CN1429905A

CN1429905A - 治疗帕金森病的可调控双基因表达的重组腺病毒伴随病毒载体

Info

Publication number: CN1429905A
Application number: CN02100103A
Authority: CN
Inventors: 王晓民; 牛东滨; 韩济生
Original assignee: Peking University
Current assignee: Peking University
Priority date: 2002-01-04
Filing date: 2002-01-04
Publication date: 2003-07-16

Abstract

本发明涉及用四环素诱导表达系统携带并调控人GDNF和人TH基因治疗帕金森病的腺病毒伴随病毒载体构建。其特征是在载体上提供了腺病毒伴随病毒两端ITR，ITR之间有双向启动子、两个治疗基因和调控元件；随本专利还同时提供了用该质粒或重组腺病毒伴随病毒载体携带治疗基因在体外导入细胞，筛选后移殖到脑纹状体的方法，或与四环素转录激活子载体混合、应用于治疗的方法；在治疗神经退行性疾病，特别是帕金森病的过程中，根据症状服用四环素(或其衍生物)，对表达人GDNF、人TH水平进行量的调控，达到安全、有效、无副作用的目的。

Description

治疗帕金森病的可调控双基因表达的重组腺病毒伴随病毒载体

本发明属于基因治疗帕金森病领域，特别是利用四环素诱导双基因表达治疗帕金森病的腺病毒伴随病毒(adeno-associated bvirus，AAV)载体构建。该载体携带的基因是人胶质源性神经营养因子(human glial-derived neurotrophic factor，hGDNF)基因和人酪氨酸羟化酶(human tyrosine hydroxylase，hTH)基因，它们由一个四环素调控反应的双向启动子进行转录控制，外侧有多聚腺苷酸序列和腺病毒伴随病毒的两端ITR；同时涉及了在体治疗和体外培养细胞水平，如何导入治疗基因的方法，便于治疗帕金森病的使用，可以根据症状的变化，服用四环素类药物对治疗基因的表达进行调控。

帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是发生在中老年人一种常见的神经系统退行性疾病，由于黑质多巴胺能神经元变性，造成纹状体多巴胺(Dopamine，DA)含量下降，导致震颤、肌僵直和运动减少等症状，严重者可以致残，影响患者的生活质量，给患者家庭和社会造成沉重负担。目前治疗方法主要是沿用60年代开始的左旋多巴(L-DA)替代疗法，虽可使症状缓解，但无法阻止病情发展，长期用药副作用大，且产生“开关”现象，失去疗效。近年开展起来应用电针毁损纹状体治疗帕金森氏病方法，适应症窄，只对以震颤、肌僵直等症状为主的PD疗效较好，且还需药物辅助治疗，疗效维持时间有限。因此，寻找一种全新的治疗方法已迫在眉睫。

随着分子生物学技术发展和人类基因组计划的实施，基因治疗帕金森病成为研究热点之一。近几年来基因治疗PD取得不小进展，主要采用向脑内导入基因并表达：(1)神经营养因子^[1]：如神经生长因子、胶源性神经营养因子等，特别是GDNF^[2]，能预防多巴胺能神经元的变性死亡，促使病变的DA能神经元结构和功能恢复。(2)神经递质合成酶：主要是酪氨酸羟化酶^[3]，它是DA合成的限速酶。这些虽都取得了较好的疗效，但仍存在问题，那就是导入TH基因，可以缓解临床症状，但不能阻止多巴胺能神经元的持续变性坏死，最终导致病情恶化；而导入GDNF基因，虽然保护了残存的多巴胺能神经元，防止病情恶化，但对已存在的症状却得不到改善和恢复。因此，选择合适的目的基因导入至靶细胞，并在其中长期、稳定、可调控的表达，是基因治疗成败的关键。

基因治疗最早是把缺失的基因导入到机体治疗遗传性疾病，随着分子生物学和基因工程技术的发展，越来越多的相关基因从疾病中分离、鉴定出来，改变了人们关于基因治疗的概念，现在通常指采用设计的方法将有功能和活性的治疗基因导入到靶细胞或靶组织，转录翻译成有功能的活性蛋白、细胞因子、细胞膜受体或任何能调节细胞生长、分化的蛋白质，通过调节信号通道或转录方式在细胞内起作用，或者被细胞分泌到细胞外产生生物学作用。开始基因治疗只能采用间接导入方法，就是把体细胞从机体上取出来，在体外用重组DNA转染或感染后，再移殖到体内进行治疗。

随着技术的发展，发明了一些新方法可以把治疗基因直接导入到机体组织里，如：用脂质体包裹DNA^[4]、结合了病毒壳受体的蛋白脂质体、磷酸钙共沉淀DNA、DNA与多聚赖氨酸-糖蛋白的复合物等方法。

除了上述非病毒载体外，最常用的就是借助用重组的复制缺陷型病毒载体携带治疗基因导入的方法。病毒载体具有天然的感染能力，转染效率高；这些病毒在基因治疗中的应用，依赖于对这些病毒载体改造的策略、制备的优化等研究，一些病毒载体已经被改造成有效运输治疗基因的工具^[5]。常用的有：单纯疱疹病毒(herpes simplex virus，HSV)、人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)、逆转录病毒(retrovirus，RV)、腺病毒(Adeno virus，Ad)和腺病毒伴随病毒(AAV)等载体。

HSV病毒具有嗜神经性，与HIV病毒一道作为载体，具有携带基因容量大，导入基因效率高、感染的靶细胞广泛等优点，但由于本身携带有病毒基因序列，容易产生野生型病毒的污染和介导的外源基因表达时间短。目前的HSV介导的离体试验和在体试验均观察到明显的细胞毒性^[6]。

逆转录病毒是应用最广泛的病毒载体之一，它能够随机插入靶细胞的染色体中，稳定表达。通常载体上携带有治疗基因和病毒复制、包装信号的长末端重复序列(long terminal repeats，LTRs)，包装细胞系可整合缺陷型前病毒的全长基因，但是没有LTRs，本身不能包装出病毒颗粒，当将载体转染到具有辅助功能的包装细胞系时，就可以把治疗基因包装进逆转录病毒颗粒中，纯化后应用^[7]。但是它的缺点也是显而易见的，主要表现在稳定性差，纯化过程中易导致病毒滴度降低、只能感染整合到分裂的细胞，像成熟的神经细胞等不分裂或复制慢的靶细胞不适合使用该载体、随机插入细胞染色体可能激活原癌基因或抑制肿瘤抑制基因引起癌症、一定时间后导入的基因表达水平降低、血清补体使逆转录病毒迅速失活和发生变化重组成能完全复制及自我包装的野生病毒等，此外，逆转录病毒可导致某些动物致病，包括人类，因此，人们对它的安全性一直感到担心^[8]。

使用腺病毒载体可克服逆转录病毒的许多缺点，人腺病毒是一种双链DNA病毒，长约36kb，通过细胞膜受体介导的细胞内吞作用进入细胞内。它易培养和操作，能被敲除的DNA序列多，非常适宜做载体；特别是感染的靶细胞范围广，与逆转录病毒不同，它既可以感染分裂细胞，又可以感染非分裂细胞，如人呼吸道上皮细胞、造血细胞、脊髓等都是它的感染宿主；由于DNA不能整合到宿主的染色体，增加了安全性；此外，容易制备、滴度高，稳定性好，容易纯化和保存。尽管有这些优点，它仍不可避免地也存在一些缺点。由于DNA不能整合到宿主的染色体上，它携带的基因表达时间短，随着细胞的分裂而消失，一般只可表达两个月。另外，载体表达的病毒蛋白可以引起机体的体液和细胞免疫反应，导致感染的细胞死亡、被排除^[9][10]。因此，腺病毒载体不适宜携带需长久表达的基因，而重复使用可增强机体免疫排斥反应，故应用的次数有限，这些都限制了它的应用。

AAV是一种带有4681个核苷酸的单链DNA病毒，属于微小病毒属依赖病毒亚属，至尽为止，还没有发现对人致病。它的开放读框主要编码Rep(replication)和Cap(capsid)蛋白，在它的两侧是两个145个核苷酸长的反向末端重复序列(inverted terminal repeat sequences，ITR)，ITR可以折叠形成发夹结构，作为病毒复制起始时的引物，此外，它还是病毒整合、从宿主细胞中拯救、将病毒染色体DNA包裹在病毒蛋白壳内和促进病毒成熟的必须元件^[11]。AAV经感染进入细胞内后，有两种变化途径：一种是当存在辅助病毒时，AAV进入细胞裂解状态，此时，病毒DNA转录、复制、包装成新的病毒颗粒；当没有辅助病毒的功能存在时，AAV的ITR与宿主DNA序列之间通过重组，以原病毒的形式整合到宿主染色体上，分析发现它是特异性地整合到人19号染色体的长臂上^[12]。ITR并不像LTR一样具有转录调节功能，与逆转录病毒相比，降低了插入诱发癌症的机率。现在发现AAV载体感染细胞后，有三种存在方式：除了上面提到的定点整合外，还有随机插入和游离于宿主染色体外的方式。因为它最大的包装容量是4.7kb，所以缺陷是携带的基因容量小。如治疗的靶基因较小，则不存在这些问题。原先人们不知道AAV哪些序列决定了将DNA进行复制、包装成病毒颗粒的，现在知道，ITR在这个过程中起了关键作用，同时还决定了载体DNA同宿主染色体的整合，在基因治疗PD病中具有光明的应用前景^[13]。

基因治疗走向临床应用，解决最重要的两个问题是长期、稳定、安全表达和调控表达^[14]，调控表达是指对表达量或/和表达时间进行调控。自从Gossen和Bujard^[15]于1992年发明四环素调控系统以来，多次对它进行改进，此外又发明了糖皮质激素调控系统和金属硫蛋白调控系统等^[16]，但以四环素调控系统最为灵敏、安全、副作用小，这是一个药物剂量依赖性的调控表达系统，它由两个元件组成：四环素转录激活子(tetracycline transactivator，tTA)和四环素操纵子部分序列与巨细胞病毒即刻启动子核心序列融合构成的启动子。有人将四环素调控系统装载到HIV、Ad病毒载体中应用，都获得了较好的结果，而AAV载体由于包装容量小，还没有做到对外源基因表达进行调控。

我们在以前的研究工作中，克隆了人的GDNF基因，并将它与人TH基因分别装到Ad或AAV载体上，包装成重组Ad或AAV病毒，感染神经源性细胞系和原代培养的神经细胞，证实能够长期、稳定的表达。采用脑立体定向注射方法，应用于SD大鼠PD模型，治疗PD取得较好的治疗效果^[17]，但是仍存在缺陷，就是不论病情轻重、痊愈与否，导入的目的基因均不受影响而持续表达；此外，这两个基因由于分别包装成病毒，不能保证将这两个基因导入同一个靶细胞中产生协同作用。

本发明改变了这种状况，我们构建了一个可受四环素调控的双基因表达AAV载体，在载体上提供了AAV两端ITR，ITR之间有一个四环素调控的双向启动子、它的两端分别带有各自的多克隆酶切位点和多聚腺苷酸序列，我们曾将增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因和红色荧光蛋白(RFP)基因克隆到这两个载体上，转染细胞，证明可以表达EGFP和RFP并受四环素调控，呈剂量依赖性关系。把人TH(hTH)和人GDNF(hGDNF)基因克隆到这个可调控的AAV载体上，包装成AAV病毒，感染靶细胞或靶组织，能够根据需要长久持续表达，产生协同作用，保护DA能神经元，防止退行性变，并增加DA合成分泌，改善和消除PD症状，治愈PD；同时，通过药物诱导四环素调控系统，减少或关闭TH和GDNF基因的表达，达到安全、无副作用的目的。随本发明，我们还提出了使用本产品的方法。用于本发明的原始生物材料pDsRed1-N1：购买自CLONTECH公司生产的商业化质粒。pKS^BtTA：本单位在INVITROGEN公司的质粒pKS基础上构建的质粒，携带

有四环素转录激活子tTA的序列pSV-bi：本单位构建并保存的四环素可调控的AAV载体质粒，有两个多克隆酶

切位点，能同时携带两个基因。pAV53：本单位保存的AAV载体质粒，在两个ITR之间携带有多克隆酶切位点，

见附图1。pcDNAGDNF：本单位在CLONTECH公司商业化质粒pcDNA3基础上构建的质

粒，携带有人GDNF基因，它是本单位从人胎脑中用PCR的方

法克隆得到的基因，DNA序列附后，见序列1。人TH基因：本单位保存在pcDNA3上的人TH3型基因，见序列2。

以上质粒的宿主菌为Escherichia coli大肠杆菌MAX EFFICIENCY DH5α(GIBCO#18528-012)。pSVbiGDNFTH的构建过程

见附图2，首先用XhoI和HindIII将GDNF从pcDNAGDNF中切下，回收后连接到经同样酶切、回收处理的质粒pAV53载体上，构建成pAVGDNF；用XbaI+BamHI两个限制性内切酶把tTA基因从pKS^BtTA上切下，代之以用同样酶切pAVGDNF得到的GDNF，构成质粒pKS^BGDNF，接着，用BamHI酶切、Klenow酶补平、连接的过程，将质粒pKS^BGDNF的BamHI去除，再用XhoI+SalI双酶切pKS^BGDNF，回收小片段，为GDNF-polyA；用XhoI对pSV-bi进行限制性酶切后，与前面得到的GDNF-polyA混合，用T4DNA连接酶连接载体和片断，经转化、挑克隆、DNA的小量提取，得到单克隆，用XhoI+SalI双酶切进行鉴定正确后，得到质粒pSVbiGDNF，最后用BamHI+EcoRI将TH基因连接到pSVbiGDNF上，构建成pSVbiGDNFTH。

本发明构建的AAV载体质粒pSVbiGDNFTH，其宿主菌为Escherichia coli大肠杆菌MAX EFFICIENCY DH5α(GIBCO#18528-012)。本发明的特征及用途

本发明的特征在于将双向四环素反应启动子、两个治疗基因、多聚腺苷酸序列构建到AAV的两个ITR之间，自从5’端至3’端如下：AAV-2型的5’ITR、多聚腺苷酸序列-1、人GDNF序列、双向四环素反应启动子、人TH序列、多聚腺苷酸序列-2和3’ITR序列；两个ITR之外，AAV载体质粒上有氨苄青霉素抗性基因表达盒和新霉素抗性基因表达盒。物理图谱及酶切鉴定图谱见附图3。

本发明所使用的方法涉及到病毒学、微生物学、分子生物学和重组DNA技术等，都是现有的、公开的、常用的技术，没有使用独有的技术。

1.AAV载体质粒

本发明使用AAV的ITR核酸序列是血清2型，其序列已知，由于ITR序列是AAV病毒的复制、整合、拯救和包装所必需的顺式作用元件(见序列3)，具有转录启动子的活性，各个ITR的作用是相同的，因此载体质粒上的两个ITR可以是相同的，也可以不同，可以换成其它血清型的ITR，例如：血清1、3、4、5、6、和7型，也可以是对ITR进行核苷酸突变、替换、缺失等处理后的序列，，也可以在ITR的D区插入一个D区序列，构成双D区序列的ITR等。

TH和GDNF基因在本发明中使用的是人源性3型TH和我们自己从人胚胎脑中克隆的GDNF，其中GDNF只有561核苷酸，与以往发现的基因有差别^[18]，在细胞和动物上研究发现有生物活性^[17]。但是为了治疗帕金森病的需要，也可以使用不同的基因，只要能有相同的生物活性。如芳香族氨基酸脱羧酶(AromaticL-aminoacid Decarboxylase，AADC)^[19]、GTP环水化酶(GTP Cyclohydroxylase I，GTPCHI)^[20]和成纤维细胞生长因子、脑源性生长因子、神经生长因子等，有实验表明TH和GTP环水化酶共同应用治疗帕金森病，较单用TH产生更好的治疗效果^[11]；因此在本发明的基础上改进，用GTP环水化酶代替GDNF，与TH一道治疗帕金森病将也会产生满意的疗效。另外，老年性痴呆同帕金森病一样，都属于神经退行性变，它们有相似的病理改变，本发明有可能在不远的将来，通过替换治疗靶基因也可用于治疗其它神经退行性疾病。

四环素反应启动子由7个Tn10转座子的tetR结合序列(tetO)与去掉增强子的人巨细胞病毒即刻早期启动子(minimal CMV promoter)融合组成的，而双向四环素启动子是在tetO的另一端再融合一个相同的CMV启动子(见序列4)，当转录激活子与tetO结合，激活启动子，可使转录向两个方向进行；而四环素存在时，则使转录停止。CMV启动子是强启动子，根据需要，换用其它启动子，如TK启动子、逆转录病毒和小鼠乳房病毒的LTR启动子、SV40早期启动子、RSV启动子、融合的启动子或杂合启动子等。为了使转录能够实现靶向性，除了使用特异性启动子转录tTA外，还可以用胶质纤维酸性蛋白启动子等替代tetO两端的CMV启动子。另外，tetO可以由7个增多或减少，最多减少为1个tetO序列，或者进行突变，仍然保留与tTA特异结合的性质。为了改变治疗基因平常的分泌状态，可以将四环素反应系统换成“tet on”，即加入四环素，治疗基因进行转录、表达，当撤除四环素时，治疗基因转录停止，不进行表达。

本发明使用两种不同的SV40多聚腺苷酸连接在治疗基因的3’端(见序列5、6)，能够使转录、翻译得以顺利进行，这两个多聚腺苷酸序列可以相同或不同，但一般认为当两个polyA不相同时，可以增加转录、翻译的数量。它可以是下面的序列，但不限制本发明使用其它可以稳定mRNA的核苷酸序列：AUUAA、AAUUAA、AAUACA、AAUAAC、CAUAAA。

该质粒的构建，可以用其它的途径实现。例如，直接将AAV ITR之间的基因编码区用限制性内切酶切除，换上本发明ITR之间的DNA序列；当然，还有其它的办法，如用DNA序列人工合成的方式就可以达到这个目的。

2.病毒的生产与纯化

AAV病毒的生产需要以下四种成分参与：第一.载体成分，含有治疗基因的表达单位，其两端是AAV的ITR，后者是AAV复制与包装所需的最短的顺式作用序列；第二.AAV的复制蛋白Rep和包装蛋白Cap，支持重组AAV的复制与包装，一般由助手质粒反式提供；第三.辅助病毒，通常为腺病毒或HSV-1；第四.合适的细胞株。而本发明的载体质粒是携带治疗基因的载体成分，携带有ITR，适合生产的细胞株有：酵母细胞、昆虫细胞、哺乳细胞等，一般选用人胚肾细胞系(ATCC CRL1573)或BHK-21细胞系，先用腺病毒5型感染细胞系，再通过载体质粒与携带Rep和Cap基因的助手质粒共感染生产细胞，包装出重组AAV，携带有治疗基因。

因为本发明的质粒带有新霉素抗性表达盒，可以采用先将助手质粒与pSVbiGDNFTH转染到BHK-21细胞系或293细胞系，在含有G418的培养基的条件下，筛选阳性细胞系，再感染辅助病毒，治疗基因被包装成重组AAV病毒。

包装成的病毒有许多方法可以进行纯化。将病毒产品冻融3～4次后，加热56℃、30～55分钟；或者三氯甲烷等灭活辅助病毒，离心去除细胞碎片，接着用过硫酸胺、聚乙二醇等沉淀AAV进行粗提，接着用氯化铯超速离心(1.41～1.43g/cm³)或通过各种柱子进行纯化，经过这些过程，去除了辅助病毒、细胞碎片、辅助病毒的蛋白和核酸等污染物。rAAV载体理化性质较为稳定，可以-20℃保存数年，用于基因治疗、制备转基因鼠和体外转染细胞等。

3.可调控的AAV载体质粒pSVbiGDNFTH对基因的转染

可将携带的基因转染到细胞和体内靶组织。用于质粒或DNA转染的方法很多，有脂质体、磷酸钙、电转、直接注射到细胞内等方法，将pSVbiGDNFTH和携带tTA的载体共转染到细胞内，用选择性培养基筛选得到阳性细胞进行培养，当细胞为神经干细胞时，先共转染DNA，再用血清和加入细胞因子的培养基培养促使细胞定向诱导、分化，并表达导入的基因，将获得的转基因细胞注射到体内治疗帕金森病或制做转基因动物，也可以冻存备用。

当转染到体内时，也是用上面提到的方法，将pSVbiGDNFTH和携带tTA的载体混合，用脂质体等包裹注射到靶组织中。

4.重组AAV在体外和体内的感染

一般重组AAV可以通过感染方式将携带的基因导入到靶细胞或靶组织。当感染细胞时，培养成纤维细胞或神经干细胞，感染了重组AAV(携带治疗基因)和携带tTA的AAV，冻存备用或直接移植到脑纹状体；或者其它细胞，这种细胞可以是来源于患者的体细胞，也可以是培养的细胞系，只要在体内不会引起免疫反应或产生肿瘤。

将治疗基因和tTA导入脑内的方法与细胞的导入方法比较，前者要简单的多，只需把重组AAV(携带治疗基因)、携带tTA的AAV与适当的佐剂混合，如注射用水、生理盐水、缓冲液等，立体定向注射到脑纹状体或靶组织。

以上的产品组成都可以采用包装成治疗盒等形式，以方便运输、保存和使用。

5.重组AAV数量与疗效

重组AAV在体内的表达可以维持12个月以上，在治疗过程中，要考虑使用AAV的数量，以便治疗基因的表达量要达到治疗的药物剂量，另外，当表达过高时，口服四环素类药物，降低治疗基因的表达，当治疗基因的表达量低时，及时重复注射重组AAV，使基因的表达能够持续、稳定、可调控表达。在基因治疗的过程中，还可以配合使用药物治疗，例如：L-多巴等。

实施例

以下实施例对四环素调控重组腺病毒伴随病毒载体携带双基因治疗帕金森病的用途作了详细说明，但并不意味着限制本发明的内容。实施例1 质粒DNA转染神经干细胞

参照Molecular Cloning-A Laboratory Manual，2^nd ed.(Szmbrool J.et al，1996))用碱裂解法大量制备质粒DNA，聚乙二醇(PEG)沉淀法进行纯化。

用无血清神经细胞培养基体外培养人神经干细胞，当细胞长至40～60％时，用脂质体转染的方法，进行DNA转染实验：预先准备2个无菌小离心管，分别准备溶液A和溶液B。于A管中加入5μgpSVbiGDNFTH和5μg的pUHD15-1DNA及200μl无血清、无抗菌素的DMEM/F12(含N₂)培养液，充分混匀，即得溶液A；于B管中加入10μl Lipofectamine Reagent和190μl无血清、无抗菌素的DMEM/F12(含N₂)培养液，充分混匀，即得溶液B。将A液和B液混合，得溶液C，室温放置15～45min，使质粒DNA充分被LipofectamineReagent包裹。这期间，用无血清神经细胞培养液轻柔地将细胞冲洗2～3次，随后加入3.8ml培养液和0.4mlC液，于5％CO₂孵箱内37℃培养8～10小时，换去无血清培养液，用含血清、抗菌素的神经细胞培养液继续培养24～36小时，同时加入细胞因子对神经干细胞进行定向诱导，在培养液中采用无限稀释法将分化的神经细胞培养到96孔板，达到0～1个细胞/孔，每3～4天换液一次，在培养液中加入G418(150～200μg/ml)，当长成克隆时，换用无血清培养液培养24小时，再改用含血清的神经细胞培养液，把无血清培养液收集，用ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay)方法检测GDNF的含量，用反向高压液相(HPLC)的方法检测多巴胺的含量，挑选产量高的细胞株进行扩大培养。实施例2 质粒DNA转染人成纤维细胞

质粒DNA的大量制备同实施例1。用DMEM培养液体外培养人成纤维细胞，当细胞长至60～70％时，用脂质体转染的方法，将5μg的pSVbiGDNFTH和5μg的pUHD15-1共转染到细胞内，20小时后，在培养液中加入G418(250～300μg/ml)，采用无限稀释法将分化的神经细胞培养到96孔板，达到0～1个细胞/孔，每3～4天换液一次，当长成克隆时，换用无血清培养液培养24小时，再改用含血清的神经细胞培养液，把无血清培养液收集，用ELISA方法检测GDNF的含量，用反向高压液相(HPLC)的方法检测多巴胺的含量，挑选产量高的细胞株进行扩大培养。实施例3 重组AAV-GDNF-TH感染小鼠原代培养的中脑神经细胞1.生产细胞的制备

质粒DNA的大量制备同实施例1，BHK-21细胞是人肾小管上皮细胞，本所保存。细胞复苏后，传入25cm²的玻璃细胞培养瓶，在1640培养液(GIBCO公司产品)中培养，待细胞长至60～70％即可进行DNA转染实验：预先准备2个无菌小离心管，分别准备溶液A和溶液B。于A管中加入5～8μg载体质粒DNA和200μl无血清、无抗菌素的DMEM培养液，充分混匀，即得溶液A；于B管中加入10μl Lipofectamine Reagent和190μl无血清、无抗菌素的DMEM培养液，充分混匀，即得溶液B。将A液和B液混合，得溶液C，室温放置15～45分钟，使质粒DNA充分被Lipofectamine Reagent包裹。这期间，用无血清DMEM培养液轻柔地将细胞冲洗2～3次，随后加入3.8ml培养液和0.4ml C液，于5％CO₂孵箱内37℃5～6小时，换去转染培养液，用含血清、抗菌素的常规培养液继续培养18～24小时，然后将细胞传入一个六孔板，待细胞贴壁后，用G418选择培养液继续培养，以筛选抗药性细胞克隆。G418的剂量从200μg/ml培养液开始，每两天递增200μg/ml，直至升到800μg/ml。待多克隆细胞形成后，用0.125％胰酶、0.15％EDTA消化细胞，并传入25cm²培养瓶，继续在含有800μg/ml G418的选择培养液中培养。此后传代、冻存、保种，得包装细胞系BHK/GDNF-TH。

2.重组腺病毒伴随病毒的制备、纯化和检测

细胞大量扩增，进行转瓶(110mm×480mm，Wheaton公司产品)培养，细胞长满后(约为6～8×10⁸个细胞)用携带Rep和Cap的HSV-1感染(MOI为0.1～1.0)。当48小时细胞完全病变、变圆、容易脱落时，盖紧瓶盖剧烈振摇，将瓶壁上的细胞全部洗脱至培养液中，分装至500ml的三角烧瓶中，进行下一步纯化。

参阅Synder^[22]和Clark^[23]的方法稍做改进如下：

将回收的细胞与培养液反复冻融3～4次，加热56℃、45～50min；灭活携带反式作用元件的辅助病毒HSV-！；再在液体中加入DNase I和RNase，使终浓度为1μg/ml，37℃、30分钟；加入氯化钠至终浓度为1mol/L，剧烈摇动30分钟后，1,2000转/分钟、离心15分钟，收集上清；加入PEEG6000至终浓度为13％(W/V)，溶解后，放置4℃1小时，1,2000转/分钟，离心15分钟，弃去上清，用少量PBS溶解沉淀，加入DNase I至终浓度1ug/ml，37℃、30分钟；三氯甲烷抽提，1,2000转/分钟，离心3～5分钟，收集水相，经过柱子层吸，收集备用。

待测的rAAV-GFP样品用DNase I和RNase(终浓度均为1μg/ml/ml)于37℃消化1小时，提取重组AAV的DNA(方法见Synder RO等1996 CurrentProtocols in Human Genetics.John Wiley：New York，.12.1.1-12.1.20.)，沸水浴加热5分钟变性之后置于冰浴中。用试剂盒提供的稀释缓冲液以1∶10做系列稀释后点膜。预杂交、杂交、洗膜、显色按Boehringer Mannheim公司试剂盒说明书进行。通过计算pSVbiGDNFTH的分子数、再乘以与其杂交信号强度一致的病毒液样品的稀释倍数而得出rAAVGDNFTH的物理滴度，结果为1×10¹¹～10¹²颗粒/ml。

将纯化的重组AAV-GDNFTH(1×10¹¹病毒颗粒)感染六孔培养板中的50％铺满的人胚胎肾细胞293，待细胞长满后，在倒置显微镜下观察是否出现细胞病变效应(cytopathic effect，CPE)，以此判断rAAV中是否含有HSV-1。将细胞连同上清一起冻融3次，离心去除细胞碎片后，上清液再感染六孔培养板中的50％铺满的293细胞，如此连续感染5代，实验观察表明辅助病毒去除彻底，无CPE出现。

3.感染与检测

采用常规的方法用无血清培养液培养小鼠原代中脑神经细胞，当细胞长至1×10⁵时，向培养液中加入重组AAV(1×10⁹)，感染细胞4～6小时后，更换成无病毒的培养液，继续培养2周，收集上清，用ELISA方法检测GDNF的含量为8.90pg/ml，免疫组化检测TH的表达，显示强阳性。当感染重组病毒后2天，在培养液中加入强力霉素1ng/ml，培养2周检测，结果都为阴性。

4.无菌条件下收集培养的中脑神经细胞，储备后用。实施例5 重组AAV-GDNF-TH感染体外培养的SH-SY5Y细胞系

SH-SY5Y细胞系是神经母细胞瘤细胞系，采用常规方法，在玻璃细胞培养瓶中，用DMEM培养液(GIBCO公司产品)进行培养(FBS10～5％、5％CO₂)，待细胞长至60～70％即可进行重组腺病毒伴随病毒感染实验。在培养液中加入重组AAV-GDNFTH(1×10⁹)，感染细胞4～6小时后，更换成无病毒的培养液，继续培养2周，收集细胞，用Bowtell法(1987年)提取细胞中的总DNA，分别用标记上地高辛的寡核苷酸探针对GDNF和TH进行标记，结果阳性。实施例6 重组AAV-GDNF-TH感染神经干细胞

细胞培养方法同实施例1，无菌分离人胚胎(12周)中脑神经干细胞，培养于无血清培养基DMEM/F12(GIBCO公司)中，用免疫荧光显微镜或共聚焦显微镜检测神经干细胞早期标志抗原——巢蛋白(nestin)的表达，掺入BrdU以便进行细胞增殖特性的研究。培养2w后，培养的神经干细胞开始形成球状克隆，经共聚焦显微镜检测显示大部分细胞表达nestin，并具有增殖能力。将神经干细胞接种于24孔培养板中，用重组AAV-GDNFTH(约10⁵病毒颗粒/ml)感染4～6小时，更换成含血清培养液进行培养，中脑神经干细胞发生分化：神经突起细长，可见明显神经元胞体；收集细胞，用Bowtell法(1987年)提取细胞中的总DNA，分别用标记上地高辛的寡核苷酸探针对GDNF和TH进行标记，结果阳性。实施例7 脑纹状体定向注射重组AAV-GDNF-TH病毒对PD模型大鼠行为的影

响

制作PD大鼠模型^[24]后，将大鼠随机分成两组，采用脑立体定向注射的方法，向实验组大鼠纹状体内注射重组AAV-GDNFTH6μl(约1×10⁹)和重组AAV-tTA4μl(约1×10⁸)，对照组大鼠纹状体内注射相同量的重组AAV-GFP代替重组AAV-GDNFTH，15天后，各组大鼠每周腹腔注射Amphetamine，3mg/kg一次，测转45分钟，记录PD模型大鼠的自转圈数，实验一直进行了4个月，数据表明实验组大鼠的自转圈数明显减少，与对照组差别显著(P＜0.05)，免疫组化染色TH、ELISA检测GDNF和HPLC检测多巴胺，结果均为阳性；而实验组服用强力霉素后(水中加入强力霉素1mg/ml)，则与对照组差别不显著，TH、GDNF和多巴胺检测也与对照组无显著差别(P＞0.05)。实施例8 携带GDNF和TH基因的工程细胞移植到纹状体治疗PD模型大鼠

将实施例4储备的中脑神经细胞定向移植到帕金森病模型大鼠的纹状体中，饲养2周后，每周大鼠腹腔注射Amphetamine(3mg/kg)一次，测转45分钟，记录PD模型大鼠的自转圈数，观测6个月，数据表明大鼠的自转圈数明显减少，与未进行细胞移植的帕金森病模型大鼠相比，有显著差别(P＜0.05)。

本发明相关的DNA序列序列1(a) 序列特征

长度：558bp

类型：核酸

链数：双链

几何结构：线性(b) 分子类型：DNA(基因组)(c) 来源：人胎脑

ATGAAGTTATGGGATGTCGTGGCTGTCTGCCTGGTGCTGCTCCACACCGCG

TCCGCCTTCCCGCTGCCCGCCGCAAATAGTCCAGAGGATTATCCTGATCAG

TTCGATGATGTCATGGATTTTATTCAAGCCACCATTAAAAGACTGAAAAGG

TCGCCAGATAAACAAATGGCAGTGCTTCCTACAAGAGAGCGGAATCGGCA

GGCTGCAGCTGCCAACCCAGAGAATTCCAGAGGAAAAGGTCGGAGAGGC

CAGAGGGGCAAAAACCGGGGTTGTGTCTTAACTGCAATACATTTAAATGT

CACTGACTTGGGTCTGGGCTATGAAACCAAGGAGGAACTGATTTTTAGGT

ACTGCAGCGGCTCTTGCGATGCAGCTGAGACAACGTACGACAAAATATTG

AAAAACTTATCCAGAAATAGAAGGCTGGTGAGTGACAAAGTAGGGCAGG

CATGTTGCAGACCCATCGCCTTTGATGATGACCTGTGGTTTTTAGATGATAA

CCTGGTTTACCATATTCTAAGAAAGCATTCCGCTAAAAGGTGTGGATGTATC

TGA(终止密码子)序列2(a) 序列特征

长度：1575bp

类型：核酸

链数：双链

几何结构：线性(b) 分子类型：DNA(基因组)

来源：人类组织

ATGCCCACCCCCGACGCCACCACGCCACAGGCCAAGGGCTTCCGCAGGGCC

GTGTCTGAGCTGGACGCCAAGCAGGCAGAGGCCATCATGGGCGCCCCGGGG

CCCAGCCTCACAGGCTCTCCGTGGCCTGGAACTGCAGCCCCAGCTGCATCCT

ACACCCCCACCCCAAGGTCCCCGCGGTTCATTGGGCGCAGGCAGAGCCTCA

TCGAGGACGCCCGCAAGGAGCGGGAGGCGGCGGTGGCAGCAGCGGCCGCT

GCAGTCCCCTCGGAGCCCGGGGACCCCCTGGAGGCTGTGGCCTTTGAGGAG

AAGGAGGGGAAGGCCGTGCTAAACCTGCTCTTCTCCCCGAGGGCCACCAAG

CCCTCGGCGCTGTCCCGAGCTGTGAAGGTGTTTGAGACGTTTGAAGCCAAA

ATCCACCATCTAGAGACCCGGCCCGCCCAGAGGCCGCGAGCTGGGGGCCCC

CACCTGGAGTACTTCGTGCGCCTCGAGGTGCGCCGAGGGGACCTGGCCGCC

CTGCTCAGTGGTGTGCGCCAGGTGTCAGAGGACGTGCGCAGCCCCGCGGGG

CCCAAGGTCCCCTGGTTCCCAAGAAAAGTGTCAGAGCTGGACAAGTGTCAT

CACCTGGTCACCAAGTTCGACCCTGACCTGGACTTGGACCACCCGGGCTTC

TCGGACCAGGTGTACCGCCAGCGCAGGAAGCTGATTGCTGAGATCGCCTTC

CAGTACAGGCACGGCGACCCGATTCCCCGTGTGGAGTACACCGCCGAGGAG

ATTGCCACCTGGAAGGAGGTCTACACCACGCTGAAGGGCCTCTACGCCACG

CACGCCTGCGGGGAGCACCTGGAGGCCTTTGCTTTGCTGGAGCGCTTCAGC

GGCTACCGGGAAGACAATATCCCCCAGCTGGAGGACGTCTCCCGCTTCCTG

AAGGAGCGCACGGGCTTCCAGCTGCGGCCTGTGGCCGGCCTGCTGTCCGCC

CGGGACTTCCTGGCCAGCCTGGCCTTCCGCGTGTTCCAGTGCACCCAGTATA

TCCGCCACGCGTCCTCGCCCATGCACTCCCCTGAGCCGGACTGCTGCCACG

AGCTGCTGGGGCACGTGCCCATGCTGGCCGACCGCACCTTCGCGCAGTTCT

CGCAGGACATTGGCCTGGCGTCCCTGGGGGCCTCGGATGAGGAAATTGAGA

AGCTGTCCACGCTGTCATGGTTCACGGTGGAGTTCGGGCTGTGTAAGCAGA

ACGGGGAGGTGAAGGCCTATGGTGCCGGGCTGCTGTCCTCCTACGGGGAGC

TCCTGCACTGCCTGTCTGAGGAGCCTGAGATTCGGGCCTTCGACCCTGAGG

CTGCGGCCGTGCAGCCCTACCAAGACCAGACGTACCAGTCAGTCTACTTCGT

GTCTGAGAGCTTCAGTGACGCCAAGGACAAGCTCAGGAGCTATGCCTCACG

CATCCAGCGCCCCTTCTCCGTGAAGTTCGACCCGTACACGCTGGCCATCGAC

GTGCTGGACAGCCCCCAGGCCGTGCGGCGCTCCCTGGAGGGTGTCCAGGAT

GAGCTGGACACCCTTGCCCATGCGCTGAGTGCCATTGGCTAG(终止密码子)序列3(a) 序列特征

长度：145bp

类型：核酸

链数：单链

几何结构：线性带发夹结构(b) 分子类型：DNA

来源：Hela细胞中感染的腺病毒伴随病毒2H型

左侧末端反向重复序列(ITR-L)：

TTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACC

AAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAG

CGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCT

右侧末端反向重复序列(ITR-R)：

AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCG

CTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCC

GGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAA序列4(a) 序列特征

长度：557bp

类型：核酸

链数：双链

几何结构：线性(b) 分子类型：DNA(基因组)

来源：人工构建

CGGGGCCGCGGAGGCTGGATCGGTCCCGGTGTCTTCTATGGAGGTCAAAA

CAGCGTGGATGGCGTCTCCAGGCGATCTGACGGTTCACTAAACGAGCTCT

GCTTATATAGGTCGAGTTTACCACTCCCTATCAGTGATAGAGAAAAGTGAA

AGTCGAGTTTACCACTCCCTATCAGTGATAGAGAAAAGTGAAAGTCGAGT

TTACCACTCCCTATCAGTGATAGAGAAAAGTGAAAGTCGAGTTTACCACTC

CCTATCAGTGATAGAGAAAAGTGAAAGTCGAGTTTACCACTCCCTATCAGT

GATAGAGAAAAGTGAAAGTCGAGTTTACCACTCCCTATCAGTGATAGAGA

AAAGTGAAAGTCGAGTTTACCACTCCCTATCAGTGATAGAGAAAAGTGAA

AGTCGAGCTCGGTACCCGGGTCGAGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGCCTAT

ATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCGCCTGGAGACGCCATCC

ACGCTGTTTTGACCTCCATAGAAGACACCGGGACCGATCCAGCCTCCGCG

GCCC序列5(a) 序列特征

长度：222bp

类型：核酸

链数：双链

几何结构：线性(b) 分子类型：DNA(基因组)

来源：SV40病毒

CAGACATGATAAGATACATTGATGAGTTTGGACAAACCACAACTAGAA

TGCAGTGAAAAAAATGCTTTATTTGTGAAATTTGTGATGCTATTGCTTT

ATTTGTAACCATTATAAGCTGCAATAAACAAGTTAACAACAACAATTGC

ATTCATTTTATGTTTCAGGTTCAGGGGGAGATGTGGGAGGTTTTTTAAA

GCAAGTAAAACCTCTACAAATGTGGTA序列6(a) 序列特征

长度：452bp

类型：核酸

链数：双链

几何结构：线性(b) 分子类型：DNA(基因组)

来源：SV40病毒

AGACATGATAAGATACATTGATGAGTTTGGACAAACCACAACTAGAAT

GCAGTGAAAAAAATGCTTTATTTGTGAAATTTGTGATGCTATTGCTTTA

TTTGTAACCATTATAAGCTGCAATAAACAAGTTAACAACAACAATTGCA

TTCATTTTATGTTTCAGGTTCAGGGGGAGGTGTGGGAGGTTTTTTAAA

GCAAGTAAAACCTCTACAAATGTGGTATGGCTGATTATGATCCTGCAAG

CCTCGTCGTCTGGCCGGACCACGCTATCTGTGCAAGGTCCCCGGACGC

GCGCTCCATGAGCAGAGCGCCCGCCGCCGAGGCAAGACTCGGGCGGC

GCCCTGCCCGTCCCACCAGGTCAACAGGCGGTAACCGGCCTCTTCATC

GGGAATGCGCGCGACCTTCAGCATCGCCGGCATGTCCCCTGGCGGAC

GGGAAGTATCAGCTCGACC专利参考文献

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Claims

1.一种腺病毒伴随病毒载体，其构成特征从5’端至3’端如下：

(a).AAV-2型的5’ITR、多聚腺苷酸序列-1、人胶质源性神经营养因子(humanglial-derived neurotrophic factor，hGDNF)基因序列、双向四环素反应启动子、人酪氨酸羟化酶(human tyrosine hydroxylase，hTH)基因序列、多聚腺苷酸序列-2和AAV-2型的3’ITR序列；

(b).两个ITR之外，AAV载体质粒携带有氨苄青霉素抗性基因表达盒和/或新霉素抗性基因表达盒；

2.根据权利要求1，人GDNF序列可以是1、2、3型或是新克隆的任何一种类型基因；

3.根据权利要求1，人TH序列可以是1、2、3、4型或是新克隆的任何一种类型基因；

4.根据权利要求1，双向四环素反应启动子为四环素反应元件(tetO)序列两端融合相同或不同的启动子序列；

5.根据权利要求4，启动子可以是单纯疱疹病毒的TK启动子、SV40启动子、JC病毒启动子、胶质纤维酸性蛋白启动子等；

6.根据权利要求1，人GDNF序列和人TH序列是DNA序列，它们可以互换位置；

7.根据权利要求1、4，tetO至少有一个Tn10 tetO的序列；

8.根据权利要求1、4，tetO可以是碱基发生突变或氨基酸发生突变的DNA序列；

9.根据权利要求1，多聚腺苷酸序列-1和多聚腺苷酸序列-2可以是相同或不同，但能够稳定mRNA的DNA序列；

10.根据权利要求1，两个ITR可以分别是腺病毒伴随病毒血清1、2、3、4、5、6或7型；

11.根据权利要求1(b)，选择标记基因可以是潮霉素抗性基因、二氢叶酸还原酶基因、黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基因或腺苷脱氨酶基因等。

12.用于治疗神经退行性疾病，特别是治疗帕金森病、老年性痴呆等；