进行。
本发明的包含如ET-743的海鞘素的制剂的实施方案的制备是通过将以含有海鞘素和二糖的本体溶液形式存在的本发明的组合物冷冻干燥。通常本体溶液将被缓冲至，如约pH4。合适的缓冲剂包括磷酸盐缓冲剂和柠檬酸盐缓冲剂。能用的其它可能缓冲剂，如磷酸盐/柠檬酸盐缓冲剂(一种磷酸盐缓冲剂和柠檬酸盐缓冲剂的混合物)、乳酸盐缓冲剂、抗坏血酸盐缓冲剂、酒石酸盐/柠檬酸盐缓冲剂、碳酸氢盐/盐酸缓冲剂、醋酸盐缓冲剂、琥珀酸盐缓冲剂和甘氨酸/盐酸缓冲剂。能使用缓冲剂的混合物。允许pH控制在期望值的生物相容缓冲剂提供本发明另外的实施方案。
在填充剂溶液中能包含其它组分，例如：表面活性剂如聚氧乙烯20脱水山梨醇单油酸酯或硬脂酸-40-聚烃氧基酯。其它可能的表面活性剂包括磷脂，如卵磷脂；聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物，如Pluronic表面活性剂；12-羟基硬脂酸的聚氧乙烯酯，如Solutol表面活性剂；胆固醇的乙氧基化物，如双酰基甘油、二烷基甘油；胆汁盐，如胆酸钠、去氧胆酸钠；蔗糖酯，如蔗糖单月桂酸酯、蔗糖单油酸酯；聚乙烯吡咯烷酮(PVP)；聚乙烯醇(PVA)。
制剂通常采用含此冻干产品的管瓶供应。然而，本发明不受这种供应形式的限制。为了提供含冻干产品的管瓶，将本体溶液加入管瓶中，然后冷冻干燥。在此所提及的，本发明的另一个目的是提供一种方法，它用于改善如ET-743的海鞘素的溶解性以便增加溶液中海鞘素的浓度和减少开始冻干前管瓶中的灌装体积。本发明内容中开发的方法涉及制备本体溶液的实施方案，其中活性物质的浓度高于常规方法所能获得的浓度。因此用本发明方法能获得与常规含甘露醇的制剂相比更少的灌装体积。这种灌装体积减少可以节约冷冻干燥步骤中的时间和能量。另外，也减少ET-743的分解的风险，尤其是在第二干燥期。
正如上述所提及的，ET-743水溶性是有限的，参见例如：van Kesteren，Ch.等，2003，Anti-Cancer Drugs，14(7)，第487-502页。常规的方法提供了采用缓冲剂调节介质的pH到4以增溶ET-743。这种pH控制通常用0.05M磷酸盐缓冲剂实现pH等于4。本发明发现凭借在酸中形成ET-743的预溶液(pre-solution)能提高在本体溶液中ET-743的溶解性。凭借此预溶解，能够增加ET-743在本体溶液和管瓶中的浓度和能够减少管瓶中的灌装体积。在本发明的这些实施方案中，与其常规的灌装体积相比，灌装体积能够减少约80％。作为说明，但不受其限制，本发明的实施方案对于含有0.25mg ET-743的管瓶提供1ml灌装体积，对于含有1mg ET-743的管瓶提供4ml灌装体积。在本发明的其它实施方案中，还可以通过增加ET-743的浓度任选地进一步减少其灌装体积。
常规的方法包括用注射用水将ET-743、甘露醇和pH4的0.05M磷酸盐缓冲液溶解；本体溶液的溶解性受在这种介质中ET-743低的溶解性的限制。本发明中发现在酸溶液预处理ET-743能增加ET-743的溶解性，使本体溶液中有更高的ET-743的浓度。因此，本发明提供用来提高本体溶液中ET-743的溶解性的方法，其包括在酸性介质溶解ET-743，将含ET-743的介质与本体溶液的其它组分混合，和，任选地，调节pH。在一些说明性，但不受其限制，本发明的实施方案中，pH的调节采用磷酸盐缓冲剂来完成。适合的酸性介质不含或基本上不含缓冲成分，并且通常由酸的水溶液组成。
提供的依照本发明的用于冷冻干燥的本体溶液的说明性实施方案是：一种用磷酸二氢钾和磷酸缓冲到pH4的，采用蔗糖作为填充剂的ET-743的溶液。
提供的依照本发明的方法的一个说明性实施方案下：将ET-743溶解在0.1N磷酸中。然后将注射用水(“WFI”)、磷酸二氢钾、蔗糖和ET-743(ET-743预先溶解在0.1N磷酸中)混合。继续前目视检查溶解性，只有观察到才认为溶解完全。检查和通过缓慢加入合适的酸调节溶液的pH值到约1至约5的范围内，更优选约2至约4.5的范围内，还更优选约3至约4.5的范围内，和最优选pH约4.0。这种酸的优选实例是磷酸，其中优选的浓度为约0.1N。任选加入一种合适的碱以控制pH。这种碱优选的实例是氢氧化钾，优选在溶液中，其中优选的浓度为约0.1N。最后加入合适的生物相容性液体，优选WFI，调节容积。然后将本体溶液依照期望的剂量灌装到管瓶中。
本发明的一些实施方案中冷冻干燥是通过减少第二干燥期的时间来实现的。优选的方案包含降温至约-40℃，在40-80微巴初始干燥10-50小时，在低压和0℃以上再次干燥10-50小时。在本发明的其它方案降温至-40℃以下。
本发明的实施例包括通过将产品降温至-40℃以下冻干。在温度约-20℃至约-26℃，压力约60毫巴初始干燥进行大约15-40小时。在温度约20℃至约30℃，压力约100毫巴再次干燥进行大约20-40小时。
本发明冻干制剂的实施方案适合的贮藏温度显著高于常规制剂的贮藏温度。依照本发明的制剂的贮藏温度的实例是大约+5℃。这些温度是容易通过普通的冰箱达到的。
发明附图
图1.稳定性的对比研究。在5℃贮藏6个月后ET-743的纯度评估。
图2.稳定性的对比研究。在5℃贮藏12个月后ET-743的纯度评估。
图3.在5℃贮藏9个月期间不同制剂中ET-701杂质含量。
图4.新制剂与3批参照制剂在5℃贮藏3个月期间的ET-743的％纯度变化对比。
图5.在5℃贮藏3个月期间不同制剂中ET-701杂质含量。
图6.新制剂与3批参照制剂在25℃/65％RH时贮藏3个月期间的ET-743的％纯度变化对比。
图7.在25℃/65％RH时贮藏3个月期间的不同制剂中ET-701杂质含量。
图8.新制剂在40℃/70％RH时贮藏3个月期间的ET-743的％纯度变化对比。
图9.新制剂在40℃/70％RH时贮藏3个月期间的ET-743的％纯度变化对比。
实施例
实施例1
本实施例披露了8个新制剂同常规ET-743制剂(含甘露醇)的稳定性对比研究。乳糖和蔗糖被用于说明本发明。参照制剂用甘露醇。其它已知的填充剂例如葡聚糖(Dextran 40)和聚乙烯吡咯酮(Kollidon 12，PVP)也用于对比试验。表面活性剂硬脂酸-40-聚烃氧基酯(Myrj 45)或聚氧乙烯20脱水山梨醇单油酸酯(Polysorbate 80)在一些制剂中使用，且缓冲剂在一些制剂中是省略的。
采用标准的过程制备和冷冻干燥本体溶液。体积150ml的每个制剂的制备如下：
称取一定量的用于最终溶液的磷酸钾(1.02g)并溶解在90％最终体积(135ml)水中。然后用0.1N磷酸调节pH到pH4.0。
将7.85mg的ET-743加到一种配药玻璃容器中，用磁力搅拌大约1小时使其溶解在2/3体积(90ml)的磷酸钾溶液中(目视检查溶解性)。
加入一定量的填充剂和表面活性剂并溶解在1/3体积的磷酸钾溶液中。然后，将此溶液加到ET-743溶液中，再持续搅拌1小时。
溶液用水补充到最终重量(所有的制剂采用1.019g/cc的密度)。
溶液通过0.22μm纤维素过滤器滤过。
溶液灌装到25ml的玻璃瓶中，每瓶5ml，保持在-20℃直到冻干过程。
依照下表I进行冻干：
              表I
  冷冻到-48℃的时间   4h
  第一干燥期：   48h
  第二干燥期：   44h
在冷冻干燥后，将管瓶封口。管瓶转到冷藏区域(-20℃)
每瓶的组分如下(表II)，注意在冷冻干燥过程中水分被蒸发。
                                               表II
  参照   蔗糖   葡聚糖   PVP  乳糖
  ET-743   0.250mg   0.250mg   0.250mg   0.250mg  0.250mg
  甘露醇   250mg
  蔗糖   500mg
  葡聚糖40   500mg
  Kollidon 12   375mg
  乳糖  500mg
  磷酸二氢钾   34mg   34mg   34mg   34mg  34mg
  磷酸   适量，pH 4.0   适量，pH 4.0   适量，pH4.0   适量，pH 4.0  适量，pH4.0
  注射用水   适量，5ml   适量，5ml   适量，5ml   适量，5ml  适量，5ml
                                  表II(续)
  ET-poly80   ET-myrj   Et-poly80sacc   无缓冲剂的ET-p80sacc
ET-743   0.250mg   0.250mg   0.250mg   0.250mg
甘露醇   250mg   250mg
蔗糖   500mg   500mg
Polyscrbate 80   50mg   50mg   50mg
Myrj 45   50mg
磷酸二氢钾   34mg   34mg   34mg
磷酸   适量，pH4.0   适量，pH4.0   适量，pH4.0
注射用水   适量，5ml   适量，5ml   适量，5ml   适量，5ml
稳定性试验在温度5±3℃时进行。
在5℃3个月期间9个制剂的纯度评估显示在表III和图1中。在一些制剂中显示更高的稳定性(参照，蔗糖，乳糖和ET-poly80sacc)，此稳定性试验延长到9个月，和在一些含乳糖和蔗糖的制剂中由于它们的高度稳定性，稳定性试验甚至延长到12个月。表III中的数据和图2显示含乳糖和蔗糖的制剂呈现提高的稳定性，其纯度减少只有2％。其减少量显著低于在其它试验的制剂中观察到的减少量。
                              表III
                       ET-743纯度(％)
  参照   蔗糖   乳糖  ET-poly80sacc
  冷冻干燥前   98.04   98.34   98.06  97.96
  t＝0   97.67   98.15   97.21  97.85
  1个月   96.06   96.89   96.35  97.72
  3个月   94.37   96.64   95.33  97.58
  6个月   92.81   97.01   94.07  95.98
  9个月   88.17   95.36   94.83  96.01
  12个月   96.31   95.22
                               表III(续)
                             ET-743纯度(％)
  葡聚糖   PVP   ET-poly80   ET-myrj  无缓冲剂的ET-poly80sacc
  冷冻干燥前   96.18   97.62   96.45   97.46  97.45
  t＝0   94.64   93.72   92.46   96.36  95.80
  1个月   93.42   91.96   89.38   94.36  91.84
  3个月   84.90   90.40   81.18   85.31  88.46
正如表IV和图3所示，当ET-743在蔗糖或乳糖存在下配制时，参照制剂中主要的降解产物，ET-701，显著减少。
                             表IV
                       ET-701(％)
  参照   蔗糖   乳糖 ET-poly80sacc
  t＝0   0.188   0.066   0.060 0.050
  1个月   0.533   0.063   0.076 0.060
  3个月   0.890   0.057   0.054 0.050
  6个月   1.732   0.050   0.062 0.050
  9个月   3.225   0.050   0.050 0.050
本发明发现与甘露醇相比，二糖提高ET-743的稳定性。这种二糖的实例包括乳糖、蔗糖和它们的混合物。与含其它常规填充剂，例如葡聚糖和聚乙烯吡咯酮的其它制剂相比，含二糖制剂的稳定性也提高了。依照本发明的二糖制剂的实施方案在5℃时至少12个月被测定是稳定的。与常规制剂中的杂质含量相比，依照本发明的制剂的实施方案的杂质含量显著降低。存在的ET-701相应地减少。本发明的实施方案包含至少一种表面活性剂，例如polysorbate 80。这些实施方案呈现有利的ET-743的溶解性质和稳定特性。然而，至少一种表面活性剂的存在不是本发明的限制性特征，并且其它实施方案不含有这样的表面活性剂。
实施例2
本研究的目的是比较ET-743标准制剂与5个新制剂的稳定性。本研究评估了这些制剂在+5℃时的稳定性。
测试的制剂的成分如下(表V)，注意在冷冻干燥过程中水分被蒸发。
                                            表V
  参照   ETtreal   ETP80treal   ETP80treal250   ETP80sacc250  ETP80trealgly250
  ET-743   0.250mg   0.250mg   0.250mg   0.250mg   0.250mg  0.250mg
  甘露醇   250mg
  海藻糖   500mg   100mg   100mg  200mg
  蔗糖   100mg
  Polysorbate80   10mg   10mg   10mg  150mg
  甘氨酸  15mg
  磷酸二氢钾   34mg   34mg   34mg   6.8mg   6.8mg
  磷酸   适量，pH4.0   适量，pH4.0   适量，pH4.0   适量，pH4.0   适量，pH4.0
  盐酸  适量，pH4.5
  注射用水   适量，5ml   适量，5ml   适量，5ml   适量，1ml   适量，1ml  适量，1ml
采用下面特别的方案制备和冷冻干燥本体溶液：
制剂ETtreal、ET80treal和参照制剂
100g重量的每个制剂如下制备：
称取一定量的用于最终溶液的磷酸钾，溶解在90％最终体积(90ml)的水中。然后用0.1N磷酸调节pH到pH4.0。
将一定量的ET-743(5.0mg)加到一种配药玻璃容器中，用磁力搅拌大约1小时使其溶解在2/3体积(60ml)的磷酸钾溶液中(目视检查溶解性)。
加入一定量的填充剂和表面活性剂，溶解在1/3体积的磷酸钾溶液中。然后，将此溶液加到ET-743溶液中，再持续搅拌1小时。
溶液用水补充到最终重量。
溶液通过0.22μm纤维素过滤器滤过，在滤过前取出等分部分用于IPC。
溶液灌装到25ml的管瓶中，每瓶5ml，保持在-20℃直到冻干过程。
制剂ETP80sacc250、ETP80treal250、ETP80trealgly250
30g重量的每个制剂如下制备：
称取一定量的用于最终溶液的磷酸钾或甘氨酸，溶解在90％的最终体积(27ml)的水中。然后用0.1N磷酸或0.1N HCl调节pH到pH4.0。
称取一定量的polysorbate 80，加到1/3体积的缓冲溶液中。
将一定量的ET-743(7.5mg)加到一种配药玻璃容器中，用磁力搅拌大约1小时使其溶解在2/3体积(60ml)的磷酸钾溶液中(目视检查溶解性)。
加入一定量的填充剂，溶解在2/3体积的缓冲溶液中。然后，将此溶液加到ET-743溶液中，持续搅拌10分钟。
溶液用水补充到最终重量。
溶液通过0.22μm纤维素过滤器滤过。
溶液灌装到10ml的管瓶中，每瓶1ml，保持在-20℃直到冻干过程。
所有6个制剂的冻干步骤依照下表VI进行：
              表VI
  冷冻到-48℃的时间   2.5h
  第一干燥期：   29h
  第二干燥期   36h
在冷冻干燥后，将管瓶封口。管瓶转到冷藏区域(-20℃)
稳定性试验在温度5±3℃时进行。
在5℃时所有的制剂比参照制剂更稳定。在新的制剂之间没有观察到显著的不同。表VII披露了研究中制剂的ET-743的色谱纯度。
                                        表VII
                                ET-743纯度(％)
  参照   ETtreal   ETP80treal   ETP80treal250   ETP80sacc250 ETP80trealgly250
  过滤前   98.63   98.30   97.10   97.67   97.22 98.3
  过滤后   98.62   98.46   97.27   97.67   97.06 98.46
  冷冻干燥后   97.96   98.18   97.65   97.37   97.79 98.18
  1个月   97.35   98.22   97.78   96.39   97.40 98.22
  3个月   97.65   98.53   98.25   96.61   96.66 98.53
  6个月   95.28   97.38   96.93   97.01   97.06 97.38
实施例3
制备ET-NF A、ET-NF B、ET-NF C、ET-NF D、ET-NF E和ET-NF F的6个制剂并用于在不同温度下的稳定性的进一步研究。
选择蔗糖和乳糖作为填充剂。采用两种不同缓冲液：pH 4的0.1M柠檬酸钠缓冲液和pH 4的0.05M磷酸钾缓冲液。测试了本体溶液中两种不同的ET-743的浓度：0.250mg/ml和0.100mg/ml。依据灌装体积(4mL对10ml)采用两种不同的冷冻干燥循环。每个制剂每批生产至少125瓶。
每瓶本体溶液的成分如下(表VIII)，注意在冷冻干燥过程中水分被蒸发。
                                          表VIII
  ET-NF A   ET-NF B   ET-NF C   ET-NF D  ET-NF E   ET-NF F
  组分
  ET-743   1mg   1mg   1mg   1mg  1mg   1mg
  蔗糖   400mg   -   -   1000mg  1000mg   -
  乳糖   -   400mg   1000mg   -  -   200mg
  柠檬酸一水合物   43.6mg   43.6mg   109mg   109mg  -   43.6mg
  柠檬酸钠二水合物   45.12mg   45.12mg   112.8mg   112.8mg  -   45.12mg
  磷酸二氢钾   -   -   -   -  68mg   -
  磷酸   -   -   -   -  适量，pH4   -
  注射用水   4ml   4ml   10ml   10ml  10ml   4ml
采用下面特别的方案制备和冷冻干燥本体溶液：
制剂ET-NF A、ET-NF B和ET-NF F
制备2L约0.2M柠檬酸：76.96g的柠檬酸在2L容量瓶中溶解，溶液用注射用水加至最终体积。柠檬酸溶液的最后摩尔浓度是0.183M。
制备2L约0.2M柠檬酸钠：117.64g的柠檬酸钠在2L容量瓶中溶解，溶液用注射用水加至最终体积。柠檬酸钠溶液的最后摩尔浓度是0.175M。
制备4L约0.1M pH 4柠檬酸盐缓冲液：1125ml的0.2M柠檬酸溶液和875ml的0.2M柠檬酸钠溶液在4L容量瓶中混合。溶液用注射用水加至最终体积。检查溶液的pH并调节到pH 4。柠檬酸盐缓冲溶液的最后摩尔浓度是0.089M。
将143.83mg的ET-743加到一种配药玻璃容器中，用磁力搅拌大约1小时使其溶解在占所需总体积约80％的0.1M柠檬酸盐缓冲溶液中(目视检查溶解性)。
然后，加入一定量的蔗糖或乳糖(制剂A和B用55g蔗糖，制剂F用27.5g乳糖)，将混合物再搅拌约1小时直至溶解。
在pH检查后，溶液通过加入0.1M pH 4柠檬酸盐缓冲溶液来补至最终体积。制剂A需要重新用柠檬酸调节到pH 4。最后溶液的密度：1.04g/l。最终重量572mg。
溶液通过0.22μm的PVDF过滤器滤过。
使用自动泵和3.2mm铂加工处理的硅氧烷管将溶液灌进25ml的管瓶中。标准灌装体积是4ml。以规则的间隔(每15瓶)检查灌装体积，如果需要，调整灌装体积。
在灌装完后，放置冻干塞子并于5℃将管瓶放入冻干器。
冻干步骤依照下表IX进行：
                                  表IX
  周期   步骤   压力   设定T(℃)   斜率(min)   保持时间
  放入   Shelves Ta   atm   5℃
  冷冻   冷冻1   atm   -50℃   1h 50min0.5℃/min
  冷冻2   atm   -50℃   6h
  真空   Ch真空   0.5mb
  升华   1°干燥   0.080mb   -27℃   45min0.5℃/min
  1°干燥   0.080mb   -27℃   58h
  第二干燥期   2°干燥   ＜0.020mb   25℃   3h 30min0.25℃/min
  2°干燥   ＜0.020mb   25℃   40h
  塞上塞子   0.010mb   25℃
将管瓶封口。完成最后的调节。管瓶转到冷藏区域(-20℃)。
制剂ET-NF C和ET-NF D
制备1L约0.2M柠檬酸：38.48g的柠檬酸在1L容量瓶中溶解，溶液用注射用水加至最终体积。柠檬酸溶液的最后摩尔浓度是0.183M。
制备1L约0.2M柠檬酸钠：58.82g的柠檬酸钠在1L容量瓶中溶解，溶液用注射用水加至最终体积。柠檬酸钠溶液的最后摩尔浓度是0.175M。
制备2L约0.1M pH 4柠檬酸盐缓冲液：850ml的0.2M柠檬酸溶液和650ml的0.2M柠檬酸钠溶液在2L容量瓶中混合，溶液用注射用水加至最终体积。检查溶液的pH和调节到pH 4。柠檬酸盐缓冲溶液的最后摩尔浓度是0.089M。
将141.21mg的ET-743加到一种配药玻璃容器中，用磁力搅拌大约1小时使其溶解在占所需总体积约80％的0.1M柠檬酸盐缓冲溶液中(目视检查溶解性)。
加入一定量的蔗糖或乳糖(135g)，该混合物再搅拌约1小时直至溶解。
在pH检查后，溶液用0.1M pH 4柠檬酸盐缓冲溶液加至最终体积。不需要再调节pH。最后溶液的密度：1.04g/l。最终重量1404mg。
溶液通过0.45μm的PVDF过滤器滤过。
使用自动泵和3.2mm铂加工处理的硅氧烷管将溶液灌入25ml的管瓶中。标准灌装体积是10ml。以规则的间隔(每15瓶)检查灌装体积，如果需要，调整灌装体积。
在灌装完后，放置冻干塞子并于5℃将管瓶放入冻干器。
冻干步骤依照前述制剂ET-NF A、ET-NF B和ET-NF F的步骤(表IX)进行。
由于瓶中大量的体积，计划的周期不能产生合适的冻干且产生塌陷。为避免重新制备，所有的管瓶用10ml纯净水重新构成，检查一些重新构成的溶液的纯度，塞子用两孔塞替换，使用下面新的周期(表X)：
                                    表X
  周期   步骤   压力   设定T(℃)   斜率(min)   保持时间
  冷冻2   atm   -50℃   6h
  真空   Ch真空   0.5mb
  升华   1°干燥   0.080mb   -23℃   45min0.5℃/min
  1°干燥   0.080mb   -23℃   80h
  第二干燥期   2°干燥   ＜0.020mb   0℃   10h0.045℃/min
  2°干燥   25℃   62h0.006℃/min
  塞上塞子   0.010mb   25℃
冷冻干燥后，将管瓶封口。完成最后的调节。管瓶转到冷藏区域(-20℃)
制剂：ET-NF E
将141.21mg的ET-743加到一种配药玻璃容器中，用磁力搅拌大约1小时使其溶解在1080ml的注射用水+3,240ml 1N的磷酸中(目视检查溶解性)。
加入一定量的蔗糖(135g)和磷酸钾(9.18g)，再搅拌混合物约1小时直至分子全部溶解。
在pH检查后，用1N磷酸重新调节到pH 4。溶液用注射用水加至最终体积。最后溶液的密度：1.04g/l。最终重量1404mg。
溶液通过0.45μm的PVDF过滤器滤过。
使用自动泵和3.2mm铂加工处理的硅氧烷管将溶液灌进25ml的管瓶中。标准灌装体积是10ml。以规则的间隔(每15瓶)检查灌装体积，如果需要，调整灌装体积。
在灌装完后，放置冻干塞子，于5℃将管瓶放入冻干器。
冻干步骤依照前述制剂ET-NF A、ET-NF B和ET-NF F步骤(表IX)进行。
由于瓶中大量的体积，计划的周期不能产生合适的冻干并产生塌陷。为避免重新制备，所有的管瓶用10ml纯净水重新构成，检查一些重新构成的溶液的纯度，塞子用两孔塞替换，在制剂ET-NF C和ET-NF D中使用一种新的周期(表X)。
冷冻干燥后，将管瓶封口。完成最后的调节管瓶转到冷藏区域(-20℃)。
在所有的例子中均达到期望的ET-743浓度且这些制剂之间的杂质相似。在这制备过程(滤过前和滤过后，或灌装后)中ET-743浓度和杂质没有不同。含乳糖制剂中的本体溶液的颜色是轻微的浅黄色。
4ml或10ml灌装体积的制剂依照指定的方案开始冷冻干燥。然而4ml灌装体积的制剂是恰当地冻干，10ml灌装体积的制剂塌陷。在第二干燥期的压力变量显示冷冻干燥团块的塌陷和喷瓶。制剂ET-NF C、ET-NF D和ET-NF E的管瓶用10ml纯净水重新构成。检查制剂的纯度。因为与本体溶液相比没有观察到纯度的改变，决定使用所示的修正的冷冻干燥周期重新冻干。如所描述的冻干批数产生没有塌陷，但有些底部收缩的良好外观。
管瓶中ET-743的含量在规范内(95％-105％)。制剂之间杂质呈现相似性，并与本体溶液的杂质一致。残留水分的含量小于或等于2％，10ml灌装体积的制剂具有最大值。
在所有情况下重新构成的溶液的pH在4到4.2之间。溶液是澄清的且无色，没有可见的异物或沉淀。所有制剂重新构成的时间相似并小于30秒。
实施例4
本研究的目的是调查不同的温度条件下，每瓶1mg的ET-NF A、ET-NF B、ET-NF C、ET-NF D、ET-NF E和ET-NF F的不同制剂中的ET-743的稳定性。
每个制剂ET-NF A、ET-NF B、ET-NF C、ET-NF D、ET-NF E和ET-NF F一批130瓶，每瓶1mg ET-743，按照实施例3制备。
在5℃，25℃/65％RH和40℃/70％RH时进行稳定性试验。
图4和表XI显示与3个常规制剂(含ET-743、甘露醇和磷酸盐缓冲剂)相比，在5℃贮藏期间新制剂的ET-743的纯度变化。
                                        表XI
                              ET-743纯度(％)
  参照1   参照2   参照3   ET-NF A   ET-NF B
  t＝0   97.70   96.90   97.70   99.06   99.00
  1个月   94.70   94.60   94.00   99.28   98.86
  2个月   93.80   92.70   93.70   99.21   98.97
  3个月   92.50   91.00   91.20   99.22   98.88
                             表XI(续)
                     ET-743纯度(％)
  ET-NF C   ET-NF D   ET-NF E   ET-NF F
  t＝0   98.83   98.98   99.15   98.88
  1个月   98.53   99.03   99.14   98.71
  2个月   98.88   99.15   99.21   98.80
  3个月   98.86   99.12   99.16   98.92
图6和表XII显示与3个常规制剂(含ET-743、甘露醇和磷酸盐缓冲剂)相比，在25℃/65％RH贮藏期间新制剂的ET-743的纯度变化。
                                  表XII
                           Et-743纯度(％)
  参照1   参照2   参照3   ET-NF A   ET-NF B
  t＝0   97.70   96.90   97.70   99.06   99.00
  15天   84.70   84.50   89.50   98.97   98.09
  1个月   74.50   72.40   81.90   99.08   98.13
  2个月   99.10   98.38
  3个月   98.98   98.15
表XII(续表)
                     ET-743纯度(％)
  ET-NF C   ET-NF D   ET-NF E   ET-NF F
  t＝0   98.83   98.98   99.15   98.88
  15天   98.35   98.90   99.11   98.31
  1个月   98.01   99.03   99.13   98.32
  2个月   98.35   98.99   99.10   98.28
  3个月   98.33   98.93   99.09   98.14
图8和表XIII显示与常规制剂(含ET-743、甘露醇和磷酸盐缓冲剂)相比，在40℃/70％RH贮藏期间新制剂的ET-743的纯度变化。
                                 表XIII
                                   ET-743纯度(％)
  参照4   ET-NFA   ET-NFB   ET-NFC   ET-NFD   ET-NFE   ET-NFF
  t＝0   94.92   99.06   99.00   98.83   98.98   99.15   98.88
  2天   87.17   99.02   98.10   98.48   98.95   99.12   97.53
  7天   82.04   98.68   97.08   97.86   98.63   98.89   97.20
  15天   76.33   98.75   97.33   97.77   98.55   98.71   96.66
  1.5个月   98.52   96.99   97.53   97.54   98.47   95.79
  3个月   98.24   95.92   96.67   94.79   97.84   95.91
另外，图5和表XIV显示与3个常规制剂(含ET-743、甘露醇和磷酸盐缓冲剂)相比，在5℃贮藏期间新制剂的ET-701杂质含量。
                             表XIV
                          ET-701(％)
  参照1   参照2   参照3   ET-NF A   ET-NF B
  t＝0   0.70   0.84   0.53   0.11
  1个月   2.56   3.09   1.73   0.12
  2个月   345   3.54   2.69   0.12   0.13
  3个月   4.61   5.04   4.28   0.13   0.13
                       表XIV(续)
                    ET-701(％)
  ET-NF C   ET-NF D   ET-NF E   ET-NF F
  t＝0   0.15   0.16   0.15   0.11
  1个月   0.12   0.12   0.14   0.11
  2个月   0.16   0.14   0.15   0.12
  3个月   0.16   0.15   0.15   0.12
图7和表XV显示与3个常规制剂(含ET-743、甘露醇和磷酸盐缓冲剂)相比，在25℃/65％RH贮藏期间新制剂的ET-701杂质含量。
                               表XV
                       ET-701(％)
  参照1   参照2   参照3   ET-NFA   ET-NFB
  t＝0   0.70   0.84   0.53   0.09   0.11
  15天   7.99   8.20   4.22   0.14   0.12
  1个月   10.56   14.18   6.86   0.11   0.12
  2个月   0.15   0.16
  3个月   0.17   0.17
                            表XV(续)
                 ET-701(％)
  ET-NF C   ET-NF D   ET-NF E   ET-NF F
  t＝0   0.15   0.16   0.15   0.11
  15天   0.18   0.17   0.16   0.13
  1个月   0.18   0.18
  2个月   0.18   0.19   0.24   0.15
  3个月   0.22   0.23   0.24   0.18
正如这些图中所示，新制剂的稳定性高于常规制剂的稳定性。另外，常规制剂主要的降解产物，ET-701，在新制剂中显著地减少。
实施例5
基于蔗糖为填充剂的3个新制剂用于稳定性的进一步研究。这些新制剂的不同在于磷酸盐缓冲剂的摩尔浓度(0.05M对0.1M)和灌装体积或，换句话说，在于本体溶液(10ml对4ml)中ET-743的浓度。
描述了每种至少50瓶一批的这些制剂的制备。每瓶的药方说明书概述如下(表XVI)，注意在冷冻干燥过程中水分被蒸发。
                                         表XVI
            ET-NF G          ET-NF H   ET-NF I
  浓度(mg/ml)   最终组成  浓度(mg/ml)  最终组成   浓度(mg/ml)   最终组成
组分
ET-743   0.250   1mg  0.100  1mg   0.250   1mg
蔗糖   100   400mg  100  1g   100   400mg
磷酸二氢钾   6.8   27.2mg  13.6  136mg   13.6   54.4mg
磷酸   适量，pH4.0   适量，pH4.0  适量，pH4.0  适量，pH4.0   适量，pH 4.0   适量，pH4.0
注射用水   适量，至1ml   4ml  适量，至1ml  10ml   适量，至1ml   4ml
240ml体积的制剂ET-NF-G和ET-NF-I制备如下：
将62.76mg的ET-743加到一种配药玻璃容器中，用磁力搅拌大约1小时使其溶解在192ml的注射用水+1N的磷酸(NF G用576μl，NF I用816μl)的溶液中(目视检查溶解性)。
加入一定量的蔗糖(24g)和磷酸钾(NF G用1.63g，NF I用3.26g)，该混合物再搅拌约1小时直至溶解。
在pH检查后，如果需要，用1N磷酸溶液重新调节到pH 4.00。溶液用注射用水加至最终体积。最后溶液的密度：1.04g/l。最终重量249.6g。溶液通过0.45μm的PVDF过滤器滤过。
使用自动泵和3.2mm铂加工处理的硅氧烷管将溶液灌进25ml的管瓶中。标准灌装体积是4ml。以规则的间隔(每15瓶)检查灌装体积，如果需要，调整灌装体积。
在灌装完后，放置冻干塞子，于5℃将管瓶放入冻干器。
冻干步骤依照下述参数(表XVII)进行：
                                         表XVII
  周期   步骤   压力   设定T(℃)   斜率(min)   保持时间
  Shelves Ta   atm   5℃
  冷冻   冷冻1   atm   -50℃   1h 50min0.5℃/min
  冷冻2   atm   -50℃   6h
  真空   Ch真空   0.5mb
  升华   1°干燥   0.080mb   -27℃   45min0.5℃/min
  1°干燥   0.080mb   -27℃   58h
  第二干燥期   2°干燥   ＜0.020mb   25℃   3h 30min0.25℃/min
  2°干燥   25℃   40h
  结束   0.010mb   25℃
冷冻干燥后，将瓶封口。完成最后的调节。管瓶转轻冷藏区域(-20℃)
600ml体积的制剂ET-NF-H制备如下：
将62.76mg的ET-743加到一种配药玻璃容器中，用磁力搅拌大约1小时使其溶解在480ml的注射用水+1.44ml 1N的磷酸的溶液中(目视检查溶解性)。
加入一定量的蔗糖(60g)和磷酸钾(8.16g)，将混合物再搅拌约1小时直至溶解。
在pH检查后，如果需要，用1N磷酸溶液重新调节到pH 4.00。溶液用注射用水加至最终体积。最后溶液的密度：1.04g/l。最终重量624g。
溶液通过0.45μm的PVDF过滤器滤过。
使用自动泵和3.2mm铂加工处理的硅氧烷管将溶液灌进25ml的管瓶中。标准灌装体积是10ml。以规则的间隔(每15瓶)检查灌装体积，如果需要，调整灌装体积。
在灌装完后，放置冻干塞子，于5℃将管瓶放入冻干器。
冻干步骤依照下述参数(表XVIII)进行：
                             表XVIII
  周期   步骤  压力   设定T(℃)   斜率(min)   保持时间
  Shelves Ta  atm   5℃
  冷冻   冷冻1  atm   -50℃   1h 50min0.5℃/min
  冷冻2  atm   -50℃   6h
  真空   Ch真空  0.5mb
  升华   1°干燥  0.080mb   -27℃   45min0.5℃/min
  1°干燥  0.080mb   -27℃   62h
  第二干燥期   2°干燥  ＜0.020mb   25℃   3h 30min0.25℃/min
  2°干燥   25℃   50h
  结束  0.010mb   25℃
冷冻干燥后，将管瓶封口。完成最后的调节。管瓶转到冷藏区域(-20℃)。
ET-743的含量在规范内(95％-105％)。所有制剂的杂质呈现相似性，并与本体溶液的杂质一致。残留的水分含量小于2％，10ml灌装体积的制剂具有最大值。
在所有情况下重新构成的溶液的pH在4到4.28之间。溶液是澄清的且无色，没有可见的异物或沉淀。所有制剂重新构成的时间相似并小于30秒。
稳定性试验是在贮藏温度为40℃/70％RH，3个月期间进行的。
图9和表XIX显示在40℃/70％RH贮藏期间新制剂的ET-743纯度变化。
                            表XIX
               ET-743纯度(％)
  ET-NF G   ET-NF H   ET-NF I
  t＝0   99.18   99.23   99.00
  7天   99.04   98.68
  15天   98.97   98.86   98.79
  1.5个月   98.72   98.61   98.40
  2个月   98.29
  3个月   97.71
另外，图8中稳定性数据显示与常规制剂(含ET-743、甘露醇和磷酸盐缓冲剂)的对比。
从实施例4和5中获得的结果表明所有含二糖作为填充剂的制剂比含甘露醇作为填充剂的常规制剂更稳定。制剂ET-NF-G是优选的制剂。
依照本发明制剂实施方案在多种贮藏条件(包括温度为-20℃、4℃和25℃/60％RH)，在各种贮藏时间(包括贮藏时间为3个月、6个月和9个月)贮藏后进行了试验。测定结果表明：在-20℃贮藏9个月后至少余留99.5％ET-743，在4℃贮藏9个月后至少余留99％ET-743，在25℃/60％RH贮藏9月后至少余留97％ET-743。最终的杂质，包括ET-701、ET-745和其它杂质在25℃/60％RH贮藏9月个后不超过1.66％。另外，ET-701杂质的量在所述贮藏条件贮藏9个月后不超过0.21％。
所有在此引用的参考文献全文并入。依照在此提供的公开，本发明的特点和优点是明显的。基于此公开，对各种情况和用途的改进和适应是能进行的，因此产生在本发明的范围内的实施方案。

Claims (25)

1、一种组合物，其含有海鞘素和二糖。
2、根据权利要求1的组合物，其中海鞘素包含ET-743。
3、根据权利要求1或2的组合物，其中所述二糖选自乳糖、海藻糖、蔗糖和它们的混合物。
4、根据权利要求3的组合物，其中所述二糖是蔗糖。
5、根据前述任一项权利要求的组合物，其中ET-743与二糖的比例(w/w)为约1∶100到约1∶1500。
6、根据权利要求5的组合物，其中ET-743与二糖的比例(w/w)为约1∶250到约1∶600。
7、根据权利要求6的组合物，其中ET-743与二糖的比例(w/w)是约1∶400。
8、根据前述任一项权利要求的组合物，其还含有缓冲剂。
9、根据权利要求8的组合物，其中所述缓冲剂选自磷酸盐缓冲剂、柠檬酸盐缓冲剂、甘氨酸/盐酸缓冲剂和它们的混合物。
10、根据前述任一项权利要求的组合物，其还含有表面活性剂。
11、根据权利要求10的组合物，其中表面活性剂选自聚氧乙烯20脱水山梨醇单油酸酯、硬脂酸-40-聚烃氧基酯和它们的混合物。
12、根据前述任一项权利要求的组合物，其中组合物是冻干制剂的形式。
13、根据权利要求12的冻干制剂，其中冻干制剂是在管瓶中，并包括一定量的ET-743。
14、根据权利要求13的冻干制剂，其中所述ET-743的量是约250μg。
15、根据权利要求14的冻干制剂，其中所述管瓶包含制剂，制剂含有：约0.25mg ET-743、约100mg蔗糖和约6.8mg磷酸盐，其中所述6.8mg磷酸盐是以磷酸二氢钾计算的。
16、根据权利要求13的冻干制剂，其中所述ET-743的量是约1mg。
17、根据权利要求16的冻干制剂，其中所述管瓶包含制剂，制剂含有：约1.0mg ET-743、约400mg蔗糖和约27.2mg磷酸盐，其中所述27.2mg磷酸盐是以磷酸二氢钾计算的。
18、一种制备包含海鞘素的冻干制剂的管瓶的方法，包括将含有海鞘素和二糖的本体溶液冷冻干燥。
19、根据权利要求18的方法，其中海鞘素是ET-743。
20、一种减少在ET-743的制剂中ET-701的形成的方法，包括将含有ET-743和二糖的本体溶液冷冻干燥。
21、一种制备用于冻干的本体溶液的方法，包括在酸性介质中溶解海鞘素，将此预溶的海鞘素与本体溶液中的其它组分混合，并且任选地，调节最终溶液的pH。
22、根据权利要求21的方法，其中海鞘素是ET-743。
23、一种制备用于超静脉输注的溶液的方法，包括：提供含有冻干的海鞘素和二糖的管瓶，加水形成一种重新构成的溶液，然后用含水的系统稀释所述重新构成的溶液。
24、根据权利要求23的方法，其中海鞘素是ET-743。
25、一种治疗癌症的方法，其包括静脉输注采用权利要求23的方法制备的溶液。
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