CN1886507A - 淀粉中具有增加了直链淀粉含量的水稻及水稻制品 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种具有降低了淀粉分支酶水平的水稻，其产出的谷粒的胚乳具有相对高的直链淀粉含量。本发明的水稻谷粒尽管支链淀粉合成路径受损，但是是不缩水的显形，其可以是转基因的，也可以是非转基因的。

Description

淀粉中具有增加了直链淀粉含量的水稻及水稻制品

技术领域

本发明涉及一种谷粒淀粉中直链淀粉含量相对较高的水稻作物。本发明还涉及一种胚乳中降低了淀粉分支酶IIa(SBEIIa)活性的水稻作物。本发明还涉及由此而获得的谷粒、淀粉及其食物、非食物制品。

背景技术

谷类淀粉中包含有两种分子类型：直链淀粉和分支淀粉。直链淀粉本质上是由α-1.4链接葡萄糖单元组成的线性分子，而支链淀粉是高度分支的连接在直链上的α-1，6葡萄糖甙键。

高等植物的胚乳中，淀粉的合成是通过在四个关键的步骤起催化作用的一系列酶来完成的。第一步，通过将G-1-P和ATP合成ADP-葡萄糖，由ADP-葡萄糖焦磷酸化酶(ADP-glucose pyrophosphorylase，ADGP)活化淀粉的单体前体。第二步，活化后的葡糖糖供体——ADP-葡萄糖——通过淀粉合酶被转换成预先存在的α-1，4键的非还原性的末端。第三步，淀粉分支酶(starchbranching enzymes，SBE)把由葡聚糖连接的α-1，4区劈开，插入分支点，随后将裂开的链转换为受体链，形成新的α-1，6键。SBE是唯一一种能将α-1，6键插入α-聚葡萄糖的酶，因而在支链淀粉的形成过程中起着非常关键的作用。最后一步，淀粉分支酶去掉一部份分支链，尽管其中得机理尚未被解决(Myerset al.，2000)。但是，很清楚地是，高等植物的常规淀粉颗粒的合成过程，至少包括以上四个行为，在突变分析(Wang et al，1998a，Buleon et al.，1998)或者在通过基因改造的方法来修改基因表达水平(Abel et al.，1996，Jobling et al.，1999，Scwall et al.，2000)时，在高等作物胚乳中，上述四个行为的每一行为中都发现有多元同源异构体，每个同源异构体被认为有特定的作用。然而，目前还不清楚每个同源异构体对淀粉生物合成的确切贡献，也不知道在不同物种之间这些贡献是否会显著地不同。

谷类的胚乳中存在两种ADP-葡萄糖焦磷酸化酶的同源异构体：一个是淀粉质体形式，另一个是细胞质形式(Denyer et al.，1996，Thorbjornsen et al.，1996)。每种形式都包含着两个亚组类型。玉米中的缩水突变(sh2)和易碎突变(bt2)，分别表现出大亚组和小亚组的病症(Giroux and Hannan，1994)。在谷类胚乳中，发现有四类淀粉合成酶，一种同源异构体排他性地位于淀粉颗粒、颗粒结合型淀粉合成酶(GBSS)中，有两种被分隔在颗粒和可溶片段之间(SSI，Li et al.，1999a，SSII，Li et al.，1999b)，第四种完全位于可溶片段——SSIII之中(Cao et al，2000，Li et al.，1999b，Li et al，2000)。GBSS在直链淀粉合成过程起着很重要的作用(Shure et al.，1983)，而SSII和SSIII之间的突变改变了支链淀粉的结构(Gao et al，1998，Craig et al.，1998)。目前已经有水稻GBSS(蜡质)基因的描述(Wang et al.，1990)以及用反义方法抑制其表达(Terada et al.，2000)。蜡质基因在胚乳及花粉中有表达但在水稻的其他器官中却没有表达(Hirano and Sano，2000)。

植物中有两种主要的淀粉分支酶(Starch Branching Enzyme，SBE)：SBEI和SBEII。在谷类中，SBEII还分成两种类型：SBEIIa和SBEIIb(Boyer and Preiss，1978；Gao et al.，1996；Fisher et al.，1996；Hedman and Boyer，1982；Mizuno et al.，1992；Sun et al.，1997；Sun et al.，1998)。据报道，在其它谷类中也有其他类型的SBE，如小麦中推定的149kDa SBEI(Baga et al.，2000)和大麦中的50/51kDaSBE(Sun et al.，1996)。水稻(Nakamura and Yamanouchi，1992；Mizuno et al.，1992；Mizuno et al.，1993；Mizuno et al.，2001)、玉米(Baba et al.，1991；Fisher etal.，1993；Gao et al.，1997)和小麦(Repellin et al.，1997；Nair et al.，1997；Rahmanet al.，1997)以及其他谷类的基因组和cDNA序列已经被表征。序列排列显示，核苷酸水平与氨基酸水平同时具有的高度序列相似性，使得SBEI、SBEIIa、SBEIIb能被分组。SBEIIa和SBEIIb通常表现出80％的序列等同性，特别是基因的中心区域。

SBEIIa和SBEIIb也可根据他们的表达模式来区分，包括时间上和空间上，在胚乳及其他组织中。SBEI在小麦和玉米的中期胚乳发展阶段表现(Morell et al.，1997)。相反，SBEIIa和SBEIIb在早期的胚乳发展阶段表现。在玉米中，SBEIIb是胚乳的主要形式，而SBEIIb在叶子上有较高的表达水平(Gao et al.，1997)。在水稻中，发现SBEIIa和SBEIIb在胚乳中的含量大致相同(Yamanouchi and Nakamura，1992)。然而是，这两者的表达时间和表达组织各不相同。SBEIIa在种子成长的早期表达，通常在开花后3天(3days afterflowering，3DAF)被检测到，而且是在叶子中表达；但是在3DAF时检测不到SBEIIb，在7-10DAF时在成长的种子中发现大量的SBEIIb，却不在叶子中表达(Mizuno et al.，2001)。在小麦胚乳中，发现SBEI(Morell et al，1997)排他性地出现在可溶片段里，而SBEIIa和SBEIIb则在可溶片段和淀粉颗粒联合片段中(Rahman et al.，1995)都出现。

高等植物中存在两种分支脱支酶，根据其底物专一性定义为异淀粉酶型脱支酶和支链淀粉型脱支酶(Myers et al.，2000)。玉米和小麦的1-含糖(Sugary-1)突变与该两种脱支酶的缺失有关(James et al.，1995，Kubo et al.，1999)，然而其因果突变基因图谱与异淀粉酶型脱支酶基因却处于相同位置。水稻中，反义异淀粉酶抑制改变了直链淀粉的结构及淀粉的性质(Fujita et al.，2003)，这表明在支链淀粉的生物合成中需要用到异淀粉酶。

表1中列出了从谷类中克隆的代表性淀粉分支酶基因。

             表1谷类包括水稻的淀粉分支酶基因表征

种类	SBE同源异构体	克隆类型	编号	参考文献
					水稻	SBEI	cDNA	D10752	Nakamura andYamanouchi，1992
SBEI	基因组	D10838	Kawasaki et al.，1993
				RBE3		cDNA	D16201	Mizuno et al.，1993
RBE4	cDNA	AB023498	Mizuno et al.，2001
				玉米		SBEI	cDNA	U17897	Fisher et al.，1995
基因组	AF072724	Kim et al.，1998a
			SBEIIb		cDNA		L08065	Fisher et al.，1993
基因组	AF072725	Kim et al.，1998
					SBEIIa	cDNA	U65948	Gao et al.，1997
小麦	SBEII	cDNA	Y11282						Nair et al.，1997

	SBEI	cDNA和基因组	AJ237897 SBEI 基因)AF002821(SBEI 假基因AF076680(SBEI 基因)AF076679(SBEI cDNA)	Bagaet al.，1999Rahman et al.，1997，Rahman et al.，1999
					SBEI	cDNA	Y12320	Repellin et al.，1997
	SBEIIa	cDNA和基因组	AF338432(cDNA)AF338431(基因)	Rahman et al.，2001
					SBEIIb	cDNA和基因组		WO 01/62934
	SBEIIb	cDNA		WO 00/15810
					大麦	SBEIIa和SBEIIb	cDNA和基因组	AF064563(SBEIIb 基因)AF064561(SBEIIb cDNA)AF064562(SBEIIa 基因)AF064560(SBEIIa cDNA)	Sun et al.，1998

玉米和水稻中，高直链淀粉显型表明是SBEIIb基因损伤而导致的，也被称为直链淀粉补充剂(amylose extender，ae)基因，(Boyer and Preiss，1981，Mizuno et al.，1993；Nishi et al.，2001)。在这些SBEIIb突突变中，谷类淀粉胚乳显示出反常的形态，直链淀粉的含量显著地提高，残余的的支链淀粉的分支率降低，短链(＜DP 17，尤其是DP 8-12)的比例下降。此外，淀粉的糊化温度升高。另外，还存在一个相当数量的原料集中区域，被称为直链淀粉和支链淀粉之间的“中间体”(Boyer et al.，1980，Takeda，et al.，1993b)。水稻中，SBEIIb的失活导致直链淀粉含量约为25％，而野生水稻直链淀粉含量约为18％(Nishi et al.，2001)。

相反，玉米植物的SBEIIa基因突变取决于增变基因(Mu)插入元导致蛋白质表达中缺乏SBEIIa，它与野生玉米在胚乳淀粉的分支上难以被区别开来(Baluth et al.，2001)，尽管它们在叶片淀粉中发生了改变。同样地，缺失SBEIIa活性的稻类作物在胚乳中的支链淀粉链属性上没有明显的改变(Nakamura 2002)。在玉米和水稻中，SBEIIa和SBEIIb基因在基因组中都没有连环遗传。

目前已知有多种高直链淀粉的玉米品种。低支链淀粉的(low amylopectinstarch，LAPS)玉米淀粉中有非常高的直链淀粉含量(＞90％)已经通过大量地减少SBEI的活性以及几乎完全丧失SBEII活性的方法来获得(Sidebottom etal.，1998)。

马铃薯中，使用反义方法降低块茎中主要的SBE(SBE B，等价于SBEI)，能导致一些异常的淀粉特性，但不改变直链淀粉含量(Saffor et al.，1998)。对较少形式的SBE(SBE A，类似于谷类的SBEII)进行反以抑制，导致直链淀粉的适当升高至38％(Jobling et al.，1999)。然而，同时降低SBEII和SBEI比单独降低SBEII对直链淀粉含量带来更大的提高，提高至60-89％(Schwallet al.，2000)。

小麦中，完全缺失SGP-1(SSII)蛋白的变异改变了支链淀粉的结构，使淀粉颗粒变形，使淀粉的直链淀粉含量增加到约30-37％，这比野生种类的小麦增加了约8％(Yamamori et al.，2000)。直链淀粉通过比色测量、电流滴定(两者都是碘结合)和伴刀豆球蛋白A(concanavalin A)方法测定。比较于相同的、没有突变的作物，SSII无效突变(SSII null mutant)的淀粉表现出糊化温度下降，谷粒的淀粉含量从野外的60％减少到低于50％。

玉米中，不活泼突变(dull1 mutation)引起胚乳中淀粉含量的下降以及直链淀粉含量的升高，改变的范围取决于遗传本底遗传本底，以及剩下的支链淀粉的分支率提高程度(Shannon and Garwood，1984)。相应的突变基因可采用转位增变基因(Mu)通过转位标签法进行识别和分离，并表明可对被指定的淀粉合成酶(SSII)进行编码(Gao et al.，1998)。该被指定的SSII酶现在已被认知是谷类SSIII家族的成员(Li et al.，2003)。突变的胚乳中，SBEIIa活性的降低与不活泼突变有关。目前不知道这些发现是否与其他谷类作物相关，如水稻。

一系列的谷粒淀粉中直链淀粉含量增加的大麦已经被识别，这包括高直链淀粉冰川(High Amylose Glacier，AC38)，其直链淀粉的相对含量为45％；以及在SSIIa基因中用化学方法引入突变的大麦，其谷粒淀粉中直链淀粉含量增加到约65-70％(WO 02/37955A1；Morell et al.，2003)。这种淀粉表现出糊化温度的降低。

水稻(Oryza sativa L.)是发展国家中最重要的和广泛种植的谷类植物，尤其在亚洲，水稻产量占全球的90％左右。

淀粉被广泛用于食品、纸张和化学工业中。淀粉的物理结构，对淀粉的营养特性和其在食品、非食用产品或工业产品中的加工特性有重大影响。某些特征是由淀粉的物理结构造成的，包括支链淀粉链长的分布、结晶的类型和程度，其他特性如糊化温度、粘性和膨胀体积等。支链淀粉链长的改变是结晶的改变、糊化的改变或支链淀粉退化的指示。。

淀粉组合物，特别是抗性淀粉，具有高含量的直链淀粉，对肠胃特别是大肠的健康，有重要的影响。因此，作为食品以促进肠胃的健康，已开发了特定的谷物如玉米，使其含有较高的直链淀粉含量。抗性淀粉的营养效果，主要体现在它给大肠提供营养储备。其中，肠微生物群发酵抗性淀粉，生成其他短链的脂肪酸而成为本身的能量源。这些短链脂肪酸给结肠粘膜细胞提供营养，促进大肠对营养的吸收，提高结肠的生理活性。通常，如果不对结肠提供抗性淀粉或其他食用纤维，结肠的代谢作用就会相对地钝化。

同时，经化学或其他方式改造的淀粉可以用来食用，以提供正常的、未经改造淀粉所没有的功能。这些加工处理，要么是修改其他价值成分，要么是去掉某些不需要的内容。因此，更可取的是提供以未经改造的形式存在的组分的食品源。

因此，淀粉中直链淀粉含量大于40％的水稻仍然是未知的。虽然已经发现了高直链淀粉含量的玉米和大麦，而水稻种植区的国家希望有较高直链淀粉含量的水稻。这种水稻的淀粉是相对抗消化的，因此，较高直链淀粉含量的水稻被认为对大部分人的健康有很大的益处。

概要

本领域的技术人员都知道，本发明并不限于本说明书的描述，是可变更的和修改的。要知道，本发明在此描述的，包括这些变化和修改，还包括该文本所提及的和指出的单独或共同的所有的步骤、特征、组合物和化合物，也包括任何两个或两个以上的步骤/特征的组合。

通过本文本，“包括”和“包含”之类的词，要理解为包含规定的整体或步骤，但不排除其他的规定的整体或步骤，除非文中有特别说明。本发明不局限于所列举的实施例的范围。所列举的实施例，仅仅为了便于说明。功能相同的产品、合成物和方法都落入本发明的范围。

该文本后面，附有本发明参考过的公开发行的著录的详细资料列表。本说明书中提及的参考资料是指这些完整的资料。这些现有技术中的参考资料，包括任何一种或多种现有技术文件，并不认为是对其的承认，或建议。这些现有技术构成了普通的通用知识或形成了其中的一部分。

此处，“获得、取得、源于”之类的词，应被认为是表示某特定的整体来源于特定的种类，但是不要求是直接地获取。

该文本所涉及的核苷残留物的名称，都是IUPAC-IUB生物化学名称委员会(IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commissio)推荐的，其中，A表示腺嘌呤(Adenine)，C表示胞核嘧啶(Cytosine)，G表示鸟嘌呤(Guanine)，T表示腺嘧啶脱氧核苷(Thymidine)。

发明内容

本发明的第一方面提供一种从水稻作物中获得的谷粒，包括淀粉，其中该谷粒的淀粉中直链淀粉的百分比至少是40％。优选地，该谷粒含有降低活性或水平的SBEIIa和SBEIIb。在一种形式中，通过两种或多种基因变异获取所述谷粒，该基因变异是选自：a)抑制SBEIIa表达和/或活性的SBEIIa基因突变，以及b)引入抑制SBEIIa表达和/或活性的核苷酸；第二种基因突变是选自：a)抑制SBEIIb表达和/或活性的SBEIIb基因突变，和b)引入抑制SBEIIb表达和/或活性的核苷酸。

在一种形式的谷粒中包括转基因，该转基因可用于编码反义、共抑制、核酶或双RNA分子。此外，该谷粒可以是非转基因的，其抑制是来自染色体突变或重排列。该谷粒可包括SBEIIa和SBEIIb基因的无效突变。

该第一方面所要求的谷粒可包括降低了蛋白质水平和/或活性的SBEIIa和SBEIIb。在一特定的形式中，该谷粒还包括降低了蛋白质水平和/或活性的SBEI或也有可能还包括改变了蛋白质水平和/或酶活性的ADP-葡萄糖焦磷酸化酶、GBSS、SSI、SSII、SSIII、异淀粉酶类型的脱麸酶和普鲁兰类型的脱麸酶。在另一特定形式中，该谷粒包括改变了蛋白质水平和/或酶活性的GBSS。在另一可选的形式中，所述谷粒是籼稻(Indica)或者谷粒中包含Wx^α等位基因。

优选地，所述谷粒的淀粉中直链淀粉的含量是至少50％。

优选地，所述谷粒是不缩水的，并且在一特定形式中，该谷粒是糙米，其平均粒重至少是25mg左右，且优选地，其淀粉含量至少是未经改变的相同谷粒的淀粉含量的90％。优选地，在偏振光下，该谷粒中至少50％的淀粉颗粒没有双折射。

本发明的第二方面在于提供一种能产出本发明第一方面所述谷粒的水稻作物。

本发明的第三和第四方面涉及从本发明第一方面所述的谷粒中提取的淀粉及淀粉颗粒。

本发明第五方面涉及从本发明第一方面所述的谷粒所产出的面粉或淀粉产品。所述产品可包括所述面粉或淀粉与其他来源的面粉或淀粉的混合物。所述产品可以是食用产品或非食用产品。

本发明第六方面涉及本发明第三方面所述的淀粉与其他食物成分或水的组合物。

本发明第七方面涉及一种能产出淀粉中包括至少40％的直链淀粉的谷粒的水稻作物的方法，包括以下步骤：a)引入基因变种到母体水稻作物或者种子里；和b)识别母体水稻作物的后代水稻作物或种子，其中该后代作物或种子的淀粉中直链淀粉至少占40％。优选地，基因变种导致了水稻胚乳中SBEIIa和SBEIIb蛋白质和/或活性水平的降低。

优选地，该方法中的后代水稻作物包含至少两种基因变种，其中的一种基因变种是选自：a)抑制SBEIIa表达和/或活性的SBEIIa基因变异，以及b)导入抑制SBEIIa表达和/或活性的核酸；其中的第二种基因变种是选自：a)抑制SBEIIb表达和/或活性的SBEIIb基因变异，以及b)导入抑制SBEIIb表达和/或活性的核酸。

所述引入基因变种的步骤可以包括引入外来的核酸。该外来的核酸被引入到水稻细胞中并再生成水稻植株。优选地，该外来核酸编码SBEIIa和/或SBEIIb表达和/或活性的抑制子。所述抑制子可以是反义、共抑制、核酶或双RNA分子。

可选地，该引入基因变种的步骤中可包括采用化学试剂或辐射对水稻作物母体或种子进行突变变异。

所述后代水稻植株可包括SBEIIa和/或SBEIIb的无效变异。

所述引入基因变种的步骤可附加地导致SBEI蛋白质和/或活性水平的降低。

所述后代植株可根据谷粒淀粉中直链淀粉水平来鉴别，或者根据后代植株的胚乳中SBEIIa和/或SBEIIb蛋白质和/或活性的水平的降低来鉴别。

所述方法还包括将Wx^α等位基因引入到水稻植株中，例如通过杂交引入。

本发明的第八方面在于提供一种产生水稻植株的方法，所述水稻植株中具有同时降低了SBEIIa和SBEII蛋白质水平和/或酶活性的胚乳，包括以下步骤：

a)诱变具有降低SBEIIa蛋白质水平和/或酶活性的种子；或

b)诱变具有降低SBEIIb蛋白质水平和/或酶活性的种子；或

c)将具有降低SBEIIb蛋白质水平和/或酶活性的种子与具有降低SBEIIa蛋白质水平和/或酶活性的种子杂交；和

d)识别出胚乳中含有降低了SBEIIa和SBEIIb蛋白质活性和/或酶活性的水稻植株。

所述识别水稻植株的步骤可包括筛选出具有分子标记的水稻植株，所述的分子标记分别链接在SBEIIa或SBEIIb基因；然后根据从对链接分子标记的筛选中是否存在信号来识别作物。

所述识别水稻植株的步骤可包括从在SBEIIa或SBEIIb蛋白上结合有抗体的水稻植株中筛选出种子，再根据是否存在抗体的结合来识别植株。

本发明还包括一种产出改变的水稻淀粉的方法，包括从本发明第一方面所述的谷粒中提取淀粉的步骤。

本发明还附加地包括使用两种或多种外来核酸分子，其中至少一种外来核酸分子编码水稻SBEIIa表达和/或活性的抑制子，且至少另外一种所述的外来核酸分子编码水稻SBEIIb表达和/或活性的抑制子，以产出具有降低了SBEIIa和SBEIIb蛋白质和/或活性水平的水稻植株。所述抑制子是选自反义分子、共抑制分子、核酶、双RNA分子及其组合。

本发明还包括用以编码水稻SBEIIa抑制子和水稻SBEIIb抑制子的单个核酸分子，该核酸分子可以是相同的或不同的分子。被分离的遗传媒介可以是载体。可以理解的是，本发明涉及包括所述单个核酸分子的细胞，优选水稻细胞。还可理解的是，本发明涉及一种包括所述单个核酸分子的转基因水稻植株。

附图简要说明

图1是具有水稻淀粉分支酶I基因编码(SBEI)的cDNA序列-基因库序列D11082(序列ID.No.1)；

图2是具有水稻淀粉分支酶IIa(SBEIIa)基因编码的cDNA序列-基因库序列AB023498(序列ID.No.2)；

图3是水稻淀粉分支酶IIb(SBEIIb)基因编码的cDNA序列-基因库序列D16021(序列ID.No.3)；

图4是pRint9_BC质体的示意图，该质体包括嵌入到pBC SK-的水稻SBEI基因的基因内含子9的500bp片断；

图5是双RNA结构的示意图；所采用的基因元的顺序是启动子、正义方向的SBEIIa或SBEIIb cDNA序列、内含子(Rini9)、反义方向的SBEIIa或SBEIIb cDNA序列，以及转录终结子/多聚腺苷酸化序列；SBEIIa和SBEIIb基因的转录形成具有由正义和反义序列杂合而成的双绞合区“发夹式”(hairpin)RNA结构。与GT和AG核苷毗接的内含子序列被剪除(spliced out)；图中还示出了pRBEI.IR(pBC SK-(正义/Rinit9/反义))示意图，以及对应的pRBEIIa.IR和pRBEIIb.IR结构。

图6所示是质体载体pBx17casNOT的示意图；

图7所示是水稻SBEIIa(序列ID.NO.2)和水稻SBEIIb(序列ID.NO.3)的cDNA序列比较图。上面的是SBEIIb序列(大写)，下面的是SBEIIa序列(小写)。该图中没有示出5’和3’的末端序列，因为它们没有显著的同一性。

图8所示是采用用于基因沉默结构的SBEIIa、SBEIIb和SBEI 3’序列的基因沉默程序(Gene Silencing program)的爆破输出(BLAST output)。

具体实施方式

产出水稻植株的方法

本发明的一个方面在于提供一种产出水稻植株的方法，该水稻植株的谷粒中含有经改造的淀粉，尤其是该淀粉的直链淀粉相对含量提高到至少40％。此处对淀粉的直链淀粉相对含量的定义是基于重量百分含量(w/w)，即直链淀粉的重量占淀粉重量的百分比。优选地，所述淀粉中直链淀粉的比例至少是45％、50％、55％或60％，更优选地，是至少65％、70％或75％。通常在水稻中，淀粉中直链淀粉的含量是0至35％。所述方法包括降低水稻胚乳中淀粉分支酶IIa(SBEIIa)蛋白质水平和淀粉分支酶IIb(SBEIIb)蛋白质水平或酶活性。与未经改造的水稻胚乳中相应的蛋白质或活性水平相比，本发明中，蛋白质或活性至少降低40％，更优选的是至少降低60％，甚至至少75％，特别优选地是至少降低90％或95％。在本发明的水稻胚乳中，该两种蛋白质中的一种或两种都有可能不被检测到。该方法还包括改变了SBEIIa和SBEIIb基因表达的水稻，或者包括水稻中SBEIIa和SBEII基因的突变，或者以上的组合。从而胚乳中SBEIIa和SBEIIb的活性都被降低。可通过引入核酸如转基因来抑制其中任何一种或同时两种基因的表达。

应当注意到，本文中的“提高”、“降低”、“减少”、“改变”等词语是比较性词语，用于本发明的作物或产品与对应的野生作物或产品的比较，所述野生作物或产品没有经本发明的方法改良。

此处，直链淀粉被定义为主要由由α-1，4吡喃型葡萄糖连接的、类直链淀粉的长链分支淀粉组成的线性分子(有时也叫“中间材料”，“intermediatematerial”，Takeda et al.，1993b；Fergason，1994)。直链淀粉的含量可以通过本领域内任何已知的方法来测定，包括尺寸排除的分子筛高效液法(HPLC)，例如，90％(w/v)的二甲基亚砜(DMSO)，伴刀豆球蛋白(concanavalin)A方法(Megazyme Int，Ireland)，最好是碘量法，如实例1中所述。HPLC法可以包括或不包括淀粉的脱支(Batey and Curtin，1996)。从谷粒的重量和直链淀粉的含量，可以计算出每单位谷粒中直链淀粉的量，并与基因改造和控制种系进行比较。

该方法包括检测水稻胚乳中SBEIIa和/或SBEIIb活性的步骤——最好是两者同时检测。例如，这可通过测量蛋白质水平，如采用免疫检测(immunodetection)法来实现，或采用业内公知的方法如RNA印迹交分析法(Northern blot hybridization analysis)、槽印迹交法(slot-blot hybridization)、RNAse保护分析(RNAse protection assays)、微组合分析(microarray analysis)或反向转录聚合酶链式反应(reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR)来测定其相应的蛋白质的mRNA水平。该方法还包括筛选胚乳中具有降低的SBEIIa和/或SBEIIb活性的水稻植株，或包括选择/标识该植株或谷粒。该筛选/选择步骤可基于SBEIIa和/或SBEIIb活性或蛋白质水平的降低，或者基于水稻植株的谷粒的显型，如直链淀粉含量的增加或支链淀粉含量的降低，或其他可视显型，如缩水谷粒。

SBE活性可以采用酶分析来测量，例如，通过磷酸化酶刺激分析法(phosphorylase stimulation assay，Boyer and Preiss，1978)。该方法用磷酸化酶结合葡萄糖1-磷酸盐和α-D-葡萄糖来测量SBE的刺激性。SBE活性可以通过碘印迹法测量，它所测量的是来源于葡萄糖聚合物的分支的葡萄糖-多碘聚合体的吸光率的降低。SBE活性也可以用分支链分析法来测定，该方法是测量底物上被减少了的直链淀粉的还原性端的产出，再经异淀粉酶消化(Takeda etal.，1993a)。更适宜地，SBE活性是以SBEI活性的缺失来测定的。SBE的同功异构体显示出不同的底物特异性。例如，SBEI在分支直链淀粉中显示出更高的活性，而SBEIIa和SBEIIb在分支的直链淀粉底物上显示出更高的活性。这些异构体也可根据所转换的葡聚糖链的长度来区分。SBE蛋白质也可以采用此文描述的特定抗体来测量。在一优选的实施例中，SBEIIa和SBEIIb蛋白质的水平可通过免疫方法，如采用特别的抗体通过蛋白质印迹(Westernblotting)或ELISA化验法来进行测定，所述特别的抗体被培育成对应于水稻SBEIIa和SBEIIb的N-末端氨基酸序列的多肽片断。SBEII活性可以在胚乳发育过程的谷粒成长时期测定，也可在没有被改良的成熟谷粒的等量的蛋白质中通过免疫化验方法来测定。

本发明的更进一方面在于提供一种改变、尤其是降低水稻胚乳中第三种淀粉生物合成酶活性的方法，并结合SBEIIa和SBEIIb活性的降低，使谷粒的淀粉中直链淀粉含量是至少40％。优选地，胚乳中SBEI活性也被降低。其他与SBEIIa和SBEIIb结合的、可能被改变的淀粉生物合成酶是：SSI、SSII或SSIII。淀粉分支酶也可以被改变，如异淀粉酶或普鲁兰酶的活性。与未经改造的水稻相比，所述第三种淀粉生物合成酶活性可以被提高或被降低，最好是被降低，至少降低40％，更优选地是降低至少60％或80％，特别优选地是90％。

在另一个实施例中，淀粉生物合成酶的活性除了在作物的胚乳之外，也在其他组织中被改变，如叶片中SBEI或SBEII的活性，特别是SBEIIa活性，可以被增加以补偿植株基因变种所遭受的活性损失，该植株的基因变种造成胚乳中SBEIIa活性降低。基因变异不仅引起胚乳中SBEIIa活性的降低，也引起其他组织中特别是叶片中SBEIIa活性的降低时，是最佳的。这是因为胚乳以外的其他组织的活性补偿，例如，可由不在胚乳中表达的启动子控制之下而形成核酶编码区。所述启动子可以是光合作用相关的基因，如rbcS。选择性地，通过SBEIIa和SBEIIb活性的减少再结合一个或多个淀粉生物合成酶的过度表达，可以进一步提高胚乳的淀粉合成。编码这种酶的基因具有多个来源，例如来自细菌或水稻之外的其他来源，而且可以对其进行改造以改变其催化属性，例如，改变酶的温度依赖性(见WO 94/09144)。

高直链淀粉显型可通过部分地或全部地破坏SBEIIa和SBEIIb的基因表达来实现。本发明的方法中包括筛选或标识或选择具有SBEIIa和/或SBEIIb基因无效变异的水稻植株或谷粒。所述“无效变异”定义为导致所期望的植株器官尤其是胚乳中不可检测到蛋白质或核酶的突变。所述筛选/标识步骤因而包括基因水平的筛选，例如，筛选对SBEIIa和/或SBEIIb编码缺失的基因；也包括对所期望的基因表达水平的筛选。基因被抑制的程度在一定程度上决定了水稻谷粒中淀粉的特性。通过对引物采用PCR放大法可方便地筛选出这种缺失，该引物被设计成使至少一部分放大产物区间(spans)至少跨越一部分所期望的基因。对从经过改造的水稻胚乳中提取的蛋白质进行的任何凝胶电泳技术将显出SBEIIa和SBEIIb活性的本性以及改性程度。所述改性可导致胚乳中SBEIIa和/或SBEIIb活性的降低或者核酶活性的完全消除。为实施这些实验，可从水稻胚乳中提取淀粉并分析其蛋白质。业内公知的技术如SDS-PAGE和免疫转渍(immunoblotting)，都可在淀粉颗粒碎片和溶液上实施，以识别出SBEIIa和SBEIIb核酶变性的植株或谷粒。

本发明的方法还包括将基因变种引入到水稻植株或者世系的水稻植株或种子。所述基因变种可包括下述转基因，或者经诱变，如化学诱变或辐射，引入的转基因。

水稻植物

本发明的另一方面在于提供一种水稻作物，该水稻作物的淀粉中，直链淀粉含量至少为40％。所述水稻作物定义为任何的Oryza sativa L种类。该水稻作物可以是O.sativa L.的三个已知品种中的任意一种，即粳稻(Japonica)(或sinica)、籼稻(Indica)和爪洼稻(Javanica)，优选地是籼稻品种。每一品种都有很多栽培变种和亚种，都包含在本发明的植株中。优选的栽培变种生长在澳大利亚，包括，如栽培品种亚玛茹(Amaroo)、艾丽康蕃(Ali Combo)、笆斯玛蒂(Basmati)、蕃杆(Bogan)、蕃比芽(Bombia)、冬嘎喇(Doongara)、谷拉哈(Goolarah)、伊纳帮(Illabong)、加哈(Jarrah)、越光米(Koshihikari)、吉尔玛(Kyeema)、朗节(Langi)、米林(Millin)、纳玛葛(Namage)、澳派司(Opus)、蓓耳德(Pelde)。直链淀粉的含量优选地是至少45％、50％、55％、60％、65％、70％或75％。所述水稻植物至少包括一种抑制胚乳中SBEIIa和/或SBEIIb表达和/或活性的基因变种。该基因变种可以是任何的基因变种，或者结合导致水稻胚乳中SBEIIa和SBEIIb活性和/或蛋白质减少的基因变异，如SBEIIa和SBEIIb基因的突变，被引入的核酸如编码反义、增强反义、共抑制的基因、核酶、双RNA或者类似的抑制SBEIIa和/或SBEIIb表达或活性的分子，以及其组合。所述基因变种优选地是无效变异。具有降低了SBEIIa和SBEIIb活性的植株可通过将SBEIIb减少的植株与SBEIIa减少的植株进行杂交而产出，或者引入对抑制SBEIIa和SBEIIb的基因表达的分子进行编码的转基因而获得。在优选的实施例中，所述水稻作物具有SBEIIa和SBEIIb的无效变异。

本发明还提供一种水稻作物，至少在谷粒生长的部分时期内，其胚乳中具有降低水平的SBEIIa和SBEIIb活性，该水稻作物产生的谷粒的淀粉与从等同的、未经改造的作物中提取的淀粉相比，具有提高的直链淀粉含量。与野生的相比，优选地，胚乳中SBEIIa和SBEIIb水平降低至少50％，更优选地是至少75％，特别优选地，是至少90％或95％。所述“野生”在基因领域具有其本意，包括未经本发明改良的基因型或水稻栽培变种。

本发明还提供一种后代作物和谷粒，所述后代作物和谷粒在基因型和/或显型上具有母体水稻作物的期望特性。本发明还涉及用于产出具有期望特性的水稻作物的繁殖材料，如栽培变种组织或细胞。

本发明改造的水稻植株可与具有更期望的遗传本底遗传本底的植株杂交，因此，本发明还包括具有其他遗传本底的变异。初次杂交后，可进行适当次数的回交以去除不太希望的本底。所述期望的遗传本底可包括适当的基因组合，所述基因具有商业收益和其他特性，如农业性能或非生物的抗压性等。所述遗传本底也可包括其他改造了的淀粉生物合成或改良基因，例如，胚乳缩水且致因基因尚未知道的其它水稻品种的基因。

在优选的实施例中，水稻植株中包括蜡质基因的Wx^α等位基因。该等位基因通常在水稻的籼稻品种中发现，而Wx^b等位基因通常在粳稻(Japonica)品种中发现。Wx^b等位基因在蜡质基因的第一基因内区的5’结合点携带替换突变(GT替换为TT)，而导致了比对应的包括Wx^α等位基因的作物更低的蜡质基因表达，因此导致更低的GBSS活性和更低的直链淀粉水平(Isshiki et al.，1998；Hirano et al.，1998；Frances et al.，1998)。

由此所得的作物和谷粒可以是转基因的或非转基因的。

谷粒

本发明还提供一种相对于等同的、未经改良的水稻作物而言淀粉成分被改变的水稻谷粒。在这里，谷粒被定义为本质上成熟的谷粒，包括出于商业目的而收割的谷粒。收割时，所述水稻谷粒可以是未加工的形式，其包括外壳；或者是“糙米”形式，其外壳已去除。只有糙米是可食用的。所述糙米包括果皮的外层、种皮和珠心、幼芽(胚芽)和胚乳。所述胚乳定义为包括糊粉层和严格意义上的胚乳，包括亚糊粉层(subaleurone layer)和含淀粉的或内部的胚乳。对糙米进行研磨或摩擦以去除果皮、种皮、外种皮、糊粉层和胚芽，可以获得去壳米(milled rice)，其本质上包括含淀粉的胚乳。碾磨导致种皮和糊粉成分的损失，包括一定的脂肪、蛋白质、纤维、矿物质和维生素，所述维生素包括维生素B1、维生素B2、维生素PP和维生素E。去壳米中，碳水化合物含量，主要是淀粉含量比糙米更高。碾磨后的野生水稻谷粒中包含77-89％左右的碳水化合物，6.3-7.1％的蛋白质、1.5-1.7％的含淀粉(starch-bound)和不含淀粉(non-starch)形式的液体、0.3-0.8％的矿物质、0.3-0.5％的天然纤维、0.7-2.3％的中性洗涤剂纤维，还可包含10-15％的水分。“水稻谷粒”或简单的“水稻”定义为包括未加工米、糙米和去壳米，优选地，是去壳米。

本发明的水稻谷粒包括至少一种基因变种，如在此所述的水稻谷粒是衍生出来的水稻植株。该基因变异导致水稻谷粒的胚乳中SBEIIa和SBEIIb活性和/或蛋白质的减少。与等同的、未经改良的作物的谷粒相比较，所述谷粒包含了增加的直链淀粉百分比(作为总淀粉含量的百分比)和减少的支链淀粉的百分比。去壳米的主要成分是淀粉，干的去壳米包含90％左右的淀粉。未经本发明改良的水稻的胚乳淀粉中直链淀粉含量在0-37％的范围，取决于其基因型。基于测定“表观直链淀粉含量”的碘量法(比色法)，去壳米可分类为蜡质(1-2％的直链淀粉)、特低直链淀粉(2-12％)、低直链淀粉(12-20％)、中直链淀粉(20-25％)和高直链淀粉(25-33％)(Juliano，1979，1985)。最近采用HPLC法的研究表明最大的实际直链淀粉含量约为20％，其他的碘结合取决于支链淀粉的长线性链(Takeda et al.，1987)。此处的“直链淀粉含量”或“表观直链淀粉含量”定义为采用碘量法测定，或者业内公知的，如Morrison和Laignelet(1983)所述的分光光度法测定。当然其他方法如高性能液相色谱法(HPLC，例如Batey和Curtin，1996)仅分析“实际直链淀粉”，其可能会低估此处所定义的“直链淀粉含量”。

本发明的谷粒的淀粉中包含至少40％(w/w)的直链淀粉。优选地，直链淀粉占总淀粉的百分比是至少45％、50％或55％的，更优选地，是60％，特别优选地，是65％、70％或75％。在一优选的实施例中，谷粒是非转基因的，其淀粉中包含至少40％的直链淀粉。可选择地，所述谷粒具有降低水平的SBEIIa和SBEIIb蛋白质且其淀粉中含有至少40％的直链淀粉。增加的直链淀粉水平可通过异常的淀粉颗粒形态证明，或者通过在光学显微镜下观察淀粉颗粒的双折射损失来证明，或者采用业内公知的其他方法来证明。

在一优选的实施例中，所述水稻是籼稻品种，或者包含蜡质基因的Wx^α等位基因。

所述谷粒所含有的淀粉可具有改变后的物理特性，例如，糊化温度和升高/降低，和/或在电泳时或之后膨胀特性的改变。

所述的谷粒可以是缩水的或不缩水的，最好是具有不缩水的显型。此处所说的“不缩水”被定义为大多数谷粒，至少90％的谷粒是饱满的，具有丰满的或全填充的显型。这通常与淀粉集聚的正常或接近正常水平相关联。相比之下，此处的“缩水”显形是对大多数谷粒而言，至少90％的谷粒的淀粉集聚都是降低了的。轻度缩水谷粒是指平均淀粉含量至少降低30％，中等缩水谷粒是指平均淀粉含量至少降低50％，高度缩水谷粒是指平均淀粉含量至少降低70％。缩水率可以通过相对淀粉含量来测定，如占谷粒重量的百分比。野生糙米的大小和形状参数定义如下：超长，＞7.50mm；长，6.61至7.50mm；中等，5.51至6.60mm；短，＜5.50mm。基于长与宽的比率特性将谷粒形状定义为：细长，＞3.0；中等，2.1至3.0；粗，1.1至2.0；圆，＜1.0。本发明的水稻谷粒中，上述的每一个特性都可以被改变。

本发明还提供用该谷粒产出的粉、粗粉或其他产品。包括经加工或未加工，如分馏，漂白等。本发明还提供从本发明的水稻作物中取得的对食品生产有用的谷粒。此外，本发明还包括以其他方式加工的谷粒，如碾磨、碾碎、成珠状、粗磨、裂碎、煮等。

淀粉

本发明的另一方面，提供一种从上述的水稻作物的谷粒中获得的淀粉或淀粉颗粒，其具有增加了的直链淀粉含量和降低了的支链淀粉含量。所述水稻作物的胚乳中具有减少的SBEIIa和SBEIIb活性水平。另外一方面，本发明提供一种从所述水稻植株的谷粒中获得的淀粉或淀粉颗粒，其包括至少40％、50％、55％或60％的直链淀粉，更优选地，是至少65％、70％或75％的直链淀粉。可以通过碾磨加工如湿磨法来获得纯淀粉。所述湿磨包括把淀粉与蛋白质、油类、纤维分离。碾磨加工后的最初产品是淀粉颗粒的混合物。因此，本发明包括这些颗粒。

野生品种水稻的淀粉颗粒是多边形的，并且尺寸在3到9微米之间，平均单峰分布(unimodal distribution)尺寸在5微米左右。蛋白质主要以尺寸在0.5至4微米的球形蛋白质形式而存在于整个胚乳之中。

所述的淀粉具有提高或减少了的糊化温度，优选提高了的糊化温度。相比较于从相似的、未经改良的谷粒提取的淀粉，用DSC法测量的糊化温度尤其是第一峰值的起点温度或第一峰值的顶点温度至少升高了3℃，优选地是至少5℃，更优选地，是7℃。所述的淀粉中还可包括提高了的抗性淀粉水平，结构的改变显示出以下一项或多项特定的物理性质：消化酶的物理难接近性，这可能是因为淀粉颗粒形态的改变、与脂类相关联的淀粉的存在、结晶度的改变或分支淀粉分布链长度的改变。较高的直链淀粉含量，对抗性淀粉的水平也有贡献。

本发明还提供一种从实施例的水稻作物的谷粒中获得的淀粉。所述谷粒中食用纤维的含量增加了，优选地，抗性淀粉的水平也同时升高。这些增加，至少部分导致了直链淀粉含量的提高。

减少基因活性的方法：转基因

可以通过引入一个或多个基因变种到水稻作物中改变其SBEIIa和SBEIIb或者其他淀粉合成、修改基因的活性。也可以通过引入转基因到该水稻作物中的方式来实现。所述“基因变种”是基因组上的任何改变，在这里，所述改变引起SBEIIa和SBEII活性的减少，还可选择性地引起其他淀粉生物合成或改良基因活性的减少。该基因变种包括包括点突变、点置换、点复制、点迁移，优选地，包括点的缺失、把一个或多个转基因引入到基因组中。在一优选的实施例中，基因变种是无效突变，例如是倒置、复制、迁移、缺失、移码(frameshift)或RNA接合突变的结果。在这里，“转基因”是生物技术领域常用的含义，包括通过DNA或RNA重组技术生产的或改变的且被引入到期望器官或细胞的基因序列。转基因可以包括源自器官或细胞中的基因序列，如反义序列。在一优选的实施例中，转基因包括核苷序列，该核苷序列至少有19连续的核苷与所述的水稻SBEIIa序列或SBEIIb的19个连续的核苷具有至少94％的同一性。典型地，转基因包括不是来自水稻的外生核酸。“转基因的”是指水稻作物或谷粒或细胞中含有转基因。“非转基因的”是指水稻作物的基因组中没有任何的转基因。为了遗传的稳定性，转基因通常被整合到器官或细胞的基因组中。

这里所述的“基因”，包括SBEIIa、SBEIIb或其他淀粉生物合成基因，或者对反义、增强反义、共抑制、核酶、双RNA之类的分子进行编码的基因，以及在其最大范围内接收的类似物，包括基因组基因，以及对应于基因的编码区(基因内区)的mRNA或cRNA——如果他们存在的话，已转录但尚未翻译的序列，以及包括调节区，所述调节区包括启动子和转录终止子/多聚腺苷酸化序列。“基因”也用于描述合成的或聚合的编码部分或全部功能产品的分子。首选的基因是使用标准的重组技术从自然的SBEIIa、SBEII或淀粉生物合成基因中提取。通常，基因可能屈服于突变而产生一个或多个核苷替代、缺失和/或加成物。这些基因的核苷插入衍生物包括5’和3’末端聚合，以及单个或多个核苷中的序列内插入。随机的插入似乎是可行的，只要从结果产品中进行适宜地筛选；但插入核苷序列变异体是将一个或多个核苷引入到核苷序列中预定的位置。缺失变异体表征为从序列中移除一个或多个核苷。替代核苷变异体是指序列中至少一个核苷被移除和至少一个不同的核苷被插入到该位置。这种替代可以是“沉默”的，在根本上不改变由密码子所定义的氨基酸。同样，保守替代则是指有计划地把一个氨基酸改变成另一个相似的氨基酸。典型的替代如下：

                    氨基酸替代的适宜残留物

          原始的残留物                  典型的替代物

              Ala                           Ser

              Arg                           Lys

              Asn                           Gln；His

              Asp                           Glu

              Cys                           Ser

              Gln                           Asn

              Glu                           Asp

              Gly                           Ala

              His                           Asn；Gln

              Ile                           Leu；Val

              Leu                           Ile；Val

              Lys                           Arg；Gln；Glu

              Met                           Leu；Ile

              Phe                           Met；Leu；Tyr

              Ser                           Thr

              Thr                           Ser

              Trp                           Tyr

              Tyr                           Trp；Phe

              Val                           Ile；Leu

业内技术人员应该知道，细胞中基因的表达以及互补序列要求将所述基因与启动子序列可操作地链接。实现本目的的启动子的选择取决于需要的表达水平和/或该表达所在的组织、器官或细胞，优选的是胚乳特定的启动子。

把核酸分子置于启动子序列的调节控制之下，意味着放置所述核酸分子，使启动子序列能控制该核酸分子的表达。启动子通常但不是必须在上游，或者在其所控制的核酸分子的5’-端。更进一步地，包括启动子在内的调节单元通常位于基因转录的起始位点的2kb处。在异种的启动子/结构基因结合的结构中，启动子的位置离基因转录起始位点的距离，最好大致等于启动子与其所控制的基因(即，衍生该启动子的基因)之间固有的距离。根据现有技术，这个位置的启动子可以被容纳而不会引起启动子功能的损失。同样，与异种基因有关调节序列元的最佳位置定义为该调节序列元固有配置下(即，衍生该调节序列元的基因)的位置，其中，所述异种基因被放置在所述调节序列元的控制下。同样，业内公知，所述距离会有某些变化。

本发明的基因结构中，适用的启动子的实例包括，取自由病毒基因、酵母菌基因、霉菌基因、细菌基因、昆虫基因、鸟类基因、哺乳动物基因和植物基因的衍生而来的启动子，优选植物细胞中的功能性基因，特别是在水稻胚乳中表达的基因。启动子根据表达发生所在的组织的不同，而恒定地或差分地调节表达。而且，随着表达发生的发展阶段不同，或者随着物理压力、温度等外部刺激的不同，该表达也会不同。

降低SBEIIa或其他淀粉生物合成基因活性的方法，包括将转基因引入到可再生的水稻细胞中，或者引入到取自变性细胞的转基因水稻细胞中的步骤。支链淀粉的合成中涉及的分支酶包括SBEI、SBEIIa、SBEIIb，而该转基因能钝化其中至少一种基因。此外，对SBEIIb和/或SBEI的钝化可是直接的，即转基因(如对双RNA、反义、或核酶RNA等编码的转基因，见下述)直接针对SBEIIb或SBEI的表达，或转基因间接地导致SBEIIb或SBEI表达的减少。例如，根据序列的同一性或者碱基配对的顺序，RNA转基因可以不但针对SBEIIa基因/RNA，而且还通过改变胚乳中蛋白质的稳定性或分布来降低SBEIIb或SBEI的活性。本发明的其它形式在于将减少了SBEIIa和SBEIIb活性和一种或多种其他的支链淀粉合成酶的改变相结合，所述其他的支链淀粉合成酶包括SSI、SSII、SSIII和脱麸酶，如异淀粉酶或普鲁兰酶。其中任何一种酶或所有酶的表达，都可以通过引入转基因来改变。在一优选的实施例中，水稻作物的ADP-葡萄糖焦磷酸化酶(ADGP)的过度表达显示出提高了产量(Smidansky et al.，2003)。

目前已经知道水稻中分支淀粉合成基因的几个DNA序列，其中任何一个都可作为设计出钝化水稻基因的转基因的基础。这些序列包括水稻cDNAsSBEIIa(基因库序列E14723，日本专利申请号No.JP1998004970)、SBEIIb(D16021，Mizuno et al.，1993)和SBEI(D11082，Mizuno et al.，1992；D10752，Nakamura和Yamanouchi，1992)。水稻的SBEI基因已被Rahmant et al.，(1997)和Rahman et al.，(1999)或基因库序列D10838，Kawasaki et al.，(1993)所公开。更多基因序列可从下面的网址获取：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/；http://www.tigr.org；http://www.gramene.org/about/index.html。

小麦、大麦、玉米或其他近亲物种的SBEIIa、SBEIIb同族体或其他支链淀粉合成基因也能用于修改水稻中的基因表达水平。可用业内公知的方法获得所述基因或片断，包括PCR放大法或杂交标记探针。同源染色体中准备用作转基因结构的区域，应该与水稻基因具有至少85％的等同性，在适当的区域，最好是具有85％甚至95～100％的同一性。优选地，该转基因是具体针对水稻胚乳中的支链淀粉合成基因的表达，对作物中其他部分的支链淀粉合成只有很小的或极微弱的影响。这可以通过使用适当的调节序列，如转基因的胚乳特定启动子来实现。

文中“严格的杂交条件”意味着，探针和目前序列之间，至少有90％最好是至少95％的序列同一性时，杂交才发生。严格的杂交条件的一个例子是：在含有下述组分的溶液中通宵培养：50％甲酰胺、5×SSC(1×SSC＝150mM的NaCl和15mM柠檬酸化三钠)、50mM苯酚钠(PH＝7.6)、5×丹哈德溶液(Denhardt’s solution)、10％硫酸化右旋糖苷和20up/ml变性剪切带菌DNA，如在鲑鱼精子DNA，然后在大概65℃的条件下，在0.1×SSC中清洗杂交支撑物。其它杂交和清洗的条件是公开的且被Sambrook et al，所示证，“《分子克隆：实验室手册》(Molecular Cloning：A Laboratory Manual)，第二版，ColdSpring Harbor，NY(1989)，particularly chapter 11。”

反义

已知的的基因工程或基因改造用于于修改特别是降低作物中基因的活性，在业界是公知技术。引入基因变种到水稻作物中的方法包括适当的反义分子表达，该反义分子与目标基因的RNA互补并能与之杂交。反义分子被认为干扰了目标基因的mRNA的转录或处理或稳定性，从而钝化了该目标基因的表达。设计反义序列的方法在领域内是广泛知晓的。一些相关例子可以在美国专利号5190131、欧洲专利文本0467349-A1、欧洲专利文本0223399-A1和欧洲专利文本0240208中找到，本发明也参考结合了这些的文献。对作物采用反义技术已被Bourque(1995)和Senior(1998)所论述。Bourque列举了很多关于如何将反义序列用在作物系统而作为基因失活的方法的例子，她同时阐述，没必要100％地抑制酶活性，因为部分地抑制酶活性，更可能导致作物系统发生可测定的变化。Senior(1998)阐述，反义法是目前非常完善的用于控制基因表达的技术。

用于水稻SBEIIa、SBEIIb、SBEI或其他支链淀粉生物合成基因的反义分子是以水稻mRNA序列为基础，或以取自其他物种如大麦的与DNA或mRNA序列同族的序列为基础。这些反义序列可以对应于结构基因，或者对应于影响控制基因表达或基因剪除的序列。例如，所述反义序列可以对应于水稻SBEIIa或其他基因的目标编码区，或者对应于5’-未转录区(UTR)或3’-UTR，及其组合。所述反义序列可以与内含子序列部分互补，从而在转录时或转录后被剪除掉，优选地，仅仅剪除掉目标基因的外含子序列。考虑到UTR通常具有较大的趋异性，以UTR为目标就为基因抑制提供了较大的特异性。反义序列的长度是至少19个连续的核苷，优选地是至少50个、更优选地是至少100、200、500或1000个核苷。与整个基因转录互补的标准长度序列也会用到，其优选的长度是100～2000核苷。反义序列与目标转录之间的同一性程度是至少85％，优选地是至少95％，更优选地是至少95～100％。反义RNA分子理所当然地可以包括不相关的、用以稳定该分子的序列，。

共抑制

另一可用的分子生物学方法是共抑制。共抑制的机理尚未完全了解，共抑制被认为包含转录后的基因沉默(PTGS)，从这一点看来，与很多反义抑制的例子相似。共抑制包含以正义方向将基因或片断的额外复制引入到作物中，所述正义方向与基因表达的启动子有关。正义片段的大小、与目标基因区域的一致性、与目标基因的等同性程度，见上述反义序列。在一些实施例中，基因序列的额外复制干扰了目标作物基因的表达。实施共抑制的方法可以参考专利文本WO 97/20936和欧洲专利文本0465572。

双链RNA-媒介基因沉默

将基因突变引入到水稻作物的另一种方法就是双链或双向RNA媒介基因沉默。该方法也涉及PTGS。该方法中，被引入的DNA至少部分地指引双向RNA产物的合成，与将被钝化的目标基因有同源性。因此，该DNA包含正义和反义序列。所述正义和反义序列被转录成RNA时，能够杂交以形成双链RNA区。在优选的实施例中，正义序列和反义序列被包含内含子的间隔区域隔开，所述内含子在被转录成RNA时被剪除掉。这种安排能带来高效率的基因沉默(Smith et al.，2000)。所述双链区域可以包括一个或两个RNA分子，该RNA分子由一个或两个DNA区域转录而来。双链分子的存在引起了内生作物系统的反应，该反应破坏双链RNA，也破坏了从目标作物基因转录而来的同源RNA，有效地降低或消除目标基因的活性。为实施该方法，可以参考澳大利亚专利文本99/29514-A和专利文本WO 99/53050。杂交的正义和反义序列的长度至少是19个连续的核苷，优选地是至少30个或50个，更优选地是至少100、200、500或1000个核苷。与整个基因转录互补的标准长度序列也会用到，其优选长度是100～2000核苷。反义序列与目标转录之间的同一性程度是至少85％，优选地是至少95％，更优选地是至少95～100％。反义RNA分子理所当然地可以包括不相关的、用以稳定该RNA分子的序列。RNA分子可以在RNA聚合酶II启动子或者RNA聚合酶III启动子的控制下表达。后者包括tRNA或snRNA启动子。

反义、共抑制或双链RNA分子包括大规模双链RNA区域，优选地包括核定位信号(nuclear localization signal)，如PCT/AU03/00292所述。在优选的实施例中，所述大规模双链RNA区域源于PSTVd类病毒，或者包括至少35个CUG三核甘酸重复(trinucleotide repeats)。

核酶

核酶用于引入使水稻中所期望的基因表达失活的基因变异。核酶是带有酶的或催化功能的RNA分子，它能够在由一个或(通常是)两个杂交序列定义的特定位点分裂其它RNA分子。RNA的分裂而钝化了目标基因的表达。核酶可以扮演反义分子的角色，促成基因钝化。核酶包含在杂交序列子间的一个或多个催化域，优选锤头(hammerhead)或发夹(hairpin)类。可用的其他核酶类型包括RNAseP、组I或II内含子以及肝炎病毒类型等。参考欧洲专利文本0321201和美国专利6,221,661。用核酶来对转基因植物中基因的钝化已有示证，如Wegener et al(1994)。

遗传构体/载体

本发明还提供单个的核酸分子，其中包括RNA，最好包括对基因抑制分子进行编码的DNA。优选地，核酸分子以水稻SBEIIa和/或SBEIIb基因序列为目标且有效地对失活水稻胚乳中SBEIIa和/或SBEIIb基因表达的反义、正义(共抑制)、双链RNA或核酶分子进行编码。本发明还提供一种基因结构，其包括一个或多个调节单元如启动子、增强子和转录终止或多腺苷序列。这些单元已为业内所公知。该基因结构还可以包括促进作物——尤其是单子叶作物如水稻——的转基因表达的内含子序列。此处的“内含子”是其通用含义，指已经被转录的、但没有对蛋白质进行编码的且在转换之前被剪除掉的遗传片段。如果转基因对转录产物进行编码，那么内含子可以结合到5’-UTR或编码区域；反之，其可以结合到任何的转录区。在一特定的实施例中，所采用的是直接的胚乳特定表达内含子，如大麦基因内含子(Ahlandsberg et al.，2002)。

本发明还提供了一种载体，如质粒载体，其中包含基因结构。此处的“载体”包括表达载体和转录载体。表达载体能够在体外表达和体内表达；转录载体能够从一个细胞或器官被转移到另一个细胞或器官中。载体包括在细胞中提供复制的序列，如原核细胞中E大肠杆菌或土壤杆菌。优选地，载体是包括T-DNA序列的二元载体，由至少一个T-DNA边界序列定义。本发明还提供了一种包括载体的细胞，例如土壤杆菌或水稻细胞，所述细胞是可再生的，如幼胚盾片上的细胞。可选地，这些细胞可以是转化后含转基因的水稻细胞。

启动子/终止子

本发明中的转基因或其他基因结构可包含为水稻胚乳提供调节和本质表达的转录起始区(启动子)。这些启动子可以是组织特异性的，在胚乳中具有选择性与排他性表达。这些启动子既可以是胚乳特异性的(如高分子量麦谷蛋白启动子、水稻SSI启动子、水稻SBEII启动子、水稻GBSS启动子)也可以是非胚乳特异性的启动子[如泛素启动子(ubiquitin promoter)或CaMV35S或增强35S启动子]。这些启动子可以被温度、光或压力等因素所调整。通常，这些启动子由被表达的5’基因序列提供。这样的结构还包含其他加强转录的单元，如nos 3’或ocs 3’多聚腺苷酸化区域或转录终端。所列举的DNA区域可以结合在含有选择性标记基因序列和其它单元的载体之中，或结合在含有这些序列的与该载体共转化的载体之中。

水稻的改造方法

通过引入外生核酸的方式引入遗传变种到作物中来对水稻进行改造的方法，在本领域内是公知的。如见Chan et al.，1993；Hiei et al.，1994；Zhang et al.，1997；Buchholz et al.，1998。如业内所知，适当的土壤杆菌族(Agrobacteriumstrains)、或者基因枪法、或者水稻质体吸收的聚乙二醇媒介，或类似物，都作为改造的媒介。携带有所期望的核苷序列或基因结构以及可选择的标志的载体，可被引入到培养作物或外植体组织的可再生细胞中，例如，原生质体或未发育完全的胚晶或胼胝体(callus)。所述可选择的标志基因可以为水稻细胞提供抗生素或除草剂抵抗力，或者允许使用底物，如甘露糖，用于生长。优选地，所述可选择的标志将甘氨酸、潮霉素或草铵膦(phosphinothricin)抵抗力引入到水稻细胞中。优选地，所述可再生的水稻细胞来自幼胚或成熟晶胚的盾片及其愈合组织，或者分生组织(meristematic tissue)。改造后的细胞用业内公知的方法筛选和再生以产出改造后的水稻作物，如实施例2所述。

改造后的作物可包含可选择的标志基因，或者包含在再生过程/再生之后被移除的基因。如从基因组中切除所述的可选择的标志基因，或从导致抑制SBEIIa和/SBEIIb的转基因中分离出可选择的标志基因。

转基因或突变已被整合到染色体之中的作物可以被筛选出来，如采用恰当的的对该转基因或表型的观测具有特效的核酸探针来筛选。可以采用任何一种可行的方法来确认转基因作物的存在。例如，可以用聚合酶链式反应(PCR)来放大经改造的作物特有的序列，再用凝胶电泳法或其他方法对放大产物进行探测。从作物中提取DNA的方法可以是传统的方法或PCR反应，其中，PCR反应的实施采用了能区分改造过的和未经改造的作物的引子。例如，可以设定引子来放大DNA区域，该DNA区来自隐藏在构体中的载体并设定反引子来放大相关基因的DNA区域。如果该作物已经被成功改造，那么这些引子仅放大某一片段。另一个能证实进行了有效改造的替换方法是业内公知的DNA印迹交法(Southern blot hybridization)。可以根据显型，来区分或识别改造作物或突变作物与未改造作物或天然作物。如根据可选择的标志基因的存在所带来的显型，或免疫法的特异蛋白质的存在所带来的显型，或者某特异蛋白质不存在所带来的显型，如用ELISA化验法或蛋白质印迹分析(Western blot analysis)分析法检测发现胚乳中不存在SBEIIa蛋白质所带来的显型。可以通过观察谷粒的表形特性来筛选这样的作物，如对不缩水谷粒/升高的直链淀粉含量进行可视化的检测或测量，或者通过显微镜来检测淀粉颗粒是否存在双折射等。

突变

通过在相应的基因或调节序列进行适当的突变，可以实现导致胚乳中SBEIIa酶活性或其他淀粉生物合成酶活性降低的遗传变种的引入。基因被抑制的程度，在一定程度上决定了改造后的淀粉的特性。这些突变可以是截断，或者是无效突变，它们被认为对淀粉的本性有着显著的影响，然而，淀粉结构的改变也可由渗漏突变体(leaky mutant)引起，所述渗漏突变体显著地减少了水稻谷粒或淀粉的支链淀粉合成酶的活性以提供所期望的特性。其它染色体重组也是有效的方法，包括缺失、插入、复制或、点突变等。

突变可以通过化学的或辐射的手段来实现，例如对种子进行EMS或叠氮钠(Zar and Chandler，1995)处理，或者γ辐射。对于γ辐射诱导突变，种子在钴60放射源下以20-50kR剂量照射(Zikiryaeva and Kasimov，1972)。EMS突变是把种子用EMS(0.03％，v/v)进行处理(Mullins et al.，1999)。突突变种的分离可以采用筛选突变作物或种子来实现。例如，可以用ELISA法，从一定数量的突变的水稻中，筛选出谷粒中直链淀粉含量高的和/或大于正常的支链淀粉分布链长度的、或者不含SBEIIa和/或SBEIIb蛋白质的，或者根据已改变的谷粒形态(Green et al.，1997)来筛选。筛选最好在缺少某种SBE活性的谷粒形态下进行，例如SBEIIb-或SBEIIb-阴性背景下。然后，通过采用具有所期望的遗传本底的作物与这种突突变种进行杂交，并通过适当数量的回交把不想要的母体遗传本底除掉，从而把这些突变被引入到所期望的遗传本底中。优选的突变是影响水稻的SBEIIa和SBEIIb表达或活性的突变。

因此，本发明提供高直链淀粉、非转基因的水稻谷粒及其产品。

对SBEIIa、SBEIIb或涉及支链淀粉合成有关的核酶编码的突变，例如GBSS水平的提高，使水稻胚乳的淀粉中直链淀粉含量升高。每颗谷粒中直链淀粉量的增加，是碳元素从支链淀粉转到直链淀粉的结果；如果每颗谷粒的淀粉量显著减少，直链淀粉的量也可能减少。但这两种情况下，直链淀粉占淀粉的百分比都是升高的。

据报道，高直链淀粉大麦的种子中有扭曲形状的淀粉颗粒(Morell et al.，2003)，低支链淀粉(LAPS)玉米淀粉中有90％左右的直链淀粉(Sidebottomet al.，1998)。这些显型可用于选择一定数量的诱变水稻。双折射也可用于此。双折射是物质在两个方向反射光的能力；在偏振显微镜下观察时，双折射在淀粉颗粒上产生暗十字，称为“马尔他十字”(“maltese cross”)。双折射是颗粒内聚合体的结构组织规则程度的反映(Thomas和Atwell，1999)。淀粉颗粒中双折射的损失通常与增加的直链淀粉含量有关。

适宜的食用产品

本发明另一方面提供一种适于食用产品的水稻，其谷粒的淀粉中包含相对高的直链淀粉含量和降低了的支链淀粉含量。优选地，所述谷粒来源的水稻作物的生长期胚乳中具有降低了蛋白质和/或活性水平的SBEIIa和SBEIIb。本发明的水稻作物适用于食用产品，尤其是商业食用产品。

水稻的期望遗传本底包括农业收益和其他特性。这些特性可以包括农学性能、抗病体和非生物压力抵抗性。在澳大利亚，某些人希望把改造后的淀粉特性杂交到水稻栽培变种，包括亚玛茹(Amaroo)、艾丽康蕃(Ali Combo)、笆斯玛蒂(Basmati)、蕃杆(Bogan)、蕃比芽(Bombia)、冬嘎喇(Doongara)、谷拉哈(Goolarah)、伊纳帮(Illabong)、加哈(Jarrah)、越光米(Koshihikari)、吉尔玛(Kyeema)、朗节(Langi)、米林(Millin)、纳玛葛(Namage)、澳派司(Opus)、蓓耳德(Pelde)或其他广泛种植的变种。所列举这些品种是适宜于澳大利亚生产区的，其他的变种适宜于其他种植区。优选地，在至少一些栽培区，相对于所种植的野生水稻品种，本发明的水稻变种能带来不少于80％的收益，更优选地是不少于90％，特别优选地，是不少于95％的收益。所述产量收益可通过试验控制田很容易地测量到。

谷粒中淀粉含量(w/w)至少是25％，优选地是至少35％或45％，更优选地是接近野生水平的55％至65％(w/w)。更优选地，谷粒的淀粉含量至少是等同的、未经改造的水稻的谷粒淀粉含量的90％。淀粉含量低于野生作物的，很可能是降低了支链淀粉水平的结果。即使淀粉含量更低，这种谷粒在食品生产上也还是有用的，因为高直链淀粉产品具有相对的高价值。其他期望的特性包括谷粒的碾磨能力，特别是谷粒的硬度。另一方面，是谷粒中淀粉提取程度，淀粉提取率越高，越有用，这种谷粒就越有价值。谷粒的形状也是影响作物商业有用性的一个特性，因为其对碾磨的难易程度产生影响。例如，细长形状的谷粒就难碾磨和加工。

使用标准的方法能很容易地从水稻谷粒中分离出淀粉，例如通过在碱性溶液中湿磨以去除蛋白质。碎米在碱性溶液中浸泡24小时后，接着在碱性溶液粉磨机、锤磨机或石磨中湿磨。米糊存放10至24小时候，用筛除去纤维，通过离心收集淀粉，然后用水清洗，干燥后就得到淀粉。

改性淀粉的物理特性

本发明另一方面，水稻淀粉具有改变了的糊化温度，可用采用差式扫描量热法(DSC)测量。糊化是在过量的水中淀粉颗粒的分子顺序被热驱动瓦解(分裂)，具有伴随的和不可逆转的属性变化，如微粒膨胀，晶体溶解、双折射损失、粘性增加和淀粉加溶。与野生作物的淀粉相比，糊化温度升高或降低取决于残余的支链淀粉的链长。玉米中的ae(amylose extender，直链淀粉补充剂)突变带来的直链淀粉含量增高，显示出玉米的胶凝温度比常态的高(Fuwa et al.，1999，Krueger et al.，1987)。换句话说，相对于控制作物，大麦的sex6突变的淀粉缺乏淀粉合成酶IIa活性，糊化温度变低，糊化峰点的焓减少(Morell et al.，2003)。

胶凝温度的改变，可能与直链淀粉含量高有关系。用差式扫描量热法测定出野生水稻淀粉胶凝第一峰值的温度典型的是61-67℃(Rahman etal.，2000)，该温度定义为起点温度(onset temperature)。

与野生作物的淀粉比较，可以通过在过量的热水中的膨胀率来描述本发明所涉及的淀粉的特征。膨胀体积的测量，通常是将淀粉或面粉和水混合，再加热到高温，通常是90℃以上。然后通过离心法取样，膨胀体积通常用样品沉淀物的质量除以样品的干重来标示。在食品加工中，特别是含水食品加工中，要增加淀粉的含量，就期望淀粉具有低膨胀率的特性。

本发明中筛选出来的水稻淀粉的结构，与普通水稻淀粉的不同之处是，结晶度比普通水稻淀粉低。淀粉结晶度的降低，被认为能加强其感官属性，口感上会觉得更滑。淀粉结晶度的降低，可能是因为一个或多个支链淀粉合成酶活性的减少。结晶度可以通过X-射线结晶学来探测。

支链淀粉结构改变的一个尺度就是淀粉链长的分布，或者聚合度。可以先用荧光辅助糖类电泳(FACE)，接着使用异淀粉酶脱麸来测定链长分布。本发明中，淀粉中的支链淀粉链长分布的范围是从5到60，大于野生作物脱麸后的淀粉的链长分布范围。链长更长的淀粉，分支的频率有相应的减少。因此，淀粉的支链淀粉中，仍然存在具有更长的支链淀粉链长的分布。

食用特性

淀粉是人类饮食中碳水化合物的主要来源，尤其是亚洲。本发明的谷粒及其产物都可加工成食品。这些食品可以供人或动物食用，如家畜食品或宠物食品。来自改造后的水稻作物的谷粒，能容易地用在食品加工中。因此，本发明所得的改性淀粉颗粒可用于食品加工程序，因而本发明包括碾磨的、磨碎的、粗磨的、爆裂的、碾轧的、煮的或蒸的谷粒，或由此而得的产品，包括粉、面包、礼品(brokers)、米糠和米糠油。所述产品可以是预煮的或速煮的米，速食米、粒状米、糊化米、罐装米或米饭布丁。谷粒或淀粉可用于加工各种水稻产品，包括面条、年糕、米纸或蛋卷，或者发酵食品，如发酵的面粉或者饮料，如酒。所述谷粒或淀粉也能用于面包、蛋糕、爆米花、饼干等，包括将米粉与面粉(小麦粉)或其他粉、食品添加剂如增稠剂、结合剂混合，或者用于制造饮料、面、意大利面食或速食汤等。这些米制食品也适用于无麦食物。本发明的谷粒衍生的米或产品，如爆米花、米薄片等是特别受欢迎的早餐食品。本发明的直链淀粉含量高的淀粉，可以用做强力凝胶剂，这在制糖产品中很有用，节省了成型和固化时间；还可以用来做食物敷层，如应用到油炸马铃薯上，可以减少对油的吸收。

食用纤维

在本文本中所述的食用纤维，是指碳水化合物和碳水化合物消化产物。这些消化产物不会被健康人体的小肠吸收，而是进入到大肠中。食用纤维包括抗性淀粉和其他可溶的或不可溶的碳水化合物聚合体，还包括部分的碳水化合物蛋白，这种蛋白是可发酵的，至少能够被大肠的常驻微生物群部分地发酵。

本发明所述的淀粉优选地包括相对高含量的食用纤维，特别是相对高含量的直链淀粉。本发明中的谷粒中食用纤维的含量，可以是胚乳中直链淀粉含量增加单方面造成的；也可以是多方面造成的。

本发明的其他方面涉及高蛋白淀粉层、微生物、高含量的食用纤维的结合。具体地，涉及谷粒中更高的相对的蛋白淀粉/微生物高含量。轻度缩水的水稻谷粒中，胚乳的量也减少，而高蛋白淀粉层和微生物含量却相对地提高了。这种水稻具有相对高含量的特定有益的元素或者维生素、抗性淀粉等，包括二价阳离子、可生物利用的Ca⁺⁺和维生素如叶酸、抗氧化剂如维生素E和生育三烯酚类等。碾磨产物的一种形式是包括高蛋白淀粉层。特定的碾磨处理可以提高碾磨产品中糊份层的含量。因而由碾磨谷粒衍生的或其他处理所衍生来的任何食品都具有高蛋白淀粉层和微生物含量，具有附加的营养成分，而不需要从其他来源添加相应的元素。

抗性淀粉

抗性淀粉，是一个总称，指没有被健康人体的小肠吸收而进入大肠的淀粉及淀粉产品。因此，抗性淀粉不包括被小肠吸收消化的淀粉，抗性淀粉包括不能被身体吸收的淀粉(RS1型)，抗性原淀粉颗粒(RS2型)，回生淀粉(retrograded starch，RS3)，化学变性淀粉(RS4)。本发明中改变淀粉的组成特别是提高直链淀粉的含量，会引起食物中抗性淀粉的增加。增加的抗性淀粉可能是RS1型的，基本上不会被消化。经V-complex结晶度测量的淀粉-脂肪的结合度，也对抗性淀粉含量升高产生影响。

可以理解，本发明的一个好处就是其能产生具有特定营养价值的食品，并且，不需要对水稻谷粒的淀粉或其他的成分作收割后的改性。但是，有时可能期望对谷粒的淀粉或其他的成分进行改性，本发明就包含这种改性要素。改性方法是公知的，包括用传统的方法提取淀粉或其他成分，以及改良淀粉以增加抗性形式的淀粉。可使用热/湿度、物理加工(如碾磨)、酶促(如用α-直链淀粉或β-直链淀粉酶，普鲁兰酶等)、化学水解(采用液态或气态试剂进行湿式或干式水解)、氧化、双官能剂交联(如三偏磷酸钠、三氯氧磷等)、羧甲基化等处理方法来对淀粉进行改性。

糖解指数

醣解指数(GI)涉及含淀粉食物的消化率，是用来比较试验食物与白面包或葡萄糖所带来的血液中葡萄糖浓度效果的。醣解指数根据膳食后血糖浓度，以及要维持血液中葡萄糖的动态平衡所需要胰岛素量来衡量该食物可能存在的效用。本发明涉及的食物，一个重要的特性就是降低了醣解指数。志愿者摄取高直链淀粉水稻30分钟后，血糖水平比摄食等同低直链淀粉水稻的要低(Goddard et al.，1984)。更进一步地，该食物最终消化水平低，是相对低能量的食物。低能量产品包括含有面粉的糙米颗粒。这些产物有利于补充、增强肠胃的健康，有利于减少膳食后血糖浓度和油脂浓度，同时也能提供低热量的食品。

非食用的应用

本发明提供一种改造过的或改良的淀粉，其具有提高了的直链淀粉含量或降低了的支链淀粉含量，这些特性满足工业上的很多要求。淀粉广泛用于非食用工业，包括薄膜、纸张、纺织品、瓦楞纸、粘合剂产业(Young 1984)，如用作浆料。水稻淀粉可以当作生产葡萄糖浆产品或乙醇产品的原料。未经改性的淀粉，其物理特性限制了其在某些方面的使用，经常需要对其进行化学改造，这种化学改造通常成本很高或者有其他方面的缺陷。本发明提供的淀粉，收割后不需要对其做太多的改造，其支链淀粉含量已经被减少，还附带着其他物理特性。如，糊化温度、抗剪应力(shearing stresses)、成膜强度和/或淀粉的抗水性，由本发明的谷粒制造的产品的性能也可以被改变。本发明所涉及的淀粉还可以用来加工可生物降解的宽松包装材料，可以作为聚苯乙烯或者其他包装材料的替代品。

本上面已经对本发明的多个方面进行了说明，可以理解地，本发明也可以包含于上述两个或多个方面的组合。

实施例

实施例1：材料与方法

材料与溶液

宏量元素(macro-elements)N6(20×原液)

(NH₄)₂SO₄               9.3

KNO₃                       56.6

KH₂PO₄                   8

MgSO₄.7H₂O               3.7

CaCl₂.2H₂O               3.3

宏量元素MS(20×原液)

                          g/l

NH₄NO₃                 33.0

KNO₃                    38.0

KH₂PO₄                 3.4

MgSO₄.7H₂O             7.4

CaCl₂.2H₂O             8.8

微量元素N6(1000×原液)

                          mg/100ml

MnSO₄.4H₂O             440

ZnSO₄.7H₂O             150

H₃BO₃                  160

KI                        80

微量元素MS(1000×原液)

                          mg/l

MnSO₄.4H₂O             22300

Na₂MoO₄.2H₂O          250

H₃BO₃                  6220

ZnSO₄.7H₂O             8600

CuSO₄.5H₂O             25

CoCl₂.6H₂O              25

KI                         830

微量元素B5(100×原液)

                           mg/l

MnSO₄.4H₂O              1000

Na₂MoO₄.2H₂O           25

H₃BO₃                    300

ZnSO₄.7H₂O              200

CuSO₄.5H₂O              3.87

CoCl₂.6H₂O              2.5

KI                         75

维生素N6(100×原液)

                           mg/100ml

甘氨酸(Glycine)            20

盐酸硫胺(Thiamine-HCl)     10

盐酸吡哆醇(Pyridoxine-HCl) 5

烟酸(Nicotinic acid)       5

维生素MS(100×原液)

                           mg/100ml

肌醇(myo-Inositol)         1000

盐酸硫胺(Thiamine-HCl)     1

盐酸吡哆醇(Pyridoxine-HCl) 5

烟酸(Nicotinic acid)       5

维生素B5(100×原液)

                            mg/100ml

甘氨酸(Glycine)             1000

盐酸硫胺(Thiamine-HCl)      100

盐酸吡哆醇(Pyridoxine-HCl)  10

烟酸(Nicotinic acid)        10

铁MS(MS iron)(200×原液)

                            ml/500ml

FeCl₃(60％w/v)             2.7

乙二胺四乙酸二钠MS(MS Na₂.EDTA)(200×原液)

                            g/500ml

乙二胺四乙酸二钠(Na₂.EDTA)  3.7

制备2，4二氯苯氧乙酸(2，4-D)(1mg/ml，Sigma No.D-6679)原液：将100mg的2，4-D溶解在1ml无水乙醇中，并在其中加入3ml 1N的KOH，再用1N的HCL将pH调为6。

制备6-苄氨基嘌呤(6-benzyl amino purine，BAP)(1mg/ml BAP，Sigma No.B-3408)溶液和萘乙酸(naphthalene acetic acid，NAA)(1mg/ml NAA，SigmaNo.N-0640)溶液。

制备脱落酸(Abscisic acid，ABA)：将250mg ABA溶解在2ml的1M NaOH中，用无菌注射用水(sterile water)将其稀释到100ml。

制备特美汀(Timentin)(150mg/ml，Smith-Kline Beecham 6571-30)：将3.1g特美汀溶解在20.66ml的无菌注射用水中。

从罗氏(Roche)公司(No.843 555)或者Sigma的其他试剂中提取潮霉素(50mg/ml)。

愈伤组织诱导溶液N6D(N6D media for callus induction)

                                       (总量/升)amount/litre

宏量N6(N6macro)(20×)                  50ml

微量N6(N6micro)(1000×)                1ml

维生素N6(N6vitamins)(100×)            10ml

铁MS(MS iron)(200×)                   s5ml

乙二胺四乙酸二钠MS(MS Na₂.EDTA)(200×) 5ml

肌醇(Myoinositol)                      100mg

酸水解酪素(Casamino acid)              300mg

脯氨酸(proline)                        2.9g

2，4-D(1mg/ml)                         2ml

蔗糖(Sucrose)                          30g

用1M的KOH将pH调至5.8，每升溶液添加3g有机抗敏(phytogel)，混合后高压灭菌。

接种溶液(media for subculturing)NB

                                       总量/升(amount/liter)

宏量元素N6(20×)                       50ml

微量元素B5(100×)                      10ml

维生素B5(100×)                        10ml

铁MS(200×)                            5ml

乙二胺四乙酸二钠MS(200×)              5ml

2，4-D(1mg/ml)                         2ml

蔗糖(Sucrose)                          30g

脯氨酸(proline)                        500mg

谷酰胺(Glutamine)                      500mg

酶水解酪素(Casein enzymatic hydrolysate，CEH)    300mg

用1M的KOH将pH调至5.8-5.85，每升溶液添加3g有机抗敏(phytogel)，混合后高压灭菌。

接种溶液MS

                                       总量/升(amount/liter)

宏量元素MS(20×)                       25ml

微量元素MS(1000×)                     1ml

维生素MS(100×)                        10ml

铁MS(200×)                            5ml

乙二胺四乙酸二钠MS(200×)              5ml

蔗糖                                   10g

用1M的KOH将其pH调至58-5.85，每升溶液添加2.5g有机抗敏(phytogel)，混合后高压灭菌。

NBO：NB溶液在调节pH值之前，加入30g/l的甘露醇(mannitol)和30g/l的山梨糖醇(sorbitol)。

NBHT30：NB溶液在高压灭菌之后且倾倒之前，加入30g/l的潮霉素(hygromycin)和150g/l的特美汀(Timentin)。

NBHT50：NB溶液在高压灭菌之后且倾倒之前，加入50g/l的潮霉素(hygromycin)和150g/l的特美汀(Timentin)。

PRHT50：NB溶液(不含2，4-D)在高压灭菌后加入以下物质，使其最终成分如下：BAP(2mg/l)，NAA(1mg/l)，ABA(5mg/l)，潮霉素(50mg/l)和特美汀(150mg/l)。

MST溶液：MS溶液在高压灭菌后，添加NAA和特美汀，使该媒介MS的NAA和特美汀分别为0.05mg/l和150mg/l。

水稻改造

将成熟谷粒脱壳，在70％的乙醇中浸泡1分钟，然后用消毒水清洗3次，接着在50％的漂白剂中浸泡30分钟。在无菌条件下将灭菌后的谷粒用消毒水彻底清洗，接着在N6D溶液中培养。培养板用微孔膜密封，在光照下孵化6-8周，孵化温度为26-28℃，以产生愈伤组织(callus)。不用对谷粒的晶胚作任何解剖，从晶胚的角质鳞片(scutellum)即可推测愈伤组织的生成。需要接种时，将愈伤组织(calli)转移得到NB溶液中，用封口膜密封培养板，置于铝箔覆盖的暗箱中，温度28℃。每4周实施一次接种。在将愈伤组织用于改造前，接种次数不多于5次。

对于土壤杆菌属为媒介的改造，将含有要被转移的基因结构的土壤杆菌族在28℃下、在具有适当抗生素的培养板上生长。生长两天后，从培养板上刮下土壤杆菌族细胞，将其重新悬浮在含100um乙酰丁香酮液体的NB溶液中。10分钟后，看起来健康的愈伤组织会浸入在悬浮液中。将健康的愈伤组织排出，将其置于含有100um乙酰丁香酮的NBO培养板上，在25℃的阴暗处放置2天。这个阶段称为含有基因结构的土壤杆菌族的“协同培养”。协同培养之后，用含150ml/l特美汀的消毒水冲洗愈伤组织，简单洗干后在含有150mg/l特美汀的NBHT30(其包括选择性的潮霉素试剂)中培养。在26-28℃下，3-4周后，将生长区的愈伤组织在相同的溶液中再培养10-24天。再培养表明愈伤组织中具有了抗潮霉素，即变性的愈伤组织。将这些愈伤组织转移到含特美汀的NBHT50培养板上，再在26-28℃的阴暗处孵化14-21天。将看起来健康的愈伤组织转移到PRHT50排样板上，置于阴暗处8-12天。最后，在28℃的RHT50溶液中培养30天或更长时间，即长出新芽(shoot)。将具有根系的芽转移到1/2MST溶液中，当芽长到一定程度后，再将其转移到温室的土壤中。该方法已在多种水稻品种上试验成功，包括籼稻(indica)和粳稻(japonica)。

实施例2：基因减量调节的构造准备

用PCR放大水稻的SBEI、SBEIIa和SBEIIb基因片断，以用于水稻基因表达的减量调节的基因构造准备。所述基因片断从靠近基因3’末端的外显子区选取，因为该区域具有更多的分支，该区域被认为是能通过变性水稻的构造来降低可能的基因交叉沉默。被放大的片断是：基因库序列为D11082的SBEI-核苷的1982-2527片断；；基因库序列为AB023498的SBEIIa-核苷的2458-2997片断；基因库序列为D16201的SBEIIb-核苷的2414至2912片断(其序列分别在图1-3中示出)。放大后的片断被克隆到质体载体pGEM-T中所述放大后的片断包括附加的序列，其末端包括核酸内切酶限制点(restrictionendonuclease sites)以利于该克隆步骤。同时通过放大水稻SBEI内含子9的序列而获取内含子的序列。该片断包括基因库序列为D10838的遗传序列的核苷9112-9606片断序列，然后在SpeI和EcoRI限制点侧接，再将片断插入到pBCSK-(stratagene公司)以形成pRint9_BC(图4)。接着，在pRint9_BC中，以反义和正义方向分别在SpeI/XbaI和XhoI/EcoRI点克隆SBEI、SBEII和SBEIIb基因的外显子片断。这就得到了每个序列的反向重复，且各自被内含子序列所分隔。所得到的质体被称为pRBEI.IR、pRBEIIa.IR和pRBEIIb.IR(图5)。采用BamHI和KpnI可切掉嵌合片断(chimeric fragments)，将所切掉的嵌合片断插入到pBx17casNOT的相同位置(图6)。这样，Bx17启动子区和nos3’末端区的以正确的方向(correct orientation)连接了反义/内含子/正义嵌合片断。接着使用HindIII和NotI消化切掉每个表达盒(expression cassette)，将被切掉的表达盒插入到二元载体WBvec8(Wang et al.，Acta Hort 461：401-407，1998)，该二元载体WBvec8包含作物可表达的潮霉素基因和奇霉素基因，其中，潮霉素用于选择作物细胞，记霉素用于选择细菌。这些结构称为dsSBEI、dsSBEIIa、dsSBEIIb。接着，通过电穿孔法(electroporation)将这些结构转移到根癌土壤杆菌族(Agrobacterium tumefaciens)(AGL1)细胞之中(Lazo etal.，(1991))。

采用小麦中对应的SBEIIa基因，另一种双RNA(dsRNA)构造导致降低水稻中SBEIIa基因也可能是SBEIIb基因的表达。对于上面的其他构造，在正义和反义方向对应于部分SBEIIa基因的所期望的核酸序列与启动子有关，这样被表达的RNA中包含能碱基配对形成双链RNA的互补区。当在转基因植物内转录部分RNA时，在正义和反义序列之间的隔离区域包含的基因内区序列就会被剪除而形成紧密的“发夹式的”双重结构。基因内区的内含物被发现由于双RNA结构的关系而能增加基因沉默(gene silencing)的效率(Smithet al，2000)。所期望的核酸与高分子量的麦谷蛋白(HMWG)启动子序列(Dx5亚基因启动子，编号Accession No.X12928，Anderson et al.，1989)和来自农杆菌(Agrobacterium，nos3′)胭脂氨酸合酶基因的终止序列相连接。这就造成了双链RNA胚乳的特定表现。

SBEIIa双链RNA结构包含来自小麦SBEIIa基因被PCR放大了的1536bp核苷酸序列(基因库序列AF338431)。其中包括：含有整个外显子1和2以及部分外显子3，在两旁具有EcoRI和KpnI限制位的468bp序列(片断1)；由部分外显子3和4以及SBEIIa的整个基因内区3组成的两旁具有KpnI和SacI位的512bp片断(片断2)；以及由SBEIIa的整个外显子1、2和3组成的在两旁具有BamHI和SacI位SBEIIa的528bp片断(片断3)。所使用的序列与水稻SBEIIa基因(SBE4)有超过217个核苷具有80％的同一性，在更短的区域上有更高的同源性(50个核苷为87％；27个核苷为92％)，因此可以预测到，这些基因在水稻中的表达将显著降低水稻SBEIIa的表达。小麦序列与水稻分子酶-3有超过113个核苷上有76％的同一性，因此，认为等同的SBEIIa也会影响该转录水平。

接着，将片断1、2和3捆绑在一起，其中片断3和片断2相对于片断1的反义方向捆绑。双链RNA结构最初产生于包含有HMWG启动子序列和nos3’终止子的载体pBx17casNOT(图6)。载体中pBx17casNOT的基因结构称为pBx17ds-wSBEIIa，而双链RNA结构称为ds-wSBEIIa。包含ds-wSBEIIa基因的cassette被插入到pWBvec8中，然后被引入到农杆菌(Agrobacterium)属AGLL1中，并用于如实施例1所述的水稻改造。

实施例3：生产具有降低了SBE活性的水稻

根据实施例1所述的方法，AGL1细胞中的结构dsSBEI、dsSBEIIa、dsSBEIIb和ds-sWBEIIa用于产生改性水稻作物(粳稻亚种，cv.Nipponbare)。每个结构、选择的改性愈伤组织以及再生的水稻植株会用到500个水稻愈伤组织。植株被转移到土壤中后，使用对SBEI、SBEIIa或SBEIIb基因片断特效的引物或探针，用PCR或DNA印迹交分析法显示该植株的改性。在具有ds-wSBEIIa的变性中，每23个再生的植株中有21个对引入的SBEIIa序列呈阳性。

在丙烯酰胺凝胶体中进行胚乳蛋白质的电泳后，用蛋白质印迹分析法采用与相应蛋白质的特定抗体化验改性植株的谷粒(T1种子)的SBE蛋白质。改性品种中，大部分品种SBE活性已降低。对谷粒的淀粉中直链淀粉含量进行测定，一些SBEIIa改性品种的相对直链淀粉水平是至少40％，一部分是至少50％。当SBEIIa和SBEIIb的活性都减少时，直链淀粉的百分比更高。

实施例4：淀粉和蛋白质分析

碳水化合物测定和分析

使用Takeda et al.，(1986)、Lumdubwong et al.，(2000)、Chiou et al(2002)或Sculman et al.，(1991)的方法从生长期的胚乳或成熟的谷粒中分离淀粉。用Megazyme(Bray，Co Wicklow，Republic of Ireland)提供的总淀粉分析工具测定淀粉含量。接着，将该淀粉含量与控制作物的淀粉含量作比较。谷粒总重减去淀粉总重，得到谷粒中非淀粉部分的总重，以确定所减少的总重是否是由于淀粉成分的减少。

淀粉中直链淀粉成分的确定是采用如下经稍微修订的Morrison andLaignelet(1983)比色(碘滴定)法。准确称取大约2毫克(精准至0.1毫克)淀粉加入带橡胶垫圈盖子的2毫升螺帽试管中；为去除油脂，在淀粉中加入1毫升85％(v/v)的甲醇并将试管放入65℃水浴中加热1小时，偶尔搅动水体；在13,000g下离心过滤5分钟之后小心除去表面浮物，再重复进行萃取步骤。将淀粉在65℃下干燥1小时再溶入尿素-二甲基亚砜溶液中(UDMSO；9份二甲基亚砜与1份6M的尿素)，每2毫克淀粉(上面称取的)加1毫升UDMSO；将混合物立即充分搅动并置于95℃水浴中加热1小时，间歇搅动水体直至淀粉完全溶解。取部分淀粉-UDMSO溶液(50微升)用20微升碘-碘化钾(I2-KI)试剂处理，碘-碘化钾试剂是由将2毫克碘与20毫克碘化钾溶解在1毫升水中制得的；将混合物加水至1毫升，取200微升，采用Emax精密酶标测定仪(美国分子仪器公司，Molecular Devices，USA)在650nm光波下测定混合物的吸光率。含有0～100％直链淀粉和100～0％支链淀粉的标准样品是将马铃薯直链淀粉和玉米(或马铃薯)支链淀粉(Sigma)进行处理而制成测试样品的。直链淀粉含量(直链淀粉百分率)是通过测定吸光率值再通过标准样品的回归方程式计算而得。不脱麸淀粉中直链淀粉/支链淀粉的比率同样可按照Case et al.，(1998)提供的方法或Batey and Curtin(1996)提供的分离脱麸淀粉的HPLC法测定。

淀粉的链长分布可在将淀粉样品脱麸之后，通过Morell et al(1998)的荧光辅助碳水化合物电泳方法(FACE)的毛细电泳仪来测定。淀粉的凝胶温度曲线图可通过Pyris 1微分扫描热量计来测定(Perkin Elmer，Norwalk CT，USA)。淀粉溶液的粘度可通过快速粘度测定仪来测量(RVA，NewportScientific Pty Ltd，Waniewood，Sydney)，例如采用Batey et al.，1997所报道的条件，测量的参数包括峰值粘度(最高热粘度)、上止强力、终值粘度以及糊化温度。面粉或淀粉的溶胀比可通过Konik-Rose et al(2001)方法来确定。吸水力的确定是通过称量样品面粉或淀粉在一定温度下混入水之前后的重量变化以及所聚集的胶状物来完成的。

β-葡萄糖水平可采用Megazyme(Bray，Co Wicklow，Republic of Ireland)所提供的组件来确定。

胚乳中蛋白质表现的分析

胚乳中特定蛋白质表现的分析是采用蛋白质印迹程序(Western blotprocedures)。从母体组织中切下胚乳并将0.2毫克的样品在600微升的50mM的Kpi缓冲液中均匀成粒(42mM的K₂HPO4和8mM的KH2PO4)，该缓冲溶液的pH值为7.5，含有5mM的EDTA，20％的丙三醇、5mM的DTT以及1mM的蛋白酵素抑制剂。研磨样品在13,000g下离心分离10分钟并将表面漂浮物在使用前于-80℃下冷冻。对于总蛋白质的估算，用0，20，40，60，80及100微升的0.25毫克每毫升的牛血清清蛋白(BSA)标准建立牛血清清蛋白标准曲线，取3微升样品用蒸馏水稀释至100微升并向每一样品中加入1毫升蛋白质试剂(Coomassie Plus Protein reagent)，5分钟后在595nm处录得吸光率。在标准曲线上把含0微升BSA的样品，即不含BSA的样品的吸光率设为空白值，这样就测量出了样品的蛋白质水平。在含有20微克取自胚乳的蛋白总量的样品中加入8％的含有0.34M的三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl，pH 8.8)的非改性聚丙烯酰胺胶体、丙稀酰胺(8.0％)、过二硫酸铵(ammonium persulphate)(0.06％)以及TEMED(0.1％)。在电泳作用下，蛋白质以Morell et al.，(1997)所述的方式被转移到硝化纤维膜上并与SBEIIa或SBEIIb种类抗体发生免疫反应。

实施例5：通过鉴定水稻基因组的独特序列来优化目标基因的基因沉默

将基因序列用于减少目标基因的表达(基因沉默)，如通过双链RNA、反义或共抑制结构等方法，是优选的对目标基因有特效的方法。就是说，沉默分子的核苷序列中，至少有19个连续的核苷与目标基因的至少19个连续的核苷具有至少95左右的同一性。理想地，最大的特异性是所述沉默分子(targeted sequence)对目标序列是唯一的，不是植株基因组的遗传基因。这样就能最小化“基因偏移效应”(off-gene effects)。我们使用了几乎所有的水稻基因组序列的知识来比较SBE目标基因序列与水稻基因组剩下的基因序列，以在这些目标基因序列中鉴定出最优的目标序列。

可从TIGR网站( http://www.tigr.org/tdb/e2k1/osa1/)以FASTA格式下载水稻基因组DNA序列数据库(OSA1.seq)。用“formatdb”格式化数据库，使之对BLAST可用；使用“dbifasta”使之可用EMBOSS函数。以FASTSA格式创建查询序列，通过运行基于基因沉默程序的BLAST(P.Waterhouse et al，CSIROPlant Industry，personal communication)以及一组预设的参数(比较的选项：词18和严格度19)来使用该查询序列搜索水稻基因组的同源序列。

如实施例2所述，用于基因沉默结构的SBEIIa、SBEIIb和SBEI序列用作反水稻基因组的查询序列。其输出如图8所示。输出多个“NNNN...”表示该区域内与水稻基因组至少19个连续核苷同源。可以看到，所使用的SBEIIa序列是唯一的；所使用的SBEIIb序列包括一些非唯一序列；而所使用的SBEI序列看起来像是在水稻基因组中复制的，处理末端57个核苷之外，该57个核苷被去掉了(图8)。对当前的水稻基因序列检查发现在包括SBEI基因区的两个重叠BAC克隆体之间，有重叠的遗传DNA序列。，这些貌似的SBEI序列的复制可能是真实的或表征在这一区域的水稻基因组的聚集中发生的错误。

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                                     序列表

<110>联邦科技产业研究组织

<120>淀粉中具有增加了直链淀粉含量的水稻及水稻制品

<160>3

<210>1

<211>2739

<212>DNA

<213>水稻亚种Oryza sativa

<223>sbeI cDNA

<400>1

Gccaccgaca tccgccgcaa tgctgtgtct cacctcctct tcctcctccg cgcccgctcc      60

gctccttccc tctctcgctg atcgaccgag cccgggaatc gcgggcgggg gtggcaatgt     120

tcgcctgagc gtggtttctt cgccgcgccg gtcgtggcct ggaaaggtca agaccaattt     180

ctcagttcct gcgactgcgc gaaaaaacaa aaccatggtg actgttgtgg aggaggtcga     240

ccaccttcct atatatgatc tggaccctaa gttggaggaa ttcaaggatc acttcaacta     300

taggataaaa agatacctcg accagaaatg cctgattgaa aaacatgagg ggggccttga     360

agaattttct aaaggctatt tgaagtttgg gattaataca gttgatggtg ccacaatata     420

tcgtgaatgg gcgcctgctg cacaagaagc acagctcatt ggtgagttca ataactggaa     480

tggtgcaaaa cacaagatgg agaaggataa atttggcatt tggtcaatca agatttcaca     540

tgtcaatggg aagcctgcca tccctcacaa ttccaaggtt aaatttcgct ttaggcatgg     600

gggtggagca tgggttgatc gtattcccgc atggattcgt tatgcaactt ttgatgcctc     660

taaatttgga gctccatatg atggtgtaca ctgggatcct ccagcctgtg aaaggtacgt     720

gtttaagcat cctcgacctc caaaacctga tgctccacgc atctatgagg ctcatgtggg     780

gatgagtggt gaagagccag aagtaagcac atacagagaa tttgcagaca atgtgttacc     840

acgcatacgg gcaaataact acaacacagt tcagttaatg gcaatcatgg aacattccta     900

ctatgcttct tttgggtatc acgtgacaaa ttttttcgca gtcagcagca gatcaggaac     960

accagaggat ctgaaatatc ttgttgacaa ggcacatagt ttaggattac gagttctgat    1020

ggatgttgtc catagccatg cgagtaataa tgtgaccgat ggtctaaatg gctatgacgt    1080

tggacaaaac actcatgagt cttattttca tacaggagat aggggctacc ataaactctg    1140

ggatagtcgt ctgttcaact atgccaattg ggaggtctta agatttcttc tttctaattt    1200

gagatattgg atggacgaat tcatgtttga tggcttccga tttgatgggg ttacatcaat    1260

gctataccat caccatggta tcaataaggg atttactgga aactacaagg agtatttcag    1320

tttggatacc gatgtggatg caattgttta catgatgctc gcaaaccatt taatgcataa    1380

actcttgccg gaagcaacta ttgttgctga agatgtttcg ggcatgccag tgctttgtcg    1440

gccagttgat gaaggtggag tagggtttga cttccgcctg gcaatggcca ttcctgatag    1500

atggattgac tacctgaaga acaaagagga ccgcaaatgg tcaatgagtg aaatagtgca    1560

aactttgact aacaggagat atacagaaaa atgcattgcc tatgccgaga gccatgatca    1620

gtccattgtt ggtgacaaga ctatagcatt tctcttgatg gacaaggaaa tgtacactgg    1680

catgtcagac ttgcagcctg cttcacctac catcaaccgt ggcattgcac tccaaaagat    1740

gattcacttc attacgatgg cccttggagg tgatggctac ttaaatttta tgggcaatga    1800

gtttggccat ccagaatgga ttgactttcc aagagaaggc aacaactgga gctatgataa    1860

atgcagacgt cagtggagcc ttgtcgacac tgatcacctt cgatacaagt atatgaatgc    1920

atttgatcaa gcaatgaatg cactcgagga ggaattttcc ttcctgtcat catcaaagca    1980

gattgttagc gacatgaacg agaaagataa ggttattgtc tttgaacgtg gagatttggt    2040

ttttgttttc aattttcatc ccaacaaaac ttacaagggt tacaaagtcg gatgtgactt    2100

gcccgggaag tacagagtag ctctggactc tgatgctttg gtctttggtg gccatggaag    2160

agttggccat gatgtggatc acttcacgtc tcccgaggga atgccaggag taccagaaac    2220

aaatttcaac aaccgcccta actcattcaa agtcctttcc ccgccccgta cctgtgtggc    2280

ttactatcgc gttgatgaag atcgtgaaga gctcaggagg ggtggagcag ttgcttctgg    2340

aaagattgtt acagagtata tcgatgttga agcaacaagt ggggagacta tctctggtgg    2400

ctggaagggc tccgagaagg acgattgtgg caagaaaggg atgaagtttg tgtttcggtc    2460

ttctgacgaa gactgcaaat gaagcatcag atttcttgat caggagcaac tgttggtgcc    2520

cttgtaatct ggagatcctg gcttgccttg gacttggttg tggttcttta gcagttgcta    2580

tgtacctatc tatgatatga actttatgta tagttcgcct taaagaaaga ataagcagtg    2640

atgatgtggc cttaaacctg agctgcacaa gcctaatgta aaaataaagt ttcaggcttt    2700

catccagaat aaaacagctg ttcatttacc atctcaaaa                           2739

<210>2

<211>3015

<212>DNA

<213>水稻亚种Oryza sativa

<223>sbeIIa cDNA

<400>2

cttgactccc cccactcctc cctcgtgctg ctcctcctcg tcgctcggct cgaggcgcgg      60

catttgcggc gggagggatc tgcgcgcgag tgcgtgcggg caggcggcgg gggagcacgc     120

accgggggat ggcgtcgttc gcggtgtccg gcgcgaggct cggggtcgtg cgggcggggg     180

gcggcggcgg cggcgggggt ggcccggcgg cgcgatccgg cggggtggac ttgccgtcgg     240

tgctcttcag gaggaaggac tccttctcac gtggcgttgt gagctgcgcg ggtgctcctg     300

ggaaggtgct ggtgcctggc ggtgggagcg acgacttgct gtcctctgcg gaaccagacg     360

tggaaactca agagcaacct gaagaatctc agatacctga tgataataaa gtaaaacctt     420

ttgaggagga ggaagagatt ccagcagtgg cagaagcaag cataaaggtt gtggctgaag     480

acaaacttga atcttcagaa gtgattcaag acattgagga aaatgtgact gagggtgtga     540

tcaaagatgc tgatgaacca actgtggagg ataaaccacg agttatccca ccaccaggag     600

atgggcagaa gatataccaa attgacccaa tgctggaagg atttcggaac catcttgact     660

accgatacag tgaatacaag agaatgcgtg cagctattga ccaacatgaa ggtggcttgg     720

atgcattttc tcgtggttac gaaaagcttg gattcacccg cagcgctgaa ggcattacct     780

accgagaatg ggcacctgga gcacagtctg cagcattagt aggtgacttc aacaattgga     840

acccaaatgc agatactatg accagaaatg agtatggtgt ttgggagatt tccctgccta     900

acaatgctga tggatcccct gctattcctc atggctcacg tgtaaagatt cggatggata     960

caccatctgg cgtaaaggat tcaattcctg cctggattaa gtttgctgtg caggctccag    1020

gtgaaatacc gtacaacggt atatattatg atccacctga agaagaaaaa tatgtattcc    1080

aacatcctca acctaaacga ccaaattcgc tgcggatata tgaatcacat attggaatga    1140

gtagcccgga accgaagata aacacatatg ctaattttag ggatgaggtg ctaccaagaa    1200

ttaaaaagct tgggtacaat gctgtacaga taatggcaat ccaggagcac tcttattacg    1260

caagctttgg gtatcatgtt actaacttct ttgcgccaag tagccgtttc ggaaccccag    1320

aagacttgaa atctctgatt gataaagctc acgagcttgg tttgcttgta cttatggata    1380

ttgttcacag tcatgcatca aacaataccc tggatggttt gaatggtttt gatggtactg    1440

atacacatta cttccatggt ggaccacggg gtcatcactg gatgtgggat tctcgcctgt    1500

tcaactatgg gagttgggaa gttttaagat atttactgtc gaatgcaagg tggtggcttg    1560

aagaatacaa gtttgatggg tttcgatttg atggggtgac ctccatgatg tatactcatc    1620

atggtttaca ggtggcattt actggcaact atggcgaata ttttggattt gctactgatg    1680

ttgatgcagt agtttacttg atgctggtga acgatctaat tcatgggctt tatcctgagg    1740

ctgtagccat tggtgaagat gtcagcggga tgcccacatt ttgtattcct gttcaagatg    1800

gtggtgttgg ttttgactat cgtttgcata tggctgtacc ggacaaatgg atcgaactcc    1860

tcaagcaaag tgacgaatat tggaaaatgg gtgatatcgt gcacacccta acgaatagaa    1920

ggtggtcaga gaagtgtgtt acttatgcag aaagtcatga ccaagcacta gttggtgaca    1980

agactattgc attctggttg atggataagg atatgtatga ttttatggct ctagacagac    2040

cttcaacacc tcgcattgat cgtgggatag cattacataa aatgattagg cttgtcacca    2100

tgggcttagg aggcgaaggc tatcttaatt tcatgggaaa tgagtttggg catcctgaat    2160

ggatagattt cccaagaggc ccgcaaagtc ttccaaatgg ctcggtcctc ccaggaaaca    2220

actacagttt tgataaatgc cgtcgtagat ttgaccttgg agatgcagat tatcttagat    2280

atcatggtat gcaagagttt gatcaggcca tgcagcatct tgaggaaaaa tatggattca    2340

tgacatctga gcaccagtat atatcgcgca aacacgagga ggataaggtg atcatcttcg    2400

agagaggaga tttggtattc gtgttcaact tccactggag taatagctat tttgactatc    2460

gcgtcggttg tttaaagcct ggaaagtaca agattgtgtt ggactcagac gatggcctct    2520

ttggtggatt cagtcggctt gatcatgatg ctgagtactt cactgctgac tggccgcatg    2580

acaacagacc atgttcattc tcggtgtaca ccccaagcag aaccgccgtc gtgtatgcac    2640

ttacagagga ctaatgatca gctctgatca ttgggggaac aactcaaggg agttggtggt    2700

aatgacgccg gaatacaact caagtgaaag gtgaaaagaa aggctgccct gacgatgtga    2760

tttgaggggc ttgtgtttca tcgccaatgc caggaagatg aggtagaaaa gcctactgat    2820

gagctcctgt tttcgagtga ctcgtgaagg aaatagacca gggtgaacgg cttttttcag    2880

agctatacca aacccatcct atgttgcgca ttcgctgtag ttttgtacat aacgatatcg    2940

gttggcattt gtatgtttat gaataatctg ttcgacagaa atgtttttct ccttgtattt    3000

agtgctcaaa aaaaa                                                     3015

<210>3

<211>2918

<212>DNA

<213>水稻亚种Oryza sativa

<223>sbeIIb cDNA

<400>3

cggcgcacac ccacacaccg accaccaggc agcgcctcct cgctttggct ctcgcgtgag      60

gagggtttag gtggaagcag agcgcggggg ttgccggggg atccgatccg gctgcggtgc     120

gggcgagatg gcggcgccgg cgtctgcggt tcccgggagc gcggcggggc tacgggcggg     180

ggccgtgcgg ttccccgtgc cagccggggc ccggagctgg cgtgcggcgg cggagctccc     240

gacgtcgcgg tcgctgctct ccggccggag attccccggt gccgttcgcg tggggggttc     300

cggggggcgc gtggccgtgc gcgcggcggg cgcgtcaggg gaggtgatga tccccgaggg     360

cgagagcgac gggatgccgg tttcagcagg ttcagacgat ctgcagttgc cagccttaga     420

tgatgaatta agcacggagg ttggagctga agttgagatt gagtcatctg gagcaagtga     480

cgttgaaggc gtgaagagag tggttgaaga attagctgct gagcagaaac cacgagttgt     540

cccaccaaca ggagatgggc aaaaaatatt ccagatggac tctatgctta atggctataa     600

gtaccatctt gaatatcgat atagcctata taggagactg cgttcagaca ttgatcagta     660

tgaaggagga ctggaaacat tttctcgcgg ttatgagaag tttggattta atcacagtgc     720

tgaaggtgtc acttatcgag aatgggctcc cggggcacat tctgcagcat tagtaggtga     780

cttcaacaat tggaatccaa atgcagaccg catgagcaaa aatgagtttg gtgtttggga     840

gatttttctg cctaacaatg ctgatggctc atctcctatt ccacatggct cacgtgtaaa     900

ggtgcgaatg gaaactccat ctggtataaa ggattctatt cctgcctgga tcaagtactc     960

tgtgcaggcc gcaggagaaa tcccatacaa tggaatatat tatgatcctc ctgaagagga    1020

gaagtacata ttcaagcatc ctcaacctaa aagaccaaag tcattgcgga tatacgaaac    1080

tcatgttgga atgagtagca cggagccaaa gatcaacacg tatgcaaact ttagggatga    1140

ggtgcttcca agaatcaaaa agcttggata caatgcagtg caaataatgg caattcaaga    1200

gcatgcatat tatggaagct ttgggtacca tgtcaccaat ttctttgcac caagtagtcg    1260

tttcgggacc ccagaagatt taaagtcatt gattgataaa gctcatgagc ttggtttagt    1320

tgtgctcatg gatgttgttc acagccatgc gtcaaataat accctagatg ggttgaacgg    1380

ttttgatggt acagatacgc attactttca tagtggttca cgcggccatc attggatgtg    1440

ggattctcgc cttttcaact atgggaattg ggaagttcta agatttctac tatccaatgc    1500

aagatggtgg ctcgaggagt ataagtttga tggtttcaga tttgacggtg taacctcaat    1560

gatgtacact catcatggat tacaagtagc atttacgggg aactacagtg aatactttgg    1620

atttgccact gatgctgatg cagtagttta cttgatgctg gtaaatgatt taattcatgg    1680

actttatcct gaggccataa ccatcggtga agatgtcagt ggaatgccta catttgccct    1740

tcctgttcaa gatggtgggg ttggttttga ttatcgcctt catatggctg ttcctgacaa    1800

atggattgaa ctcctcaagc aaagtgatga atcttggaag atgggtgata ttgtgcacac    1860

actgactaac agaaggtggt cagagaagtg tgttacttat gctgaaagtc atgatcaagc    1920

actagttggt gacaaaacta ttgcattctg gttgatggac aaggatatgt atgattttat    1980

ggctctggac agaccggcaa cacctagcat tgatcgtgga atagcattgc ataaaatgat    2040

tagacttatc acaatggggt taggaggaga aggctatctt aactttatgg gaaatgagtt    2100

cggacatcct gaatggattg attttccaag agctccacaa gtacttccaa atggtaaatt    2160

catcccaggg aataacaaca gttatgataa atgccgtcga agatttgacc tgggtgatgc    2220

ggactatctt aggtatcgtg gcatgctaga gtttgaccgc gcgatgcagt ctctcgagga    2280

aaaatatggg ttcatgacat cagaccacca gtacatatct cgaaagcatg aagaggataa    2340

gatgattata tttgagaagg gagatctggt atttgtgttc aacttccatt ggagtaacag    2400

ctattttgac taccgtgttg gttgtttaaa gccagggaaa tataaggtgg tcttggactc    2460

agatgctgga ctctttggtg gatttggcag gatccatcac actgcagagc acttcactgc    2520

cgattgttca catgacaaca ggccctactc gttctcagtt tattctccta gcagaacctg    2580

cgttgtctat gctccagcgg aatgagaaca ccaagaggca gcatgcaagt gtgtgcggct    2640

gctagtgcga aggagcaaga aaaactagtt gccagcaatc tgtgaacggc tttcctaggt    2700

tctgcttcga tgaatgccgg atagactaga cagcttgctt ttgtgctttg cgctcccaat    2760

ttgtagtttt agtttgtgag ggaaagaaac gtttatttgt aattatctat ggctgtcgaa    2820

cggcgacgaa accatgaacc ccgtatattt gttggtaccg ttcgaactgc cagttataca    2880

tagttctgca cttctgtaca tcttgtgatg cttgaatc                            2918

Claims (47)

1、一种从水稻作物中获得的谷粒，其中包含淀粉，其特征在于，所述谷粒的淀粉中直链淀粉的比例是至少40％。

2、根据权利要求1所述的谷粒，其特征在于，所述谷粒包括两种或多种遗传变种，其中一种遗传变种是选自：

a)具有抑制SBEIIa表达和/或活性的SBEIIa基因突变，和

b)被引入了具有抑制SBEIIa表达和/或活性的的核酸；

第二种遗传变种是选自：

c)具有抑制SBEIIb表达和/或活性的SBEIIb基因突变，和

d)被引入了具有抑制SBEIIb表达和/或活性的核酸。

3、根据权利要求1或2所述的谷粒，其特征在于，所述谷粒包含降低了水平的SBEIIa和SBEIIb蛋白质和/或活性。

4、根据权利要求1至3任意一项所述的谷粒，其特征在于，所述谷粒的淀粉中直链淀粉的比例是至少50％。

5、根据权利要求1至4任意一项所述的谷粒，其特征在于，所述谷粒中包含转基因。

6、根据权利要求5所述的谷粒，其特征在于，所述转基因对反义、共抑制、核酶或双RNA分子进行编码。

7、根据权利要求1至4任意一项所述的谷粒，其特征在于，所述谷粒是非转基因的。

8、根据权利要求2至7任意一项所述的谷粒，其特征在于，还包括降低了水平的SBEI蛋白质和/或活性。

9、根据权利要求1至8任意一项所述的谷粒，其特征在于，所述谷粒包含改变了水平和/或酶活性的ADP-葡萄糖焦磷酸化酶、SSI、SSII、SSIII、异淀粉脱麸酶和普鲁兰脱麸酶。

10、根据权利要求9所述的谷粒，其特征在于，所述谷粒包含改变了水平的GBSS蛋白质和/或酶活性。

11、根据权利要求1至10任意一项所述的谷粒，其特征在于，所述谷粒是不缩水的。

12、根据权利要求1至11任意一项所述的谷粒，其特征在于，所述谷粒是平均粒重是至少25mg的糙米。

13、根据权利要求1至12任意一项所述的谷粒，其特征在于，在偏振光下观察时，所述谷粒的淀粉颗粒中至少50％不显出双折射。

14、根据权利要求1至13任意一项所述的谷粒，其特征在于，所述谷粒的淀粉含量至少是等同的、未经改造的谷粒中淀粉含量的90％。

15、根据权利要求2至14任意一项所述的谷粒，其特征在于，所述谷粒包含SBEIIa和SBEIIb的无效突变。

16、根据权利要求1至15任意一项所述的谷粒，其特征在于，所述谷粒是籼稻或者其中包含Wx^α等位基因。

17、一种能产出权利要求1至16任意一项所述谷粒的水稻作物。

18、一种从权利要求1至16任意一项所述谷粒中提取的淀粉颗粒。

19、一种从权利要求1至16任意一项所述谷粒中提取的淀粉。

20、一种含有从权利要求1至16任意一项所述谷粒中产出的面粉或淀粉制品的产品。

21、根据权利要求20所述的产品，其特征在于，所述面粉或淀粉与来自其他来源的面粉或淀粉相混合。

22、根据权利要求20所述的产品，其特征在于，所述产品其是非食品产品。

23、一种含有权利要求19所述的淀粉以及其他食品成分或水的组合物。

24、一种生产能够产出谷粒的水稻作物的方法，所述谷粒淀粉中包含至少40％的直链淀粉，其特征在于，该方法包括以下步骤：

a)将基因变种引入到母体水稻作物或者种子里；和

b)识别母体水稻作物的后代水稻作物或种子，所述后代作物或种子的淀粉中直链淀粉含量至少是40％。

25、根据权利要求24所述的方法，其特征在于，所述后代水稻作物包括2种或多种遗传变种，其中一种遗传变种是选自：

e)具有抑制SBEIIa表达和/或活性的SBEIIa基因突变，和

f)被引入了具有抑制SBEIIa表达和/或活性的核酸；

第二种基因变种是选自：

g)具有抑制SBEIIb表达和/或活性的SBEIIb基因突变，和

h)被引入了具有抑制SBEIIb表达和/或活性的核酸。

26、根据权利要求24或25所述的方法，其特征在于，所述遗传变种导致水稻作物的胚乳中SBEIIa和SBEIIb蛋白质和/或活性的降低。

27、根据权利要求24或27所述的方法，其特征在于，所述引入遗传变种的步骤包括引入外来核酸。

28、根据权利要求27所述的方法，其特征在于，水稻细胞被引入所述外来核酸后再生成水稻植株。

29、根据权利要求28所述的方法，其特征在于，所述外来核酸对SBEIIa和/或SBEIIb的表达和/或活性的抑制子进行编码。

30、根据权利要求29所述的方法，其特征在于，所述抑制子可以是反义、共抑制、核酶或双RNA分子。

31、根据权利要求24至25中任意一项所述的方法，其特征在于，所述引入遗传变种的步骤包括采用化学试剂或辐射来形成水稻作物母体或种子的变异。

32、根据权利要求25至31中任意一项所述的方法，其特征在于，所述后代水稻植株中包含SBEIIa和/或SBEIIb的无效变异。

33、根据权利要求25至32中任意一项所述的方法，其特征在于，所述引入遗传变种的步骤还导致SBEI蛋白质和/或活性水平的降低。

34、根据权利要求24或25所述的方法，其特征在于，所述后代植株根据谷粒淀粉中直链淀粉水平来识别，或者根据后代植株的胚乳中SBEIIa和/或SBEIIb蛋白质和/或活性的水平的降低来识别。

35、根据权利要求24至34中任意一项所述的方法，其特征在于，所述方法还包括将Wx^α等位基因引入到水稻植株中。

36、根据权利要求35所述的方法，其特征在于，所述Wx^α等位基因通过杂交而引入的。

37、一种产出其胚乳中具有降低了水平的SBEIIa蛋白质和SBEII蛋白质和/或酶活性的水稻植株的方法，其特征在于，包含以下步骤：

a)诱变具有降低水平的SBEIIa蛋白质和/或酶活性的种子；或

b)诱变具有降低水平的SBEIIb蛋白质和/或酶活性的种子；或

c)使用具有降低水平的SBEIIb蛋白质和/或酶活性的种子与具有降低水平的SBEIIa蛋白和/或酶活性的种子进行杂交；和

d)识别出胚乳中含有降低的SBEIIa和SBEIIb蛋白质活性和/或酶活性的水稻植株。

38、根据权利要求37所述的方法，其特征在于，所述识别水稻植株的步骤包括：筛选出具有分子标记的种子，所述的分子标记分别链接到SBEIIa或SBEIIb基因；根据是否有来自筛选具有分子标记链接的信号来识别所述植株。

39、根据权利要求37所述的方法，其特征在于，所述鉴定水稻植株的步骤包括：从具有抗体的水稻植株中筛选种子，所述抗体结合水稻的SBEIIa或SBEIIb蛋白质；然后根据是否存在抗体结合来识别所述植株。

40、一种产出改性后的水稻淀粉的方法，其特征在于，包括从权利要求1至16任意一项所述的谷粒中提取淀粉的步骤。

41、一种产生水稻植株的方法，所述水稻植株具有降低水平的SBEIIa和SBEIIb蛋白质和/或活性，该方法使用两种或多种外来核酸分子，其中，至少一种所述的外来核酸分子编码水稻SBEIIa表达的抑制子和/或活性，且至少另外一种所述的外来核算分子编码水稻SBEIIb表达的抑制子和/或活性。

42、根据权利要求41所述的方法，其特征在于，所述抑制子是选自反义分子、共抑制分子、核酶、双RNA分子及其组合。

43、一种被分离的核酸分子，其对水稻SBEIIa的抑制子和水稻SBEIIb的抑制子进行编码，该两种抑制子可以相同，也可以不同。

44、一种包括权利要求43所述的被分离的核酸分子的载体。

45、一种包括权利要求43所述的被分离的核酸分子的细胞。

46、根据权利要求45所述的细胞是水稻细胞。

47、一种包括权利要求43所述的被分离的核酸分子的转基因水稻作物。

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