CN1544633A

CN1544633A - 一种植物耐低钾基因及其编码蛋白与应用

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Publication number: CN1544633A
Application number: CNA2003101151744A
Authority: CN
Inventors: 武维华; 徐江; 赵淑清; 林春; 杨小贺
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2003-11-25
Filing date: 2003-11-25
Publication date: 2004-11-10
Anticipated expiration: 2023-11-25
Also published as: CN1239705C

Abstract

本发明公开了一种植物耐低钾基因及其编码蛋白与应用。本发明所提供的植物耐低钾基因，是下列核苷酸序列之一：1)序列表中SEQ ID №：1的DNA序列；2)编码序列表中SEQ ID №：2蛋白质序列的多核苷酸；3)与序列表中SEQID №：1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。植物耐低钾基因的编码蛋白，是具有序列表中SEQ ID №：2氨基酸残基序列的蛋白质，或者是将SEQ ID №：2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与SEQ ID №：2的氨基酸残基序列相同活性的由SEQ ID №：2衍生的蛋白质。本发明的基因可用于培育耐低钾的植物新品种。

Description

一种植物耐低钾基因及其编码蛋白与应用

技术领域

本发明涉及植物生物工程领域中一种耐低钾基因及其编码蛋白与应用，特别涉及拟南芥的一种耐低钾基因及其编码蛋白与应用。

背景技术

钾作为植物的必需营养元素在植物的生长和发育中起着至关重要的作用，它不仅参与植物的许多生理、生化代谢过程，还通过调控光合作用、呼吸作用、物质迁移和许多酶系统的功能而对植物的生长发育、产量形成、抗逆能力等产生重要影响。

目前，随着世界范围内的人口不断增长和耕地面积的逐渐减少，迫切需要人们通过提高作物单产的方式来增加粮食产量。而要解决这一问题，我国面临的一个严峻的形势是大部分耕地土壤缺钾且钾肥资源极其匮乏，这已成为限制我国农作物生产发展的重要因素。尽管提高钾肥施用量可以大幅度地提高作物产量，但大量进口钾肥无论从经济上还是从长远的战略意义上考虑，都有一定的局限性。

解决农业生产中钾肥短缺的另一条途径是提高农作物自身在低钾水平下吸收利用钾素的效率。利用遗传工程的手段有可能将调控钾高效吸收利用的基因转入农作物中，使农作物能在低钾的土壤中正常生长发育，从而极大地减少钾肥需求量，降低生产成本。

拟南芥是一种典型的双子叶模式植物，其作用与动物实验中的实验鼠、果蝇、线虫等相当，已被广泛用于植物遗传学、发育生物学和分子生物学的研究。拟南芥(Arabidopsis thaliana)以其个体小、生长周期短、遗传背景简单清楚、易被诱变等特点已成为植物科学研究的模式材料。拟南芥的大多数基因在其它植物中都能找到，利用拟南芥作为模式植物的发现能够被应用于其它植物研究以及帮助科学家培育新的作物品种、找到提高农作物产量的方法。

拟南芥共有约1.3亿个碱基对，2.9万个基因。目前大部分基因的功能还不清楚，利用突变技术研究基因功能已成为一种有效方法。通过对突变体的研究，可以较为方便地获得一些有重要应用价值的植物功能基因。

发明创造内容

本发明的目的是提供一种植物耐低钾基因及其编码蛋白。

本发明所提供的植物耐低钾基因，名称为AtLKT1(Arabidopsis thalianaLow-K⁺ Tolerant)，来源于Landsberg生态型拟南芥，是下列核苷酸序列之一：

1)序列表中SEQ ID №：1的DNA序列；

2)编码序列表中SEQ ID №：2蛋白质序列的多核苷酸；

3)与序列表中SEQ ID №：1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。

序列表1中的DNA序列由3255个碱基组成，如图1所示，其中大写字母部分表示由15个外显子构成的长1449bp的开放读码框；小写字母部分表示14个内含子的序列。

植物耐低钾基因AtLKT1的编码蛋白AtLKT1，是具有序列表中SEQ ID №：2氨基酸残基序列的蛋白质，或者是将SEQ ID №：2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与SEQ ID №：2的氨基酸残基序列相同活性的由SEQ ID №：2衍生的蛋白质。

序列表中序列2氨基酸残基序列是由482个氨基酸残基组成的蛋白质。

含有本发明基因的表达载体及细胞系均属于本发明的保护范围。

扩增AtLKT1中任一片段的引物对也在本发明的保护范围之内，其中，上游引物和下游引物之间的距离在50到5000个碱基之间；该引物对中的每一个引物的长度为15到30个碱基。如，引物1：AACGCCTTCACGATCGAC(SEQ ID №：3)；引物2：CCACCAGTGACGAATTCCA(SEQ ID №：4)

利用某种可以引导外源基因在植物中表达的载体，将本发明所提供的AtLKT1基因导入植物细胞，或将AtLKT1基因过表达，植物就表现为耐低钾。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所使用的载体进行加工，如加入植物可选择性标记或具有抗性的抗生素标记物。被转化的植物宿主既可以是单子叶植物，也可以是双子叶植物。本发明的基因对培育耐低钾新品种具有重要意义。

下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。

附图说明

图1为AtLKT1的DNA序列

图2为AtLKT1的图位克隆(Map-Based Cloning)

图3为AtLKT1基因敲除突变体N536154的T-DNA插入验证结果

图4为AtLKT1基因敲除突变体N536154 T-DNA插入的Southern分析结果

图5为野生型Ler和突变体lkt1-1的Northern分析结果

图6为野生型和突变体在四种不同培养基上处理4天的表型观察结果

图7为野生型和突变体在四种不同培养基上处理10天的表型观察结果

图8为目的基因过表达植株在四种不同培养基上处理6天的表型观察结果

图9为pBIB物理图谱

具体实施方式

实施例1、AtLKT1基因的图位克隆(Map-Based Cloning)

(1)Ler背景的拟南芥突变体lkt1-1的获得

拟南芥突变体lkt1-1是自行筛选获得的表现耐低钾性状的突变体。将野生型拟南芥(Landsberg生态型)种子经EMS(Ethyl Methane Sulfonate)诱变后种植获得后代(M₂代)，在低钾(70μM-100μMK⁺)培养基上筛选M₂代幼苗(注：在此低钾条件下，野生型植株的生长被抑制，典型的可观察性状或表型为幼苗根的向地性生长被完全抑制。实验中采用将培养皿垂直倒置的方法，因此在低钾条件下表现为根的向地性弯曲生长被完全抑制)；将在低钾条件下M₂代幼苗中其根仍能正常生长(表现为根的向地性弯曲生长)的株系选出并种植、获得后代(M₃代)，对M₃代再在低钾条件下检测性状，将仍然稳定表现上述耐低钾性状的株系选出进行遗传分析(与野生型回交、获得F₂代后对F₂代的耐低钾性状进行检测)；将回交F2代中耐低钾与不耐低钾性状的分离比符合经典遗传定律(即1∶3或3∶1)的突变株系选出作为进一步基因克隆的材料。本发明所采用的拟南芥突变体lkt1-1即是通过上述方法筛选获得的耐低钾突变体之一。拟南芥lkt1-1突变体表现出在低钾胁迫下根仍能继续生长(表现为根的向地性弯曲生长)，且其耐低钾性状可稳定遗传；而在相同的低钾条件下野生型幼苗的根生长则被完全抑制。

(2)AtLKT1基因的图位克隆

首先将Ler背景的拟南芥突变体lkt1-1与Col(Columbia生态型拟南芥)野生型杂交得到F₁代，F₁代自交得到F₂代，挑选在低钾培养基上幼苗根仍能继续生长(表现为根的向地性弯曲生长)的F₂代个体构建成作图群体。具体过程如图2所示，用拟南芥遗传图谱中的已知分子标记将突变基因定位在第一染色体的两个标记(nga392和S0392)之间；然后用TAIR数据库所给信息设计新的SSLP和CAPS标记，将突变基因精细定位到BAC克隆F12P21的一个42kb的区段内。经过对这一区域内的候选基因进行测序，确定了突变发生在基因AT1G30270(AT1G30270为在所有与拟南芥相关的基因数据库—如NCBI，GeneBak，TAIR等---中使用的统一编号，是在拟南芥全基因组序列测定完成之后根据碱基序列分析而推测的基因序列。AT1G30270编码一个名称为CIPK23的蛋白，在拟南芥中共有20余种CIPK，CIPK23是其中一种。而目前还没有任何关于CIPK23功能的研究报道。本发明所述的AtLKT1基因即是数据库中编号为AT1G30270的基因或CIPK23基因)。lkt1-1突变体的AtLKT1基因发生一个由C到T的碱基置换(1317位)使AtLKT1蛋白中的一个丙氨酸(199位)变为缬氨酸。AtLKT1基因由测序该区段内的lkt1-1和Ler的所有候选基因得到(序列表中的SEQ ID №：1)，其编码的蛋白质如序列表中的SEQ ID №：2。图2中，A为AtLKT1的物理图谱定位，遗传图谱定位将AtLKT1定位在BAC克隆F12P21的一段区域内；B为AtLKT1基因的结构和lkt1-1的突变位点，所有位置是相对于起始密码子而言，实心框表示外显子，框间连线表示内含子。

实施例2、AtLKT1基因敲除突变体N536154的T-DNA插入验证

(1)AtLKT1基因敲除突变体(Salk_036154或N536154)的获得

根据TAIR网站(http：//www.arabidopsis.org)的信息检索知ABRC(Arabidopsis Biological Resource Center)现有的拟南芥T-DNA插入突变体库中有一编号为Salk_036154的T-DNA插入突变体(该突变体的NASC编号为N536154)，其T-DNA插入在AtLKT1基因或编号为AT1G30270的基因编码区域。自ABRC订购该突变体的T₃代种子，检测并鉴定获得纯合的AtLKT1基因或AT1G30270基因被敲除的突变体。

(2)AtLKT1基因敲除突变体N536154的T-DNA插入验证

分别将野生型Col、N536154和lkt1-1的种子经消毒、春化处理后，在MS培养基上、光照培养箱中进行连续光照培养，待幼苗生长4天后分别同时移入MS(含20mM K⁺、3mM Ca²⁺)、低钾MS(含K⁺80μM，Ca²⁺3mM)、低钙MS(含20mMK⁺、100μM Ca²⁺)、及低钾低钙MS(含80μM K⁺、100μM Ca²⁺)固体培养基上，将培养皿垂直倒置继续在光照培养箱中生长并连续观察其生长状况，每皿中4种材料(位置如图6右侧所示)，每种材料五株，待生长4天后进行拍照并进行PCR检测。分别以CTAB法提取的野生型Col和N536154的基因组DNA为模板，按照常规方法进行PCR扩增。然后将PCR扩增产物在0.8％琼脂糖凝胶电泳中进行检测。结果如图6和图3所示，图6表明目的基因AtLKT1的基因敲除(T-DNA插入)突变体植株N536154在低钾(含K⁺80μM)条件下表现与lkt1-1完全一致的突变表型(低钾条件下主根的生长性弯曲，见图6B)；图3的PCR检测显示这些具有突变表型的植株都是T-DNA纯合插入的个体。由此判断lkt1-1突变体中AtLKT1基因发生的一个碱基突变造成了AtLKT1基因的功能缺失。图3中箭头指示电泳方向，M为2kb DNA分子量标准；C为Col的扩增产物；中间10个泳道为N536154 T-DNA纯合插入个体的扩增产物。

实施例3、AtLKT1基因敲除突变体N536154 T-DNA插入的Southern分析

用CTAB法提取野生型和突变体N536154的基因组DNA。取1μg基因组DNA，分别用BamHI、EcoRI和HindIII酶切。酶切产物经0.8％琼脂糖凝胶电泳(40V)分离，然后用常规方法在摇床上处理电泳凝胶：经0.25M HCl浸洗15分钟，变性液(1.5M NaCl，0.5M NaOH)浸洗30分钟，中和液(1.5M NaCl，0.5M Tris-HCl，pH 7.2)浸洗30分钟。最后用10×SSC将DNA印迹到HybondN⁺尼龙膜上。

探针标记按Amersham Biosciences的Rediprime^TM II Random Prime LabellingSystem试剂盒说明进行。

预杂交与杂交：将2×SSC预湿的杂交膜放入杂交管中，带有DNA片段的一面向里，加入15ml预热到65℃的Church缓冲液(含0.25M Na₂HPO₄-NaH₂PO₄(pH7.2)，1mM EDTA，7％(w/v)SDS，1％(w/v)BSA)65℃预杂交约半小时，加入变性好的探针，于65℃杂交16小时。

洗膜：杂交结束后，分别用2×SSC+0.5％(w/v)SDS，1×SSC+0.5％(w/v)SDS，0.5×SSC+0.5％(w/v)SDS和0.1×SSC+0.1％(w/v)SDS在65℃下洗膜，每次15分钟，并不断用检测器检测信号。

放射自显影：膜洗完后用保鲜膜包好，放入暗盒，夹入X光片(Kodak产品)后-80℃放射自显影，1-2天后进行显影和定影。

结果如图4所示，三种内切酶的Southern杂交结果都显示基因敲除突变体的T-DNA插入为单拷贝。说明突变体的突变性状是由目的基因AtLKT1突变造成的。图4中1、2、3分别为Col基因组DNA经BamHI、EcoRI和HindIII酶切后的杂交对照；4、5、6分别是N536154基因组DNA经BamHI、EcoRI和HindIII酶切后与线形T-DNA片段杂交得到的单一条带。

实施例4、野生型和突变体lkt1-1的Northern分析

在1/2MS中摇培8天的Ler与lkt1-1幼苗，分别移到低钾(含K⁺80μM，Ca²⁺3mM)1/2MS、低钙(含K⁺20mM，Ca²⁺10μM)1/2 MS或低钾、低钙(含K⁺80μM，Ca²⁺10μM)1/2MS液体培养基中处理3-12小时后取出用于总RNA提取；若需分根、冠，则取出后从胚芽鞘处剪开，分别取100-200mg的根、冠材料提取总RNA。总RNA的提取按Invitrogen TRIzol Reagent的产品说明书进行。RNA经1.0％琼脂糖凝胶电泳检查完整性后，用紫外分光光度计和电泳方法相结合作精确定量。然后进行如下操作：(1)配制1.2％(w/v)琼脂糖的甲醛变性凝胶：1.2g琼脂糖，10ml 10×MOPS缓冲液，75ml DEPC-H2O，加热融化后冷却至50-60℃时加入15ml甲醛；混匀后灌胶；凝胶室温放置约1小时后放入1×MOPS电泳缓冲液中，上样前预电泳30分钟(60V)，(2)RNA样品处理：10-30μg总RNA，加2倍体积(v/v)的RNA loading buffer，混匀后65℃加热5-10分钟，置于冰上3-5分钟；(3)电泳：在1×MOPS电泳缓冲液中进行电泳分离；电压10V/cm，电泳至溴酚兰距边缘约2cm处停止，约需2小时；(4)凝胶扫描及浸泡：紫外灯下扫胶，然后切去多余的边缘胶条；用250m1 10×SSC浸泡凝胶两次以洗去甲醛，每次20分钟，浸泡完毕可直接转膜。(5)转膜、预杂交、杂交及其后步骤同Southern杂交。

以AtLKT1基因的cDNA全长产物为模板，引物序列为：引物1：AACGCCTTCACGATCGAC(SEQ ID №：3)；引物2：CCACCAGTGACGAATTCCA(SEQ ID№：4)，PCR扩增出长度为327bp的AtLKT1基因特异cDNA片段作为探针。结果如图5所示，A表明AtLKT1基因的表达受低钾胁迫的诱导，突变体lkt1-1与野生型在转录水平上的表达没有差异；B表明AtLKT1主要在根中表达并受低钾或低钙的诱导，突变体与野生型在根和冠的表达趋势上是一致的。由Northern杂交结果推测突变体与野生型的表型差异是由AtLKT1蛋白水平的差异造成的。图5中，A为在MS培养基上生长8天的幼苗移入不同K⁺浓度的1/2MS溶液中，处理不同时间后取样提取RNA。rRNA的变性凝胶电泳图谱用作mRNA上样量的对照；杂交探针为目的基因AtLKT1的特异片段；B为植物材料经不同K⁺、Ca²⁺浓度的1/2MS溶液处理12小时后，分根、冠提取RNA做杂交分析，四种处理用1/2 MS溶液分别为：MS为(含K⁺20mM，Ca²⁺3mM)；LK为低钾MS(含K⁺ 80μM，Ca²⁺ 3mM)；LCa为低钙MS(含K⁺ 20mM，Ca²⁺ 10μM)；LKLCa为低钾、低钙MS(含K⁺ 80μM，Ca²⁺10μM)。R为根组织；S为地上部分组织。

实施例5、野生型和突变体在四种不同培养基上处理不同时间的表型观察

将两种野生型(Ler与Col)和突变体lkt1-1、N536154的种子经消毒、春化处理后，放入光照培养箱中进行连续光照培养，待幼苗生长4天后分别同时移入MS、低钾MS、低钙MS及低钾、低钙MS固体培养基上，然后将培养皿垂直放置，使幼苗倒置继续放入光照培养箱中生长并连续观察其生长状况，每皿中4种材料(位置如图6和图7右侧所示)，每种材料五株。分别处理4天和10天后拍照。

(1)野生型和突变体在四种不同培养基上处理4天的表型观察

生长4天后的拍照结果如图6所示，表明：移苗后在22℃下连续光照培养4天，Ler、Col、lkt1-1与N536154植株在MS培养基上生长无明显差异，根正常生长，发生向重力性弯曲(A)；在低钙MS上Ler、Col与lkt1-1、N536154植株根冠尚能生长但生长速度减缓(C)；在低钾培养基上Ler与Col的生长明显受到抑制，根系不再发生生长弯曲；而lkt1-1与N536154植株的根系则继续发生向重力性弯曲生长(B)；在低钾、低钙培养基上则生长进一步受到抑制，lkt1-1和N536154的根系也不再发生明显的弯曲，接近野生型的表型(D)。表明在处理4天时，突变体和野生型只在低钾培养基上表现明显的差异，突变体的根系在低钾胁迫下能继续生长，而野生型的根生长则受低钾胁迫的抑制。图6中，A为MS(含K⁺ 20mM，Ca²⁺3mM)，B为低钾MS(含K⁺ 80μM，Ca²⁺ 3mM)，C为低钙MS(含K⁺ 20mM，Ca²⁺ 100μM)，D为低钾、低钙MS(含K⁺ 80μM，Ca²⁺ 100μM)。

(2)野生型和突变体在四种不同培养基上处理10天的表型观察

继续观察Ler、Col、lkt1-1和N536154在四种培养基上的生长性状，处理10天后拍照的结果如图7所示，表明这四种拟南芥植株在MS上均可继续快速生长，叶片翠绿，延伸肥大；根系继续伸长(A)；在低钙MS培养基上，四种拟南芥植株的叶片肥厚，呈深绿色；在低钙MS培养基上生长一周后四种植株的主根伸长不明显而代之以大量生长的侧根(C)；在低钾MS培养基上，野生型Ler和Col的主根生长继续受到抑制而仅长出部分短的侧根，叶片生长延伸缓慢，而与它们对应的突变体lkt1-1和N536154主根则可继续伸长，而子叶则逐渐表现出缺钾的失绿症状，而且这种缺钾症状在N536154中表现得比lkt1-1更为快速明显，在低钾MS上生长10天后N536154不仅子叶失绿，而且部分真叶也开始出现缺钾失绿状态(B)，推测这可能与两种突变体的遗传背景不同有关，因为N536154相应的野生型Col在低钾中生长10天后也开始表现出子叶缺绿的症状，而与lkt1-1对应的野生型Ler子叶则大多仍维持绿色，也就是说Col背景的拟南芥比Ler对低钾更加敏感；在低钾、低钙MS培养基中生长10天后，除lkt1-1的主根缓慢生长而略有伸长以外，N536154与两种野生型相似主根的生长明显受到抑制；并且四种拟南芥都或多或少地长出一些短的侧根；而叶片生长则较在低钾下表现出更明显的失绿症状，其中对低钾最不敏感的Ler也开始出现子叶失绿而对低钾最敏感的N536154则真叶已部分或全部地表现失绿(D)。图7中，A为MS(含K⁺ 20mM，Ca²⁺ 3mM)，B为低钾MS(含K⁺80μM，Ca²⁺ 3mM)，C为低钙MS(含K⁺ 20mM，Ca²⁺100μM)，D为低钾、低钙MS(含K⁺ 80μM，Ca²⁺ 100μM)。

结果表明在处理10天时，突变体与野生型在低钾下不仅根系生长表现明显差异，而且冠部也开始出现生长差异。在低钾、低钙MS培养基上突变体与野生型的冠部生长差异表现的更为明显。

实施例6、目的基因过表达植株在不同培养基上处理6天的表型观察

(1)目的基因AtLKT1的cDNA全长的获得

自拟南芥幼苗提取总RNA、反转录为cDNA，以此cDNA为模板、利用分别设有XbaI和KpnI酶切位点的一对引物，PCR扩增出1449bp的目的基因cDNA全长。引物序列如下：

引物1：GCTCTAG ATGGCTTCTCGAACAACGCC(含XbaI酶切位点)

引物2：ATGGTACC TTATGTCGACTGTTTTGCAATTGTTCC(含KpnI酶切位点)

(2)目的基因过表达植株在不同培养基上处理6天的表型观察

将目的基因的cDNA全长回收后连接到pGEM-T载体上(购自Promega公司)，连接产物转化大肠杆菌感受态细胞DH5α；转化菌液经卡那霉素筛选、培养过夜后挑取单菌落，经PCR及酶切鉴定的阳性质粒，进一步做测序鉴定。选择序列正确的克隆质粒用XbaI和KpnI进行酶切，同时用这两种酶对过表达载体pBIB(该载体的物理图谱见图9)的质粒进行酶切；两种质粒的酶切片断分别进行切胶回收后用T4-DNA连接酶连接，连接产物再转化按常规方法制备的大肠杆菌感受态细胞，转化出的单菌落扩繁、提取质粒，经PCR、酶切鉴定后转化到按常规方法制备的根癌农杆菌的感受态细胞中并再做PCR鉴定。将转化得到的阳性农杆菌菌落经两次摇菌扩繁后用Floral dip法转化拟南芥。收获得到T₁代种子后经潮霉素筛选，挑出绿色的阳性转化植株在低钾培养基上进行表型观察。然后再将T₁代植株栽培得到T₂代后在四种培养基：A、MS(含K⁺ 20mM，Ca²⁺ 3mM)，B、低钾MS(含K⁺ 80μM，Ca²⁺3mM)，C、低钙MS(含K⁺ 20mM，Ca²⁺ 100μM)，D、低钾、低钙MS(含K⁺ 80μM，Ca²⁺ 100μM)上做进一步的验证：将在MS培养基上生长4天的幼苗分别移至上述4种培养基上，每皿中6种材料(位置如图8右侧所示)，每种材料五株。处理6天后拍照。结果如图8所示，表明将目的基因在突变体(N532341)和野生型(Ler和Col)中过表达后，后代植株在低钾培养基上均表型类似突变体的根弯曲性状；而在处理6天时，当对照N532341的叶片已开始出现明显的缺钾失绿症状时，其相应的过表达植株仍然维持绿色。尤其在低钾、低钙培养基上生长6天后，不仅三种过表达转化植株的叶色都与野生型Ler的叶色相近，表现较强的耐低钾特性；而且N532341过表达转化植株的主根在低钾、低钙的双重胁迫下仍能维持正常的生长。表明目的基因的过表达植株具有更强的耐低钾能力。

序列表

<160>4

<210>1

<211>3255

<212>DNA

<213>拟南芥属拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400>1

atggcttctc gaacaacgcc ttcacgatcg actccttcac gatcaacgcc ttctggtagt 60

tcttctggtg gtaggacacg agttggtaag tatgagcttg gacgaacttt gggtgaagga 120

actttcgcta aggtcaaatt cgctagaaat gttgagaatg gtgataatgt cgctattaag 180

gttattgata aagagaaagt tctgaaaaat aagatgatcg ctcaggtatg tattatacaa 240

ttctccagct gctgtgttct tattgggaat ctgatttacg cagttgtgat ataacctttg 300

attttggatt ttgtagatca agcgtgagat ttcgacgatg aaattgatca agcacccgaa 360

tgtcattcgt atgtttgagg tttgattctg atactataaa gctgaattca aagttgtgtt 420

gcacgttttg gttgttgttg ttgttctata gatttgtgct ataagctgag attcgtttga 480

agttatggaa catatttgtg gtccctggct aatcatatgt atgtaatata agggatttga 540

ttattctatg tatttttttg gtatctttgt agttacagat tctcttcttc ttcttcttct 600

tcttcttctt cttcttcttc ttcttcttct tcttcttctt cttcttcttc ttcttcttct 660

tcttcttctt cttcaggtga tggctagcaa aactaagatc tacttcgttt tggaattcgt 720

cactggtggg gagcttttcg ataaaattgt aagatttcat tgaaagatgt gttttttttt 780

tcttaatact atgtggaaat gagatcttaa ttctttagaa ttgtcatgta ttagtcaagc 840

aatgggagat tgaaggaaga tgaggcgagg aagtatttcc aacagctgat taatgcggtt 900

gattattgtc atagcagggg agtttatcat agagacctta aggttaggaa tcttactttg 960

tgatcctctt gcatagggtt tcttgtgaat caattggcat cagaataaaa gtttgatgtg 1020

tttgaatcat gttgcacatt ctggttgcag ccagaaaatt tgcttttgga tgctaatggt 1080

gctttgaaag tgtctgactt tggattgagc gctctacctc agcaagttcg agtgagcatc 1140

gagatattga tttctttttc tatcatttca ttgtaaatat catagttcga taattcagct 1200

actatggctt ctaaggagaa agatttccat gatttattca aaagctgatt ttgtgaccct 1260

ttttctttag gaggatgggt tacttcacac aacctgtgga acacccaatt atgttgctcc 1320

ggaggtatta gcaactgcta ctgaaaactg acacacaatt ttctcaaaac ttgaattcta 1380

ttattttcta gtctcagtaa ccttctatat tttctcccta ggtaatcaac aacaaaggtt 1440

atgatggagc gaaggctgat ttgtggtctt gtggagtaat tctctttgtt ttaatggctg 1500

gttatttacc ttttgaagat tctaacctga cgtcgttata taaaaaggta ttacgcttgc 1560

ctcttcttct tttgcttttc ttttgataca tatcatttta catgctatca gaaaggcttc 1620

aaggtctagg tgcatttggg tggctgtata aaagcctctg tcatttttgt atgagacgta 1680

tatagcataa aagccacctg attttctttc ttcataatta cagatattca aagcagaatt 1740

tacttgccct ccctggttct ctgcaagtgc taagaagtta atcaaaagaa ttctggatcc 1800

caatccagca acggtatatt tttcttaccc tattatataa tttatattag aggatctctc 1860

ctttgaagag gcaaaagctt ctataggatt gagtagatct gaaggcttac actgattttt 1920

tatattgggc agaggattac atttgctgag gtcattgaaa atgagtggtt taaaaaaggg 1980

tataaagcac ctaaatttga gaatgctgat gtcagccttg atgatgttga tgcaatcttt 2040

gatgactcag gggtaaggct agtgttcttt tgtttgtttt tttcggtact ttgtccggga 2100

tgattgctca gttgtttttg tttgttaata ggagtctaag aatcttgttg tggagaggcg 2160

agaagaagga ctcaaaacac cagtaacgat gaatgctttt gagctcatct cgacatccca 2220

gggtctcaat ctcggttcac ttttcgaaaa acaaatggta cagaagtctg atacgtaaag 2280

ctggtcttta aatttcgtcc cccaaggctc ttattttgtt gacaattttt aactatcttt 2340

ttgcggtttt ggtcaaacct aataagaagt agctttgcca caaaatttta gtgaccaata 2400

cttttctttg gaagcccgta cttagtttga tagaagtcgt cattctgatt gataagcttc 2460

tctgatttca ggggctggtg aaacgaaaaa ctcgatttac ttccaaatct tcggctaatg 2520

agatagttac aaaaattgag gctgcggcag cacctatggg gtttgatgtc aagacaaata 2580

actacaaggt tagaatactg ttacgtattt acccaatgct gtggagttgt gtattggttt 2640

gttgcttctg aatagaccct ttaaccattt ctcaactcct tcagatgaag ctgacaggag 2700

agaaatcagg ccgcaagggt cagttggcag ttgccactga ggttagcttt cacaatgacc 2760

agtgatcacc ctttgtatgg ttggctgaac ctaatttaag ttaattgaca tctaccttca 2820

ggtttttcaa gttgctccat ctctttacat ggttgaaatg cgaaaatcag ggggtgacac 2880

attggaattc cacaaggtat gcaagggtta ttaatgctga tcaggttgta tcaaacccga 2940

gcttgtcaaa tggtcttcca gtaactgatg tttgaatctt tacctttttg catcctttct 3000

tgctcttctt ttagttttac aagaacctta ccacgggact taaggacatt gtttggaaaa 3060

ccatcgacga agagaaagag gaaggaaccg atggtggtaa gtatctgcct tgaatactct 3120

gttttttaga taaagctcct agaaaaggag aaactaacga aacatgtaaa cacaaatcct 3180

gttttgtttc ttcatgtttc aggtggtact aatggtgcca tggctaaccg gacaattgca 3240

aaacagtcga cataa 3255

<210>2

<211>482

<212>PRT

<213>拟南芥属拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400>2

Met Ala Ser Arg Thr Thr Pro Ser Arg Ser Thr Pro Ser Arg Ser Thr

1 5 10 15

Pro Ser Gly Ser Ser Ser Gly Gly Arg Thr Arg Val Gly Lys Tyr Glu

20 25 30

Leu Gly Arg Thr Leu Gly Glu Gly Thr Phe Ala Lys Val Lys Phe Ala

35 40 45

Arg Asn Val Glu Asn Gly Asp Asn Val Ala Ile Lys Val Ile Asp Lys

50 55 60

Glu Lys Val Leu Lys Asn Lys Met Ile Ala Gln Ile Lys Arg Glu Ile

65 70 75 80

Ser Thr Met Lys Leu Ile Lys His Pro Asn Val Ile Arg Met Phe Glu

85 90 95

Val Met Ala Ser Lys Thr Lys Ile Tyr Phe Val Leu Glu Phe Val Thr

100 105 110

Gly Gly Glu Leu Phe Asp Lys Ile Ser Ser Asn Gly Arg Leu Lys Glu

115 120 125

Asp Glu Ala Arg Lys Tyr Phe Gln Gln Leu Ile Asn Ala Val Asp Tyr

130 135 140

Cys His Ser Arg Gly Val Tyr His Arg Asp Leu Lys Pro Glu Asn Leu

145 150 155 160

Leu Leu Asp Ala Asn Gly Ala Leu Lys Val Ser Asp Phe Gly Leu Ser

165 170 175

Ala Leu Pro Gln Gln Val Arg Glu Asp Gly Leu Leu His Thr Thr Cys

180 185 190

Gly Thr Pro Asn Tyr Val Ala Pro Glu Val Ile Asn Asn Lys Gly Tyr

195 200 205

Asp Gly Ala Lys Ala Asp Leu Trp Ser Cys Gly Val Ile Leu Phe Val

210 215 220

Leu Met Ala Gly Tyr Leu Pro Phe Glu Asp Ser Asn Leu Thr Ser Leu

225 230 235 240

Tyr Lys Lys Ile Phe Lys Ala Glu Phe Thr Cys Pro Pro Trp Phe Ser

245 250 255

Ala Ser Ala Lys Lys Leu Ile Lys Arg Ile Leu Asp Pro Asn Pro Ala

260 265 270

Thr Arg Ile Thr Phe Ala Glu Val Ile Glu Asn Glu Trp Phe Lys Lys

275 280 285

Gly Tyr Lys Ala Pro Lys Phe Glu Asn Ala Asp Val Ser Leu Asp Asp

290 295 300

Val Asp Ala Ile Phe Asp Asp Ser Gly Glu Ser Lys Asn Leu Val Val

305 310 315 320

Glu Arg Arg Glu Glu Gly Leu Lys Thr Pro Val Thr Met Asn Ala Phe

325 330 335

Glu Leu Ile Ser Thr Ser Gln Gly Leu Asn Leu Gly Ser Leu Phe Glu

340 345 350

Lys Gln Met Gly Leu Val Lys Arg Lys Thr Arg Phe Thr Ser Lys Ser

355 360 365

Ser Ala Asn Glu Ile Val Thr Lys Ile Glu Ala Ala Ala Ala Pro Met

370 375 380

Gly Phe Asp Val Lys Thr Asn Asn Tyr Lys Met Lys Leu Thr Gly Glu

385 390 395 400

Lys Ser Gly Arg Lys Gly Gln Leu Ala Val Ala Thr Glu Val Phe Gln

405 410 415

Val Ala Pro Ser Leu Tyr Met Val Glu Met Arg Lys Ser Gly Gly Asp

420 425 430

Thr Leu Glu Phe His Lys Phe Tyr Lys Asn Leu Thr Thr Gly Leu Lys

435 440 445

Asp Ile Val Trp Lys Thr Ile Asp Glu Glu Lys Glu Glu Gly Thr Asp

450 455 460

G1y Gly Gly Thr Asn Gly Ala Met Ala Asn Arg Thr Ile Ala Lys Gln

465 470 475 480

Ser Thr

<210>3

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>3

aacgccttca cgatcgac 18

<210>4

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>4

ccaccagtga cgaattcca 19

Claims

1、一种植物耐低钾基因，是下列核苷酸序列之一：

1)序列表中SEQ ID №：1的DNA序列；

2)编码序列表中SEQ ID №：2蛋白质序列的多核苷酸；

2、根据权利要求1所述的基因，其特征在于：所述植物耐低钾基因是序列表中的SEQ ID №：1。

3、一种植物耐低钾基因的编码蛋白，是具有序列表中SEQ ID №：2氨基酸残基序列的蛋白质，或者是将SEQ ID №：2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与SEQ ID №：2的氨基酸残基序列相同活性的由SEQ ID№：2衍生的蛋白质。

4、根据权利要求3所述的蛋白质，其特征在于：所述植物耐低钾基因的编码蛋白是序列表中的SEQ ID №：2。

5、含有权利要求1所述基因的表达载体。

6、含有权利要求1所述基因的细胞系。

7、扩增权利要求1所述基因任一片段的引物对。

8、权利要求1所述基因在培育耐低钾植物品种中的应用。