[go: up one dir, main page]
More Web Proxy on the site http://driver.im/

CN105821065A - 一种双抗原重组蛋白及其制备方法和应用 - Google Patents

一种双抗原重组蛋白及其制备方法和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN105821065A
CN105821065A CN201610280481.5A CN201610280481A CN105821065A CN 105821065 A CN105821065 A CN 105821065A CN 201610280481 A CN201610280481 A CN 201610280481A CN 105821065 A CN105821065 A CN 105821065A
Authority
CN
China
Prior art keywords
tir
espa
seq
recombiant
fusion gene
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201610280481.5A
Other languages
English (en)
Inventor
范宏英
林如琴
吴娴波
张益多
李亚文
吴宇桦
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Southern Medical University
Original Assignee
Southern Medical University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Southern Medical University filed Critical Southern Medical University
Priority to CN201610280481.5A priority Critical patent/CN105821065A/zh
Publication of CN105821065A publication Critical patent/CN105821065A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/24—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Enterobacteriaceae (F), e.g. Citrobacter, Serratia, Proteus, Providencia, Morganella, Yersinia
    • C07K14/245—Escherichia (G)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/025—Enterobacteriales, e.g. Enterobacter
    • A61K39/0258—Escherichia
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/545—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the dose, timing or administration schedule
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/70—Multivalent vaccine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/10—Plasmid DNA
    • C12N2800/101—Plasmid DNA for bacteria

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

本发明提供一种双抗原重组蛋白及其制备方法和应用，具体提供了一种EHEC O157:H7 espA‑Tir‑M双抗原片段的融合基因，其序列如SEQ ID No.1所示，同时还提供了由此编码的重组蛋白及其亚单位疫苗将制备双抗原重组蛋白通过皮下注射、滴鼻方式免疫小鼠，并进行EHEC O157:H7攻毒实验，证明该双抗原重组蛋白具有良好的免疫原性和免疫保护效果，可用于预防EHEC O157:H7感染的候选疫苗。

Description

一种双抗原重组蛋白及其制备方法和应用
技术领域
本方法属于基因工程技术领域，具体涉及一种EHEC O157:H7espA-Tir-M双抗原重组蛋白。
背景技术
肠出血型大肠埃希菌(enterohaemorrhagic E.coli,EHEC)O157:H7感染性腹泻是一种危害严重的肠道传染病，临床主要表现为出血性肠炎(haemorrhagic colitis,HC)、严重者可引起溶血性尿毒综合症(hemolytic uremic syndrome,HUS)、血栓性血小板减少性紫癜(thrombotic thromobocytopenie porpura,TTP)等并发症，甚至可导致死亡。EHEC O157:H7可通过多种途径传播，其中以食源性传播为主，水源性传播和接触传播也是重要的传播途径。我国的大部分地区已陆续在市售食品和进口食品、家畜家禽和腹泻病患者中检出EHEC O157:H7，有些地区还发生了较大规模的暴发流行，EHEC O157:H7感染因具有暴发流行趋势、强烈的致病性与致死性以及抗生素治疗可能会加剧病情等特点，目前已经成为世界范围内重要的公共卫生问题，有效的疫苗研制是预防和控制EHEC O157:H7感染最经济、有效的方法，但是目前尚未有可用于人体的疫苗。
EHEC O157:H7的致病性主要体现在细菌的黏附定植力和毒素两个方面，黏附是肠出血性大肠埃希菌感染的第一步，Tir和espA在细菌黏附和形成特征性的黏附和抹平损伤(attaching and effacing lesion,A/E lesion)，即A/E损伤的效应分子传递中起到重要的桥梁作用。因此我们选择EHEC O157:H7Tir和espA两个关键性定植功能蛋白作为研制预防其感染的疫苗候选抗原，结合生物信息学B细胞表位和T细胞表位预测其作为抗原的潜力，构建EHEC O157:H7espA-Tir-M双抗原重组蛋白作为预防EHEC O157:H7感染的候选疫苗。基因工程亚单位疫苗是只含有病原体的一种或几种只产生保护性免疫应答所必需的免疫原成分，而不含有感染性成分和病原体的其他遗传信息，无须灭活，也无致病性，减少或消除了常规活疫苗或灭活疫苗难以避免有害的反应原，是最具安全性和稳定性的一种基因工程疫苗。
发明内容
本发明要解决的技术问题是构建一种EHEC O157:H7espA-Tir-M双抗原重组蛋白，该重组蛋白可用于预防EHEC O157:H7感染的候选疫苗。
本发明是通过以下技术方案来实现：
1.EHEC O157:H7espA-Tir-M双抗原片段，其特征在于：espA和Tir-M通过生物信息学表位预测，采用ABCPred和BepPred在线软件B细胞表位的预测，ProPred和NetMHCIIPan在线软件进行Th细胞表位预测，ProPred选择49种系统中的HLA-DRB1等位基因，NetMHCIIpan选择中国人群分布频率较高的7种等位基因:HLA-DRB1*0901(14.4％)、HLA-DRB1*1202(13.3％)、HLA-DRB1*1501(10.8％)、HLA-DRB1*1101(7.0％)、HLA-DRB1*0803(5.9％)、HLA-DRB1*0701(5.7％)、HLA-DRB1*1602(5.3％)。
2.一种制备如权利要求1所述的EHEC O157:H7espA-Tir-M双抗原片段，该方法包括以下步骤：
(1)通过重叠延伸PCR法制备espA-Tir-M双链融合基因，其序列为SEQ ID No.1；
(2)将步骤(1)得到espA-Tir-M双链融合基因和质粒pet-28a(+)分别用EcoR I和Hind III进行双酶切后，用T4连接酶连接，得到连接产物；
(3)将步骤(2)连接产物转化到DH5α感受态中，鉴定含有pet-28a(+)-espA-Tir-M重组质粒的重组DH5α菌株，得到重组质粒；
(4)将步骤(3)重组质粒导入BL21(DE3)感受态，得到重组菌株BL21-pet-28a(+)-espA-Tir-M；
(5)诱导步骤(4)重组菌株BL21-pet-28a(+)-espA-Tir-M表达和纯化重组融合蛋白espA-Tir-M(et)；
(6)将步骤(5)制备的重组蛋白et进行WB鉴定，得到重组蛋白et。
本发明一个方面提供了一种EHEC O157:H7espA-Tir-M双抗原片段的融合基因，其序列如SEQ ID No.1所示。
本发明另一个方面提供了一种重组蛋白，其由前述的融合基因编码。
本发明另一个方面提供了一种用于前述的融合基因的引物组合物，其由四条引物组成
espA-P1:5′-CGGAATTCATGGATACATCAAATGCA(SEQ ID No.2)，
espA-P2:5′-GCTACCTCCTCCACTTCCGCCTCCTTTACCAAGGGATATTGCTG(SEQ ID No.3)；
Tir-M上游引物引入linker，下游引物引入酶切位点Hind III，Tir-M-P1:5′-GGAGGCGGAAGTGGAGGAGGTAGCAGCCCAACCACGACCGAC(SEQ ID No.4)，
Tir M-P2:5′-CCCAAGCTTGGCTTGCTGTTTGGCCTCTT(SEQ ID No.5)。
本发明另一个方面提供了如前述的重组蛋白的制备方法，该方法包括以下步骤：
(1)通过重叠延伸PCR法制备espA-Tir-M双链融合基因，其序列为SEQ ID No.1；
(2)将步骤(1)得到espA-Tir-M双链融合基因和质粒pet-28a(+)分别用EcoR I和Hind III进行双酶切后，用T4连接酶连接，得到连接产物；
(3)将步骤(2)连接产物转化到DH5α感受态中，鉴定含有pet-28a(+)-EspA-Tir-M重组质粒的重组DH5α菌株，得到重组质粒；
(4)将步骤(3)重组质粒导入BL21(DE3)感受态，得到重组菌株BL21-pet-28a(+)-EspA-Tir-M；
(5)诱导步骤(4)重组菌株BL21-pet-28a(+)-EspA-Tir-M表达和纯化重组融合蛋白EspA-Tir-M(et)。
其中，步骤(1)中PCR所用的引物组如前所示。
本发明另一个方面提供了一种重组亚单位疫苗，其中包含前述的重组蛋白。
本发明另一个方面提供了本发明蛋白或者重组亚单位疫苗在预防EHEC O157:H7感染的疫苗或者药品中的用途。
上述技术方案中所述的重组蛋白即为预防EHEC O157:H7感染的候选疫苗。
本发明具有的有益效果为：通过使用生物信息学表位预测的方法对EHEC O157:H7espA和Tir-M作为抗原进行理论上的研究，表明espA-Tir-M具有较多的B细胞和T细胞表位，可作为有效的保护性抗原，进一步用动物实验验证了重组蛋白espA-Tir-M免疫小鼠后可诱导小鼠产生特异性抗体和细胞因子，有效保护感染EHEC O157:H7的小鼠。亚单位是最具安全性和稳定性的一种基因工程疫苗，该重组espA-Tir-M可用于预防EHEC O157:H7感染的候选疫苗。
为让本发明的上述和其它目的、特征和优点能更明显易懂，下文特举实例，并配以附图表，作如下详细说明。
附图说明
图1：重组质粒pet‐28a(+)-espA-Tir-M构建路线图；
图2：重叠延伸PCR结果，其中泳道M为核酸(DNA)分子量标准(Marker)，泳道1为espA-Tir M(816bp)；
图3：重组细菌菌落质粒pet‐28a(+)-espA-Tir-M PCR鉴定结果，泳道M为核酸(DNA)分子量标准(Marker)，泳道1-6为PCR结果(816bp)；
图4：重组质粒pet‐28a(+)-espA-Tir-M酶切鉴定，泳道M为核酸(DNA)分子量标准(Marker)，泳道1是重组质粒EcoR I和Hind III双酶切后基因片段，泳道2是重组质粒EcoR I单酶切后的基因片段，泳道3是重组质粒Hind III单酶切后的基因片段；
图5：重组质粒pet‐28a(+)-espA-Tir-M测序结果；
图6：SDS-PAGE检测重组菌株BL21-pet-28a(+)-espA-Tir-M在不同时间诱导 产生重组蛋白et结果，泳道M为蛋白分子量标准(Marker)，泳道1-4分别为重组菌株加入IPTG诱导0,1,3,4h的蛋白表达，泳道5-6为空载体菌株BL21-pet-28a(+)分别诱导0,4h结果；
图7：SDS-PAGE检测重组蛋白et纯化结果，泳道M为蛋白分子量标准(Marker)，泳道1-2是为空载体菌株BL21-pet-28a(+)分别诱导0,4h结果对照，泳道3是重组菌株BL21-pet-28a(+)-espA-Tir-M用IPTG诱导4h后细菌裂解上清液；泳道4重组菌株BL21-pet-28a(+)-espA-Tir-M用IPTG诱导4h后细菌裂解后沉淀；泳道5是纯化后的重组蛋白et；
图8：WB检测重组蛋白et结果；
图9：小鼠血清IgG检测结果，分别为首次免疫0,7,21,35天后采血血清用间接ELISA检测，PBS组为PBS阴性对照组，et(s.c)为重组蛋白et与弗氏佐剂皮下注射免疫组，et(i.n)为重组蛋白et滴鼻免疫组；
图10：小鼠粪便IgA检测结果，小鼠末次免疫后14天粪便用间接ELISA检测；
图11：小鼠细胞因子检测，小鼠末次免疫后14天血清用ELISA试剂盒检测IL-4、IL-10、INF-γ表达水平；
图12：攻毒后小鼠生存曲线；
图13：攻毒后小鼠体内O157定植结果；
图14：攻毒后小鼠病理切片结果，A中Ileum、Colon、Cecum、Liver、Panereas、Kindey分别为未免疫的小鼠攻毒EHEC O157:H7后小肠、结肠、盲肠、肝脏、脾脏和肾脏的病理切片；B中a、b、c分别为正常小鼠结肠、滴鼻免疫小鼠结肠和皮下注射免疫小鼠结肠。
具体实施方式
以下实施例和试验例中除特别说明外，所用试剂和实验方法均为本领域常用技术方法和材料。
实施例1生物信息学表位预测筛选EHEC O157:H7的抗原表位
从GenBank查找espA基因序列(KJ549678.1)和Tir M基因序列(NC_002655.2)，分别使用InterProScan对氨基酸序列中所包含的结构和功能进行预测，分别通过ABCPred(http://www.imtech.res.in/raghava/abcpred/ABC_submission.html)和BepiPred(http://tools.immuneepitope.org/tools/bcell/iedb_input)两种分析工具预测蛋白质B细胞表位，通过ProPred(http://www.imtech.res.in/raghava/propred/)和NetMHCIIpan(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetMHCIIpan/)两种分析工具预测蛋白质Th细胞表位。ProPred选择49种系统中的HLA-DRB1等位基因，NetMHCIIpan选择中国人群分布频率较高的7种等位基因：HLA-DRB1*0901(14.4％)、 HLA-DRB1*1202(13.3％)、HLA-DRB1*1501(10.8％)、HLA-DRB1*1101(7.0％)、HLA-DRB1*0803(5.9％)、HLA-DRB1*0701(5.7％)、HLA-DRB1*1602(5.3％)。
表1生物信息学预测espA、Tir-M细胞表位结果
实施例2引物的设计及合成
从GenBank查找espA基因序列(KJ549678.1)和Tir M基因序列(NC_002655.2)，espA上游引物5′端引入EcoR I酶切位点，下游引物去除终止密码子TAA，引入linker(ggaggcggaagtggaggaggtagc)，引物设计如下：espA-P1:5′-CGGAATTCATGGATACATCAAATGCA(SEQ ID No.2)，espA-P2:5′-GCTACCTCCTCCACTTCCGCCTCCTTTACCAAGGGATATTGCTG(SEQ ID No.3)；Tir-M上游引物引入linker，下游引物引入酶切位点Hind III，Tir-M-P1:5′-GGAGGCGGAAGTGGAGGAGGTAGCAGCCCAACCACGACCGAC(SEQ ID No.4)，Tir M-P2:5′-CCCAAGCTTGGCTTGCTGTTTGGCCTCTT(SEQ ID No.5)，引物由上海生工基因技术有限公司合成。
实施例3.重叠延伸PCR法制备EspA-Tir M双链融合基因
3.1采用基因组DNA提取试剂盒(天根生物)提取EHEC O157:H7标准株EDL933染色体DNA为模板，分别扩增espA基因序列和Tir-M基因序列，按以下循环参数在PCR仪上进行反应：94℃预变性5分钟，然后94℃30sec→58℃30sec→72℃45sec进行30个循环，最后72℃延伸10分钟。反应结束1％琼脂糖凝胶电泳，采用琼脂糖凝胶回收试剂盒(购于大连宝生物公司)回收espA和Tir M后进行重叠延伸PCR。
3.2重叠延伸PCR：先将espA和Tir M在高保真酶反应体系中94℃30sec→58℃30sec→72℃45sec反应10个循环，之后加入上下游引物espA-P1和Tir M-P2在反应条件为94℃30sec→58℃30sec→72℃1min反应30循环，最后72℃延伸10分钟。反应结果1％琼脂糖凝胶电泳，琼脂糖凝胶回收试剂盒回收espA-Tir M双链融合基因。对espA-Tir M双链融合基因进行测序，测序的结果如SEQ ID No.1所示：
atggatacatcaaatgcaacatccgttgttaatgtgagtgcgagttcttcgacatcgacgatctatgacttaggtaatatgtcgaaggatgaggtggttaagctatttgaggaactcggtgtttttcaggctgcgattctcatgttttcttatatgtatcaggcacaaagtaatctgtcgattgcaaagtttgctgatatgaatgaggcatctaaagcgtcaaccacggcacaaaagatggctaatcttgtggatgccaaaattgctgatgttcagagtagcactgataagaatgcgaaagccaaacttcctcaagacgtgattgactatataaacgatccacgtaatgacataagtgtaactggtattcgtgatcttagtggtgatttaagcgctggtgatctgcaaacagtgaaggcggctatttcagctaaagcgaataacctgacaacggtagtgaataatagccagctcgaaattcagcaaatgtcgaatacattaaatctcttaacgagtgcacgttctgatgtgcaatctctacaatatagaactatttcagcaatatcccttggtaaaggaggcggaagtggaggaggtagcagcccaaccacgaccgaccctgatgcagctgcaagtgcaactgaaactgcgacaagagatcagttaacgaaagaagcgttccagaacccagataatcaaaaagttaatatcgatgagctcggaaatgcgattccgtcaggggtattgaaagatgatgttgttgcgaatatagaagagcaggctaaag cagcaggcga agaggccaaa cagcaagcc SEQ ID No.1
实施例4.构建pet-28a(+)-espA-Tir-M重组质粒
4.1将导入pet-28a(+)质粒的大肠杆菌DH5α在含50ug/ml红霉素LB固体培养基复苏后挑取单菌落，在含红霉素的LB液体培养基中扩大培养后，采用小提质粒试剂盒(大连宝生物)提取pet-28a(+)质粒。
4.2采用EcoR I、Hind III内切酶(赛默飞世尔科技)分别双酶切espA-Tir-M双链融合基因和pet-28a(+)质粒，37℃水浴箱酶切2h，1％琼脂糖凝胶电泳，采用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收双酶切后的产物。
4.3采用T4连接酶(赛默飞世尔科技)在16℃连接4h后，将含双酶切后的重组双链espA-Tir-M融合基因连接入双酶切后的pet-28a(+)载体(10:1)。
4.4将步骤4.3连接产物导入大肠杆菌DH5α感受态，采用PCR鉴定、重组质粒双酶切鉴定、测序测定筛重组质粒pet-28a(+)-espA-Tir-M。
实施例5重组菌株BL21-pet-28a(+)-espA-Tir-M的构建
将步骤4中成功构建的重组质粒PET-28a(+)-espA-Tir-M从重组DHDH5α中采用小提质粒试剂盒(大连宝生物)提取后，取2ul转化至BL21/DE3感受态细菌后，挑选阳性重组子，得到重组菌株BL21-pet-28a(+)-espA-Tir-M。
实施例6.诱导重组菌株BL21-pet-28a(+)-espA-Tir-M表达蛋白和纯化重组融合蛋白EspA-Tir-M(et)；
6.1将重组菌株BL21-pet-28a(+)-espA-Tir-M接种至含卡那霉素(Kan+)(终浓度50μg/mL)的5mL LB液体培养基中，37℃200rpm振摇培养过夜。
6.2第二天按l:100(菌液:培养基)转接，在37℃250rpm摇振培养至OD600＝0.6(约3-4h)，取lmL菌液作为诱导前对比样品后，再加入IPTG(终浓度1 mmol/L)，37℃，200rpm诱导培养1,3，4h，分别取1mL菌液作为诱导后样品，并且以空载体菌株BL21-pet-28a(+)分别诱导0,4h作为对照。
6.3将所有样品离心收菌，在沉淀中加入100μL l×SDS-PAGE上样裂解缓冲液后，煮沸10min,12000rpm离心5min，取10μL进行12％SDS-PAGE(分离胶12％、浓缩胶5％)，用考马斯亮蓝R250染液室温染色约4h，脱色液脱色后，用凝胶成像分析系统观察是否有重组目的蛋白的表达，结果显示该重组菌利用IPTG诱导4h可产生较多的重组蛋白。
6.4根据步骤6.3实验结果情况，大量表达重组目的蛋白，用Ni-Agarose His标签蛋白纯化试剂盒进行纯化(康为世纪)，按照试剂盒说明操作，并且取重组菌裂解液上清和沉淀分别进行SDS-PAGE，考察重组蛋白et可溶性表达和包涵体的表达情况，用SDS-PAGE检测显示，该重组蛋白主要存在细菌裂解上清液，即主要以可溶性形式存在。
实施例7.重组蛋白espA-Tir-M表达和免疫原性鉴定
取步骤6诱导4h后的重组菌种1ml，离心弃上清，在沉淀中加入适量1*SDS-PAGE上样缓冲液，煮沸10min,12000rpm离心5min，取20μL进行12％SDS-PAGE，用常规Western blot检测，结果显示在36KD处可检测到目的条带。
实验例：双抗原亚单位疫苗对O157:H7感染的小鼠具有免疫保护作用
实验例1重组蛋白的准备
大量纯化制备重组蛋白et，将洗脱的重组蛋白进行4℃透析24h，期间更换透析液PBS 4-5次，取出透析后的蛋白用10KD超滤浓缩管进行浓缩，用BCA法进行蛋白定量，调整蛋白浓度为2mg/ml。
实验例2重组亚单位疫苗免疫原性研究
2.1选取4-5周龄SPF级BALB/c小鼠，将其随机分组15只/组，皮下注射组首次免疫将2mg/ml的重组蛋白与弗式完全佐剂等体积研磨成水包油悬滴，第2、3次加强免疫将2mg/ml的重组蛋白与弗式不完全佐剂等体积研磨，在小鼠背部、腹股沟等进行多点皮下注射100ul/只(蛋白抗原100ul)；滴鼻免疫组进行滴鼻100ul/只蛋白抗原；同时设置PBS阴性对照，免疫程序为：0d、7d和21d。
2.2在首次免疫前及首次免疫后7，21，35d断尾采血，室温静置2h后离心取血清(1:50)用间接ELISA法测定特异性IgG类抗体效价，并且在末次免疫后采集小鼠粪便(1:5)检测小鼠特异性SIgA类抗体。
2.3第三次免疫后14天，采血测血清中细胞因子IFN-γ，IL-4，和IL-10(Elabascience试剂盒)等表达水平，考察该重组蛋白诱导小鼠的免疫效果，确定最佳免疫途径，评价其安全性和免疫预防效果。
实验例3攻毒菌株准备
为解决小鼠对O157菌感染不敏感的问题，先用抗生素选择的方法使O157获得对链霉素的耐药性，链霉素的作用是抑制肠道的其它正常菌群，使O157在肠道 中成为优势菌群，有利于其感染。将耐链霉素的EHEC O157:H7菌接种于LB培养基，37℃振荡培养8h，离心后弃上清，再以无菌LB洗涤2次，最后以无菌LB液体重悬菌体，调整浓度为1.0×1010CFU/ml。
实验例4重组亚单位疫苗免疫保护效果研究
小鼠于末次免疫后14天进行攻毒实验，在攻毒前3天给予小鼠含有5g/L链霉素的无菌水溶液饮用，再以5×109CFU/只剂量的O157全菌液分两次，间隔6小时，经口灌入小鼠胃肠道，攻菌后密切观察小鼠的活动、摄食及精神状态的改变，15天观察期结束时计算小鼠的死亡率和排菌量，取病死小鼠的肠道组织、肝脏、脾脏和肾脏，及15天观察期结束后免疫组结肠进行病理切片观察。
实验例5小鼠粪便O157的培养鉴定
攻菌后小鼠粪便O157的培养鉴定：取小鼠攻毒后3、5、7、9、11、13、15d粪便数粒，用LB培养基悬浮、振碎后置4℃冰箱1h后，涂布于麦康凯琼脂(SMAC)选择性培养基平板，以100mg/CFU≤100视为排菌结束。
6.统计学方法：采用SPSS21.0进行单向方差分析LSD统计方法和两独立样本的t检验，以P<0.05为统计学有差异，采用GraphPad Prism5进行作图。
结果：动物实验结果表明，重组蛋白第一次免疫小鼠后，皮下注射和滴鼻均可以诱导特异性IgG抗体(*p<0.05)且两免疫组无统计学差异，第二次免疫后滴鼻组的特异性IgG抗体高于皮下注射组(*p<0.05)，滴鼻组在第三次免疫后，特异性IgG抗体达到高峰，且明显高于皮下注射组(**p<0.001)。两个免疫组在粪便均可检测到特异性SIgA类抗体，抗体水平高于对照组(皮下注射*p<0.05，滴鼻**p<0.001)，且滴鼻组高于皮下注射组(*p<0.05)。末次免疫后14d，滴鼻免疫可提高IL-4的表达水平(*p<0.05)，皮下注射组IL-4表达水平与PBS对照无统计学差异；而滴鼻组和皮下注射组两个免疫组却均可提高IL-10和INF-γ的表达水平(*p<0.05)，而且两免疫组之间并我统计学差异。
对小鼠攻毒后进行15天观察，在观察期内，PBS对照组存活率为10％，滴鼻组存活率为90％，皮下注射免疫组存活率为50％，在存活小鼠中进行O157排菌量的监测，结果显示滴鼻组排菌量基本均少于皮下注射组(*p<0.05)，且在第11天滴鼻组O157排菌结束，皮下注射组有1只在15天观察期内尚未结束排菌。未免疫接种的小鼠攻毒后状态萎靡，行动迟缓，在攻毒后3天基本出现大部分死亡，病理切片显示，肠道组织出现不同程度损伤，以结肠最为严重，可观察到肠道溃疡形成；肝脏可观察到肝小叶中央静脉轻度扩张充血，少量肝细胞水肿变性，肝实质内少量炎症细胞浸润；脾脏中脾血窦扩张，重度淤血，脾小梁动脉壁玻璃样变；肾脏出现部分肾近曲小管上皮水肿变性，间质毛细血管充血，少量炎症细胞浸润。取免疫后小鼠结肠病理切片可观察，结肠的损伤明显减轻，可见部分炎症细胞。
综合，espA-Tir-M重组蛋白滴鼻免疫小鼠产生可诱导产生特异性抗体和细胞因子，用具有链霉素抗性的O157菌攻毒，经加强免疫的小鼠攻毒后可减少O157 在肠道内的定植量，保护率可达90％，而espA-Tir-M重组蛋白皮下注射免疫效果较差，保护率为50％，可能改重组蛋白不适合用弗氏佐剂作为免疫佐剂。表明重组蛋白滴鼻免疫可对小鼠产生良好的免疫保护效果，可作为预防EHEC O157:H7感染的候选疫苗。
以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何形式上和实质上的限制，凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用以上所揭示的技术内容，而作出的些许改动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对以上实施例所作的任何等同变化的改动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。

Claims (7)

1.一种EHEC O157:H7espA-Tir-M双抗原片段的融合基因，其序列如SEQ IDNo.1所示。
2.一种重组蛋白，其由权利要求1所述的融合基因编码。
3.一种用于权利要求1所述的融合基因的引物组合物，其由四条引物组成
espA-P1:5′-CGGAATTCATGGATACATCAAATGCA(SEQ ID No.2)，
espA-P2:5′-GCTACCTCCTCCACTTCCGCCTCCTTTACCAAGGGATATTGCTG(SEQ ID No.3)；
Tir-M上游引物引入linker，下游引物引入酶切位点Hind III，Tir-M-P1:5′-GGAGGCGGAAGTGGAGGAGGTAGCAGCCCAACCACGACCGAC(SEQ ID No.4)，
Tir M-P2:5′-CCCAAGCTTGGCTTGCTGTTTGGCCTCTT(SEQ ID No.5)。
4.如权利要求2所述的重组蛋白的制备方法，该方法包括以下步骤：
(1)通过重叠延伸PCR法制备espA-Tir-M双链融合基因，其序列为SEQ IDNo.1；
(2)将步骤(1)得到espA-Tir-M双链融合基因和质粒pet-28a(+)分别用EcoR I和Hind III进行双酶切后，用T4连接酶连接，得到连接产物；
(3)将步骤(2)连接产物转化到DH5α感受态中，鉴定含有pet-28a(+)-EspA-Tir-M重组质粒的重组DH5α菌株，得到重组质粒；
(4)将步骤(3)重组质粒导入BL21(DE3)感受态，得到重组菌株BL21-pet-28a(+)-EspA-Tir-M；
(5)诱导步骤(4)重组菌株BL21-pet-28a(+)-EspA-Tir-M表达和纯化重组融合蛋白espA-Tir-M(et)。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其中，步骤(1)中PCR所用的引物组如权利要求3所示。
6.一种重组亚单位疫苗，其中包含权利要求2所述的重组蛋白。
7.权利要求2所述的重组蛋白或者权利要求6所述的重组亚单位疫苗在预防EHEC O157:H7感染的疫苗或者药品中的用途。
CN201610280481.5A 2016-04-29 2016-04-29 一种双抗原重组蛋白及其制备方法和应用 Pending CN105821065A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610280481.5A CN105821065A (zh) 2016-04-29 2016-04-29 一种双抗原重组蛋白及其制备方法和应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610280481.5A CN105821065A (zh) 2016-04-29 2016-04-29 一种双抗原重组蛋白及其制备方法和应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN105821065A true CN105821065A (zh) 2016-08-03

Family

ID=56527931

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201610280481.5A Pending CN105821065A (zh) 2016-04-29 2016-04-29 一种双抗原重组蛋白及其制备方法和应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN105821065A (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2020240268A1 (en) * 2019-05-31 2020-12-03 Universidad De Chile An immunogenic formulation that induces protection against shiga toxin-producing escherichia coli (stec)

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002079240A2 (en) * 2001-03-29 2002-10-10 Imperial College Innovations Limited Intimins for the prevention or treatment of infections: i
US20030166841A1 (en) * 1997-03-21 2003-09-04 Kaper James B. Escherichia coli secreted protein b
WO2004050119A1 (en) * 2002-11-29 2004-06-17 Imperial College Innovations Limited Vaccine against enteropathogenic and enterohaemorragic escherichia coli
CN1748791A (zh) * 2005-08-08 2006-03-22 中国人民解放军第三军医大学 人和牲畜预防用出血性大肠杆菌o157：h7疫苗及制备方法
CN1922324A (zh) * 2003-10-31 2007-02-28 不列颠哥伦比亚大学 细菌毒力因子及其用途
CN101062410A (zh) * 2007-02-05 2007-10-31 中国人民解放军第三军医大学 一种肠出血性大肠杆菌o157:h7基因工程疫苗及其制备方法
CN101289508A (zh) * 2006-12-27 2008-10-22 中国人民解放军第三军医大学 抗肠出血性大肠杆菌o157：h7a/e损伤形成的单克隆抗体

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030166841A1 (en) * 1997-03-21 2003-09-04 Kaper James B. Escherichia coli secreted protein b
WO2002079240A2 (en) * 2001-03-29 2002-10-10 Imperial College Innovations Limited Intimins for the prevention or treatment of infections: i
WO2004050119A1 (en) * 2002-11-29 2004-06-17 Imperial College Innovations Limited Vaccine against enteropathogenic and enterohaemorragic escherichia coli
CN1922324A (zh) * 2003-10-31 2007-02-28 不列颠哥伦比亚大学 细菌毒力因子及其用途
CN1748791A (zh) * 2005-08-08 2006-03-22 中国人民解放军第三军医大学 人和牲畜预防用出血性大肠杆菌o157：h7疫苗及制备方法
CN101289508A (zh) * 2006-12-27 2008-10-22 中国人民解放军第三军医大学 抗肠出血性大肠杆菌o157：h7a/e损伤形成的单克隆抗体
CN101062410A (zh) * 2007-02-05 2007-10-31 中国人民解放军第三军医大学 一种肠出血性大肠杆菌o157:h7基因工程疫苗及其制备方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
第3-4期: "Decreased shedding of Escherichia coli O157:H7 by cattle following vaccination with type Ⅲ secreted proteins", 《VACCINE》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2020240268A1 (en) * 2019-05-31 2020-12-03 Universidad De Chile An immunogenic formulation that induces protection against shiga toxin-producing escherichia coli (stec)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP5327873B2 (ja) リコンビナントヘリコバクターピロリの経口ワクチン及びその調製方法
CN104877019B (zh) 鲍曼不动杆菌假定蛋白a1s_1523的蛋白及制备方法和应用
Heidary et al. Colonization and investigation of vibrio cholera recombination protein in e-coli
Lee et al. Artificially designed recombinant protein composed of multiple epitopes of foot-and-mouth disease virus as a vaccine candidate
CN104861049B (zh) 鲍曼不动杆菌1a1s_1969重组蛋白及其制备方法和应用
CN102058881B (zh) 预防肠道病毒71型感染的基因重组疫苗及其制备方法
CN104861050B (zh) 鲍曼不动杆菌锌依赖寡肽a1s_1610蛋白及其制备方法和应用
CN108956985B (zh) 一种检测新型鹅星状病毒抗体的间接elisa检测试剂盒及应用
CN108330142B (zh) 一种具有免疫保护作用的美人鱼发光杆菌溶血素Hlych蛋白
CN111621506B (zh) 牛支原体分泌蛋白MbovP0145及其应用
CN107446872A (zh) 一种组成型表达兔病毒性出血症病毒vp60蛋白的重组乳酸菌疫苗株及其制备方法和用途
CN103243105B (zh) 一种旋毛虫重组蛋白及应用
CN105821065A (zh) 一种双抗原重组蛋白及其制备方法和应用
KR101635673B1 (ko) Ａ형 간염 바이러스 백신 소재 단백질 ｖｐ1-3ｎ 및 백신 조성물
CN104479028B (zh) 牛轮状病毒vp8*亚单位重组嵌合蛋白及其应用
CN108840913B (zh) 一种胸膜肺炎放线杆菌免疫保护性抗原蛋白apjl_0922及其应用
CN106397546B (zh) 一种o型口蹄疫病毒人工重组抗原及其制备与应用
CN106177934B (zh) 一种副猪嗜血杆菌亚单位疫苗及其制备方法
CN104861048B (zh) 鲍曼不动杆菌假定蛋白a1s_1462蛋白及制备方法和应用
CN101781632A (zh) 马耳它布氏杆菌bp26基因缺失M5-90疫苗株
CN101319011A (zh) 多型别hcv-e1表位复合免疫原及其编码基因与应用
CN1748791B (zh) EspA人和牲畜预防用出血性大肠杆菌O157:H7疫苗及制备方法
Cao et al. Construction and evaluation of a novel Bacillus subtilis spores-based enterovirus 71 vaccine
Xue et al. Expression of Helicobacter pylori AlpA protein and its immunogenicity
Lublin et al. Protection against avian coronavirus conferred by oral vaccination with live bacteria secreting LTB-fused viral proteins

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination