CN1748791A - 人和牲畜预防用出血性大肠杆菌o157：h7疫苗及制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于医药生物技术领域，特别涉及一种预防用出血性大肠杆菌O157:H7疫苗及制备方法。它采用将III型分泌蛋白EspA片段连接到pET－28a(+)载体上，构建pET28a(+)－EspA表达载体，并转化到BL21(DE3)工程菌中，IPTG诱导可高效表达EspA蛋白，获得表达目的蛋白的工程菌BL21－pET28a(+)－EspA。本发明制备工艺简单，重复性好，获得目的蛋白纯度高，动物实验表明，本疫苗能有效诱发机体的免疫应答，具有高效、安全、便于分离纯化等优点。

Description

人和牲畜预防用出血性大肠杆菌O157：H7疫苗及制备方法

技术领域

本发明涉及医药生物技术领域，特别涉及一种利用基因克隆技术将O157：H7粘附基因片段连接到表达载体上，用转化进工程菌表达目的蛋白的预防用出血性大肠杆菌O157：H7疫苗及制备方法以及建立用于评价所述O157疫苗免疫保护性和有效性感染的Balb/c小鼠的动物模型。

背景技术

肠出血性大肠杆菌(Enterohemorrhagic Escherichia coli，EHEC)O157：H7(血清型)曾多次在世界各地特别是发达国家引起广泛的暴发流行。感染主要导致腹泻、出血性结肠炎(hemorrhagic colitis，HC)，并经常伴发溶血性尿毒综合征(Hemolytic ruemic syndrome，HUS)、血栓形成的血小板减少性紫癜(thrombotic thrombocytopenic purpura，TTP)并发症，严重威胁着人类的生命健康。人类感染此菌的途径主要是食用或接触污染的牛肉、蔬菜、水果及水源等。

目前，对O157：H7感染尚缺乏有效的防治方法，只能给予对症治疗和适当的抗菌治疗，但研究证明抗菌药物可促使O157：H7释放Vero毒素，从而使患者并发溶血性尿毒综合征(HUS)的危险性增加。因此研发O157：H7的有效疫苗对预防该病原菌感染具有重要意义。

粘附是细菌感染的基础。EHEC O157具有粘附素intimin，但数量有限，且通过III型分泌蛋白EspA(Esp为E.coli secreted protein缩写)所致的粘附、穿孔、及效应蛋白的转位早于intimin与Tir的结合，用EspA制备的亚单位疫苗能提前预防该菌的感染定植。

由于O157天然产生的几大毒力因子数量非常有限，分离提纯这些保护性抗原也很困难，且大量培养O157菌存在极大的危险性，所以采用病原菌直接分离纯化保护性抗原可行性差。而传统的减毒活疫苗也存在回复突变的危险性。

EspA在细菌的粘附定植中起到关键作用。EspA以多聚体形式存在，形成纤维样管状结构，连接到宿主细胞表面，EspB，EspD经过此通道分泌到宿主细胞，并在细胞膜表面形成小孔，转位的粘附素受体Tir(translocated intiminreceptor)蛋白经过EspA通道及小孔插入宿主细胞。Intimin蛋白与tir蛋白结合，造成A/E损伤。EspA是表面表达和多聚体形式存在，具有良好的免疫原性，抗EspA抗体常比其它表面蛋白的抗体存在的数量为多；EspA的天然暴露可诱导良好的免疫反应且持续时间长使其成为具有良好的免疫原性的抗EHEC和EPEC多种血清型疫苗。

III型分泌蛋白广泛存在于致病性革兰氏阴性(G-)杆菌中，在非致病菌肠杆菌中未见表达。对O157：H7的分子进化研究发现致病性大肠杆菌EPEC和EHEC的LEE(locus of enterocyte effacement)高度同源。Bianca C.Neves等[NevesBC，Knutton S，Trabulsi LR，Sperandio V，Kaper JB，Dougan G，Molecular andultrastructural characterisation of EspA from different enteropathogenic Escherichiacoli serotypes.FEMS Microbiol Lett 1998，169：73-80]研究了EPEC十种不同血清型的EspA分子特征和超微结构，在全部血清型中，EspA多肽序列至少有65％的一致性。其中O127：H6和O55：H6两种血清型比较分析发现，两者的EspA多肽序列完全一致；而O111：H2和O128：H2也至少有95％的一致性。MaritaNoguera-Obenza等[Marita Noguera-Obenza，Theresa J.Ochoa，Henry F.Gomez.Human Milk Secretory Antibodies against Attaching and Effacing Escherichia coliAntigens Emerg Infect Dis 2003，9(5)]调查了北美的墨西哥市和弗吉尼亚州诺福克市123名妇女乳液，发现有90％以上存在EspA抗体。因为EspA比其它毒力分子更加保守，来源不同的多型病原体的EspA变异体具有结构相似性，抗EspA抗体有高发生率及广泛的交叉反应，因此EspA抗体能提供了对多种血清型广泛交叉的保护作用。通过序列分析显示O127：H6和O157：H7的EspA具有85％相同EspA抗体能够阻止EPEC和EHEC许多血清型的粘附，不象抗LPS或intimin抗体仅对有限的肠道病原体有保护作用。以此设计的疫苗相对于O157LPS能够提供广泛的交叉保护作用。

目前，检测O157：H7疫苗的免疫性能，常用对该菌易感的动物多为猪、牛、羊等大动物作为感染模型。用这种方法建立的感染动物模型不仅耗费巨大，而且也给动物实验的实施带来极大不便。

发明内容

本发明的目的，是提供一种预防用出血性大肠杆菌O157：H7疫苗和制备方法。本发明采用基因工程的手段克隆表达EspA抗原，利用基因克隆技术将O157：H7粘附基因片段连接到表达载体上，用转化进工程菌表达目的蛋白的预防用出血性大肠杆菌O157：H7疫苗及制备方法，具有高效、安全、便于分离纯化等优点。

本发明的另一个目的是提供一种本疫苗免疫性能的检测方法。采用建立Balb/c小鼠的感染动物模型，用以检测疫苗的免疫性能。

本发明所述的疫苗采用将致病细菌通过克隆表达其毒力基因制备多价亚单位的或融合多价亚单位抗原。本发明将III型分泌蛋白、粘附素、溶血素、志贺样毒素(Stx)按照一定的比例通过克隆毒力基因组合或通过基因工程连接构建融合多价亚单位抗原，以获得不同种类、不同组分比例以及不同融合方式的多价亚单位抗原。其中优选将这些多价亚单位通过克隆毒力基因进行组合。抗原组分，优选III型分泌蛋白EspA、粘附素，采用基因工程的手段克隆表达EspA抗原。

本发明抗EspA抗体比其它表面蛋白的抗体存在的数量多，是具有良好的免疫原性的抗EHEC和EPEC多种血清型疫苗。

本发明将III型分泌蛋白EspA片段连接到pET-28a(+)载体上，构建pET28a(+)-EspA表达载体，其构建见实施例1。EspA片段连接到pET-28a(+)载体的连接方式为：设计EHEC O157：H7 EDL933标准株的EspA基因序列的引物，上游引物设计在序列前端加入CC碱基，与起始密码子ATG及后面的G构成NcoI酶切位点；下游引物去掉终止密码子，填加XhoI酶切位点CTCGAG；终止密码子使用pET28a(+)的6个His氨基酸标签后面的密码子。

用于检测本发明疫苗的免疫性能的方法，采用通过给小鼠口服链霉素，然后灌菌，筛选出耐药株，并通过传代筛选出定植适应株，建立可稳定带菌的Balb/c小鼠的感染动物模型，建立方法见实施例2。被感染的小鼠模型带菌稳定，能准确检测疫苗的免疫性能，并且成本低。

本发明采用EspA为主要抗原，通过诱导可高效表达EspA蛋白，表达目的蛋白的工程菌，有高效、安全、便于分离纯化等优点。

附图说明：

图1.PCR扩增产物核酸电泳图

左起带1为核酸(DNA)分子量标准(marker)，带2-5为PCR扩增片段，片段实际大小为584bp，电泳条带位于500～750之间，扩增片段大小与目的片段一致。

图2.含有EspA基因片段的pET-28a(+)质粒图谱

构建的质粒C末端含有6个His标签，黑色序列为插入的espa基因片段，红色为操纵子，黄色为卡那霉素抗性基因。

图3.EspA测序峰图

重组的BL21工程菌送上海博亚公司测序，结果只有第111位碱基与EDL933标准株不一致(A→G)，但未改变编码的氨基酸。

图4.IPTG诱导含有构建载体的工程菌表达EspA蛋白

泳道1为未克隆目的片段的BL21(DE3)全菌对照，经IPTG诱导2h，与诱导重组菌相比，EspA蛋白大小处未出现明显泳带；

泳道2为蛋白质分子量标准，从高到低分子量为66.2、43.0、31.0、20.1、14.4、6.2kDa；

泳道3为未诱导前的全菌对照，在EspA蛋白大小处未出现明显泳带；

泳道4-7为诱导后1h、2h、4h、6h全菌经变性后电泳，诱导4h和6h浓度最高，4h与6h差别不明显。

基因重组后经过诱导在分子量21kDa处有增加的蛋白表达条带，与目的蛋白分子量一致。

图5.表达形式的鉴定电泳图

1-3泳道为高速离心上清，4为全菌，5-8为高速离心沉淀(不同上样量)，EspA蛋白主要存在于沉淀中，说明以不溶的包涵体形式表达。

图6.EspA蛋白N端测序结果

峰图信号较强，结果为MDTSN，与GenBank公布的结果一致。

图7.免疫家兔后双向琼脂扩散试验检测抗体滴度

从底部开始逆时针顺序抗体分别作1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64稀释，观察沉淀线，只有1∶64稀释度没出现沉淀线，抗体滴度为1∶32。

图8.亲和层析纯化目的蛋白

1-4泳道为洗脱峰，5为空泳道，6-10为流穿峰，纯化后用UVP扫描分析蛋白纯度约为86.5-91.2％。

图9.琼脂糖电泳检测PCR扩增产物

泳道1，2为目的基因intiminC300的PCR扩增产物(879)

泳道3，4为目的基因Stx2B的PCR扩增产物(270)

泳道5，6为目的基因hlyAB的PCR扩增产物(489)

以O157-SM^R2全菌基因组为模板，PCR扩增片段条带分别位于DNA分子量标准的1000、300、500bp的指示条带附近，预计片段大小为879、270、489，扩增片段与预计大小相一致。

图10.九周龄小鼠攻菌粪便O157培养情况

▲感染10¹⁰CFU O157的9W龄小鼠，

△感染10⁹CFU O157的9W龄小鼠

用10¹⁰CFU O157攻菌，带菌可持续3周以上，而采用10⁹CFU O157带菌可达2周。

图11.免疫攻毒保护实验小鼠的血清抗体检测

从加强免疫开始，小鼠抗EspA抗体滴度持续增高，3周后几何平均滴度达1∶300000，混合免疫组抗体滴度也显著增高，而对照组不见升高。

图12.免疫攻毒保护实验细菌脱落情况图

两实验组3日内可以检测到小鼠粪便中O157细菌的排泄，1周后只有一只还能检测到O157排泄，而对照组3周后仍能检测到细菌，说明EspA抗原具有显著的抗粘附能力。

具体实施方式

材料的准备

1.出血性大肠杆菌O157：H7菌株：

EHEC O157：H7(编号44828)[中国药品生物制品检定所曾明博士赠送]。

EHEC O157：H7(O157-SM^R、O157-SM^R1、O157-SM^R2)[本室制备保存]

2.所用试剂：

①LB液体培养基：

胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g加蒸馏水至1000ml，调整pH至7.4，高压蒸气灭菌。

②LB固体培养基：1.5g琼脂粉加入100ml LB培养液中，高压蒸气灭菌后(15磅20min)倾倒平板，如需加入抗生素，则温度在60℃左右为宜，加入后再倾倒平板，氨苄青霉素加入量为终浓度50ug/ml，卡那霉素为30ug/ml。

③山梨醇-麦康凯(SMAC)培养基：

蛋白胨20g，胆盐5g，NaCl 10g，山梨醇10g，0.5％中性红5ml，琼脂18g，除山梨醇、中性红外，其余加热溶于水，加NaOH调整pH为7.2。再加入山梨醇、中性红，高压蒸气灭菌。

④DNA电泳缓冲液(50×TAE)

Tris 242g，冰乙酸57.1ml，Na₂EDTA·2H₂O 37.2g，加水至1000ml即可，应用浓度为1×TAE。

⑤EB溶液

EB贮存液(10mg/ml)

0.2g EB溶解于20ml H₂O中，混匀后于4℃避光保存。

EB染色液

10μl EB贮存液，100ml 1×TAE缓冲液

⑥经口感染菌液制备

将EHEC O157接种于LB培养基，37℃振荡培养6h(经倍比稀释接种SMAC平板培养后计数结果约为4×10⁹CFU/ml)，离心后弃上清，再以无菌LB洗涤2次，最后按不同浓度需要以无菌LB液体重悬菌体。

⑦PBS缓冲液(pH7.2)

Na₂HPO₄14mmol，NaH₂PO₄6mmol，NaCl9g，加蒸馏水到1L

⑧NcoI、XhoI          中国大连Takara公司

⑨DNAmaker            中国大连Takara公司

⑩胶回收试剂盒        Omega公司

质粒抽提试剂盒      Omega公司

考马斯亮兰R-250快速染色系统(参考《精编分子生物学实验指南》)。

脱色液：250ml 95％乙醇和80ml冰乙酸，加双蒸水至1000ml。

包涵体洗涤液及溶解液

包涵体洗涤液I 20mmol/L Tris；pH8.0，包涵体洗涤液II 20mmol/L Tris；1.0％Triton X-100；pH8.0，包涵体洗涤液III 20mmol/L Tris；2mol/L尿素；pH8.0

包涵体溶解液

20mmol/L Tris，8mol/L尿素，pH8.0

电转移缓冲液

甘氨酸2.9g，Tris5.8g，SDS0.37g，甲醇200ml，加双蒸水至1000ml

PVDF膜转移缓冲液(蛋白测序用)

CAPS2.21g，DTT0.5g，15％甲醇150ml，加双蒸水至1000ml，用NaOH调校至pH10.5，并于4℃冷却。

丽春红S贮存液

丽春红S，2g，三氯乙酸30g，磺基水杨酸30g，用1份上述贮存液加9份双蒸水即为丽春红S应用液。

TTBS

Tris·Cl(PH7.5)100mmol/L，NaCl(w/v)0.9％，Tween-20(v/v)0.1％

TE buffer(pH8.0)

10mmol/L Tris

1mmol/L EDTA

底物反应液

4mg DAB溶于10ml TTBS中，加入5μl 30％H₂O₂混匀。

弗氏佐剂

弗氏完全佐剂：  石蜡油(1～6份)+羊毛脂(1份)+灭活卡介苗1支

弗氏不完全佐剂：石蜡油(1～6份)+羊毛脂(1份)

3.实验动物

(1)BALB/c小鼠：6-8周龄，体重18-22g，由四川大学实验动物中心提供，动物质量合格证号：医动字第24101110号。

(2)家兔：由中国人民第三军医大学实验动物中心提供。

实施例1

构建pET28a(+)-EspA表达载体

1. Gen Bank获得的EspA基因序列，编号AE005594，为EHEC O157：H7EDL933标准株，共579bp。

  1  ATGGATACAT  CAAATGCAAC  ATCCGTTGTT  AATGTGAGTGCGAGTTCTTC  GACATCGACG

 61  ATCTATGACT  TAGGTAATAT  GTCGAAGGAT  GAGGTGGTTAAGCTATTTGA  AGAACTCGGT

121  GTTTTTCAGG  CTGCGATTCT  CATGTTTTCT  TATATGTATCAGGCACAAAG  TAATCTGTCG

181  ATTGCAAAGT  TTGCTGATAT  GAATGAGGCA  TCTAAAGCGTCAACCACGGC ACAAAAGATG

241  GCTAATCTTG  TGGATGCCAA  AATTGCTGAT  GTTCAGAGTAGCACTGATAA  GAATGCGAAA

301  GCCAAACTTC  CTCAAGACGT  GATTGACTAT  ATAAACGATCCACGTAATGA  CATAAGTGTA

361  ACTGGTATTC  GTGATCTTAG  TGGTGATTTA  AGCGCTGGTGATCTGCAAAC  AGTGAAGGCG

421  GCTATTTCAG  CTAAAGCGAA  TAACCTGACA  ACGGTAGTGAATAATAGCCA  GCTCGAAATT

481  CAGCAAATGT  CGAATACATT  AAATCTCTTA  ACGAGTGCACGTTCTGATGT  GCAATCTCTA

541  CAATATAGAA  CTATTTCAGC  AATATCCCTT  GGTAAATAA

2. PCR扩增EspA片段：

①模板制备

菌株：EHEC O157：H7菌株，编号42828，来源中国药品生物制品检定所。

保种的菌株经活化后，涂LB平板，挑取4个单菌落于LB液体培养基中培养4h，取菌液5ml离心弃去上清，加双蒸水1ml重悬，沸水中煮10min，离心留取上清作PCR模板。

②设计引物

根据检索的EspA碱基序列、酶切位点检索结果和引物设计原则设计引物如下：

P1：5′-CCATGGATACATCAAATGCAAC-3′

P2：5′-CTCGAGTTTACCAAGGGATATT-3′

上游引物设计在序列前端加入CC碱基，与起始密码子ATG及后面的G构成NcoI酶切位点，下游引物去掉终止密码子，填加XhoI酶切位点CTCGAG，终止密码子使用pET28a(+)的6个His氨基酸标签后面的密码子。

PCR反应体系如下：总体积150μl

P1：3μl，P2：3μl，10×PCR buffer 15μl，Taq DNAase 3μl，dNTP 12μl模板：6μl，DDH₂O：108μl

反应条件如下：

预变性：94℃  5分钟

循环扩增：94℃  1分钟；55℃  1分钟；72℃  1分钟

延伸：    72℃  10分钟

PCR扩增仪：BioRad公司生产

核酸电泳结果见附图1.

③回收PCR扩增产物

灌制可上样200μl的1.0％琼脂糖凝胶。

将PCR扩增产物加入电泳上样孔中，指示剂迁移至适当位置时停止电泳。

在紫外线灯下分离含目的片段的凝胶，移入1.5mlEP管。

用凝胶回收试剂盒(中国大连Takara公司)回收凝胶，操作严格按试剂盒

说明书进行。

3. EspA连接到pMD18-T载体并转化致DH5α工程菌

①EspA与pMD18-T连接

通过紫外分光光度计检测回收产物的含量，按外源片段与载体摩尔数比1∶2～10的原则，设计连接反应体系如下：

EspA 1μl，pMD18-T 1μl，ddH₂O 3μl，ligation solution 5μl，16℃连接3h。

②制备DH5α感受态菌(C_aCl₂法，参考《精编分子生物学实验指南》)

③连接后将质粒转化入DH5α(热休克法，参考《精编分子生物学实验指南》)

④Amp⁺-LB平板筛选转化成功的细菌

LB阴性对照平板布满细菌，Amp⁺-LB平板阴性平板无菌落生长；阳性对照平板有蓝、白斑菌落生长，挑取转化平板上分隔良好的白斑菌落接种于7mlAmp⁺-LB培养液中，37℃摇床培养过夜。取4ml抽提质粒，用NcoI和XhoI双酶切鉴定，酶切体系如下：

质粒5μl，NcoI 1μl，XhoI 1μl，10×buffer(K)1μl，BSA 1μl，ddH₂O1μl，混匀，37℃水浴4h，电泳。

质粒大小和切下的片段大小与预期值相符。

⑤测序：将上述转化成功的细菌送往北京三博远志公司测序，测序结果与Gen Bank序列比较只有第111位碱基由A→G，但编码氨基酸并未改变。

4.EspA基因片段连接到pET-28a(+)转化到BL21表达细菌中

①EspA-pMD18-T质粒的提取，采用质粒抽提试剂盒(中国大连Takara公司)，操作步骤按试剂盒说明书进行。

②pET28a(+)质粒提取，方法同上。

③用NcoI和XhoI酶切以上两个质粒，获得EspA片段和打开的pET28a(+)载体

④连接EspA和pET28a(+)，构建重组质粒结构示意图见附图2。

⑤转化入BL21(DE3)表达细菌中(热休克法，参考《精编分子生物学实验指南》)

⑥酶切鉴定后送上海博亚公司测序，结果与三博远志公司测序一致，见附图3。

用上述方法得到pET28a(+)-EspA表达载体。

实施例2

制备目的蛋白的工程菌BL21-pET28a(+)-EspA即预防用出血性大肠杆菌O157：H7疫苗

1..IPTG诱导目的片段的表达及表达形式的鉴定：

①IPTG诱导BL21(DE3)表达

重组工程菌BL21-pET28a(+)-EspA经IPTG诱导后，进行Tris-Tricine电泳观察蛋白表达情况，与对照相比EspA高表达，见附图4。

②超声波破菌后，进行减速离心，分别取沉淀及上清做蛋白电泳，电泳图所示表达形式主要是包涵体表达。见附图5。

2.包涵体的洗涤及纯化：

①破菌：高压均浆仪破菌

②包涵体分离：差速离心的方法。

③洗涤：分别用TE+Triton X100和不同浓度的尿素-TE缓冲液洗涤

④溶解：用8M尿素溶解包涵体

⑤透析：20mM的Tris·Cl缓冲液透析除尿素

⑥用亲和层析的方法进行蛋白纯化，利用pET-28a(+)质粒表达的外源蛋白带有His标签这一特性，采用亲和层析的方法进行蛋白纯化，结果见附图6。

3.EspA蛋白N端氨基酸序列测定：

①配制10％的SDS-PAGE凝胶，2×SDS上样缓冲液与纯化的蛋白1∶1混匀，煮沸5min，每孔上样20μl，电泳2h，分离蛋白。

②倾去电泳缓冲液，小心拆卸凝胶夹层，轻轻将玻璃板分开。

③按下面的次序在小型转移装置中组装转印夹层：塑料框、海绵、滤纸、凝胶、PVDF膜、滤纸、海绵、塑料框。PVDF膜组装前置于100％甲醇中润湿。

④将转印夹层插入转移装置，最靠近阳极的是膜。用CAPS转移缓冲液充满装置，用50V转移3h。

⑤小心取下PVDF膜，用含0.1％考马斯亮蓝R250的50％甲醇染色1min，用含10％乙酸的50％甲醇脱色至背景清晰为止。

⑥用刀片将目标蛋白条带切下，放入微量离心管中，室温风干，送中国医学科学院基础医学研究所中心实验室测序N端的5个氨基酸。结果见附图6。

4.多克隆血清的制备

①动物选择：成年兔子两只。

②接种途径：皮下注射。

③接种部位：四肢腋窝，四个足掌，颈部。

④佐剂使用：第一次为完全佐剂，羊毛脂∶石蜡油＝1∶1，BCG：1支/只(0.2-0.3mg/支)，研磨至完全乳化，成油包水样。

⑤接种策略：

接种量，每只2mg抗原；接种体积，每只2ml；接种时间，共接种4次，第一次间隔3周，第二、三次间隔10天。

⑥采样：心脏取血。

⑦多克隆血清抗体滴度的检测(双向琼脂扩散试验)

a)在水平桌面上，将熔化的1％琼脂倒于载玻片上，每张载玻片约4ml。

b)用打孔器打孔，孔径3mm，孔距4mm，呈梅花形。

c)将待测抗体从1∶2开始，依次作倍比稀释，逆时针分别加入周围孔中，抗原原液加入中间孔，每孔约15μl。

d)放入湿盒中，37℃作用24h，观察结果。

e)染色：将滤纸打湿盖在玻片上，置37℃温箱内过夜，彻底烤干后打湿滤并纸揭下，玻片置于5％氨基黑染液染色10min，用含50％乙酸的甲醇溶液脱色，直到背景清晰为止，最后照相。见附图7，可见抗体效价为1∶32。

结论：得到含有pET28a(+)-EspA表达载体的BL21(DE3)工程菌；EspA即人和牲畜预防用出血性大肠杆菌O157：H7疫苗。

用基因工程连接构建融合多价亚单位抗原，采用本发明方法，同样可以获得人和牲畜预防用出血性大肠杆菌O157：H7疫苗，并且可以达到同样的效果。

实施例3

O157：H7感染Balb/c小鼠动物模型的建立：

1.耐链霉素的O157：H7细菌的选择：

a)抗生素的选择

选用8周龄Balb/c小鼠20只，平均分4组，实验组3组，对照组1组，经适应1周后，实验组分别给予含5g/l的链霉素、卡那霉素、氨苄青霉素的无菌水，让其饮用3天，对照组给予正常无菌水，3天后取小鼠新鲜粪便于PBS缓冲液中，用旋涡混合器振碎混匀，倍比稀释后接种LB固体培养基进行计数培养。观察三种抗生素对肠道细菌的清除效果。

b)高抗性的耐链霉素的O157：H7细菌的选择

i、将冻存的O157：H7菌株涂布于LB固体培养基上，于37℃培养24h。

ii、挑取上述单菌落接种于含10μg/ml的链霉素的LB液体培养基，37℃摇瓶150rpm24h培养。将菌液涂布于LB固体培养基上，于37℃培养24h。

iii、取步骤2所得菌落用三种O157诊断血清鉴定无误后接种于含20μg/ml的链霉素的LB液体培养基，37℃摇瓶150rpm24h培养。将菌液涂布于LB固体培养基上，于37℃培养24h。

iv、取步骤3所得菌落用同样方法接种于含50μg/ml的链霉素的LB液体培养基。

v、取步骤4所得菌落用同样方法接种于含100μg/ml的链霉素的LB液体培养基。

vi、取步骤5所得菌落用同样方法接种于含200μg/ml的链霉素的LB液体培养基。

vii、取步骤6所得菌落用三种O157诊断血清鉴定无误后，保种，命名为EHEC O157-SMR。

2. EHEC O157小鼠感染适应株的选择

a)将 EHEC O157-SM^R接种于LB培养基，37℃振荡培养6h，离心后弃上清，再以无菌LB洗涤2次，最后以无菌LB液体重悬菌体。实验小鼠均给予5g/L链霉素溶液饮用3d，然后全部断水断食1d。再以该菌液经口感染Balb/c小鼠(每只小鼠实灌菌1×10¹⁰CFU)，攻菌后全部给予0.5g/L的链霉素溶液饮用，观察小鼠临床症状并对其做微生物学检测。从感染3d后的小鼠粪便中分离O157，以抗血清凝集、山梨醇发酵实验鉴定无误后，命名为EHEC O157-SM^R1。

b)将EHEC O157-SM^R1以同样方法剂量经口感染Balb/c小鼠，观察小鼠临床症状并对其做微生物学检测。从感染3d后的小鼠粪便中分离O157，以抗血清凝集、山梨醇发酵实验鉴定无误后，命名为EHEC O157-SM^R2。

c)将EHEC O157-SM^R2以同样方法剂量经口感染Balb/c小鼠，观察小鼠临床症状并对其做微生物学检测。

d)EHEC O157-SM^R2的毒力基因检测：

为了确保用链霉素筛选出的菌落是所需要的EHEC O157-SM^R2，根据该菌株特有的基因序列设计引物，以EHEC O157-SM^R2的DNA作为模板，做PCR扩增，结果为阳性的即为所需的EHEC O157-SM^R2。

以GenBank公布的hlyA和hlyB基因核苷酸序列(Access Number：U12572)的第2241～2730bp基因片段(hlyAB)、intiminC300(AccessNumber：NC 002695)、Stx2B(Access Number：AE005174)作为O157的特异基因，根据引物设计原则，设计以下引物。

hlyAB：       上游引物P1：5’-acaacacacactcaacaactt-3’

下游引物P2：  5’-actctccgactactgttgctc-3’

intiminC300： 上游引物P3：5’-acttcagcacttaatgccagtgcgg-3’

下游引物P4：  5’-ttctacacaaaccgcatagacatttg-3’

Stx2B：       上游引物P5：5’-atgaagaagatgtttatggcggt-3’

下游引物P6：  5’-tcagtcattattaaactgcacttc-3’

引物用Primer Premier 5.0软件设计和分析评价，并由上海博亚公司合成，PAGE纯。

目的基因的PCR扩增

模板制备：EHEC O157-SM^R2过夜培养菌液2ml 10000rpm离心5分钟去上清，加入0.2ml双蒸水混匀煮沸10分钟，同样离心后取上清作模板。

PCR扩增反应体系如下：

	HlyAB	IntC300	Stx2B
				模板DNA	1μl	1μl	1μl
P1(25pmol/μl)	1μl	1μl	1μl
				P2(25pmol/μl)	1μl	1μl	1μl
dNTPs(2.5mmol/L each)	4μl	4μl	4μl
				10×PCR buffer	5μl	5μl	5μl
Ex-Taq DNA polymerase	1μl	1μl	1μl
				ddH2O	37μl	37μl	37μl
total volume	50μl	50μl	50μl

将反应体系振荡混匀，离心处理后，加入40μl石蜡油。94℃预变性5min，94℃变性90s，60℃退火60s，72℃延伸90s，35个循环，72℃完全延伸10min。反应完毕后取5μl反应产物，1.0％琼脂糖凝胶电泳检测PCR效果。结果见附图9

3. EHEC O157：H7感染Balb/c小鼠动物模型的建立

a)菌株及攻菌液制备

EHEC O157-SM^R2接种于LB培养基，37℃振荡培养6h(经倍比稀释倾注培养后计数结果为4×10⁹CFU/ml)，离心后弃上清，再以无菌LB洗涤2次，最后以无菌LB液体重悬菌体，调整活菌浓度约为1.5×10¹⁰CFU和1.5×10⁹CFU/ml的活菌。

b)动物分组及处理

3种不同大小(5、7、9w龄)的小鼠各分3组，实验组2组，对照组1组，每组6只，所有组均给予5g/L链霉素溶液饮用3d。3d后粪检肠道排菌少于10³CFU/g，然后全部断水断食1d。灌胃攻菌后全部给予0.5g/L的链霉素溶液饮用。

c)攻菌方法及剂量

实验组小鼠分别经口用饲胃针灌0.3ml LB液体洗涤后的菌液(约含1.5×10¹⁰CFU和1.5×10⁹CFU/ml的活菌)，间隔6h连续灌胃2次(每只小鼠灌菌1×10¹⁰CFU和1×10⁹CFU)。对照组经口灌胃LB液体培养基，其剂量方法同实验组。

d)粪便收集及培养

小鼠攻菌后于1、4、7、10、13、16、19、22天收集新鲜粪便(成形粪便采10～15粒)于PBS缓冲液中，再用旋涡混合器振碎，接种于SMAC平板进行计数培养。O157在该培养基上的菌落特征为，不发酵山梨醇，菌落透明、光滑湿润，与O157诊断血清做玻片凝集实验为阳性，粪便排菌情况见附图10。

实施例4

EspA抗原的免疫攻毒保护试验

采用上述O157：H7感染Balb/c小鼠感染动物模型。

①免疫动物为3周龄Balb/c小鼠，分3组：EspA皮下免疫组、EspA+Stx2B-intiminC300组、PBS对照组，每组12只。

②皮下免疫抗原量：30μg/只/次；免疫时间：0，1，2周，共3次；佐剂为弗氏完全和不完全佐剂。

③免疫2、3周后每组留6只作抗体效价的长期观察，ELISA检测抗体效价。见附图说明之图11。

④免疫后10天，用O157全菌液进行灌胃攻毒，剂量为1×10⁹CFU/只，共两次，每次间隔6小时，分别于第3、7、14、21、28日留取小鼠粪便，接种山梨醇麦康凯培养基(SMAC)，监测细菌脱落情况。

⑤结果：两实验组小鼠1周后只有1只能检测到细菌，14天后完全检测不到，而对照组3周后皆检测到细菌脱落，4周后仍有5只检测到细菌。说明EspA抗原免疫产生的抗体具有抗粘附定植作用。见附图12。

根据以上实验可证明，本发明建立了Balb/c小鼠感染的动物模型，带菌可达21天，构建了高效表达的载体，所制备的抗原能有效诱发机体的免疫应答反应，是制备EHEC O157疫苗的良好抗原。

在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员采用等价形式对本发明作各种改动或修改，同样落于本发明所限定的范围。

                                 序列表

<110>中国人民解放军第三军医大学

<120>人和牲畜预防用出血性大肠杆菌O157：H7疫苗及制备方法

<160>1

<170>Patent In Version 2.1

<210>1

<211>603

<212>DNA

<213>肠出血性大肠杆菌O157：H7(Enterohemorrhagic Escherichia coli O157：H7)

<220>

<221>misc_feature

<222>(44)…(656)

<400>1

CCTCTAGAAA TAATTTTGTT TAACTTTAAG AAGGAGATAT ACCATGGATA CATCAAATGC 60

AACATCCGTT GTTAATGTGA GTGCGAGTTC TTCGACATCG ACGATCTATG ACTTAGGTAA 120

TATGTCGAAG GATGAGGTGG TTAAGCTATT TGAGGAACTC GGTGTTTTTC AGGCTGCGAT 180

TCTCATGTTT TCTTATATGT ATCAGGCACA AAGTAATCTG TCGATTGCAA AGTTTGCTGA 240

TATGAATGAG GCATCTAAAG CGTCAACCAC GGCACAAAAG ATGGCTAATC TTGTGGATGC 300

CAAAATTGCT GATGTTCAGA GTAGCACTGA TAAGAATGCG AAAGCCAAAC TTCCTCAAGA 360

CGTGATTGAC TATATAAACG ATCCACGTAA TGACATAAGT GTAACTGGTA TTCGTGATCT 420

TAGTGGTGAT TTAAGCGCTG GTGATCTGCA AACAGTGAAG GCGGCTATTT CAGCTAAAGC 480

GAATAACCTG ACAACGGTAG TGAATAATAG CCAGCTCGAA ATTCAGCAAA TGTCGAATAC 540

ATTAAATCTC TTAACGAGTG CACGTTCTGA TGTGCAATCT CTACAATATA GAACTATTTC 600

AGCAATATCC CTTGGTAAAC TCGAGCACCA CCACCACCAC CACTGAGATC CGGCTGCTAA 660

Claims (7)

1.一种人和牲畜预防用出血性大肠杆菌O157:H7疫苗，其特征在于：包括肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157:H7和通过克隆表达其毒力基因制备多价亚单位抗原或融合多价亚单位的抗原。

2.根据权利要求1所述的人和牲畜预防用出血性大肠杆菌O157:H7疫苗，其特征在于：所述疫苗的多价亚单位抗原或融合多价亚单位的抗原以特定组分和比例混合或融合。

3.根据权利要求1或2所述的人和牲畜预防用出血性大肠杆菌O157:H7疫苗，其特征在于：所述疫苗的抗原组分是m型分泌蛋白中的一种或几种与粘附素、溶血素、志贺样毒素(Stx)的一种或几种的混合物或融合多价亚单位抗原的混合物，及在此基础上添加其它组分而形成的混合物。

4.根据权利要求1或2所述的人和牲畜预防用出血性大肠杆菌O157:H7疫苗，其特征在于：所述疫苗的多价亚单位的抗原或融合多价亚单位的抗原是在基因工程水平以特定组合及连接方式融合而得到的基因工程重组蛋白。

5.制备权利要求1所述的人和牲畜预防用出血性大肠杆菌O157:H7疫苗的方法，包括以下步骤：

(1)设计EHEC O157:H7 EDL933标准株的EspA基因序列的引物；

1)上游引物设计在序列前端加入CC碱基；

2)与起始密码子ATG及后面的G构成NcoI酶切位点；

3)下游引物去掉终止密码子，填加XhoI酶切位点CTCGAG；

4)终止密码子使用pET28a(+)的6个His氨基酸标签后面的密码子；

(2)用-PCR方法扩增获得EspA片段；

(3)构建含有EspA基因的pET28a(+)质粒；

(4)将表达载体转化到BL21(DE3)工程菌中，异丙基-b-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导可高效表达EspA蛋白，获得表达目的蛋白的工程菌BL21-pET28a(+)-EspA；

(5)发酵BL21-pET28a(+)-EspA重组工程菌，大量表达目的蛋白，经纯化获得纯化抗原；

6.根据权利要求1所述的人和牲畜预防用出血性大肠杆菌O157:H7疫苗，其特征在于：所述疫苗适合于口服和/或皮下给药途径。

7.一种用于检测权利要求1所述疫苗免疫性能的方法，其特征在于：包括以下步骤

(1)用链霉素压力筛选的方法选择高抗性耐链霉素的O157:H7细菌，得到EHEC O157-SM^R菌落；

(2)EHEC O157小鼠感染适应株的选择

1)用LB液体培养基培养EHEC O157-SM^R1菌落和EHEC O157-SM^R2菌落；

2)设计hlyA和hlyB基因核苷酸序列O157的特异基因的引物；

3)用PCR法扩增目的基因；

(3)建立EHEC O157:H7感染Balb/c小鼠动物模型

1)用EHEC O157-SM^R2接种于LB培养基制备攻菌液，对动物进行攻菌；

2)用通常方法收集粪便，SMAC平板培养，测定菌落特征；

(4)取上述O157:H7感染Balb/c小鼠，用免疫攻毒保护实验及抗粘附实验检验EspA人和牲畜预防用出血性大肠杆菌O157:H7疫苗的免疫性能。

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