CN110734483B

CN110734483B - 耐低钾相关蛋白TaPR1及其编码基因和应用

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Publication number: CN110734483B
Application number: CN201911117162.2A
Authority: CN
Inventors: 程西永; 毕惠惠; 许海霞; 刘晓丹; 张旭睿
Original assignee: Henan Agricultural University
Current assignee: Henan Agricultural University
Priority date: 2019-11-15
Filing date: 2019-11-15
Publication date: 2022-07-12
Anticipated expiration: 2039-11-15
Also published as: CN110734483A

Abstract

本发明公开了耐低钾相关蛋白TaPR1及其编码基因和应用，本发明提供的蛋白TaPR1为氨基酸序列是序列表中序列1所示的氨基酸序列的蛋白质，其编码基因为核苷酸序列是序列表中序列2的DNA，所述蛋白本发明提供的蛋白和基因为人为控制钾离子吸收相关基因的表达提供了基础，将在培育耐低钾和钾离子吸收增强的植物中发挥重要的作用。

Description

耐低钾相关蛋白TaPR1及其编码基因和应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种耐低钾相关蛋白TaPR1及其编码基因和应用。

背景技术

氮肥、磷肥和钾肥是作物生长的肥料三要素，自20世纪50年代中期开始，相继应用于我国农业生产中(沈善敏等，1998)，化学肥料的使用保障了我国粮食安全。随着对作物产量需求增加，我国土壤经历了由偏施氮磷肥造成的土壤钾元素亏缺，到现在转变为三种化学肥料均大量施用，虽然钾肥施用量不断提高，但作物从土壤中带走钾元素的量也在增加，土壤施用钾量依然不能维持土壤钾元素等营养元素的平衡，导致农田钾含量不平衡，这种养分间不平衡会降低肥料利用率，从而成为限制作物产量提高的因素(夏乐，2016；孙爱文等，2009；金继运，2005；孙海峰等，2018)。据中国农业科学院对我国土地情况的调查，我国土壤缺钾现象，正从南方向北方扩展，缺钾面积也逐年增大，缺钾已成为许多地区农作物增产的主要制约因素(王孝峰，2005)。我国作物的缺钾问题主要表现为土壤缺钾和钾肥资源缺乏(王毅，2009)，因此从改善植物自身的钾吸收和转运就显得非常重要。目前，植物钾吸收和转运机制研究已逐渐深入到细胞、分子水平，并与遗传学和遗传工程研究相结合，探索用生物技术来改进植物生长特性，其目的是提高植物对钾的吸收和转运能力。

小麦是世界上最重要的粮食作物之一。我国小麦产量占全部粮食作物产量的1/4，其中河南省是我国小麦种植大省，种植面积约占全国小麦种植面积的1/5，产量超过全国小麦产量的1/4(孟立慧，2018)。由于我国对农作物产量需求不断增加，土壤钾元素输出不断增加、偏施氮肥和磷肥等，导致我国耕地土壤缺钾严重(夏乐，2016；孙爱文等2009；孙海峰等，2018)，成为作物增产的限制因素，因此进行K⁺高效吸收的分子机理研究十分必要。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于：如何提高生物对于低钾环境的耐受能力，为了解决这一问题，本发明提供一种植物耐低钾相关蛋白TaPR1及其编码基因。

本发明提供的一种蛋白，来源于小麦属小麦(Triticum aestivum L.)，是如下(a)或(b)：

(a)氨基酸序列是序列表中序列1所示的氨基酸序列的蛋白质；

(b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加，与(a)所示的蛋白质具有90％以上的同一性且与钾离子吸收相关的蛋白质。

上述蛋白中，一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。

上述序列表中序列1的氨基酸残基序列由712个氨基酸残基组成。

所述蛋白质来源于小麦属小麦。

本发明还提供一种所述蛋白质相关的生物材料，为下述B1)至B9)中的任一种：

B1)编码权利要求1所述蛋白质的核酸分子；

B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；

B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体、或含有B2)所述表达盒的重组载体；

B4)含有B1)所述核酸分子的重组微生物、或含有B2)所述表达盒的重组微生物、或含有B3)所述重组载体的重组微生物；

B5)含有B1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有B2)所述表达盒的转基因植物细胞系；

B6)含有B1)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有B2)所述表达盒的转基因植物组织；

B7)含有B1)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有B2)所述表达盒的转基因植物器官；

B8)降低权利要求1所述蛋白质表达的核酸分子；

B9)含有B8)所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因植物细胞系。

其中，B1)所述核酸分子为如下b1)或b2)所示的所述蛋白质的编码基因：

b1)编码序列是序列表中序列2的第80-2218位核苷酸的cDNA分子或DNA分子；

b2)核苷酸是序列表中序列2的cDNA分子或DNA分子。

上述序列2由2400个核苷酸组成，开放阅读框架为自5′端第80至2218位。

上述重组表达载体为将上述基因插入P-Super1300中得到的重组载体，具体为将序列表的序列2自5'端第80-2218位(请提供引物扩增出来对应的位置)核苷酸所示的DNA片段插入P-Super1300的XbaI和SacI酶切识别位点之间得到的重组质粒。

扩增上述基因的全长或其任意片段的引物对也是本发明保护的范围。

本发明还提供一种生物耐低钾剂，其特征在于：所述生物耐低钾剂含有所述蛋白质、或/和所述生物材料。

所述蛋白质、或所述生物材料的下述P1-P5中的任一种应用：

P1、所述蛋白质、或所述生物材料在调控生物耐低钾性中的应用；

P2、所述蛋白质、或所述生物材料在制备提高生物耐低钾性的产品中的应用；

P3、所述蛋白质、或所述生物材料在培育耐低钾生物中的应用；

P4、所述蛋白质、或所述生物材料在制备生物耐低钾产品中的应用；

P5、所述蛋白质、或所述生物材料在植物育种中的应用。

其中，所述生物具体可为植物或微生物。所述植物可为单子叶植物或双子叶植物，所述微生物可为真菌。所述双子叶植物可为十字花科植物。所述真菌可为酵母。上述应用中，所述调控植物耐低钾具体为在低钾条件下提高植物钾离子吸收。

本发明还提供一种培育耐低钾植物的方法，包括提高目的植物中上述蛋白质或其编码基因的表达量，得到耐低钾植物。

所述目的植物为单子叶植物或双子叶植物。

所述耐低钾植物的钾离子吸收能力高于所述目的植物。

上述方法中，所述低钾为0.01mM K⁺。

上述提高植物钾离子吸收体现在提高根长和鲜重。

本发明的实验证明，本发明发现的基因TaPR1在低钾的诱导下表达，将TaPR1基因导入钾离子吸收突变体酵母菌株CY162中表达，发现TaPR1可以部分弥补CY162酵母菌株的生长缺陷，同时，在拟南芥hak5突变体中，TaPR1也可以减轻其对低钾的敏感性，这些结果表明TaPR1具有钾离子吸收的功能。另外将TaPR1基因导入拟南芥中得到的转基因拟南芥，其对低钾逆境的抗性高于野生型拟南芥，本发明提供的蛋白和基因为人为控制钾离子吸收相关基因的表达提供了基础，将在培育耐低钾和钾离子吸收增强的植物中发挥重要的作用。

附图说明

图1为TaPR1基因在小麦灌浆期不同组织的荧光定量PCR结果。图中，具有不同字母的处理间具有显著差异(P<0.05)。

图2为TaPR1基因响应钾缺乏胁迫(0.1mM K⁺)的实时荧光定量PCR结果。图中，具有不同字母的处理间具有显著差异(P<0.05)。

图3为TaPR1蛋白亚细胞定位的结果。

图4为TaPR1可以互补钾离子吸收缺陷型酵母的功能。

图5在hak5突变体拟南芥中表达TaPR1可以减轻其对低钾敏感的结果，其中，A为过表达TaPR1的hak5突变体在含有不同浓度K⁺的培养基上生长10d的表型，B为过表达TaPR1的hak5突变体在含有不同浓度K⁺的培养基上生长10d的鲜重，误差线表示3次测量的标准误差，C为过表达TaPR1的hak5突变体在含有不同浓度K⁺的培养基上生长10d的根长，误差线表示10次测量的标准误差。图中，具有不同字母的处理间具有显著差异(P<0.05)。

图6在野生型拟南芥中表达TaPR1可以减轻其对低钾敏感的结果。其中A为过表达TaPR1的野生型拟南芥在含有不同浓度K⁺的培养基上生长10d的表型，B为过表达TaPR1的野生型拟南芥在含有不同浓度K⁺的培养基上生长10d的鲜重，误差线表示3次测量的标准误差，C为过表达TaPR1的野生型拟南芥在含有不同浓度K⁺的培养基上生长10d的根长，误差线表示10次测量的标准误差。图中，具有不同字母的处理间具有显著差异(P<0.05)。

具体实施方式

材料：

普通小麦(Triticum aestivum L.)品种矮抗58(Triticum aestivumcv.Aikang58，公众可从河南农业大学农学院获得，公众也可从国家种质资源库获得(国审麦2005008)；提及矮抗58的文献为：侯鹏飞等，外源甜菜碱对干旱胁迫下小麦幼苗叶绿体抗氧化酶及psbA基因表达的调节，作物学报，2013，39(07)：1319-1324。

35S-GFP(Genome-Wide Identification and Analysis of HAK/KUP/KTPotassium Transporters Gene Family in Wheat，Cheng et al.,2018，公众可以从河南农业大学获得)农杆菌感受态GV3101(购自宝生物工程(大连)有限公司)

P416(海马齿细胞膜Na_H_逆转运蛋白功能的调控机理，周扬，2015，公众可以从河南农业大学获得)

酵母菌CY162(Genome-Wide Identification and Analysis of HAK/KUP/KTPotassium Transporters Gene Family in Wheat，Cheng et al.,2018，公众可以从河南农业大学获得)

pSuper1300(Genome-Wide Identification and Analysis of the AP2Transcription Factor Gene Family in Wheat(Triticum aestivum L.),Zhao et al.,2019)

拟南芥野生型：哥伦比亚型(Col-0)拟南芥(Genome-Wide Identification andAnalysis ofthe AP2 Transcription Factor Gene Family in Wheat(Triticumaestivum L.),Zhao et al.,2019，公众可以从河南农业大学获得)

hak5突变体拟南芥，即拟南芥突变体athak5(拟南芥高亲和性钾转运体AtHAK5参与植物根对盐胁迫及ABA的反应，张彦桃等，华北农学报，2014，公众可以从河南农业大学获得)

实施例1、TaPR1的克隆

一、TaPR1的克隆

将水培生长5天左右的普通小麦(Triticum aestivum L.)(品种矮抗58)取三叶期幼苗根部样品，用液氮速冻，-80℃保存备用。

采用Trizol法(TransGEN Biotech)提取小麦幼苗根总RNA，cDNA合成用PrimerScriptTm RT reagent Kitwith gDNAEraser试剂盒(TaKaRa)。

扩增体系(20μL)：

反应程序：

PCR产物进行1.0％琼脂糖凝胶电泳检测。

该序列表中序列2所示的基因命名为TaPR1基因，其中，其编码基因为序列表中的序列2的5′端第80-2218位的核苷酸，将该基因编码的蛋白命名为TaPR1蛋白，该蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列1，由712个氨基酸残基组成。

上述序列2也可以通过人工合成。

实施例2、实时荧光定量PCR分析TaPR1的表达特性

一、小麦材料处理

a、在小麦灌浆期，取在大田生长的小麦根、茎、幼叶、老叶和籽粒，放入液氮中速冻，-80℃保存备用。

b、对三叶期的小麦幼苗，进行以下处理：

(1)低钾处理：将小麦幼苗置于0.1mM钾离子浓度的培养液中，光照培养1小时、3小时、6小时、9小时、12小时、24小时后分别取根部样品，用液氮速冻，-80℃保存备用。

(2)对照的处理：直接取未经任何处理的小麦幼苗根部-80℃冻存作为对照。

二、RNA的提取

采用Trizol法(TransGEN Biotech)提取大田生长的小麦根、茎、幼叶、老叶和籽粒以及小麦幼苗根的总RNA。

三.反转录为cDNA

cDNA合成用PrimerScriptTm RT reagent Kit with gDNA Eraser试剂盒(TaKaRa)。

四、实时荧光定量PCR

根据已知的TaPR1序列，设计特异引物。

TaPR1-qF：5'-CGCACAGGTTATGAGATGCC-3'；

TaPR1-qR：5'-GAACTCGTAGGATCGGAGCA-3'

以actin为内参基因。Actin引物为

actin-F:5'-GTGTCGCACCAGAGGATCAT-3'

actin-R:5'-CGCTGGCATACAAGGACAGA-3'

反应体系：

SYBR 5μL

TaPR1的引物/Actin的引物 0.4/0.4μL

模板cDNA 4.6μL

反应条件：

95℃5min；95℃15sec，61℃60sec，40个循环；72℃，5min。

实时荧光定量PCR的结果如图1所示，图1为TaPR1基因在小麦灌浆期不同组织的荧光定量PCR结果，从图1中可以看出在小麦灌浆期，TaPR1主要在根、茎和幼叶中表达(图1)。且对低钾胁迫表现出响应，在处理3h时达到其最高水平(图2)。矮抗58的小麦种子在含有水的培养皿里生长5天后，将小麦幼苗转移到营养液里继续生长，营养液每三天更换一次，直到三叶期。取三叶期的小麦苗进行0.1mM的低钾处理，在处理的0,1,3,6,9,12和24小时收集小麦根部，经短暂液氮冷冻后，放入超低温冰箱中保存直到RNA提取。

实施例3、TaPR1亚细胞定位分析

1.构建35S-GFP载体：

根据TaPR1基因的序列设计引物对(TaPR1-1F和TaPR1-1R)，引物末端分别引入BamHI和SalI酶切识别位点，

TaPR1-1F：5'-CGCGGATCCATGGATCTCGAGGCGGCAGCT-3'；

TaPR1-1R：5'-ACGCGTCGACAACCTTGTACAACATGCCG-3'。

对目的基因PCR产物和35S-GFP表达载体分别使用Thermo Fisher的酶BamHI和SalI进行双酶切。

双酶切体系(20μL)如下：

使用PCR仪37℃孵育70min，按照说明书的要求对酶进行灭活，用于后续实验。

对双酶切产物进行胶回收，使用TAKARA的T4连接酶进行连接，目的片段：载体的摩尔比为10:1。

连接体系(20μL)如下：

连接条件：16℃连接16h。

将连接产物转化大肠杆菌感受态DH5α，挑取阳性克隆，提取质粒，得到质粒35S-GFP-TaPR1，所述质粒35S-GFP-TaPR1为将质粒35S-GFP的识别位点BamHI和SalI之间的核苷酸序列替换为TaPR1的编码基因的核苷酸序列，并保持35S-GFP的其他序列不变的重组质粒。

2.农杆菌转化

将质粒35S-GFP-TaPR1导入农杆菌感受态GV3101，得到农杆菌-TaPR1。具体方法如下：

1)从-80℃取出农杆菌感受态GV3101，并于冰上溶解。

2)在超净台中，取构建好的质粒35S-GFP-TaPR11μg加入到溶解的农杆菌感受态GV3101中，轻轻混匀。

3)放置到液氮中5min，37℃水浴热激5min，立即放回冰上冰浴2min。

4)加入500μL无抗性的YEP液体培养基，于28℃摇床中，220r复苏3h。

5)取100μL上述菌液涂布到含利福平和卡那霉素的YEP固体培养基上，28℃倒置培养3天，得到农杆菌-TaPR1。

3.农杆菌菌落PCR阳性鉴定

鉴定农杆菌-TaPR1是否含有TaPR1的编码基因，以引物TaPR1-1F和TaPR1-1R对农杆菌-TaPR1进行菌落PCR，电泳结果得到与TaPR1基因大小相同的条带(约2136bp的条带)，表明农杆菌-TaPR1含有TaPR1基因。

4.农杆菌介导的烟草叶片瞬时表达

烟草植株准备：

烟草培养：将烟草种子撒播于苗圃中，在光照培养箱中培养，培养条件为：温度为25℃，光周期为16h光照8h黑暗。待烟草长出第五片或第六片真叶时，用于农杆菌的侵染。

烟草转化液准备：

母液准备：使用蒸馏水配制1M的MgCl.6H₂O和0.2M的MES,并过滤除菌，放置于4℃保存。使用DMSO溶解As，其浓度为50mM，使用有机溶剂专用滤膜过滤除菌，放置于-20℃保存。

烟草转化液体系(现用现配)：500μL 1M MgCl.6H₂O,2.5mL 0.2M MES,150μL 50mMAs,加水至50mL。

侵染烟草叶片及观察蛋白的亚细胞定位：

1)将携带表达载体的农杆菌按1％接种到含有卡那霉素和利福平的YEP液体培养基中，28℃，200r震荡培养(约12h)，摇至菌液OD₆₀₀＝0.6。

2)5000r离心5min收集菌体，弃上清，沉淀的菌体使用灭菌的蒸馏水洗涤一次，再次5000r离心5min收集菌体。

3)使用配好的烟草转化液重悬2)中收集好的菌体，至OD600＝0.6，并将其放置到30℃培养箱中避光培养3h,之后被用于烟草叶片注射。

4)选择叶片表面光滑，颜色深绿且较厚的烟草叶片进行注射，注射前将烟草植株放置于光照下1h。

5)使用注射器的针头在烟草叶片避开叶脉的中间位置扎一个针孔，然后用1mL的无针头注射器吸取菌体转化液，将注射口紧贴针孔位置进行注射(注射时不可用力过大)，注射后的烟草叶片表现为湿润现象。

6)注射后贴上标签，将烟草重新放入培养箱培养2～3d，剪下一片被农杆菌侵染的烟草叶片，将其置于滴加有蒸馏水的载玻片上，盖上盖玻片。

7)将做好的玻片放在激光共聚焦显微镜下检测蛋白荧光信号并扫描拍照。

结果显示TaPR1定位在细胞膜上(图3)。

实施例4、TaPR1对钾离子吸收缺陷型酵母CY162的影响

1.构建酵母表达载体

根据TaPR1基因的序列设计引物对(TaPR1-2F和TaPR1-2R)，引物末端分别引入XbaI和EcoRI识别位点，

TaPR1-2F：5'-TGCTCTAGAATGGATCTCGAGGCGGCAGCT-3'；

TaPR1-2R：5'-CCGGAATTCTCAAACCTTGTACAACATGCCG-3'。

对目的基因PCR产物和酵母表达载体(P416)分别使用Thermo Fisher的酶XbaI和EcoRI进行双酶切；使用TAKARA的T4连接酶进行连接；将连接产物转化大肠杆菌感受态DH5α，挑取阳性克隆，提取质粒，得到重组质粒P416-TaPR1，所述重组质粒P416-TaPR1为将质粒P416的识别位点XbaI和EcoRI之间的核苷酸序列替换为TaPR1的编码基因的核苷酸序列，并保持P416的其他序列不变的重组质粒。。

2.酵母转化

将质粒P416-TaPR1导入酵母菌CY162中，得到酵母菌-TaPR1(图4中用TaPR1表示)。

将质粒P416导入酵母菌CY162中，得到酵母菌-P416(图4中用P416表示)。

具体方法如下：

1)取出-80℃保存的CY162菌保，在YPDA固体培养基上活化，于28℃培养箱培养3d。

2)取出在培养箱中活化好的酵母平板，挑取新鲜的CY162单克隆到含有10mL YNB⁺Ade⁺Ura⁺His⁺100mM KCl的液体培养基中，并将其放入28℃，220r的摇床中过夜震荡，至OD600＝0.6时，停止摇动。

3)取2)中1mL CY162菌液于灭菌的1.5mL的离心管中，3000r离心1min，弃上清。

4)3000r离心1min，弃尽上清。

5)向4)中加入5μL总量为1μg的质粒(目的基因-PYPGE15/p416的重组质粒或P416)。

6)向5)中加入500μL PEG-Mixture，吸打混匀，并用涡旋仪震荡。

7)室温静置12h，取底部50μL，平铺于YNB+Ade+His+100mM KCl的固体培养基上，28℃培养箱培养2-3d。

3.酵母梯度点滴实验

酵母功能互补实验选用AP固体培养基(pH＝6.5)，在AP培养基中添加Ade和His种营养成分，K⁺浓度设置0mM KCl、1mM KCl、10mM KCl和100mM KCl等。

方法如下：

1)在转化目的基因-酵母表达载体的YNB平板上挑取3个单菌落(酵母菌-TaPR1)，在转化酵母表达载体的YNB平板上挑取1个单菌落(酵母菌-P416)，分别置于4个含有10mLYNB+Ade+Ura+His+100mM KCl的液体培养基的锥形瓶中。28℃摇床中过夜震荡培养，至OD600＝1.0时，停止摇动。

2)每个样本取1mL到灭菌的1.5mL的离心管中，3000r离心5min。

3)弃上清，用灭菌去离子水洗涤3次，以期除尽菌液中残留的K⁺。

4)再用1mL灭菌的去离子水重悬3)中的菌体。

5)做梯度稀释:

A：取4)中菌液20μL加入到含180μL灭菌去离子水的1.5mL的离心管中，涡旋混匀；

B:取A中菌液20μL加入到含180μL灭菌去离子水的1.5mL的离心管中，涡旋混匀；

C:取B中菌液20μL加入到含180μL灭菌去离子水的1.5mL的离心管中，涡旋混匀；

6)每个梯度菌液取5μL,点到预先准备好的含合适K⁺浓度的AP固体培养基上，风吹干后，封口，倒置于28℃培养箱中，培养3～5d，并在培养期间观察转基因菌株能否互补CY162的功能缺陷。结果如图4所示，其中，图4每个K⁺浓度中自左至右的第一列点滴的是酵母培养物原液，第二列点滴的是原液的十倍稀释液，第三列点滴的是原液的100倍稀释液，从图4中可以看出，当K⁺浓度为1mM时，酵母菌-TaPR1(图4中用TaPR1表示)，仍能继续生长存活，而酵母菌-P416(图4中用P416表示)不能存活，也就是说，图4的结果显示TaPR1可以部分弥补CY162酵母菌株的生长缺陷。

实施例5、TaPR1提高了转基因拟南芥植株的耐低钾能力

1.构建拟南芥表达载体

根据TaPR1基因的序列设计引物对(TaPR1-3F和TaPR1-3R)，引物末端分别引入XbaI和SacI酶切识别位点，

TaPR1-3F：5'-ATACACCAAATCGACTCTAGAATGGATCTCGAGGCGGCA-3'；

TaPR1-3R：

5'-CGATCGGGGAAATTCGAGCTCTCAAACCTTGTACAACATGCCGAT-3'。

植物表达载体pSuper1300使用Thermo Fisher的酶XbaI和SacI进行双酶切，对目的基因PCR产物和经过双酶切的pSuper1300载体进行胶回收。

使用诺唯赞生物公司的一步法克隆试剂盒(

II One Step CloningKit)连接目的基因和植物表达载体pSuper1300,连接体系如下：

放置于PCR仪上37℃孵育30min。将连接产物转化大肠杆菌，获得阳性单克隆，提取质粒，得到重组质粒pSuper1300-TaPR1，所述重组质粒pSuper1300-TaPR1为将质粒pSuper1300的识别位点XbaI和SacI之间的核苷酸序列替换为TaPR1的编码基因的核苷酸序列，并保持pSuper1300的其他序列不变的重组质粒。将阳性重组质粒保存于-20℃冰箱中备用。

2.拟南芥种植

将拟南芥种子使用75％(v/v)的酒精表面消毒7min，然后用0.01％的NaClO表面消毒5min，用ddH₂O反复洗涤4次，然后将拟南芥材料点在相应的固体培养基上，4℃放置3d以利于种子同步萌发，然后将培养皿放置于光照培养箱内竖直培养。若材料需要扩繁，则需将长至四叶期的幼苗移栽至装有经高温高压灭菌的营养土的培养盒中，于光照培养箱中进行培养。培养条件：22℃，光照培养16h，暗培养8h。

3.农杆菌转化

将质粒pSuper1300-TaPR1导入农杆菌感受态GV3101，得到农杆菌-pSuper1300-TaPR1。具体方法与实施例3中的农杆菌转发方法相同。

4.遗传转化拟南芥

1)将携带表达载体的农杆菌按1％接种到含有卡那霉素和利福平的YEP液体培养基中，于28℃的摇床中，200r震荡培养(约12h)，待菌液OD₆₀₀＝0.6时，停止摇动。

2)将菌液转移至灭菌的50mL离心管中，5000r离心10min收集菌体。

3)用拟南芥转化缓冲液(0.22％MS粉，5％蔗糖，pH＝5.8；转化前加入0.02％SilwetL-77)重悬菌液，调节到OD₆₀₀＝0.6左右。

4)取处于盛花期的拟南芥，准备进行农杆菌转化，剪去果夹荚和盛开的小花，留下未授粉的花蕾。

5)将拟南芥花蕾在转化缓冲液侵染30s，取出侧放，暗培养24h后，继续正常培养，待种子成熟后收集拟南芥种子。

5.拟南芥阳性植株的筛选

将转基因拟南芥种子按照第2步的方法灭菌，铺在含有终浓度为30μg/mL潮霉素的MS培养基上，4℃低温处理两天后，转移到光照培养箱中培养。一周后，阳性苗生长出两片真叶，叶片绿色，而未转入基因的幼苗则发生黄化，没有真叶，挑选阳性苗转移到盆栽盒中。按照此方法筛选到T3代。

6.转基因拟南芥表型鉴定

每个材料各取2-3个转基因株系及一个相应的未转基因拟南芥株系的种子，按照第2步的方法进行种子表面消毒，用牙签将种子种在含有0mM K⁺、0.01mM K⁺、0.1mM K⁺和1mMK⁺的低钾MS上，种植3个统计学重复，生长10天观察表型，测量每个株系的根长和鲜重等表型性状。

图5为在hak5突变体拟南芥中表达TaPR1可以减轻其对低钾敏感的结果，其中图A为过表达TaPR1的hak5突变体在含有不同浓度K⁺的培养基上生长10d的表型，图B为过表达TaPR1的hak5突变体在含有不同浓度K⁺的培养基上生长10d的鲜重，误差线表示3次测量的标准误差，图C为过表达TaPR1的hak5突变体在含有不同浓度K⁺的培养基上生长10d的根长，误差线表示10次测量的标准误差。

图6为在野生型拟南芥中表达TaPR1可以减轻其对低钾敏感的结果，其中图A为过表达TaPR1的野生型拟南芥在含有不同浓度K⁺的培养基上生长10d的表型，图B为过表达TaPR1的野生型拟南芥在含有不同浓度K⁺的培养基上生长10d的鲜重，误差线表示3次测量的标准误差，图C为过表达TaPR1的野生型拟南芥在含有不同浓度K⁺的培养基上生长10d的根长，误差线表示10次测量的标准误差。

图5和图6的结果显示，当c(K+)＝1mM时，hak5/TaPR1转基因株系与hak5未转基因株系在根长和鲜重上均没有显著差异，当c(K+)≤0.01mM时，hak5/TaPR1转基因株系的根长和鲜重均比hak5未转基因株系显著提高(图5)。同样在WT/TaPR1转基因株系和WT未转基因株系的表型鉴定中也存在类似的现象，当c(K+)≥0.1mM时，WT/TaPR1转基因株系和WT未转基因株系在根长和鲜重上均不存在显著性差异，当c(K+)≤0.01mM时，WT/TaPR1转基因株系的鲜重(株系L(WT)20除外)和根长比WT未转基因株系显著提高(图6)。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

序列表

<110> 河南农业大学

<120> 耐低钾相关蛋白TaPR1及其编码基因和应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 712

<212> PRT

<213> Triticum aestivum

<400> 1

Met Asp Leu Glu Ala Ala Ala Pro His Arg Pro Arg Gly Gly Ser Pro

1 5 10 15

Ala Thr Ala Pro Leu Pro Pro Ala Asn Arg Glu Thr Asp Val Gly Asn

20 25 30

Val Arg Lys Asn Ile Phe Leu Val Tyr Lys Thr Leu Gly Val Val Phe

35 40 45

Gly Gly Leu Val Thr Ser Pro Leu Tyr Val Tyr Pro Ser Met Asn Leu

50 55 60

Ser Ser Pro Thr Glu Ala Asp Tyr Leu Gly Ile Tyr Ser Ile Met Phe

65 70 75 80

Trp Thr Leu Thr Leu Ile Gly Val Val Lys Tyr Val Gly Ile Ala Leu

85 90 95

Asn Ala Asp Asp His Gly Glu Gly Gly Thr Phe Ala Met Tyr Ser Leu

100 105 110

Leu Cys Arg His Ala Asp Ile Gly Ile Leu Pro Ser Lys Arg Gly Tyr

115 120 125

Ser Glu Glu Glu Pro Phe Leu His Glu Gln Ser Ala Thr Ala Ile Arg

130 135 140

Pro Ser Lys Leu Gly Lys Phe Phe Glu Arg Ser Ile Thr Ala Arg Arg

145 150 155 160

Val Leu Leu Phe Met Ala Ile Leu Gly Met Cys Met Leu Ile Gly Asp

165 170 175

Gly Ile Leu Thr Pro Ala Ile Ser Val Leu Ser Ala Ile Glu Gly Leu

180 185 190

Arg Gly Pro Phe Pro Ser Val Ser Lys Pro Val Val Glu Ala Leu Ser

195 200 205

Ala Ala Ile Leu Ile Gly Val Phe Leu Leu Gln Lys Tyr Gly Thr Ser

210 215 220

Lys Val Ser Phe Leu Phe Ser Pro Ile Met Ala Ala Trp Thr Phe Thr

225 230 235 240

Thr Pro Val Val Gly Ile Tyr Ser Ile Val Arg Tyr Tyr Pro Gly Ile

245 250 255

Phe Lys Ala Ile Ser Pro His Tyr Ile Val His Phe Phe Leu Arg Asn

260 265 270

Lys Lys Gln Gly Trp Gln Leu Leu Gly Gly Thr Val Leu Cys Ile Thr

275 280 285

Gly Ala Glu Ala Met Phe Ala Asp Leu Gly His Phe Ser Lys Lys Ala

290 295 300

Ile Gln Ile Ala Phe Leu Ser Ser Ile Tyr Pro Ser Leu Val Leu Thr

305 310 315 320

Tyr Ala Gly Gln Thr Ala Tyr Leu Ile Asn Asn Val Asn Asp Phe Ser

325 330 335

Asp Gly Phe Tyr Lys Phe Ile Pro Arg Pro Val Tyr Trp Pro Met Phe

340 345 350

Val Ile Ala Thr Leu Ala Ala Ile Val Ala Ser Gln Ser Leu Ile Ser

355 360 365

Ala Thr Phe Ser Val Ile Lys Gln Ser Val Val Leu Asp Tyr Phe Pro

370 375 380

Arg Val Lys Val Val His Thr Ser His Gln Lys Glu Gly Glu Val Tyr

385 390 395 400

Ser Pro Glu Ile Asn Tyr Ile Leu Met Val Leu Cys Val Gly Val Ile

405 410 415

Leu Gly Phe Gly Gly Gly Lys Glu Ile Gly Asn Ala Phe Gly Val Val

420 425 430

Val Ile Met Val Met Leu Ile Thr Thr Ile Met Leu Thr Leu Val Met

435 440 445

Ile Ile Ile Trp Arg Thr Pro Pro Val Phe Val Gly Met Phe Phe Ile

450 455 460

Pro Phe Val Ile Met Glu Gly Ser Tyr Val Ser Ala Val Phe Thr Lys

465 470 475 480

Ile Pro Glu Gly Gly Trp Leu Pro Phe Ala Val Ser Met Ile Leu Ala

485 490 495

Leu Ile Met Phe Val Trp Tyr Tyr Gly Arg Gln Arg Lys Ile Glu Tyr

500 505 510

Glu Met Ala Asn Lys Ile Thr Met Glu Arg Leu Gly Gln Leu Leu Ala

515 520 525

Met Pro Glu Val Gln Arg Val Pro Gly Leu Cys Phe Phe Tyr Ser Asn

530 535 540

Ile Gln Asp Gly Leu Thr Pro Ile Leu Gly His Tyr Ile Lys Asn Met

545 550 555 560

Ser Ser Leu His Thr Val Thr Ile Phe Val Thr Leu Arg Tyr Leu Leu

565 570 575

Val Ser Lys Val Asp Gln Arg Glu Arg Val Leu Ile Lys Arg Leu Gly

580 585 590

Pro Arg Gly Val Tyr Gln Cys Thr Val Gln Tyr Gly Tyr Ala Asp Asn

595 600 605

Leu Ser Leu Lys Gly Gly Asp Asp Leu Val Ala Gln Val Met Arg Cys

610 615 620

Leu Lys Arg His Ile Ala Met Ser Thr Asp Arg Arg Ser Ser Val Ser

625 630 635 640

Thr Glu Glu Glu Ile Ala Asn Leu Glu Ala Ala Ser Leu Ala Gly Val

645 650 655

Val His Val Arg Gly Lys Met Arg Phe Tyr Val Gly Asp Asp Ala Gly

660 665 670

Cys Phe Asp Lys Val Met Leu Arg Ser Tyr Glu Phe Leu His Ser Ile

675 680 685

Cys Arg Ser Ala Leu Pro Ala Leu Gly Met Pro Leu Gln Gln Arg Val

690 695 700

Glu Ile Gly Met Leu Tyr Lys Val

705 710

<210> 2

<211> 2400

<212> DNA

<213> Triticum aestivum

<400> 2

cgctcgcctt ctaatacagc ttcggccacc cccgctttct cgtccccctc tgcctgcaca 60

cgccggacag ggggcccaca tggatctcga ggcggcagct cctcaccggc cccgcggcgg 120

ctccccggcg accgccccac taccgccggc caacagagag accgacgttg gcaatgttcg 180

caagaatata ttccttgtgt acaagactct tggcgtggtt tttggtggcc tcgttacttc 240

tcccctctat gtttatccct caatgaactt gtcatctcct acagaagctg actacctggg 300

aatatacagc ataatgtttt ggactcttac tttaattggt gtggtcaagt atgtaggcat 360

agctctcaat gctgatgacc atggtgaagg tggtacattt gcaatgtatt ctttgttgtg 420

taggcatgcc gatataggca tccttccttc caagagaggg tattcagaag aagaaccatt 480

tcttcatgag cagtcagcaa cagctataag gcctagtaag ctgggcaagt tctttgagcg 540

aagcataact gcaagaaggg tattgttatt catggcaatt cttgggatgt gcatgctcat 600

tggagatgga atcctaactc ctgctatttc agtgttatca gcaattgaag gactaagagg 660

accatttcct tctgttagta aacctgttgt ggaagctcta tctgcagcaa ttcttattgg 720

tgtattcttg ctgcaaaagt atgggacttc aaaagtgagc tttctgtttt ctccaatcat 780

ggcagcatgg actttcacca ctccagttgt tggaatatac agcattgttc gttactaccc 840

gggcattttc aaagccattt cgccacatta tattgttcat ttcttcctaa gaaataaaaa 900

acaaggatgg cagctgcttg gtgggactgt tctatgtatc acaggtgcag aagctatgtt 960

tgcagatctt ggccacttca gcaaaaaagc tattcagata gcatttctat ccagcatata 1020

tccttctctg gtcctcactt atgccgggca aacagcatac cttattaaca atgtcaatga 1080

cttcagtgat ggattctaca aatttatccc tcggccagtt tactggccga tgtttgtcat 1140

tgcaacacta gcagcaattg ttgcaagcca gtccttaata tcggcaacat tttctgtcat 1200

caagcaatca gttgtcctgg actactttcc acgtgttaaa gtggtgcaca catcacatca 1260

aaaggaaggg gaggtttact caccagaaat taattacatt ctgatggtac tatgtgttgg 1320

tgttatacta ggctttggag gtggaaagga gatagggaat gcttttggtg ttgttgtcat 1380

catggttatg ctcataacta caatcatgct cactcttgtg atgatcatca tatggagaac 1440

accacctgtt tttgtcggga tgtttttcat tccattcgtc attatggaag ggtcctatgt 1500

cagtgccgtt ttcaccaaga tccctgaagg tggttggctt ccttttgcag tttccatgat 1560

ccttgcattg atcatgttcg tctggtacta tggtaggcaa aggaaaatag agtacgaaat 1620

ggcgaacaag ataaccatgg agcgccttgg tcagctcttg gcaatgcctg aggtccagag 1680

ggtcccgggc ttgtgcttct tctacagcaa catacaggac gggctaactc ctatacttgg 1740

ccattacatc aagaacatga gctcactgca tacagtcaca atttttgtga ccctgaggta 1800

cctgctggtt tccaaagttg atcaacggga aagggtcctg atcaagaggc tcggacctag 1860

gggggtgtac cagtgcaccg tccagtatgg ctacgctgac aacctgagcc tcaaaggagg 1920

cgatgatctt gtcgcacagg ttatgagatg cctgaagcgg cacattgcga tgagcaccga 1980

ccggcgttca tctgtttcta cggaggaaga gatcgctaac ctggaggcgg cgagtttggc 2040

cggggtggtg catgtccggg gcaagatgag gttctatgtg ggtgacgatg ccggctgttt 2100

tgacaaggtc atgctccgat cctacgagtt cttgcatagc atctgcagat cggcactgcc 2160

agctctcggg atgcctctgc agcagcgagt tgagatcggc atgttgtaca aggtttgagg 2220

cgctgcatca actgtttttt gtatgaatct catgaacatg gtcactctcc acaatatacc 2280

gtcatgtcgg aaatgtcatt tgtgttggcc acgccatatt ttttgcaagc aatgacacgg 2340

ttggtgcaca tcttttgtaa agatttttga actgtcattt agaagacaag tgggcctgaa 2400

Claims

1.一种蛋白质，其特征在于，是氨基酸序列是序列表中序列1所示的氨基酸序列的蛋白质；

所述蛋白质来源于普通小麦（Triticum aestivum L.）。

2.与权利要求1所述蛋白质相关的生物材料，为下述B1）至B5）中的任一种：

B1）编码权利要求1所述蛋白质的核酸分子；

B2）含有B1）所述核酸分子的表达盒；

B3）含有B1）所述核酸分子的重组载体、或含有B2）所述表达盒的重组载体；

B4）含有B1）所述核酸分子的重组微生物、或含有B2）所述表达盒的重组微生物、或含有B3）所述重组载体的重组微生物。

3.根据权利要求2所述的相关生物材料，其特征在于：B1）所述核酸分子为如下b1）或b2）所示的所述蛋白质的编码基因：

b1）编码序列是序列表中序列2的第80-2218位核苷酸的DNA分子；

b2）核苷酸是序列表中序列2的DNA分子。

4.植物或酵母菌耐低钾剂，其特征在于：所述植物或酵母菌耐低钾剂含有权利要求1所述蛋白质、或/和权利要求2或3所述生物材料。

5.权利要求1所述蛋白质、或权利要求2或3所述生物材料的下述P1-P5中的任一种应用：

P1、权利要求1所述蛋白质、或权利要求2或3所述生物材料在正调控植物或酵母菌耐低钾性中的应用；

P2、权利要求1所述蛋白质、或权利要求2或3所述生物材料在制备提高植物或酵母菌耐低钾性的产品中的应用；

P3、权利要求1所述蛋白质、或权利要求2或3所述生物材料在培育耐低钾植物或酵母菌中的应用；

P4、权利要求1所述蛋白质、或权利要求2或3所述生物材料在制备植物或酵母菌耐低钾产品中的应用；

P5、权利要求1所述蛋白质、或权利要求2或3所述生物材料在植物育种中的应用，所述育种为培育耐低钾植物。

6.一种培育耐低钾植物的方法，包括提高目的植物中权利要求1所述蛋白质或其编码基因的表达量，得到耐低钾植物。

7.根据权利要求4所述耐低钾剂，其特征在于：所述植物为单子叶植物或双子叶植物。

8.根据权利要求5所述应用，其特征在于：所述植物为单子叶植物或双子叶植物。

9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述目的植物为单子叶植物或双子叶植物。