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WO2020000641A1 - 编码人nadh脱氢酶亚单位蛋白的核酸及其应用 - Google Patents

编码人nadh脱氢酶亚单位蛋白的核酸及其应用 Download PDF

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Publication number
WO2020000641A1
WO2020000641A1 PCT/CN2018/103937 CN2018103937W WO2020000641A1 WO 2020000641 A1 WO2020000641 A1 WO 2020000641A1 CN 2018103937 W CN2018103937 W CN 2018103937W WO 2020000641 A1 WO2020000641 A1 WO 2020000641A1
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WO
WIPO (PCT)
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sequence
protein
nucleic acid
seq
cells
Prior art date
Application number
PCT/CN2018/103937
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
李斌
Original Assignee
武汉纽福斯生物科技有限公司
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
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Priority claimed from CN201810703168.7A external-priority patent/CN110724695A/zh
Application filed by 武汉纽福斯生物科技有限公司 filed Critical 武汉纽福斯生物科技有限公司
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Priority to CN201980054770.5A priority patent/CN112584874A/zh
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Priority to US17/181,849 priority patent/US11352645B2/en
Priority to US17/317,295 priority patent/US20220340895A1/en
Priority to US17/320,388 priority patent/US11332741B1/en
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    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
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    • A—HUMAN NECESSITIES
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    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins

Definitions

  • the invention relates to the technical field of genetic engineering, in particular to a nucleic acid encoding a human NADH dehydrogenase subunit protein and application thereof.
  • Leber's hereditary optic neuroneopathy is a mitochondrial hereditary disease that mainly affects the macular papillary bundle fibers and causes degeneration of the optic nerve.
  • the disease is prevalent in young and middle-aged men, and the clinical manifestations are simultaneous or successive acute or subacute painless vision loss in both eyes, and may be accompanied by central visual field defect and color vision disorder.
  • the coding sequence of OPA1 has the sequence shown in SEQ ID NO.:7.
  • the fusion nucleic acid has the structure of Formula I from the 5 'end to the 3' end:
  • Z2 is a nucleotide sequence according to the first aspect of the invention.
  • the Z1 is a COX10 coding sequence or an OPA1 coding sequence.
  • Bits 610-2034 are 3'-UTR sequences.
  • the vector is an AAV vector containing or inserted with the nucleotide sequence according to the first aspect of the present invention or the fusion nucleic acid according to the second aspect of the present invention; preferably the AAV vector plasmid pSNaV .
  • a host cell containing the vector according to the third aspect of the present invention, or the genome of which the exogenous nucleotide sequence of the first aspect of the present invention is integrated Or the fusion nucleic acid according to the second aspect of the present invention.
  • Figure 5 shows the fundus photographs of rabbit eyes under glass microscope, where A is the rAAV2 / 2-optimized ND6 group (experimental group A1), B is the rAAV2 / 2-ND6 group (experimental group B1), and C is rAAV2- EGFP group (control group C1).
  • NADH dehydrogenase subunit 1 protein used interchangeably.
  • human NADH dehydrogenase subunit 1 protein used interchangeably.
  • ND1 (protein) used interchangeably.
  • AAV vectors can be prepared using standard methods in the art. Any serotype of adeno-associated virus is suitable. Methods for purifying vectors can be found in, for example, U.S. Patent Nos. 6566118, 6989264, and 6995006, the disclosures of which are incorporated herein by reference in their entirety. The preparation of hybrid vectors is described, for example, in PCT Application No. PCT / US2005 / 027091, the disclosure of which is incorporated herein by reference in its entirety. The use of AAV-derived vectors for in vitro and in vivo transport of genes has been described (see, for example, International Patent Application Publication Nos. WO91 / 18088 and WO93 / 09239; U.S. Patent Nos.
  • the present invention provides a coding sequence of NADH dehydrogenase subunit 1 protein and application thereof. It has been found through research that the optimized ND1 coding sequence of the present invention makes the expression of ND1 protein more efficient, and more ND1 protein plays a physiological role in the patient's optic ganglion cells.
  • the nucleic acid encoding the human NADH dehydrogenase subunit 1 protein according to the present invention has a nucleotide sequence as shown in SEQ ID NO :: 3 or 4, and has a full length of 951 bp.
  • sequence fragments that affect gene expression and protein localization.
  • sequence fragments include, but are not limited to, codon usage preferences, eliminate secondary structures (such as hairpin structures) that are not conducive to expression, and change GC content. CpG dinucleotide content, mRNA secondary structure, concealed splice sites, early polyadenylation sites, internal ribosome entry sites and binding sites, negative CpG islands, RNA unstable regions, repeating sequences ( Direct repeats, inverted repeats, etc.) and restriction sites that may affect cloning.
  • SEQ ID NO.:4 a specially optimized DNA coding sequence as shown in SEQ ID NO.:4 is finally obtained. This sequence is specially optimized, and the expression of ND1 is significantly increased.
  • fusion nucleic acid refers to a nucleic acid formed by joining two or more nucleotide sequences from different sources, or two or more nucleosides from the same source but whose natural positions are not linked to each other. Nucleic acid formed by linking acid sequences.
  • the protein encoded by the fusion nucleic acid of the present invention is called a fusion protein, and in the present invention, it is an ND6 fusion protein or an ND1 fusion protein.
  • the coding sequence of the mitochondrial targeting peptide is the COX10 gene as shown in SEQ ID NO: 5 or 6.
  • the COX10 sequence shown in SEQ ID NO.:5 is the original COX10 coding sequence
  • the COX10 sequence shown in SEQ ID NO.:6 is the COX10 coding sequence obtained after targeted optimization.
  • the sequence of the fusion nucleic acid is shown as SEQ ID NO .: 9 or 10.
  • the COX10 gene is a mitochondrial targeting sequence that guides the ND6 protein into the mitochondria and exerts its physiological functions.
  • the 3'UTR is a non-coding sequence designed behind the ND6 protein. Its role is to stabilize the expression of the COX10 gene mitochondrial targeting sequence and the ND6 sequence. .
  • the sequence of the fusion nucleic acid is shown as SEQ ID NO .: 11 or 12.
  • the COX10 gene is a mitochondrial targeting sequence, which guides the ND1 protein into the mitochondria and exerts its physiological functions.
  • the 3'UTR (Untranslated Region) is a non-coding region and is designed behind the ND1 protein to stabilize the expression of mitochondrial targeting sequences and ND1 .
  • a nucleic acid sequence encoding a ND6 or ND1 protein is provided as a vector, preferably an expression vector is provided.
  • an expression vector is provided.
  • it is provided as a gene therapy vector that is preferably suitable for transduction and expression in retinal target cells.
  • the vector can be viral or non-viral (e.g., a plasmid).
  • Viral vectors include those derived from: adenovirus, adeno-associated virus (AAV) including mutant forms, retroviruses, lentivirus, herpes virus, vaccinia virus, MMLV, GaLV, simian immunodeficiency virus (SIV) , HIV, pox virus, and SV40.
  • the viral vector is replication-defective, although it is envisaged that it may be replication-deficient, capable of replication or conditionally replicating.
  • Viral vectors can often maintain an extrachromosomal state without integrating into the genome of target retinal cells.
  • a preferred viral vector for introducing a nucleic acid sequence encoding an ND6 or ND1 protein to a retinal target cell is an AAV vector, such as a self-complementary adeno-associated virus (scAAV).
  • scAAV self-complementary adeno-associated virus
  • Selective targeting can be achieved using specific AAV serotypes (AAV serotype 2 to AAV serotype 12) or modified versions of any of these serotypes (including AAV 4YF and AAV 7m8 vectors).
  • Viral vectors can be modified to delete any non-essential sequences.
  • the virus in AAV, can be modified to delete all or part of the IX gene, Ela, and / or Elb gene.
  • helper virus such as adenovirus
  • replication is very inefficient.
  • the replication gene and the capsid gene are provided in trans (in the pRep / Cap plasmid), and only the 2ITR of the AAV genome is retained and packaged into the virion, while the adenovirus gene is required Provided by adenovirus or another plasmid. Similar modifications can also be made to lentiviral vectors.
  • a suitable promoter is the immediate early cytomegalovirus (CMV) promoter sequence.
  • the promoter sequence is a strongly constitutive promoter sequence capable of driving high-level expression of any polynucleotide sequence operably linked thereto.
  • Another example of a suitable promoter is elongation growth factor-1 ⁇ (EF-1 ⁇ ).
  • constitutive promoter sequences can also be used, including but not limited to the simian virus 40 (SV40) early promoter, mouse breast cancer virus (MMTV), human immunodeficiency virus (HIV) long terminal repeat (LTR) promoter, MoMuLV promoter, avian leukemia virus promoter, Epstein-Barr virus immediate early promoter, Russ sarcoma virus promoter, and human gene promoters such as, but not limited to, the actin promoter , Myosin promoter, heme promoter, and creatine kinase promoter.
  • the present invention should not be limited to the application of a constitutive promoter. Inducible promoters are also considered as part of the invention.
  • the invention also provides a host cell for expressing ND6 or ND1 protein.
  • the host cell is a mammalian cell (preferably a human, more preferably a human optic nerve cell or a photoreceptor cell), which increases the expression of the ND6 or ND1 protein.
  • the optimized nucleic acid encoding human ND6 or ND1 protein has a higher expression level, which translates more ND6 or ND1 fusion proteins, while the COX10 sequence can accurately locate the ND6 or ND1 fusion protein on the mitochondrial inner membrane, so there are more Many ND6 or ND1 proteins are transfected into mitochondria.
  • the agent for fusion nucleic acid of the present invention is injected into the vitreous cavity of a rabbit eye, and the agent maintains viability in the vitreous cavity and is transfected into optic nerve cells.
  • Optimized ND6 or ND1 nucleic acid encodes more ND6 or ND1 protein than the prior art, which has higher transfection efficiency and can better treat Leber hereditary optic neuropathy.
  • the optimized COX10 sequence or OPA1 sequence of the present invention can accurately locate the ND6 or ND1 fusion protein on the mitochondrial inner membrane, so more ND6 or ND1 proteins are transfected into the mitochondria.
  • rabbits were divided into 3 groups: experimental group 1-1, experimental group 1-2 and control group.
  • the cells are lysed after the lysate has been in contact with the cells for 1-2 seconds.
  • agarose gel electrophoresis (as shown in Figure 9) found that the ND1 target band was around 950bp, indicating that the selected plasmid was the target plasmid.
  • Real-time PCR was performed on a Real-time PCR Detection System instrument.
  • a Real-time PCR Detection System instrument In a 0.2 mL PCR reaction tube, 12.5 ⁇ L of SYBR Green mix, 8 ⁇ L of ddH 2 O, 1 ⁇ L of each primer, 2.5 ⁇ L of cDNA sample, and 25 ⁇ L of the total system were added.
  • Each sample was used to amplify both the target gene and the internal reference gene rabbit ⁇ -actin.
  • Each gene was amplified in triplicate.
  • the reagents common to each PCR reaction tube can be added together and then aliquoted. After loading, perform Real-time PCR.
  • a melting curve analysis of 94 ° C to 55 ° C was performed.
  • the relative quantitative method was used to study the difference in gene expression. This method does not need to make a standard curve.
  • the housekeeping gene rabbit ⁇ -actin is used as the internal reference gene.
  • the analysis software that comes with the instrument can automatically generate expression values.
  • the coding sequence of ND1 (SEQ ID No .: 3) of Example 7 is specially optimized, and the optimized ND1 coding sequence (SEQ ID No .: 4) is obtained, and the 5 'of the gene is optimized at ND1.
  • the optimized mitochondrial coding sequence of COX10 (as shown in SEQ ID NO.:6) is ligated to the end, and the UTR sequence of 3 'end of ND1 optimized gene is shown (shown as SEQ ID NO.:8).
  • the sequence of the gene (or fusion nucleic acid) is shown in SEQ ID NO.:12. All gene sequences were synthesized by Chengdu Qingke Zixi Biotechnology Co., Ltd.
  • the homology between the specially optimized coding sequence shown in SEQ ID No.:12 and SEQ ID No.:11 at position 1-1035 (that is, the COX10-ND1 coding sequence) is only 77.68% (804/1035). ).
  • mice taken 24 rabbits divided into 3 groups, 3mm away from the limbal puncture pars into the vitreous cavity, for intravitreal injection, were divided into experimental groups A3 (injected 10 10 vg / 50ul rAAV2 / 2- optimization ND1 ), Experimental group B3 (injected 10 10 vg / 50ul rAAV2 / 2-ND1) and control group C3 (injected 10 10 vg / 50ul rAAV2-EGFP).
  • experimental groups A3 injected 10 10 vg / 50ul rAAV2 / 2- optimization ND1
  • Experimental group B3 injected 10 10 vg / 50ul rAAV2 / 2-ND1
  • control group C3 injected 10 10 vg / 50ul rAAV2-EGFP
  • ND1-R TTTTAGGGGCTCTTTGGTGAA (SEQ ID NO.:30)

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Abstract

提供了编码人NADH脱氢酶亚单位蛋白的核酸，包含线粒体靶向肽编码序列的融合核酸，包含该核酸或融合核酸的载体、宿主细胞，重组蛋白或融合蛋白的制备方法，药物制剂，以及载体或药物制剂用于治疗遗传性视神经病变中的用途。编码人NADH脱氢酶亚单位蛋白的核酸是核苷酸序列如SEQ ID NO：1或2所示或与SEQ ID NO：1或2同源性大于等于95%的编码人NADH脱氢酶亚单位6蛋白的核酸，或核苷酸序列如SEQ ID NO：3或4所示或与SEQ ID NO：3或4同源性大于等于95%的编码人NADH脱氢酶亚单位1蛋白的核酸。

Description

编码人NADH脱氢酶亚单位蛋白的核酸及其应用 技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及编码人NADH脱氢酶亚单位蛋白的核酸及其应用。
背景技术
Leber遗传性视神经病变(Leber’s hereditary optic neuropathy，LHON)是一种主要累及黄斑乳头束纤维，导致视神经退行性变的线粒体遗传性疾病。本病好发于青中年男性，临床表现为双眼同时或先后急性或亚急性无痛性视力减退，同时可伴有中心视野缺损及色觉障碍。
Leber遗传性视神经病变(LHON)与线粒体DNA的突变有关，至今人们已经发现了很多与疾病相关的线粒体DNA(Mitochondrial DNA，mtDNA)突变。mtDNA突变影响氧化磷酸化的功能，导致ATP产生缺乏，供能不足，导致细胞无法正常地进行代谢，细胞发生退变、坏死或调亡，组织和器官的功能衰退，出现相应的临床症状。目前国内由于基因突变导致的LHON患者中95％以上与线粒体的三个原发位点相关，包括：11778位点突变(人NADH脱氢酶亚单位4，即ND4)，占90％左右；14484位点突变(人NADH脱氢酶亚单位6，即ND6)，占4-5％左右；3460位点突变(人NADH脱氢酶亚单位1，即ND1)，占1％左右。14484位点是中国人群能够引起LHON的三个高发位点之一，主要是ND6基因的第14484位核苷酸由T突变成C，突变后使ND6亚基第64位编码的起始氨基酸甲硫氨酸替换成缬氨酸，该位点低度保守，该突变使呼吸链复合物I的活性降低，从而减少视神经细胞ATP的产生，细胞逐渐凋亡，从而导致患者发生LHON。3460位点作为高发位点之一，其预后很差，很多患者双眼视力在0.1以下。在3460位点的突变主要是ND1基因的第3460位核苷酸由胞嘧啶(C)突变成腺嘌呤(A)，造成丙氨酸转换成苏氨酸，此突变使得复合物I的活性丧失20％，从而减少视神经细胞ATP的产生，细胞逐渐凋亡，从而导致患者发生LHON。
LHON目前尚无方法治疗，是世界公认的青少年致盲眼病之一，随着基因治疗的发展，LHON的基因治疗成为可能，其中的难点在于转染的基因进入细胞核，而LHON的突变位点在线粒体DNA，是线粒体中蛋白异常所致。但是目前国内外均没有治疗ND6(14484位点突变)或ND1(3460位点突变)导致的LHON的有效治疗方法。ND4是现在的国内外研究的重点，ND6和ND1的相关治疗研究由于病例过少，现在并无单独的研究专利和文献。
因此，本领域亟需开发一种高效表达人NADH脱氢酶亚单位6蛋白或人NADH脱氢酶亚单位1蛋白的表达体系及制备方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种高效表达人NADH脱氢酶亚单位6蛋白或人NADH脱氢酶亚单位1蛋白的表达体系及制备方法。
本发明的第一方面，提供了一种核苷酸序列，所述核苷酸序列选自下组：
(a)编码人NADH脱氢酶亚单位6蛋白的核苷酸序列，且所述核苷酸序列如SEQ ID NO.:1或2所示；
(b)编码人NADH脱氢酶亚单位1蛋白的核苷酸序列，且所述核苷酸序列如SEQ ID NO.:3或4所示；
(c)与SEQ ID NO.:1-4中任一所示的核苷酸序列的同源性≥95％(优选地≥98％，更优选地≥99％)，且编码人NADH脱氢酶亚单位6蛋白或人NADH脱氢酶亚单位1蛋白的核苷酸序列；和
(d)与(a)-(c)任一所述的核苷酸序列互补的核苷酸序列。
在另一优选例中，所述核苷酸序列包括DNA序列、cDNA序列、或mRNA序列。
在另一优选例中，所述核苷酸序列包括单链序列和双链序列。
本发明的第二方面，提供了一种融合核酸，所述融合核酸包含如本发明第一方面所述的核苷酸序列。
在另一优选例中，所述融合核酸还包含选自下组的序列：线粒体靶向肽的编码序列、UTR序列、或其组合。
在另一优选例中，所述线粒体靶向肽的编码序列包括：COX10的编码序列和/或OPA1的编码序列。
在另一优选例中，所述COX10的编码序列具有如SEQ ID NO.:5或6所示的序列。
在另一优选例中，所述OPA1的编码序列具有如SEQ ID NO.:7所示的序列。
在另一优选例中，所述UTR序列包括3’-UTR和/或5’-UTR，较佳地为3’-UTR。
在另一优选例中，所述UTR序列具有如SEQ ID NO.:8所示的序列。
在另一优选例中，所述融合核酸从5’端-3’端具有式I结构：
Z0-Z1-Z2-Z3  (I)
式中，
各“-”独立地为键或核苷酸连接序列；
Z0为无、或5’-UTR序列；
Z1为线粒体靶向肽的编码序列；
Z2为如本发明第一方面所述的核苷酸序列；和
Z3为3’-UTR序列。
在另一优选例中，所述的Z1为COX10的编码序列或OPA1的编码序列。
在另一优选例中，所述融合核酸从5’-3’端的结构为COX10-ND6-UTR；较佳地，所述融合核酸序列如SEQ ID NO.:9或10所示。
在另一优选例中，所述序列如SEQ ID NO.:9或10所示的融合核酸中，
第1-84位为COX10的编码序列；
第85-609位为编码人NADH脱氢酶亚单位6蛋白的核苷酸序列；
第610-2034位为3’-UTR序列。
在另一优选例中，所述融合核酸从5’-3’端的结构为COX10-ND1-UTR；较佳地，所述融合核酸序列如SEQ ID NO.:11或12所示。
在另一优选例中，所述序列如SEQ ID NO.:11或12所示的融合核酸中，
第1-84位为COX10的编码序列；
第85-1035位为编码人NADH脱氢酶亚单位1蛋白的核苷酸序列；
第1036-2460位为3’-UTR序列。
在另一优选例中，所述融合核酸从5’-3’端的结构为OPA1-ND6-UTR或OPA1-ND1-UTR。
在另一优选例中，各个核苷酸连接序列的长度为1-30nt，较佳地1-15nt，更佳地3-6nt。
在另一优选例中，所述的核苷酸连接序列来源于限制性内切酶酶切形成的核苷酸接头序列。
本发明的第三方面，提供了一种载体，所述载体含有如本发明第一方面所述的核苷酸序列或本发明第二方面所述的融合核酸。
在另一优选例中，所述载体包含一个或多个启动子，所述启动子可操作地与所述核酸序列、增强子、转录终止信号、多腺苷酸化序列、复制起点、选择性标记、核酸限制性位点、和/或同源重组位点连接。
在另一优选例中，所述的载体包括质粒、病毒载体。
在另一优选例中，所述的载体包括DNA病毒、逆转录病毒载体。
在另一优选例中，所述的载体选自下组：慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、或其组合。较佳地，所述载体为AAV载体。
在另一优选例中，所述AAV载体的血清型选自：AAV2、AAV5、AAV7、AAV8、或其组合。
在另一优选例中，所述载体为含有或插入有本发明第一方面所述的核苷酸序列或本发明第二方面所述的融合核酸的AAV载体；较佳地为AAV载体质粒pSNaV。
在另一优选例中，所述载体的骨架为腺相关病毒载体质粒pSNaV。
在另一优选例中，所述载体用于表达重组人NADH脱氢酶亚单位6蛋白或人NADH脱氢酶亚单位1蛋白。
本发明的第四方面，提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞含有本发明第三方面所述的载体，或其基因组中整合有外源的本发明第一方面所述的核苷酸序列或本发明第二方面所述的融合核酸。
在另一优选例中，所述宿主细胞为哺乳动物细胞，所述哺乳动物包括人和非人哺乳动物。
在另一优选例中，所述宿主细胞选自下组：HEK293细胞、感光细胞(包括锥状细胞和/或杆状细胞)、其他视觉细胞(如双节细胞)、(视)神经细胞、或其组合。
在另一优选例中，所述宿主细胞选自下组：视杆细胞、视锥细胞、给光双极细胞、撤光双极细胞、水平细胞、神经节细胞、无长突细胞、或其组合。较佳地，所述宿主细胞为(视网膜)神经节细胞。
本发明的第五方面，提供了如本发明第三方面所述的载体的用途，用于制备一制剂或组合物，所述制剂或组合物用于恢复受试者视力和/或治疗眼部疾病。
在另一优选例中，所述眼部疾病为视神经退化性疾病。
在另一优选例中，所述制剂或组合物用于治疗视网膜神经节细胞的局灶性退化。
在另一优选例中，所述制剂或组合物用于治疗遗传性视神经病变，较佳地为Leber遗传性视神经病变(LHON)。
本发明的第六方面，提供了一种药物制剂，所述的制剂含有(a)本发明第三方面所述的载体，以及(b)药学上可接受的载体或赋形剂。
在另一优选例中，所述药物制剂的剂型选自下组：冻干制剂、液体制剂、或其组合。较佳地，所述药物制剂的剂型为注射剂型。
在另一优选例中，所述的载体选自下组：慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、或其组合。较佳地，所述载体为AAV载体。
在另一优选例中，所述药物制剂中载体的含量为1×10 9-1×10 16，较佳地1×10 12-1×10 13个病毒/毫升。
在另一优选例中，所述药物制剂用于治疗眼部疾病，较佳地治疗视神经退化性疾病，更佳地治疗视网膜神经节细胞的局灶性退化。
在另一优选例中，所述药物制剂用于治疗遗传性视神经病变，较佳地为Leber遗传性视神经病变(LHON)。
本发明的第七方面，提供了一种治疗方法，所述方法包括将本发明第三方面所述的载体施用于需要的对象。
在另一优选例中，所述的载体选自下组：慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、或其组合。较佳地，所述载体为AAV载体。
在另一优选例中，将所述载体引入到需要的对象的眼睛内。
在另一优选例中，所述需要的对象包括人和非人哺乳动物。
在另一优选例中，所述治疗方法为治疗眼部疾病的方法。
在另一优选例中，所述眼部疾病为遗传性视神经病变，较佳地为Leber遗传性视神经病变(LHON)。
本发明的第八方面，提供了一种重组人NADH脱氢酶亚单位6蛋白或人NADH脱氢酶亚单位1蛋白的制备方法，包括步骤：培养本发明第四方面所述的宿主细胞，从而得到重组人NADH脱氢酶亚单位6蛋白或人NADH脱氢酶亚单位1蛋白。
本发明的第九方面，提供了一种如本发明第二方面所述的融合核酸编码的融合蛋白。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了重组质粒pSNaV/rAAV2/2-ND6结构图，其中MTS指线粒体定位序列。
图2显示了PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图，其中M为Marker，泳道1和2均为ND6。
图3显示了兔子的眼底照相，其中A为rAAV-ND6注射组，B为rAAV-GFP注射组，C为PBS注射组。
图4显示了兔子的视网膜荧光照相，其中A为rAAV-GFP注射组，B为PBS注射组。
图5显示了兔眼玻切镜下眼底拍照，其中A为注射rAAV2/2-优化ND6组(实验组A1)，B为注射rAAV2/2-ND6组(实验组B1)，C为注射rAAV2-EGFP组(对照组C1)。
图6显示了293T细胞分别感染rAAV2/2-优化ND6组(实验组A2)，rAAV2/2-ND6组(实验组B2)，rAAV2-EGFP组(对照组C2)，ND6基因mRNA水平相对表达量。
图7显示了293T细胞分别感染rAAV2/2-优化ND6组(实验组A2)，rAAV2/2-ND6组(实验组B2)，rAAV2-EGFP组(对照组C2)，ND6蛋白水平相对表达量。
图8显示了重组质粒pSNaV/rAAV2/2-ND1结构图，其中MTS指线粒体定位序列。
图9显示了PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图，其中M为Marker，泳道1为ND1。
图10显示了兔子的眼底照相，其中A为rAAV2/2-ND1注射组，B为rAAV-GFP注射组，C为PBS注射组。
图11显示了兔子的视网膜荧光照相，其中A为rAAV-GFP注射组，B为PBS注射组。
图12显示了兔眼玻切镜下眼底拍照，其中A为注射rAAV2/2-优化ND1组(实验组A3)，B为注射rAAV2/2-ND1组(实验组B3)，C为注射rAAV2-EGFP组(对照组C3)。
图13显示了293T细胞分别感染rAAV2/2-优化ND1组(实验组A4)，rAAV2/2-ND1组(实验组B4)，rAAV2-EGFP组(对照组C4)，ND1基因mRNA水平相对表达量。
图14显示了293T细胞分别感染rAAV2/2-优化ND1组(实验组A4)，rAAV2/2-ND1组(实验组B4)，rAAV2-EGFP组(对照组C4)，ND1蛋白水平相对表达量。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，对重组人NADH脱氢酶亚单位6或1蛋白基因编码序列进行了针对性优化设计，从而获得了一种特别适合在哺乳动物(如人)细胞中进行高效转录和高效表达ND6或ND1蛋白并转染至线粒体内的核苷酸序列和融合核酸，并构建了重组人NADH脱氢酶亚单位4蛋白的重组表达载体。经过特殊优化后的ND6或ND1编码序列，其重组人NADH脱氢酶亚单位6或1蛋白表达量显著提高，至少提高两倍以上。优化后的ND6编码序列的转录水平也略有提高，并且能有效进入线粒体内，发挥正常的线粒体ND6或ND1蛋白的生理功能，达到治疗LHON的目的。在此基础上，发明人完成了本发明。
术语
为了可以更容易地理解本公开，首先定义某些术语。如本申请中所使用的，除非本文另有明确规定，否则以下术语中的每一个应具有下面给出的含义。在整个申请中阐述了其它定义。
术语“约”可以是指在本领域普通技术人员确定的特定值或组成的可接受误差范围内的值或组成，其将部分地取决于如何测量或测定值或组成。例如，如本文所用，表述“约100”包括99和101和之间的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。
如本文所用，术语“含有”或“包括(包含)”可以是开放式、半封闭式和封闭式的。换言之，所述术语也包括“基本上由…构成”、或“由…构成”。
序列同一性通过沿着预定的比较窗(其可以是参考核苷酸序列或蛋白的长度的50％、60％、70％、80％、90％、95％或100％)比较两个对齐的序列，并且确定出现相同的残基的位置的数目来确定。通常地，这表示为百分比。核苷酸序列的序列同一性的测量是本领域技术人员熟知的方法。
如本文使用的，术语“受试者”、“需要的对象”指任何哺乳动物或非哺乳动物。哺乳动物包括但不限于人类、脊椎动物诸如啮齿类、非人类灵长类、牛、马、狗、猫、猪、绵羊、山羊。
术语“NADH脱氢酶亚单位6蛋白”、“人NADH脱氢酶亚单位6蛋白”、“ND6(蛋白)”、“重组人NADH脱氢酶亚单位6蛋白”和“本发明ND6蛋白”可互换使用。
术语“NADH脱氢酶亚单位1蛋白”、“人NADH脱氢酶亚单位1蛋白”、“ND1(蛋白)”、“重组人NADH脱氢酶亚单位1蛋白”和“本发明ND1蛋白”可互换使用。
腺相关病毒
腺相关病毒(adeno-associated virus，AAV),也称腺伴随病毒,属于微小病毒科依赖病毒属,是目前发现的一类结构最简单的单链DNA缺陷型病毒，需要辅助病毒(通常为腺病毒)参与复制。它编码两个末端的反向重复序列(ITR)中的cap和rep基因。ITRs对于病毒的复制和包装具有决定性作用。cap基因编码病毒衣壳蛋白，rep基因参与病毒的复制和整合。AAV能感染多种细胞。
重组腺相关病毒载体(rAAV)源于非致病的野生型腺相关病毒，由于其安全性好、宿主细胞范围广(分裂和非分裂细胞)、免疫源性低，在体内表达外源基因时间长等特点，被视为最有前途的基因转移载体之一，在世界范围内的基因治疗和疫苗研究中得到广泛应用。经过10余年的研究，重组腺相关病毒的生物学特性己被深入了解，尤其是其在各种细胞、组织和体内实验中的应用效果方面已经积累了许多资料。在医学研究中，rAAV被用于多种疾病的基因治疗的研究(包括体内、体外实验)；同时作为一种有特点的基因转移载体，还广泛用于基因功能研究、构建疾病模型、制备基因敲除鼠等方面。
在本发明一个优选的实施例中，载体为重组AAV载体。AAV是相对较小的DNA病毒，其可以稳定和位点特异性方式整合到它们所感染的细胞的基因组中。它们能够感染一大系列的细胞而不对细胞生长、形态或分化产生任何影响，并且它们似乎并不涉及人体病理学。AAV基因组己被克隆、测序及表征。AAV含有大约4700碱基并在每个末端包含约145个碱基的反向末端重复序列(ITR)区域，其作为病毒的复制起点。该基因组的其余被分成两个带有衣壳化功能的重要区域：包含涉及病毒复制和病毒基因表达的rep基因的基因组左边部分；以及包含编码病毒衣壳蛋白的cap基因的基因组右边部分。
AAV载体可采用本领域的标准方法制备。任何血清型的腺相关病毒均是合适的。用于纯化载体的方法可见于例如美国专利No.6566118、6989264和6995006，它们的公开内容整体以引用方式并入本文。杂合载体的制备在例如PCT申请No.PCT/US2005/027091中有所描述，该申请的公开内容整体以引用方式并入本文。用于体外和体内转运基因的衍生自AAV的载体的使用己有描述(参见例如国际专利申请公布No.WO91/18088和WO93/09239；美国专利No.4,797,368、6,596,535和5,139,941，以及欧洲专利No.0488528，它们均整体以引用方式并入本文)。这些专利公布描述了其中rep和/或cap基因缺失并被所关注的基因替换的各种来源于AAV的构建体，以及这些构建体在体外(进入培养的细胞中)或体内(直接进入生物体)转运所关注的基因的用途。复制缺陷重组AAV可通过将以下质粒共转染进被人类辅助病毒(例如腺病毒)感染的细胞系而制备：所含的所关注核酸序列的侧翼为两个AAV反向末端重复序列(ITR)区域的质粒，和携带AAV衣壳化基因(rep和cap基因)的质粒。然后通过标准技术纯化所产生的AAV重组体。
在一些实施方案中，重组载体被衣壳化到病毒粒子(例如包括但不限于AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV14、AAV15和AAV16的AAV病毒粒子)中。因此，本公开包括含有本文所述的任何载体的重组病毒粒子(因其包含重组多核苷酸而为重组的)。产生这样的粒子的方法是本领域己知的， 并在美国专利No.6,596,535中有所描述。
核酸编码序列
本发明的要解决的技术问题是克服现有技术中NADH脱氢酶亚单位6(ND6)或NADH脱氢酶亚单位1(ND1)序列无法转染至线粒体内、治疗效果不佳的技术问题。为了解决上述技术问题，提供了如本发明第一方面所述的核苷酸序列。
具体地，本发明提供一种NADH脱氢酶亚单位6蛋白的编码序列及其应用。经研究发现，本发明ND6编码序列转染至线粒体内的ND6蛋白量更多，有更多的ND6蛋白在患者视神经节细胞发挥生理作用。本发明所述的编码人NADH脱氢酶亚单位6蛋白的核酸，其核苷酸序列如SEQ ID NO.:1或2所示，全长为525bp。
具体地，本发明提供一种NADH脱氢酶亚单位1蛋白的编码序列及其应用。经研究发现，本发明优化的ND1编码序列，使ND1蛋白表达效率更高，有更多的ND1蛋白在患者视神经节细胞发挥生理作用。本发明所述的编码人NADH脱氢酶亚单位1蛋白的核酸，其核苷酸序列如SEQ ID NO.:3或4所示，全长为951bp。
本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。在另一优选例中，所述核苷酸为DNA。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。本发明的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据已公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明多肽(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。
本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或多肽编码序列经基因工程产生的宿主细胞。上述多核苷酸、载体或宿主细胞可以是分离的。如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。
在本发明较佳的实施方式中，所述核苷酸序列如SEQ ID NO.:1-4中任一所示。
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。应用PCR技术扩增DNA/RNA的方法被优选用于获得本发明的基因。用于PCR的引物可根据本文所公开的本发明的序列信息适当地选择，并可用常规方法合成。可用常规方法如通过凝胶电泳分离和纯化扩增的DNA/RNA片段。
本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或蛋白编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术利用所述宿主细胞表达ND6或ND1蛋白的方法。
通过常规的重组DNA技术，可利用本发明的多核苷酸序列获得表达本发明ND6或ND1 蛋白的宿主细胞(如哺乳动物细胞)。一般来说包括步骤：将本发明第一方面所述的多核苷酸、或本发明第二方面所述的融合核酸、或本发明第三方面所述的载体转导入宿主细胞内。
本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含本发明多肽的编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达多肽。
宿主细胞可以是原核细胞，或是低等真核细胞，或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞(包括人和非人哺乳动物)。代表性例子有：CHO、NS0、COS7、或293细胞的动物细胞等。在本发明的一个优选实施方式中，选择HEK细胞、感光细胞(包括锥状细胞和/或杆状细胞)、其他视觉细胞(如双节细胞)、神经细胞为宿主细胞。在另一优选例中，所述宿主细胞选自下组：视杆细胞、视锥细胞、给光双极细胞、撤光双极细胞、水平细胞、神经节细胞、无长突细胞、或其组合。
用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl 2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl 2。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的蛋白质。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。
在上面的方法中的多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
ND6编码序列优化
本发明将ND6的线粒体编码序列改变为核编码序列(如SEQ ID NO.:1所示)，其在细胞核里编码出正常的ND6蛋白质，与其在线粒体中编码的蛋白质完全相同。
Figure PCTCN2018103937-appb-000001
此外，本发明还优化了影响基因表达和蛋白定位的序列片段，这些序列片段包括但不 限于，密码子使用偏好性，消除不利于表达的二级结构(如发夹结构)，改变GC含量，CpG二核苷酸含量，mRNA的二级结构，隐蔽剪接位点，早期多聚腺苷化位点，内部核糖体进入位点和结合位点，负CpG岛，RNA不稳定区，重复序列(直接重复、反向重复等)和可能影响克隆的限制性位点。通过分析和试验筛选，最终得到如SEQ ID NO.:2所示的特别优化的DNA编码序列。此序列是经过特殊优化，转录水平略有提高，ND6表达量显著提高。
如本文所用，所述“优化的ND6编码序列”、“ND6优化基因”、“ND6优化基因核酸”和“优化ND6编码基因”均指经过特殊优化后的编码ND6蛋白的核苷酸序列(如SEQ ID NO.:2所示)。所述优化的ND6编码序列的ND6蛋白的表达量显著提高。
Figure PCTCN2018103937-appb-000002
ND1编码序列优化
本发明将ND1的线粒体编码序列改变为核编码序列(如SEQ ID NO.:3所示)，其在细胞核里编码出正常的ND1蛋白质，与其在线粒体中编码的蛋白质完全相同。
Figure PCTCN2018103937-appb-000003
此外，本发明还优化了影响基因表达和蛋白定位的序列片段，这些序列片段包括但不限于，密码子使用偏好性，消除不利于表达的二级结构(如发夹结构)，改变GC含量，CpG二核苷酸含量，mRNA的二级结构，隐蔽剪接位点，早期多聚腺苷化位点，内部核糖体进入位点和结合位点，负CpG岛，RNA不稳定区，重复序列(直接重复、反向重复等)和可能影响克隆的限制性位点。通过分析和试验筛选，最终得到如SEQ ID NO.:4所示的特别优化的DNA编码序列。此序列是经过特殊优化，ND1表达量显著提高。
如本文所用，所述“优化的ND1编码序列”、“ND1优化基因”、“ND1优化基因核酸”和“优化ND1编码基因”均指经过特殊优化后的编码ND1蛋白的核苷酸序列(如SEQ ID NO.:4所示)。所述优化的ND1编码序列的ND1蛋白的表达量显著提高。
Figure PCTCN2018103937-appb-000004
Figure PCTCN2018103937-appb-000005
融合核酸
本发明还提供了一种融合核酸，其包含本发明第一方面所述的核苷酸序列。
如本文所用，“融合核酸”指由两个或两个以上不同来源的核苷酸序列连接而成的核酸，或者由同一来源但其天然位置并不互相连接的两个或两个以上核苷酸序列连接而成的核酸。本发明的融合核酸所编码的蛋白称作融合蛋白，在本发明中即ND6融合蛋白或ND1融合蛋白。
在本发明的一个优选实施方式中，所述的融合核酸在编码人ND6或ND1蛋白的核酸可操作性地连接有线粒体靶向肽的编码序列和/或UTR序列。本发明融合核酸末端有线粒体定位序列(或称线粒体靶向序列，Mitochondrial targeting sequence，MTS)，可将细胞核里编码好的ND6或ND1蛋白引导到线粒体中，发挥正常的线粒体ND6或ND1蛋白的生理功能，达到治疗LHON的目的。
优选地，当所述的编码人ND6或ND1蛋白的核酸连接了线粒体靶向肽的编码序列时，所述线粒体靶向肽的编码序列为如SEQ ID NO.:5或6所示的COX10基因的线粒体靶向肽的编码序列(简称COX10序列)，或如SEQ ID NO.:7所示的OPA1(optic atrophy 1，视神经萎缩相关蛋白1抗体)基因的线粒体靶向肽的编码序列(简称OPA1序列)；当所述的编码ND6或ND1蛋白的核酸连接了UTR序列时，所述UTR序列如SEQ ID NO.:8所示。其中，如SEQ ID NO.:5所示的COX10序列为原COX10编码序列，如SEQ ID NO.:6所示的COX10序列为经过针对性优化后得到的COX10编码序列。
Figure PCTCN2018103937-appb-000006
Figure PCTCN2018103937-appb-000007
在另一优选例中，在所述融合核酸中，所述COX10的编码序列、所述编码人ND6或ND1蛋白的核酸、所述UTR序列由5’端至3’端依次排列。
在另一优选例中，所述融合核酸的序列如SEQ ID NO.:9或10所示。COX10基因为线粒体靶向序列，引导ND6蛋白进入到线粒体中，发挥其生理功能，3’UTR是非编码序列，设计在ND6蛋白的后面，其作用是稳定COX10基因线粒体靶向序列和ND6序列的表达。
在SEQ ID NO.:9所示的序列中，ND6融合蛋白的核酸的序列全长为2034bp，自1bp至84bp为COX10基因的线粒体靶向序列(共84bp)(下划线部分)；85bp至609bp为ND6基因(共525bp)，610bp至2034bp为3’UTR(共1425bp)。
Figure PCTCN2018103937-appb-000008
在SEQ ID NO.:10所示的序列中，ND6融合蛋白的优化核酸的序列全长为2034bp，自1bp至84bp为优化后的COX10基因的线粒体靶向序列(共84bp)(下划线部分)；85bp至609bp为ND6优化基因(共525bp)，610bp至2034bp为3’UTR(共1425bp)。
Figure PCTCN2018103937-appb-000009
Figure PCTCN2018103937-appb-000010
在另一优选例中，所述融合核酸的序列如SEQ ID NO.:11或12所示。COX10基因为线粒体靶向序列，引导ND1蛋白进入到线粒体中，发挥其生理功能，3’UTR(Untranslated Region)是非编码区，设计在ND1蛋白的后面，作用是稳定线粒体靶向序列和ND1的表达。
在SEQ ID NO.:11所示的序列中，ND1融合核酸的序列全长为2460bp，自1bp至84bp为COX10基因的线粒体靶向序列(共84bp)(下划线部分)；85bp至1035bp为ND1基因序列(共951bp)，1036bp至2460bp为3’UTR序列(共1425bp)。
Figure PCTCN2018103937-appb-000011
Figure PCTCN2018103937-appb-000012
在SEQ ID NO.:12所示的序列中，ND1融合蛋白的优化核酸的序列全长为2460bp，自1bp至84bp为优化后的COX10基因的线粒体靶向序列(共84bp)(下划线部分)；85bp至1035bp为ND1基因序列(共951bp)，1036bp至2460bp为3’UTR序列(共1425bp)。
Figure PCTCN2018103937-appb-000013
表达载体和宿主细胞
本发明还提供了一种用于ND6或ND1蛋白的表达载体，它含有本发明的优化ND6或ND1编码序列。
通过提供的序列信息，熟练的技术人员可以使用可用的克隆技术以产生适于转导进入 细胞的核酸序列或载体。
优选地，编码ND6或ND1蛋白的核酸序列作为载体，优选地表达载体被提供。优选地，其可作为优选地适用于在视网膜靶细胞中转导和表达的基因治疗载体被提供。载体可以是病毒的或非病毒的(例如质粒)。病毒载体包括源自以下的那些病毒载体:腺病毒、包括突变的形式的腺相关病毒(AAV)、逆转录病毒、慢病毒、疱疹病毒、牛痘病毒、MMLV、GaLV、猿猴免疫缺陷病毒(SIV)、HIV、痘病毒和SV40。优选地，病毒载体是复制缺陷的(replication defective)，尽管设想其可以是复制缺乏的(replication deficient)、能够复制或条件性复制的。病毒载体通常可以保持染色体外状态而不整合进入靶视网膜细胞的基因组。用于向视网膜靶细胞引入编码ND6或ND1蛋白的核酸序列的优选的病毒载体是AAV载体，例如自身互补的腺相关病毒(scAAV)。使用特定的AAV血清型(AAV血清型2到AAV血清型12)或这些血清型中的任何一个的修饰的版本(包括AAV 4YF和AAV 7m8载体)可以实现选择性靶向。
病毒载体可被修饰以缺失任何非必需的序列。例如，AAV中，病毒可被修饰以缺失全部或部分的IX基因、Ela和/或Elb基因。对于野生型AAV，没有辅助病毒诸如腺病毒的存在，复制是非常低效率的。对于重组的腺相关病毒，优选地，复制基因和衣壳基因以反式被提供(在pRep/Cap质粒中)，并且仅AAV基因组的2ITR被保留并且包装进入病毒体，同时需要的腺病毒基因被被腺病毒或另一个质粒提供。也可对慢病毒载体做出类似的修饰。
病毒载体具有进入细胞的能力。然而，非病毒载体诸如质粒可与剂复合以有利于病毒载体被靶细胞的摄取。此类剂包括聚阳离子剂。可选地，递送系统诸如基于脂质体的递送系统可被使用。用于在本发明中使用的载体优选地适于在体内或体外使用，并且优选地适于在人类中使用。
载体将优选地包含一个或多个调节序列以指导核酸序列在视网膜靶细胞中的表达。调节序列可以包括与核酸序列可操作地连接的启动子、增强子、转录终止信号、多腺苷酸化序列、复制起点、核酸限制性位点、和同源重组位点。载体还可包括选择性标记，例如来确定载体在生长系统(例如细菌细胞)中或在视网膜靶细胞中的表达。
“可操作地连接”意指，核酸序列在功能上与其可操作地连接的序列相关，以使得它们以使得它们影响彼此的表达或功能的方式连接。例如，与启动子可操作地连接的核酸序列将具有被启动子影响的表达模式。
启动子介导与其连接的核酸序列的表达。启动子可以是组成型的或可以是诱导型的。启动子可以指导在内视网膜细胞中遍在的表达，或神经元特异的表达。在后一种情况中，启动子可以指导细胞类型特异的表达，例如对给视神经节细胞。合适的启动子将是本领域技术人员己知的。例如，合适的启动子可以选自由以下组成的组:L7、thy-1、恢复蛋白、钙结合蛋白、人类CMV、GAD-67、鸡β肌动蛋白、hSyn、Grm6、Grm6增强子SV40融合蛋白。使用细胞特异的启动子可以实现靶向，例如Grm6-SV40用于选择性靶向给视神经细胞。Grm6启动子是Grm6基因的200碱基对增强子序列和SV40真核启动予的融合体，Grm6基因编码给视神经细胞特异的代谢型谷氨酸受体mGluR6。Grm6基因的优选的来源是小鼠和人类。使用泛-神经元的启动子可以实现遍在的表达，其实例在本领域是己知的并且可得的。一个此类实例是CAG。CAG启动于是CMV早期增强子和鸡β肌动蛋白启动子的融合体。
合适的启动子的一个例子为即时早期巨细胞病毒(CMV)启动子序列。该启动子序列为能够驱动可操作地连接至其上的任何多核苷酸序列高水平表达的强组成型启动子序列。合适的启动子的另一个例子为延伸生长因子-1α(EF-1α)。然而，也可使用其他组成型启动子序列，包括但不限于类人猿病毒40(SV40)早期启动子、小鼠乳癌病毒(MMTV)、人免疫缺陷病毒(HIV)长末端重复(LTR)启动子、MoMuLV启动子、鸟类白血病病毒启动子、艾伯斯坦-巴尔(Epstein-Barr)病毒即时早期启动子、鲁斯氏肉瘤病毒启动子、以及人基因启动子，诸如但不限于肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、血红素启动子和肌酸激酶启动子。进一步地，本发明不应被限于组成型启动子的应用。诱导型启动子也被考虑为本发明的一部分。诱导型启动子的使用提供了分子开关，其能够当这样的表达是期望的时，打开可操作地连接诱导型启动子的多核苷酸序列的表达，或当表达是不期望的时关闭表达。诱导型启动子的例子包括但不限于金属硫蛋白启动子、糖皮质激素启动子、孕酮启动子和四环素启动子。许多表达载体可应用ND6或ND1蛋白在哺乳动物细胞(较佳地为人，更佳地为人视神经细胞或感光细胞)表达。本发明优选用腺相关病毒作为表达载体。
本发明还提供了一种宿主细胞，用于表达ND6或ND1蛋白。优选地，所述宿主细胞为哺乳动物细胞(较佳地为人，更佳地为人视神经细胞或感光细胞)，提高ND6或ND1蛋白的表达量。
制剂和组合物
本发明提供一种制剂或组合物，所述制剂或组合物含有(a)本发明第三方面所述的载体，以及(b)药学上可接受的载体或赋形剂。
在另一优选例中，所述药物制剂用于治疗眼部疾病；较佳地，所述药物制剂用于治疗遗传性视神经病变，较佳地为Leber遗传性视神经病变(LHON)。
本发明所述药物组合物中的“活性成分”是指本发明所述的载体(vector)，例如病毒载体(包括腺相关病毒载体)。本发明所述的“活性成分”、制剂和/或组合物可用于治疗眼部疾病。“安全有效量”指的是：活性成分的量足以明显改善病情或症状，而不至于产生严重的副作用。“药学上可接受的载体或赋形剂(excipient)”指的是：一种或多种相容性固体或液体填料或凝胶物质，它们适合于人使用，而且必须有足够的纯度和足够低的毒性。“相容性”在此指的是组合物中各组份能和本发明的活性成分以及它们之间相互掺和，而不明显降低活性成分的药效。
组合物可以是液体或固体，例如粉末、凝胶或糊剂。优选地，组合物是液体，优选地可注射液体。合适的赋形剂将是本领域技术人员己知的。
在本发明中，所述载体可通过视网膜下或玻璃体内施用向眼睛施用。在任一种施用模式中，优选地，载体作为可注射液体被提供。优选地可注射液体作为胶囊或注射器被提供。
药学上可以接受的载体部分例子有纤维素及其衍生物(如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素钠、纤维素乙酸酯等)、明胶、滑石、固体润滑剂(如硬脂酸、硬脂酸镁)、硫酸钙、植物油(如豆油、芝麻油、花生油、橄榄油等)、多元醇(如丙二醇、甘油、甘露醇、山梨醇等)、乳化剂(如
Figure PCTCN2018103937-appb-000014
)、润湿剂(如十二烷基硫酸钠)、着色剂、调味剂、稳定剂、抗氧化剂、防腐剂、无热原水等。
组合物可包含生理上可接受的无菌含水或无水溶液、分散液、悬浮液或乳液，和用于 重新溶解成无菌的可注射溶液或分散液的无菌粉末。适宜的含水和非水载体、稀释剂、溶剂或赋形剂包括水、乙醇、多元醇及其适宜的混合物。
本发明提供的编码ND6或ND1的核酸或融合核酸，可以体外或体内生产ND6或ND1蛋白、或ND6或ND1融合蛋白，所述融合蛋白或者含所述融合蛋白的制剂可应用于制备治疗Leber遗传性视神经病变的药物。
经优化的编码人ND6或ND1蛋白的核酸表达量更高，从而翻译出更多的ND6或ND1融合蛋白，而COX10序列可以准确地将ND6或ND1融合蛋白定位到线粒体内膜上，因此有更多的ND6或ND1蛋白转染到在线粒体中。将本发明融合核酸的药剂注入兔眼玻璃体腔中，该药剂在玻璃体腔内保持活力，并转染到视神经细胞。优化ND6或ND1核酸编码比现有技术表达更多的ND6或ND1蛋白，其转染效率更高，能较好地治疗Leber遗传性视神经病变。
与现有技术相比，本发明主要具有以下优点：
1.本发明对ND6和ND1的核苷酸进行改进，将ND6和ND1的线粒体编码序列改变为核编码序列，使其在细胞核里编码出正常的ND6或ND1蛋白质，并与在线粒体编码的蛋白质完全相同，能够非常有效地治疗Leber遗传性视神经病变。
2.本发明在ND6和ND1的编码序列末端连接有线粒体定位序列，可将细胞核里编码好的ND6或ND1蛋白引导到线粒体中，发挥正常的线粒体ND6或ND1蛋白的生理功能，达到治疗LHON的目的。
3.本发明对重组人ND6和ND1编码基因序列进行了特殊优化。与ND6和ND1的未优化的DNA编码序列相比，优化后的序列ND6和ND1蛋白表达量显著提高、生物活性高。其中优化后的ND6编码序列的转录水平也略有提高。
4.本发明优化后的COX10序列或OPA1序列可以准确地ND6或ND1融合蛋白定位到线粒体内膜上，因此有更多的ND6或ND1蛋白转染到在线粒体中。
5.本发明优化的ND6或ND1编码基因或融合核酸能够非常有效地治疗Leber遗传性视神经病变，并且安全性好。
下面结合具体实施，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
实施例1 pSNaV/rAAV2/2-ND6质粒的构建和重组腺相关病毒的制备
1、pSNaV/rAAV2/2-ND6质粒的构建
获取人NADH脱氢酶亚单位6(ND6)的核苷酸序列(NCBI参考序列：NC_024511.2)，本发明改变了ND6的线粒体编码序列为核编码序列(如SEQ ID NO.:1所示)，并在ND6基因的5’端连接COX10的线粒体编码序列(如SEQ ID NO.:5所示)，ND6基因的3’端连接UTR序列(如SEQ ID NO.:8所示)，所得融合基因(或称融合核酸)的序列如SEQ ID NO.:9所示，所有基因序列均由成都擎科梓熙生物技术有限公司合成。
将重组人NADH脱氢酶亚单位6融合基因用加了Kpn I和Sal I两个酶切位点的引物进行PCR扩增全长基因，通过Kpn I/Sal I的酶切，在融合基因上形成粘性末端，并将融合基因嵌入有Kpn I/SalI酶切位点的质粒载体pSNaV(BioVector)得到重组腺相关病毒表达载体，命名为pSNaV/rAAV2/2-ND6(简称rAAV2/2-ND6)(如图1所示)。
2、重组子的筛选和鉴定
将上述得到的pSNaV/rAAV2/2-ND6涂布于平板上，取37℃培养后的LB平板，出现蓝斑和白斑，其中白色为重组克隆。挑取白色的菌落加入到含有100mg/L Amp的LB液体培养基中，在37℃200rpm培养8h。培养好后取菌液，提取质粒pSNaV/rAAV2/2-ND6，质粒提取步骤参照Biomiga说明书，使用ND6全长引物进行PCR鉴定。
ND6全长引物设计如下：
ND6全长-正向引物：5’-ATGATGTATGCTTTGTTTCTG-3’(SEQ ID NO.:13)
ND6全长-反向引物：5’-CTAATTCCCCCGAGCAATCTC-3’(SEQ ID NO.:14)
PCR后进行琼脂糖凝胶电泳(如图2所示)发现在525bp左右有ND6目的条带，说明筛选出的质粒为目的质粒。
3、细胞转染
转染前一天，将HEK293细胞接种于225cm 2细胞培养瓶中，接种密度3.0×10 7个/mL细胞，培养基为DMEM+10％牛血清，置37℃含5％CO 2的培养箱中培养过夜；转染当天换液，用新鲜的含10％牛血清的DMEM培养基继续培养。待细胞生长至80～90％时，弃去培养基，用PlasmidTrans II(VGTC)转染试剂盒进行转染。具体步骤为：
(a)每个转染瓶取pAd Helper(购于BioVector)、pAAV-r2c2(购于BioVector)、pSNaV/rAAV2/2-ND6质粒按要求比例与DMEM+PlasmidTrans II(VGTC)(转染试剂)在1.5mL无菌Ep管中混匀，编号为A试剂，室温静止10～15min；
(b)将A试剂同30mL DMEM+10％牛血清混合均匀，编号为B试剂；
(c)将B试剂均匀加入细胞培养瓶中，37℃含5％CO 2的培养箱中继续培养；
(d)转染16h后，换完全培养基(DMEM+10％牛血清)。
转染48h后，收取细胞，将收取细胞用PBS重悬，并反复冻融3次。
4、重组腺相关病毒rAAV2/2-ND6的分离、浓缩和纯化
采用氯仿处理-PEG/NaCl沉淀-氯仿抽提三个步骤进行分离、浓缩和纯化得到重组腺相关病毒rAAV2/2-ND6，具体步骤如下：
4.1病毒的收集：1)准备干冰乙醇浴(或液氮)和37℃水浴；2)将上述1.3中收取的细胞连同培养基一同收集到一个15ml的离心管中；3)1000rpm/min，离心3分钟，分离细胞和上清，将上清另外存放，细胞用1ml PBS重悬；4)将细胞悬浮液在干冰乙醇浴和37℃水浴中反复转移，冻融四次，冻和融各10分钟，每次融解后稍加震荡。
4.2病毒的浓缩：1)10,000g离心去除细胞碎片，将离心得到的上清转移到一个新离心管中；2)用0.45μm滤器过滤除杂质；3)加入1/2体积的1M NaCl，10％PEG8000溶液，混合均匀，4℃过夜；4)12,000rpm离心2h，弃上清，病毒沉淀用适量的PBS溶液溶解，待完全溶解后用0.22μm滤器过滤除菌；5)加入Benzonase核酸酶消化去除残留的质粒DNA(终浓度为50U/ml)。合上管盖，颠倒几次以充分混合。在37℃孵育30分钟；6)用0.45μm过滤头过滤，取滤出液，即为浓缩的rAAV2/2-ND6病毒液。
4.3病毒的纯化：1)向浓缩的rAAV2/2-ND6病毒液中添加固体CsCl直到密度为1.41g/ml(折射率为1.372)；2)将样品加入到超速离心管中，用预先配好的1.41g/ml CsCl溶液将离心管剩余空间填满；3)在175,000g下离心24小时，以形成密度梯度。按顺序分步收集不同密度的样品，取样进行滴度测定。收集富集有rAAV2颗粒的组分；4)重复上述过程一次。将病毒装入100kDa的透析袋，4℃透析脱盐过夜。至此，获得浓缩和纯化的重组腺相关病毒rAAV2/2-ND6。
实施例2 rAAV2/2-ND6的滴度测定
用地高辛标记的H1探针点杂交方法检测病毒液中rAAV2/2-ND6的物理滴度。将质粒pSNAV-ND6准确定量，用稀释缓冲液以一系列稀释度稀释后点到尼龙膜上；待测的病毒液rAAV2/2-ND6样品用DNase I和RNase于37℃消化1h。提取rAAV2/2-ND6病毒基因组，沸水浴5min变性之后置于冰浴中。用试剂盒提供的稀释缓冲液以一定比列做系列稀释后点膜。预杂交、杂交、洗膜、显色按Boehringer Mannheim公司试剂盒说明书进行。通过计算pSNAV-ND6的拷贝数、再乘以与其杂交信号强度一致的病毒液样品的稀释倍数而得出rAAV2/2-ND6的基因组滴度为2.0×10 11vg/mL。
实施例3兔眼玻璃体腔注射rAAV2/2-ND6试验
1、取24只兔子分为3组：实验组1-1、实验组1-2和对照组。分别用rAAV2/2-ND6、rAAV-GFP和PBS在距角膜缘外3mm处穿刺睫状体平坦部进入玻璃体腔内，进行玻璃体腔注射。
2、眼压、眼底照相检查
3组兔子分别于术后1、7、30天眼压的检查,所有兔子均无明显异常，无结膜充血、分泌物，无眼内炎，眼压均无升高。术后30天的眼底照相如图3所示，所有兔子的视网膜血管和视神经均无明显并发症或损害。表明正规标准的玻璃体腔注射不会发生明显的炎症反应或其他并发症。
3、视网膜的荧光照相
玻璃体腔注射30天后，GFP组视网膜的荧光照相如图4所示，GFP成功地被表达在视网膜上，表明以rAAV为载体，携带GFP基因转染兔眼玻璃体内可以正常表达，间接证明rAAV2/2-ND6重组基因可以在视网膜上表达。
4、Real-time PCR检测ND6的表达
分别利用TRIZOL试剂盒提取rAAV2/2-ND6组和PBS组视兔神经细胞总RNA并反转录合成cDNA模板。然后根据荧光定量PCR的引物设计原则，用primer premier 5设计引物(β-actin作为内参)：
β-actin-正向引物：CGAGATCGTGCGGGACAT(SEQ ID NO.:15)
β-actin-反向引物：CAGGAAGGAGGGCTGGAAC(SEQ ID NO.:16)
ND6-正向引物：AGTGTGGGTTTAGTAATG(SEQ ID NO.:17)
ND6-反向引物：TGCCTCAGGATACTCCTC(SEQ ID NO.:18)
在Real-time PCR Detection System仪器上进行Real-time PCR。在0.2mL的PCR反应管中加入SYBR Green mix12.5μL、ddH 2O 8μL、引物各1μL，cDNA样品2.5μL， 总体系25μL。每个样品既要用于扩增目的基因又要扩增内参基因兔β-actin，各个基因的扩增都做三个重复。实际加样时，为减小误差，各PCR反应管中共有的试剂可加在一起然后分装。加样完毕，进行Real-time PCR。按照95℃预变性1s，然后94℃变性15s、55℃退火15s、72℃延伸25s共40个循环的反应程序进行扩增，并于每个循环的延伸阶段采集荧光信号。反应结束后做94℃～55℃的融解曲线分析。
采用相对定量方法研究基因表达量的差异，该方法无需制作标准曲线，以看家基因兔β-actin为内参基因，仪器自带的分析软件即可自动生成表达数值，rAAV2/2-ND6组和PBS组分别为0.59±0.06和0.41±0.03，表明rAAV2/2-ND6实验组视网膜上ND6的表达明显比对照组高(P＜0.01)。
实施例4 pSNaV/rAAV2/2-优化ND6质粒的构建和重组腺相关病毒的制备
本实施例对实施例1的ND6的编码序列(SEQ ID NO.:1)进行了特殊优化，得到了优化后的ND6编码序列(SEQ ID NO.:2)，并在ND6优化基因的5’端连接优化后的COX10的线粒体编码序列(如SEQ ID NO.:6所示)，ND6优化基因的3’端连接UTR序列(如SEQ ID NO.:8所示)，所得优化后的ND6融合基因(或称融合核酸)的序列如SEQ ID NO.:10所示，所有基因序列均由成都擎科梓熙生物技术有限公司合成。所述特殊优化后的SEQ ID NO.:10所示的编码序列和SEQ ID NO.:9的第1-609位(即COX10-ND6编码序列)的同源性仅为70.28％(428/609)。
将优化后的ND6融合核酸用加了Kpn I和Sal I两个酶切位点的引物进行PCR扩增全长基因，通过Kpn I/Sal I的酶切，在融合基因上形成粘性末端，并将融合基因嵌入有Kpn I/SalI酶切位点的质粒载体pSNaV(BioVector)得到重组腺相关病毒表达载体，命名为pSNaV/rAAV2/2-优化ND6(简称rAAV2/2-优化ND6)。
实验方法同实施例1，用pSNaV/rAAV2/2-优化ND6质粒代替实施例1中的pSNaV/rAAV2/2-ND6质粒。最后得到浓缩和纯化的重组腺相关病毒rAAV2/2-优化ND6。
实施例5兔子安全性实验
1兔眼玻璃体腔注射
取24只兔子分为3组，在距角膜缘外3mm处穿刺睫状体平坦部进入玻璃体腔内，进行玻璃体腔注射，分为实验组A1(注射10 10vg/50ul rAAV2/2-优化ND6)、实验组B1(注射10 10vg/50ul rAAV2/2-ND6)和对照组C1(注射10 10vg/50ul rAAV2-EGFP)。
2裂隙灯、眼压、眼底照相检查
两组兔子分别于术后1、7、30天进行裂隙灯，眼压的检查。
检查结果显示，所有兔子均无明显异常，无结膜充血、分泌物，无眼内炎，眼压均无升高。术后一个月的眼底照相显示。如图5所示，所有兔子的视网膜血管和视神经均无明显并发症或损害，表明正规标准的玻璃体腔注射不会发生明显的炎症反应或其他并发症。
实施例6体外细胞有效性实验
1、细胞感染
取6孔板分为3组，分别接种5×10 5细胞在每个孔内，接种一天后，细胞计数在1×10 6 左右，分别接种10 10vg/50ul rAAV2/2-优化ND6、rAAV2/2-ND6和rAAV2-EGFP，标注为实验组A2、实验组B2和对照组C2。感染2天后，分别提取mRNA和总蛋白进行检测分析。
2、Real-Time PCR检测ND6基因的表达
首先用NCBI的保守结构域分析软件分析ND6的保守结构，确保所设计引物的扩增片段位于非保守区；然后根据荧光定量PCR的引物设计原则，用premier 5设计引物：
β-actin-F：CTCCATCCTGGCCTCGCTGT(SEQ ID NO.:19)
β-actin-R：GCTGTCACCTTCACCGTTCC(SEQ ID NO.:20)
ND6-F：GGGTTTTCTTCTAAGCCTTCTCC(SEQ ID NO.:21)
ND6-R：CCATCATACTCTTTCACCCACAG(SEQ ID NO.:22)
优化ND6-F：CGCCTGCTGACCGGCTGCGT(SEQ ID NO.:23)
优化ND6-R：CCAGGCCTCGGGGTACTCCT(SEQ ID NO.:24)
1)提取RNA、反转录
利用TRIZOL试剂盒提取不同实验组兔子视网膜的总RNA并反转录合成cDNA模板。
2)荧光定量PCR的反应体系和反应程序
在Real-time PCR Detection System仪器上进行荧光定量PCR。在0.2mL的PCR反应管中加入SYBR Green mix 10.0μL、dd H 2O 8μL，一对引物各0.5μL，cDNA样品1μL，总体系20L。每个样品既要用于扩增目的基因又要扩增内参基因兔-actin，各个基因的扩增都做三个重复。实际加样时，为减小误差，各PCR反应管中共有的试剂可加在一起然后分装。加样完毕，进行荧光定量PCR。按照95℃预变性1s，94℃变性15s，55℃退火15s，72℃延伸45s，共40个循环的反应程序进行扩增，并于每个循环的延伸阶段采集荧光信号。反应结束后做94℃～55℃的融解曲线分析。采用2-△△CT相对定量方法(Livak等，2001)研究基因表达量的差异，该方法无需制作标准曲线，以看家基因兔-actin为内参基因，仪器自带的分析软件即可自动生成表达数值。
结果如图6所示，实验组A2、实验组B2的ND6基因mRNA的相对表达量均比对照组C2的ND6基因相对表达量高(P＜0.05)，说明感染rAAV2/2-优化ND6和rAAV2/2-ND6的293T细胞表达ND6基因；实验组A2的mRNA的水平相对表达水平比实验组B2略高。
3、Western blot检测ND6蛋白的表达
分离不同实验组的293T细胞，用细胞总蛋白提取试剂盒提取总蛋白，按100μL/50mg组织加入对应体积的RIPA裂解液，混匀。取适当量的裂解液，在使用前数分钟内加入PMSF，使PMSF的最终浓度为1mM。对于贴壁细胞：去除培养液，用PBS、生理盐水或无血清培养液洗一遍(如果血清中的蛋白没有干扰，可以不洗)。按照6孔板每孔加入150-250微升裂解液的比例加入裂解液。用枪吹打数下，使裂解液和细胞充分接触。通常裂解液接触细胞1-2秒后，细胞就会被裂解。对于悬浮细胞：离心收集细胞，用手指把细胞用力弹散。按照6孔板每孔细胞加入150-250微升裂解液的比例加入裂解液。再用手指轻弹以充分裂解细胞。充分裂解后应没有明显的细胞沉淀。如果细胞量较多，必需分装成50-100万细胞/管，然后再裂解。充分裂解后，10000-14000g离心3-5分钟，取上清。BCA法测定蛋白浓度后，按总蛋白50μg计算实验组和对照组上样体积，进行SDS-PAGE凝胶电泳和Westernblot。一抗和二抗体孵育后进行化学发光成像拍照。
结果如图7所示，蛋白质印迹的实验组A2的ND6相对表达水平明明显高于实验组B2和对 照组C2，有显著差异P＞0.05，说明优化ND6序列可以正常翻译成ND6蛋白，且更适合在人体细胞内表达，相对表达量明显提高。
实施例7 pSNaV/rAAV2/2-ND1质粒的构建和重组腺相关病毒的制备
1、质粒的构建
获取人NADH脱氢酶亚单位1(ND1)的核苷酸序列后(NCBI参考序列：NC_011137.1)，将ND1的线粒体编码序列改变为核编码序列(如SEQ ID NO.:3所示)，并在ND1基因的5’端连接COX10的线粒体编码序列(如SEQ ID NO.:5所示)，ND1基因的3’端连接UTR序列(如SEQ ID NO.:8所示)，所得融合基因(或称融合核酸)的序列如SEQ ID NO.:11所示，所有基因序列均由成都擎科梓熙生物技术有限公司合成。
将重组的人ND1融合基因用加了Kpn I和Sal I两个酶切位点的引物进行PCR扩增全长基因，通过Kpn I/Sal I的酶切，在融合基因上形成粘性末端，并将融合基因嵌入有Kpn I/Sal I酶切位点的质粒载体pSNaV(BioVector)得到重组腺相关病毒表达载体，命名为pSNaV/rAAV2/2-ND1(简称rAAV2/2-ND1)(如图8所示)。
2.重组克隆的筛选和鉴定
将上述得到的pSNaV/rAAV2/2-ND1涂布于平板上，37℃培养后取出LB平板，出现蓝斑和白斑，其中白色为重组克隆。挑取白色的菌落加入到含有100mg/L Amp的LB液体培养基中，在37℃200rpm培养8h。培养好后取菌液，提取pSNaV/rAAV2/2-ND1质粒，质粒提取步骤参照Biomiga说明书，使用ND1全长引物进行PCR鉴定。
ND1全长引物设计如下：
ND1全长-正向引物：5’-ATGGCCGCATCTCCGCACACT-3’(SEQ ID NO.:25)
ND1全长-反向引物：5’-TTAGGTTTGAGGGGGAATGCT-3’(SEQ ID NO.:26)
PCR后进行琼脂糖凝胶电泳(如图9所示)发现在950bp左右有ND1的目的条带，说明筛选出的质粒为目的质粒。
3.细胞转染和重组腺相关病毒的收集、浓缩、纯化及滴度测定
方法同实施例1-2，用pSNaV/rAAV2/2-ND1质粒代替实施例1和2中的pSNaV/rAAV2/2-ND6质粒，最后获得浓缩和纯化的重组腺相关病毒rAAV2/2-ND1，并且检测计算得出rAAV2/2-ND1的基因组滴度为2.0×10 11vg/mL。
实施例8兔眼玻璃体腔注射rAAV2/2-ND1的试验
1、玻璃体腔注射
取24只兔子分为3组：实验组2-1、实验组2-2和对照组，分别用0.1％的rAAV2/2-ND1、0.1％的rAAV-GFP和PBS在距角膜缘外3mm处穿刺睫状体平坦部进入玻璃体腔内，进行玻璃体腔注射。
2、眼压、眼底照相检查
3组兔子分别于术后1、7、30天眼压的检查，所有兔子均无明显异常，无结膜充血、分泌物，无眼内炎，眼压均无升高。术后30天的眼底照相如图10所示，所有兔子的视网膜血管和视神经均无明显并发症或损害，表明正规标准的玻璃体腔注射不会发生明显的炎症反应或其他并发症。
3、视网膜的荧光照相
玻璃体腔注射30天后，rAAV-GFP组和PBS对照组视网膜的荧光照相如图11所示，GFP成功地被表达在视网膜上，表明以rAAV为载体、携带的GFP转染至兔眼玻璃体内，间接证明了rAAV2/2-ND1重组基因可以在视网膜上表达。
4、Real-time PCR检测ND1的表达
分别利用TRIZOL试剂盒提取rAAV2/2-ND1组和PBS对照组视兔神经细胞总RNA并反转录合成cDNA模板。然后根据荧光定量PCR的引物设计原则，用primer premier 5设计引物(β-actin作为内参，β-actin的正反向引物分别如SEQ ID NO.:15和16所示)：
ND1-正向引物：AACCTCAACCTAGGCCTCCTA(SEQ ID NO.:27)
ND1-反向引物：TGGCAGGAGTAACCAGAGGTG(SEQ ID NO.:28)
在Real-time PCR Detection System仪器上进行Real-time PCR。在0.2mL的PCR反应管中加入SYBR Green mix 12.5μL、ddH 2O 8μL、引物各1μL、cDNA样品2.5μL，总体系25μL。每个样品既要用于扩增目的基因又要扩增内参基因兔β-actin，各个基因的扩增都做三个重复。实际加样时，为减小误差，各PCR反应管中共有的试剂可加在一起然后分装。加样完毕，进行Real-time PCR。
按照95℃预变性1s，然后94℃变性15s、55℃退火15s、72℃延伸30s进行40个循环的反应程序进行扩增，并于每个循环的延伸阶段采集荧光信号。反应结束后做94℃～55℃的融解曲线分析。采用相对定量方法研究基因表达量的差异，该方法无需制作标准曲线，以看家基因兔β-actin为内参基因，仪器自带的分析软件即可自动生成表达数值，rAAV2/2-ND1组和PBS对照组的结果分别为0.62±0.07和0.36±0.05，表明rAAV2/2-ND1实验组视网膜上ND1的表达明显比对照组高(P＜0.01)。
实施例9 pSNaV/rAAV2/2-优化ND1质粒的构建和重组腺相关病毒的制备
本实施例对实施例7的ND1的编码序列(SEQ ID NO.:3)进行了特殊优化，得到了优化后的ND1编码序列(SEQ ID NO.:4)，并在ND1优化基因的5’端连接优化后的COX10的线粒体编码序列(如SEQ ID NO.:6所示)，ND1优化基因的3’端连接UTR序列(如SEQ ID NO.:8所示)，所得优化后的ND1融合基因(或称融合核酸)的序列如SEQ ID NO.:12所示，所有基因序列均由成都擎科梓熙生物技术有限公司合成。所述特殊优化后的SEQ ID NO.:12所示的编码序列和SEQ ID NO.:11的第1-1035位(即COX10-ND1编码序列)的同源性仅为77.68％(804/1035)。
将优化后的ND1融合核酸用加了Kpn I和Sal I两个酶切位点的引物进行PCR扩增全长基因，通过Kpn I/Sal I的酶切，在融合基因上形成粘性末端，并将融合基因嵌入有Kpn I/SalI酶切位点的质粒载体pSNaV(BioVector)得到重组腺相关病毒表达载体，命名为pSNaV/rAAV2/2-优化ND1(简称rAAV2/2-优化ND1)。
实验方法同实施例7，用pSNaV/rAAV2/2-优化ND1质粒代替实施例7中的pSNaV/rAAV2/2-ND1质粒。最后得到浓缩和纯化的重组腺相关病毒rAAV2/2-优化ND1。
实施例10兔子安全性实验
1兔眼玻璃体腔注射
取24只兔子分为3组，在距角膜缘外3mm处穿刺睫状体平坦部进入玻璃体腔内，进行玻璃体腔注射，分为实验组A3(注射10 10vg/50ul rAAV2/2-优化ND1)、实验组B3(注射10 10vg/50ul rAAV2/2-ND1)和对照组C3(注射10 10vg/50ul rAAV2-EGFP)。
2裂隙灯、眼压、眼底照相检查
两组兔子分别于术后1、7、30天进行裂隙灯，眼压的检查。
检查结果显示所有兔子均无明显异常，无结膜充血、分泌物，无眼内炎，眼压均无升高。术后一个月的眼底照相显示。如图12所示，所有兔子的视网膜血管和视神经均无明显并发症或损害，表明正规标准的玻璃体腔注射不会发生明显的炎症反应或其他并发症。
实施例11体外细胞有效性实验
1、细胞感染
取6孔板分为3组，分别接种5×10 5细胞在每个孔内，接种一天后，细胞计数在1×10 6左右，分别接种10 10vg/50ul rAAV2/2-优化ND1、rAAV2/2-ND1和rAAV2-EGFP，标注为实验组A4、实验组B4和对照组C4。感染2天后，分别提取mRNA和总蛋白进行检测分析。
2、Real-Time PCR检测ND1基因的表达
首先用NCBI的保守结构域分析软件分析ND1的保守结构，确保所设计引物的扩增片段位于非保守区；然后根据荧光定量PCR的引物设计原则，用premier 5设计引物(β-actin作为内参，β-actin的正反向引物分别如SEQ ID NO.:19和20所示)：
ND1-F：AGGAGGCTCTGTCTGGTATCTTG(SEQ ID NO.:29)
ND1-R：TTTTAGGGGCTCTTTGGTGAA(SEQ ID NO.:30)
优化ND1-F：GCCGCCTGCTGACCGGCTGCGT(SEQ ID NO.:31)
优化ND1-R：TGATGTACAGGGTGATGGTGCTGG(SEQ ID NO.:32)
1)提取RNA、反转录
利用TRIZOL试剂盒提取不同实验组兔子视网膜的总RNA并反转录合成cDNA模板。
2)荧光定量PCR的反应体系和反应程序
在Real-time PCR Detection System仪器上进行荧光定量PCR。在0.2mL的PCR反应管中加入SYBR Green mix 10.0μL、dd H 2O 8μL，一对引物各0.5μL，cDNA样品1μL，总体系20L。每个样品既要用于扩增目的基因又要扩增内参基因兔-actin，各个基因的扩增都做三个重复。实际加样时，为减小误差，各PCR反应管中共有的试剂可加在一起然后分装。加样完毕，进行荧光定量PCR。按照95℃预变性1s，94℃变性15s，55℃退火15s，72℃延伸45s，共40个循环的反应程序进行扩增，并于每个循环的延伸阶段采集荧光信号。反应结束后做94℃～55℃的融解曲线分析。采用2-△△CT相对定量方法(Livak等，2001)研究基因表达量的差异，该方法无需制作标准曲线，以看家基因兔-actin为内参基因，仪器自带的分析软件即可自动生成表达数值。
结果如图13所示，实验组A4、实验组B4的ND1基因mRNA的相对表达量均比对照组C4的ND1基因相对表达量高(P＜0.05)，说明感染rAAV2/2-优化ND1和rAAV2/2-ND1的293T细胞表达ND1基因；实验组A4和实验组B4之间的mRNA的水平相对表达水平无显著差异(P＞0.05)。
3、Western blot检测ND1蛋白的表达
用枪吹打数下，使裂解液和细胞充分接触。通常裂解液接触细胞1-2秒后，细胞就会被裂解。对于悬浮细胞：离心收集细胞，用手指把细胞用力弹散。按照6孔板每孔细胞加入150-250微升裂解液的比例加入裂解液。再用手指轻弹以充分裂解细胞。充分裂解后应没有明显的细胞沉淀。如果细胞量较多，必需分装成50-100万细胞/管，然后再裂解。充分裂解后，10000-14000g离心3-5分钟，取上清。BCA法测定蛋白浓度后，按总蛋白50μg计算实验组和对照组上样体积，进行SDS-PAGE凝胶电泳和Western blot。抗体孵育后进行化学发光成像拍照。
结果如图14所示，蛋白质印迹的实验组A4的ND1相对表达水平明明显高于实验组B4和对照组C4，有显著差异P＞0.05，说明优化ND1序列可以正常翻译成ND1蛋白，且更适合在人体细胞内表达，相对表达量明显提高。
实施例12
将序列如SEQ ID NO.:9和10中的COX10序列(第1-84位)替换为OPA1线粒体靶向肽编码序列(SEQ ID NO.:7)，分别得到结构为OPA1-ND6-UTR的融合核酸和OPA1-优化ND6-UTR的融合核酸。
方法同实施例1-3，将其中SEQ ID NO.:9所示的融合核酸替换为上述两种融合核酸。结果发现，OPA1-ND6-UTR的融合核酸和OPA1-优化ND6-UTR的融合核酸的ND6蛋白表达水平均显著提高，均能够有效地治疗Leber遗传性视神经病变，并且安全性好。
实施例13
将序列如SEQ ID NO.:11和12中的COX10序列(第1-84位)替换为OPA1线粒体靶向肽编码序列(SEQ ID NO.:7)，分别得到结构为OPA1-ND1-UTR的融合核酸和OPA1-优化ND1-UTR的融合核酸。
方法同实施例7-8，将其中SEQ ID NO.:11所示的融合核酸替换为上述两种融合核酸。结果发现，OPA1-ND1-UTR的融合核酸和OPA1-优化ND1-UTR的融合核酸的ND1蛋白表达水平均显著提高,均能够有效地治疗Leber遗传性视神经病变，并且安全性好。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (17)

  1. 一种核苷酸序列，其特征在于，所述核苷酸序列选自下组：
    (a)编码人NADH脱氢酶亚单位6蛋白的核苷酸序列，且所述核苷酸序列如SEQ ID NO.:1或2所示；
    (b)编码人NADH脱氢酶亚单位1蛋白的核苷酸序列，且所述核苷酸序列如SEQ ID NO.:3或4所示；
    (c)与SEQ ID NO.:1-4中任一所示的核苷酸序列的同源性≥95％(优选地≥98％，更优选地≥99％)，且编码人NADH脱氢酶亚单位6蛋白或人NADH脱氢酶亚单位1蛋白的核苷酸序列；和
    (d)与(a)-(c)任一所述的核苷酸序列互补的核苷酸序列。
  2. 一种融合核酸，其特征在于，所述融合核酸包含如权利要求1所述的核苷酸序列。
  3. 如权利要求2所述的融合核酸，其特征在于，所述融合核酸还包含选自下组的序列：线粒体靶向肽的编码序列、UTR序列、或其组合。
  4. 如权利要求3所述的融合核酸，其特征在于，所述线粒体靶向肽的编码序列包括COX10的编码序列和/或OPA1的编码序列。
  5. 如权利要求4所述的融合核酸，其特征在于，所述COX10的编码序列具有如SEQ ID NO.:5或6所示的序列；所述OPA1的编码序列具有如SEQ ID NO.:7所示的序列；和/或所述UTR序列具有如SEQ ID NO.:8所示的序列。
  6. 如权利要求2所述的融合核酸，其特征在于，所述融合核酸从5’端-3’端具有式I结构：
    Z0-Z1-Z2-Z3  (I)
    式中，
    各“-”独立地为键或核苷酸连接序列；
    Z0为无、或5’-UTR序列；
    Z1为线粒体靶向肽的编码序列；
    Z2为如权利要求1所述的核苷酸序列；和
    Z3为3’-UTR序列。
  7. 如权利要求2所述的融合核酸，其特征在于，所述融合核酸具有如SEQ ID NO.:9-12中任一所示的序列。
  8. 一种载体，其特征在于，所述载体含有如权利要求1所述的核苷酸序列或权利要求2所述的融合核酸。
  9. 如权利要求8所述的载体，其特征在于，所述载体为腺相关病毒载体，较佳地，所述载体的骨架为腺相关病毒载体质粒pSNaV。
  10. 一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞含有权利要求8所述的载体，或其基因组中整合有外源的如权利要求1所述的核苷酸序列或权利要求2所述的融合核酸。
  11. 如权利要求10所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞选自下组：HEK293细胞、感光细胞(包括锥状细胞和/或杆状细胞)、其他视觉细胞(如双节细胞)、(视)神经细胞、或其组合。
  12. 如权利要求8所述的载体的用途，其特征在于，用于制备一制剂或组合物，所述制剂或组合物用于恢复受试者视力和/或治疗眼部疾病。
  13. 如权利要求12所述的用途，其特征在于，所述制剂或组合物用于治疗遗传性视神经病变，较佳地为Leber遗传性视神经病变(LHON)。
  14. 一种药物制剂，其特征在于，所述的制剂含有(a)权利要求8所述的载体，以及(b)药学上可接受的载体或赋形剂。
  15. 一种治疗方法，其特征在于，所述方法包括将权利要求8所述的载体施用于需要的对象。
  16. 一种重组人NADH脱氢酶亚单位6蛋白或人NADH脱氢酶亚单位1蛋白的制备方法，其特征在于，包括步骤：培养权利要求10所述的宿主细胞，从而得到重组人NADH脱氢酶亚单位6蛋白或人NADH脱氢酶亚单位1蛋白。
  17. 一种如权利要求3-7中任一所述的融合核酸编码的融合蛋白。
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