CN1315965A

CN1315965A - 丙型肝炎肽抑制剂

Info

Publication number: CN1315965A
Application number: CN99810449A
Authority: CN
Inventors: 蒙特斯·林纳斯-布鲁内特; 默里·D·贝利; 戴尔·卡梅伦; 埃莉斯·吉罗; 纳塔利·古德若; 马克-安德烈·波帕特; 琼·兰考特; 扬拉·S·桑特雷佐斯
Original assignee: Boehringer Ingelheim Canada Ltd
Current assignee: Boehringer Ingelheim Canada Ltd
Priority date: 1998-08-10
Filing date: 1999-08-09
Publication date: 2001-10-03
Anticipated expiration: 2019-08-09
Also published as: EA004765B1; UA73480C2; CO5180537A1; EA200100229A1; CZ2001515A3; DE69929887T2; NO20010604D0; HUP0104548A2; HRP20010101A2; AU764655B2; BG105230A; DE69929887D1; DK1105422T3; PL346051A1; CN1166690C; ZA200100972B; CA2336597A1; RS49819B; ATE317854T1; WO2000009558A1

Abstract

本发明公开了用于治疗丙型肝炎病毒(HCV)感染的式(Ⅰ)化合物或其药学上可接受的盐或酯,其中a为0或1;b为0或1;Y为H或C₁₆烷基;B为H、酰基衍生物或磺酰基衍生物;W为羟基或N－取代氨基。

Description

丙型肝炎肽抑制剂

发明领域

本发明涉及用于治疗丙型肝炎病毒(HCV)感染的化合物、组合物和方法。尤其是，本发明提供了其新的肽、其类似物和中间体，含这类肽的药物组合物，以及将这些肽用于治疗HCV感染的方法。

发明背景

丙型肝炎病毒(HCV)是输血后和群体传染的全球性非A非B肝炎的主要病原物。已证实全球超过150百万人感染有这种病毒。有较高比例的携带者成为慢性感染并且大多数发展为慢性肝病，即所谓的慢性丙型肝炎。这些群体随后有患严重肝病的危险，例如肝硬变、肝细胞癌和晚期肝病而导致死亡。HCV形成病毒存留和导致慢性肝病高发病率的机制还没有完全得到阐明。还不知道HCV是如何相互作用和离开宿主免疫系统的。另外，细胞免疫应答和体液免疫应答在防止HCV感染和疾病中的作用也还没有得以确立。据报道免疫球蛋白已用于预防与输血相关的病毒性肝炎。但是，疾病控制中心目前还没有推荐用于此目的的免疫球蛋白。缺乏有效的保护性免疫应答正防碍着对疫苗和适当的后期照射预防方法的开发，因此，近期把希望专注于抗病毒方法。

为了确定能有效治疗患有慢性丙型肝炎患者的HCV感染的药剂，已经进行了各种临床研究。这些研究包括α干扰素的使用，单独使用和与其它抗病毒剂联合应用。这类研究表明大多数参与者对这些治疗没有反应，并且发现其中出现有利反应的参与者中，在治疗结束后大部分病情复发。

直到最近，人们认为干扰素(IFN)是唯一能得到的对慢性丙型肝炎患者产生实际临床效果的疗法。但是其持续反应速度慢，且干扰素导致严重的副作用，降低被治疗患者的生活质量(即视网膜病、甲状腺炎、急性胰腺炎、抑郁症)。近来，已允许将干扰素和病毒唑联合用于对单独IFN无反应的患者。但是，由IFN导致的这些副作用并没有随着这种联合疗法而得以缓解。

因此，要开发有效治疗HCV感染的抗病毒剂必须解决现有的药物疗法局限性的问题。

HCV是Flaviviridae家族中的有包膜正链RNA病毒。单链HCV RNA基因组长度约9500个核苷酸、具有单个开放读框(ORF)，编码约3000个氨基酸的单个大的多蛋白。在被感染的细胞中，这种多蛋白通过细胞蛋白酶和病毒蛋白酶在多个位点分裂，产生结构和非结构(NS)蛋白。在HCV情况中，成熟的非结构蛋白(NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B)是通过两种病毒蛋白酶的作用而产生的。第一种蛋白酶，表征还不清楚，它是在NS2-NS3连接处分裂；第二种是包含在NS3的N末端区的丝氨酸蛋白酶(以下称作NS3蛋白酶)，并介导所有随后的NS3下游的分裂，该NS3包括顺式和反式两种，顺式在NS3-NS4A分裂位点，反式是指剩下的NS4A-NS4B、NS4B-NS5A、NS5A-NA5B位点。NA4A蛋白具有多种功能，作为NS3蛋白酶的辅因子、能辅助NS3和其它病毒复制酶成分的膜定位。这种NS3蛋白与NS4复合物的形成对于这些过程似乎是需要的，增强了所有位点上的蛋白酶解的功效。这种NS3蛋白也具有核苷三磷酸酶和RNA解旋酶活性。NS5B是一种涉及HCV复制的RNA依赖性RNA聚合酶。

开发抗病毒剂的总策略是使病毒复制所必需的病毒性编码酶失活。为此，专利申请WO97/06804描述了作为抗HCV的核苷类似物胞嘧啶-1,3-氧硫烷(oxathiolane)(也叫做3TC)的(-)对映异构体。此化合物，虽然据报道它在以前的临床抗HIV和HBV试验中是安全的，但临床还需要证实该化合物具有抗HCV活性，其抗病毒的作用机制也还未见报道。

为找到抑制HCV的NS3蛋白酶或RNA解旋酶的化合物而进行的认真和艰难的尝试已有了如下发现：

美国专利5,633,388描述了用作抗HCV活性剂的杂环取代的羧酰胺和类似物。这些化合物具有抗病毒的NS3蛋白的解旋酶活性，但临床试验还没有报道。

Chu等报道了(Tet.快报(1996),7229-7232)菲醌具有抗体外HCV NS3蛋白酶活性。未见对该化合物的进一步开发的报道。

在第9界国际抗病毒研究会议上Urabandai,Fukyshima,Japan(1996)公开的一篇论文—(抗病毒研究，30,1,1996；A23,(摘要19))报道了噻唑烷衍生物可抑制HCV蛋白酶。

数项研究报道了抑制其它诸如人白细胞弹性蛋白酶的丝氨酸蛋白酶的化合物。这些化合物的其中一组在WO95/33764(Hoechst Marion Roussel,1995)中有报道。公开在该申请中的肽是吗啉基羰基-苯甲酰基-肽类似物，该类似物在结构上不同于本发明的肽。

Vertex药物公司的WO98/17679公开了丝氨酸蛋白酶、尤其是丙型肝炎病毒NS3蛋白酶的抑制剂。这些抑制剂是基于NS5A/5B天然底物的肽类似物。所有这些肽均含有C末端活性羰基功能团作为它的基本特征。还报道了这些肽具有抗其它丝氨酸蛋白酶活性，因此它对HCV NS3蛋白酶不是特异性的。

Hoffman LaRoche也报道了属于蛋白酶抑制剂的六肽，它可用作治疗HCV感染的抗病毒剂。这些肽在C末端含有醛或硼酸。

Steink hler等和Ingallinella等发表了N末端分裂产物的抑制作用(生物化学(1998),37,8899-8905和8906-8914)。但是，其中的肽和肽类似物并不包括本发明肽、也不会导致构思出本发明肽。

Emory大学的WO98/46597公开了丝氨酸蛋白酶抑制剂，尤其是丙型肝炎蛋白酶抑制剂。所有公开的化合物与本发明肽在结构上是不同的。

肽医疗有限公司的WO98/46630公开了丙型肝炎NS3蛋白酶抑制剂。然而，所公开的肽没有一种与本发明肽相关。

日本Energy公司的JP10298151公开了作为丝蛋白酶抑制剂、尤其是作为丙型肝炎病毒蛋白酶抑制剂的N-(2,3-二羟基苯甲酰基)-取代的丝氨酸衍生物。这些化合物不包含任何与本发明肽类似物类似的结构。

本发明的一大优点是提供了抑制丙型肝炎病毒的NS3蛋白酶的肽。

本发明的另一个优点是在于这些肽特异地抑制NS3蛋白酶，但它对其它丝氨酸蛋白酶在浓度约300μM时没有显著的抑制活性，例如人白细胞弹性蛋白酶(HLE)、猪胰弹性蛋白酶(PPE)、或牛胰凝乳蛋白酶、或诸如人肝组织蛋白酶B(Cat B)的半胱氨酸蛋白酶。

发明概述

包含在本发明范围内的是式(Ⅰ)化合物的外消旋物、非对映异构体和光学异构体，或其药学上可接受的盐或酯：

其中a为0或1；b为0或1；Y为H或C_1-6烷基；B为H、式R₇-C(O)-的酰基衍生物或式R₇-SO₂的磺酰基衍生物，其中

R₇为(ⅰ)可不被取代或被羧基、C_1-6链烷醇氧基(alkanoyloxy)或

C_1-6烷氧基取代的C_1-10烷基；

(ⅱ)可不被取代或被羧基、(C_1-6烷氧基)羰基或苯基甲氧羰基

取代的C_3-7环烷基；

(ⅲ)C₆或C₁₀芳基或C_7-16芳烷基、可不被取代或被C_1-6烷基、

羟基、或可不被取代或被C_1-6烷基取代的氨基取代；或

(ⅳ)可不被取代或被C_1-6烷基、羟基、可不被取代或被C_1-6烷

基取代的氨基、或可不被取代或被C_1-6烷基取代的酰氨基取代

的Het；R₆，当存在时，它是用羧基取代的C_1-6烷基；R₅，当存在时，它是可被羧基取代或不取代的C_1-6烷基；R₄是C_1-10烷基、C_3-7环烷基或C_4-10(烷基环烷基)；R₃是C_1-10烷基、C_3-7环烷基或C_4-10(烷基环烷基)；R₂为CH₂-R₂₀、NH-R₂₀、O-R₂₀或S-R₂₀，其中R₂₀为可不被取代或被R₂₁单、二或三取代的饱和或不饱和的C_3-7环烷基或C_4-10(烷基环烷基)，或R₂₀为C₆或C₁₀芳基或C_7-16芳烷基可不被取代或被R₂₁单、二或三取代，或R₂₀为可不被取代或被R21单、二或三取代的Het或(低级烷基)-Het，其中每个R₂₁各自为C_1-6烷基；C_1-6烷氧基；可不被取代或被C_1-6烷基单或二取代的氨基；磺酰基；NO₂；OH；SH；卤素；卤代烷基；可不被取代或被C_1-6烷基、C₆或C₁₀芳基、C_7-16芳烷基、Het或(低级烷基)-Het单取代的酰氨基；羧基；羧(低级烷基)；C₆或C₁₀芳基，C_7-16芳烷基或Het，所述的芳基、芳烷基或Het均可不被取代或被R₂₂取代；其中R₂₂是C_1-6烷基；C_1-6烷氧基；可被C_1-6烷基取代或不取代的氨基；磺酰基；NO₂；OH；SH；卤素；卤烷基；羧基；酰胺基；(低级烷基)酰胺基；R₁是可被卤素取代或不取代的C_1-6烷基或C_2-6链烯基；和W为羟基或N-取代的氨基。

包含在本发明范围内的是一种药物组合物，该组合物包括病毒学上有效量的抗丙型肝炎的式Ⅰ化合物、或其治疗上可接受的盐或酯，以及包括药学上可接受的载体介质或辅助剂。

本发明的一个重要方面是涉及一种治疗哺乳动物丙型肝炎病毒感染的方法，即给予哺乳动物病毒学上有效量的抗丙型肝炎的式Ⅰ化合物、或其治疗上可接受的盐或酯或上述组合物。

另一重要方面是涉及一种通过将病毒暴露于丙型肝炎病毒的NS3蛋白酶而抑制丙型肝炎病毒复制的方法，即给予抑制量的式Ⅰ化合物、或其治疗上可接受的盐或酯、或上述组合物。

还有一方面是涉及一种治疗哺乳动物丙型肝炎病毒感染的方法，即给予该哺乳动物病毒学上有效量的抗丙型肝炎的式Ⅰ化合物、或其治疗上可接受的盐或酯、和干扰素的组合物。包括上述组合和药学上可接受的载体介质或辅助剂的药物组合物也包含在本发明范围内。发明的详细说明定义

除非另有说明，本文使用了下述定义：

在各种情况中所提及的(R)或(S)用于表示基团的构型，例如式Ⅰ化合物的R₄，这种表示是以该化合物而论、不是指单独的基团。

除了甘氨酸外，天然氨基酸包含手性碳原子。除非另有特别指明，优选的是含L-构型的天然氨基酸的化合物。但是，申请人考虑，在特殊情况时，式Ⅰ的一些氨基酸可以是D-或L-构型、或者可以是D-和L-异构体的混合物，包括外消旋混合物。

本文所用的标记“P1、P2、P3等”是指从肽类似物的C末端开始向N末端延伸的氨基酸残基的位置(即P1指从C末端起的位置1,P2指从C末端起的位置2，等)(见Berger A.和Schechter I.，伦敦皇家学会会报汇编B257,249-264(1997))。

α-氨基酸的缩写列在表A中。

表A

氨基酸	符号
氨基酸	符号	丙氨酸	Ala
天冬氨酸	Asp	丙氨酸	Ala
天冬氨酸	Asp	半胱氨酸	Cys
环己基甘氨酸(也叫做2-氨基-2-环己基乙酸)	Chg	半胱氨酸	Cys
环己基甘氨酸(也叫做2-氨基-2-环己基乙酸)	Chg	谷氨酸	Glu
异亮氨酸	Ile	谷氨酸	Glu
异亮氨酸	Ile	亮氨酸	Leu
苯丙氨酸	Phe	亮氨酸	Leu
苯丙氨酸	Phe	脯氨酸	Pro
缬氨酸	Val	脯氨酸	Pro
缬氨酸	Val	叔丁基甘氨酸	Tbg

本文所用的术语“1-氨基环丙基-羧酸”(Acca)是指下式化合物：

本文所用的术语“叔-丁基甘氨酸”(Tbg)是指下式化合物：

与氨基酸或氨基酸衍生物相关的术语“残基”意指通过去除羧基的羟基和α-氨基的一个氢从相应的α-氨基酸产生的基团。例如，术语Gln、Ala、Gly、Ile、Arg、Asp、Phe、Ser、Leu、Cys、Asn、Sar和Tyr分别代表L-谷氨酰胺、L-丙氨酸、甘氨酸、L-异亮氨酸、L-精氨酸、L-天冬氨酸、L-苯丙氨酸、L-丝氨酸、L-亮氨酸、L-半胱氨酸、L-天冬酰胺、肌氨酸和L-酪氨酸。

与氨基酸或氨基酸残基相关的术语“侧链”意指与α-氨基酸的α-碳原子相连的基团。例如，甘氨酸的R-基团侧链是氢，对丙氨酸的是甲基，缬氨酸的是异丙基。对于α-氨基酸的特异性R-基团或侧链，参考A.L.Lehninger的《生物化学》教科书(见第4章)。

本文的术语“卤”意指选自溴基、氯基、氟基或碘基的卤素基。

本文的术语“C_1-6烷基”或“(低级)烷基”，单独或与另一个基团结合，都是指含1-6个碳原子的直链或支链烷基基团，包括甲基、乙基、丙基、丁基、己基、1-甲基乙基、1-甲基丙基、2-甲基丙基、1,1-二甲基乙基(例如叔丁基)。

本文的术语“C_3-7环烷基”，单独或与另一个基团结合，部是指含3-7个碳原子的环烷基基团，包括环丙基、环丁基、环戊基、环己基和环庚基。

术语“不饱和的环烷基”包括，例如环己烯基：

本文的术语“C_4-10(烷基环烷基)”意指含3-7个碳原子与烷基基团相连的环烷基基团，被连接的基团含1-10个碳原子；例如，环丙基甲基、环戊基乙基、环己基甲基、环己基乙基或环庚基乙基。

本文的术语“C_2-10链烯基”，单独或与另一个基团结合，都是指如上所述的含2-10个碳原子的烷基基团，并且还含至少一个双键。例如链烯基包括烯丙基和乙烯基。

本文的术语“C_1-6烷酰基”，单独或与另一个基团结合，都是指含1-6个碳原子的直链或支链1-氧烷基基团，包括甲酰基、乙酰基、1-氧丙基(丙酰基)、2-甲基-1-氧丙基、1-氧己基，等等。

本文的术语“C_1-6烷氧基”，单独或与另一个基团结合，都是指-O(C_1-6烷基)基团，其中烷基如上所述含1-6个碳原子。烷氧基包括甲氧基、乙氧基、丙氧基、1-甲基乙氧基、丁氧基和1,1-二甲基乙氧基。后面这一基团通常叫做叔丁氧基。

本文的术语“C_3-7环烷氧基”，单独或与另一个基团结合，都是指与一个氧原子连接的C_3-7环烷基基团，例如：

本文的术语“C₆或C₁₀芳基”，单独或与另一个基团结合，都是指含6个碳原子的芳族单环基团或含10个碳原子的芳族二环基团。例如，芳基包括苯基、1-萘基或2-萘基。

本文的术语“C_7-16芳烷基”，单独或与另一个基团结合，都是指上述与一个烷基连接的C₆或C₁₀芳基，其中烷基如上所述含1-6个碳原子。C_7-16芳烷基包括例如苄基、丁基苯基和1-萘基甲基。

本文的术语“氨基芳烷基”，单独或与另一个基团结合，都是指被C_7-16芳烷基取代的氨基基团，例如，氨基芳烷基：

本文的术语“羧基(低级)烷基”，单独或与另一个基团结合，都是指通过上述的(低级)烷基连接的羧基(COOH)，包括例如酪酸。

本文的术语“杂环”或“Het”，单独或与另一个基团结合，都是指通过从含1-4个杂原子的5-、6-或7-节饱和或不饱和(包括芳族)杂环中去掉一个氢而衍生的一价基团，其中的杂原子选自氮、氧和硫。另外，本文的“Het”意指上述与一个或多个可以是杂环或任何其它环的另外的环稠合的杂环。适合的杂环例如包括：吡咯烷、四氢呋喃、噻唑烷、吡咯、噻吩、二氮杂、1H-咪唑、异噁唑、噻唑、四唑、哌啶、1,4-二噁烷、4-吗啉、吡啶、嘧啶、噻唑[4,5-b]-吡啶、喹啉、或吲哚、或下列杂环：

本文的术语“(低级烷基)-Het”，意指通过一种链或支链烷基连接的上述杂环基团，其中烷基如上所述含1-6个碳原子。(低级烷基)-Het的例子包括：

本文的术语“药学上可接受的酯”，单独或与另一个基团结合，都是指式Ⅰ化合物的酯，其中分子的任何羧基官能团、但优选羧基末端，被烷氧基羰基官能团代替：

其中酯的R部分选自烷基(例如甲基、乙基、正丙基、叔丁基、正丁基)；烷氧基烷基(例如甲氧基甲基)；烷氧基酰基(例如乙氧基甲基)；芳烷基(例如苄基)；芳氧基烷基(例如苯氧基甲基)；芳基(例如苯基)，可用卤素、C_1-4烷基或C_1-4烷氧基取代或不取代。其它适合的前药酯可以在此引用的《前药设计》，Bundgssrd,H.Ed.Elsevier(1985)中找到。当这些药学上可接受的酯注射在哺乳动物中时它通常在体内水解、并转化为式Ⅰ化合物的酸形式。

关于上述酯，除非另有说明，任何所出现的烷基部分优选含1-16个碳原子，特别是1-6个碳原子。在这些酯中所出现的任何芳基部分优选包含苯基。

尤其是这些酯可以是C_1-16烷基酯，未取代的苄基酯或被至少一种卤素、C_1-6烷基、C_1-6烷氧基、硝基或三氟甲基取代的苄基酯。

本文的术语“药学上可接受的盐”包括那些从药学上可接受的碱衍生的盐。适合的碱例如包括胆碱、乙醇胺和1,2-二乙胺。Na⁺、K⁺和Ca⁺⁺盐也应包含在本发明范围内(也参见“药物盐”，Birge,S.M.等，《药物科学杂志》(1997),66,1-19，将其在此引作参考)。优选的实施方式

包含在本发明化合物范围内的式Ⅰ化合物是其中B优选为R₇-SO₂，其中R₇优选C₆或C₁₀芳基、C_7-16芳烷基或Het，它们均可被C_1-6烷基取代或不取代。

或者，B优选H或式R₇C(O)-的酰基衍生物，其中R₇优选C_1-6烷基；C_1-6烷氧基；可被羟基取代或不取代的C_3-7环烷基；可被C_1-6烷基或Het取代或不取代的酰氨基；C₆或C₁₀芳基、C_7-16芳烷基或Het，这些均可被C_1-6烷基或羟基取代或不取代。更优选是，B为H或R₇C(O)-，其中R₇更优选C_1-6烷基或杂环，例如：

最优选是B为H、乙酰基、

甚至最优选是B为乙酰基。

包含在本发明化合物范围内的是其中当R₆存在时、它优选是Asp或Glu的侧链的式Ⅰ化合物。最优选是，当R₆存在时、它是Asp的侧链。或者，优选a为0、而没有R₆。

包含在本发明化合物范围内的是其中当R₅存在时、它优选是一种氨基酸的侧链的式Ⅰ化合物，该氨基酸选自D-Asp、L-Asp、D-Glu、L-Glu、D-Val、L-Val、D-叔-丁基甘氨酸(Tbg)和L-Tbg。更优选是，当R₅存在时，它是D-Asp、D-Val或D-Glu的侧链。最优选是，当R₅存在时，它是D-Glu的侧链。或者，优选a为0且b为0，并且同时没有R₆和R₅。

包含在本发明化合物范围内的是其中R₄优选是一种氨基酸的侧链的式Ⅰ化合物，该氨基酸选自Val、环己基甘氨酸(Chg)、Tbg、Ile、或Leu。更优选是，R₄为Chg或Ile的侧链。最优选是，R₄为Chg的侧链。

包含在本发明化合物范围内的是其中Y优选H或Me的式Ⅰ化合物。最优选是Y为H。

包含在本发明化合物范围内的是其中R₃优选是一种氨基酸的侧链的式Ⅰ化合物，该氨基酸选自Ile、Chg、Val、或Tbg。更优选是，R₃是Val、Chg或Tbg的侧链。最优选是，R₃是Val或Tbg的侧链。

包含在本发明化合物范围内的是R₂优选是S-R₂₀或O-R₂₀的式Ⅰ化合物，其中R₂₀优选C₆或C₁₀芳基、C_7-16芳烷基、Het或-CH₂-Het，它们均可不被取代或被R₂₁单、二或三取代；

R₂₁优选C_1-6烷基；C_1-6烷氧基；氨基；单或二(低级烷基)氨基；可不被取代或被C_1-6烷基、C₆或C₁₀芳基、C_7-16芳烷基、Het或(低级烷基)-Het单取代的酰氨基；NO₂；OH；卤素；三氟甲基；羧基；C₆或C₁₀芳基，C_7-16芳烷基，或Het，所述的芳基、芳烷基或Het可不被取代或被R₂₂取代；更优选是R₂₁为C_1-6烷基；C_1-6烷氧基；氨基、二(低级烷基)氨基；(低级烷基)酰胺；C₆或C₁₀芳基，或Het，所述的芳基或Het可被R₂₂取代或不取代。

R₂₂优选C_1-6烷基；C_1-6烷氧基；氨基；单或二(低级烷基)氨基；(低级烷基)酰胺；NO₂；OH；卤素；三氟甲基；或羧基。更优选是R₂₂为C_1-6烷氧基；氨基；二(低级烷基)氨基；(低级烷基)酰胺；卤素或三氟甲基。

更优选是R₂为1-萘甲氧基；2-萘甲氧基；苄氧基；1-萘氧基；2-萘氧基；或被上述R₂₁不取代、单或二取代的喹啉氧基。最优选是R₂为1-萘甲氧基；或被上述R₂₁不取代、单或二取代的喹啉氧基。

还有最佳优选是R₂为：

更优选是R_21A为可不被取代或被C_1-6烷基、C₆或C₁₀芳基、C_7-16芳烷基或Het单取代的酰氨基；可不被取代或被R₂₂取代的C₆或C₁₀芳基或Het。R_21A最优选C₆或C₁₀芳基或Het，它们均可不被取代或被R₂₂取代。R₂₂最优选氨基、二(低级烷基)氨基、或(低级烷基)酰胺。R₂₂甚至最优选氨基、二甲基氨基或乙酰氨基。

另外R_21A最优选均未被取代的C₆或C₁₀芳基或Het。

R_21B优选C_1-6烷基；C_1-6烷氧基；氨基；二(低级烷基)氨基；(低级烷基)酰胺；NO₂；OH；卤素；三氟甲基或羧基。R_21B更优选是C_1-6烷氧基或二(低级烷基)氨基。R_21B最优选为甲氧基。

包含在本发明范围内的是其中R₁优选甲基、乙基、丙基、乙烯基的式Ⅰ化合物，这些基团均可被卤素取代或不取代。更优选是R₁为乙基、乙烯基或溴乙烯基。最优选是R₁为乙烯基。

包含在本发明范围内的是其中W优选羟基或其药学上可接受的盐或酯；或(低级烷基)氨基、二(低级烷基)氨基或氨基芳烷基的式Ⅰ化合物。更优选是W为羟基、或N(R₁₃a)R_13b，其中R_13a和R_13b各自为H、芳基或者可被羟基或苯基取代或不取代的C_1-6烷基；或其药学上可接受的盐。最优选是W为-OH、-NH-苄基或-NH-CH(Me)Ph。另外W还最优选-OH、-NH-(S)CH(Me)-苯基。

当W为一种酯时，所述的酯选自C_1-6烷氧基、苯氧基、或芳基(C_1-6烷氧基)。这些酯更优选是甲氧基、乙氧基、苯氧基、苄氧基或PhCH(Me)-O-。

如上所述，式Ⅰ化合物的P1片段是下式的环丙基环系统：

其中C₁和C₂各自代表环丙基环的位置1和2上的不对称的碳原子。虽然在式Ⅰ化合物的其它片段上有其它可能的不对称中心，但这两种不对称中心的存在意味着式Ⅰ化合物可以以非对映异构体的外消旋混合物的形式存在。如后面实施例所例证的，可以制备该外消旋混合物、然后将其分离成单个旋光异构体，或者通过手性合成法制备这些旋光异构体。

因此，式Ⅰ化合物可以以一种非对映异构体的外消旋混合物的形式存在，其中位置2上的R₁与位置1上的羰基以顺式定向，以下列基团表示：

或者式Ⅰ化合物可以以一种非对映异构体的外消旋混合物的形式存在，其中位置2上的R₁与位置1上的羰基以反式定向，以下列基团表示：

接下来，可以将该外消旋混合物分离成单个光学异构体。

本发明最有趣的发现是有关P1片段的立体定向。该发现涉及位置1上的不对称碳的构型。一种优选的实施方式是其中位置1上的不对称碳具有R构型。

更详细地说，当碳1具有R构型时，通过环丙基环的碳2上的取代基R₁(如烷基或亚烷基)的位置，HCV NS3蛋白酶抑制进一步增强。最优选的化合物是一种旋光异构体其在下式绝对构型中具有顺式定向的R₁取代基和羰基：

在R₁为乙基的情况中，位置1和2上的不对称碳原子具有R,R构型。

通过举例说明取代基的绝对构型对化合物的位能水平的作用，具有绝对构型1R,2R的化合物112(表1)具有1.6M的IC₅₀，而对应的1S,2S异构体(化合物113)的IC₅₀为27.5ìM。因此，1R、2R异构体的位能较1S,2S异构体强25倍。

包含在本发明范围中的还有下列式Ⅰ化合物或其药学上可接受的盐或酯，其中B为H、低级烷基-C(O)-或Het-C(O)-；R₆，当它存在时，它是Asp或Glu的侧链；R₅，当它存在时，它是D-或L-：Asp、Glu、Val或Tbg的侧链；Y是H或甲基；R₄是Val、Chg、Tbg、Ile或Leu的侧链；R₃是氢或Ile、Chg、Val或Tbg的侧链；R₂是1-萘甲氧基、2-萘甲氧基、O-Bn、

其中R₂₂为氨基、二(低级烷基)氨基、(低级烷基)酰胺、NO₂、OH、卤、CF₃或羧基；P1为下式的环丙基环系统

其中R₁为乙基、乙烯基或溴乙烯基；和W为羟基或N(R_13a)R_13b，其中R_13a和R_13b各自为H、芳基或者可被羟基或苯基取代或不取代的C_1-6烷基。

进一步优选的化合物组是这些式Ⅰ化合物或其药学上可接受的盐或酯，其中B为H、乙酰基或Het-C(O)-；R₆，当它存在时，它是Asp的侧链；R₅，当它存在时，它是D-Asp、D-Glu、或D-Val的侧链；Y是H；R₄是Chg或Ile的侧链；R₃是Val、Chg或Tbg的侧链；R₂是1-萘甲氧基、苄氧基、4-喹啉氢基、或

P1为下式的环丙基环系统

其中R₁为Et或-CH=CH₂或-CH=CHBr；和W为羟基或-NH-(S)-CHMePh。

还进一步优选的化合物组是这些式Ⅰ化合物或其药学上可接受的盐或酯，其中B为乙酰基；R₆，当它存在时，它是Asp的侧链；R₅，当它存在时，它是D-Glu的侧链；Y是H；R₄是Chg的侧链；R₃是Val或Tbg的侧链；R₂是：P1是：W为羟基。

最后，包含在本发明范围内的是表1-5所列出的每个式Ⅰ化合物。

根据一种可替代的实施方式，本发明的药物组合物还可以包括另一种抗HCV剂。抗HCV剂的例子包括α或β干扰素、病毒唑和金刚胺。

根据另一种可替代的实施方式，本发明的药物组合物还可包括HCV蛋白酶的其它抑制剂。

还根据另一种可替代的实施方式，本发明的药物组合物还可包括HCV存活期中的其它目标的抑制剂，包括但不限于，例如解旋酶、聚合酶、金属蛋白酶或内部核糖体进入位点(IRES)。

本发明的药物组合物可以口服、非肠道或通过一种植入的贮主给药。优选口服或注射给药。本发明的药物组合物也可含有常规的药学上可接受的无毒载体、辅助剂或赋形剂。在某些情况中，可以用药学上可接受的酸、碱或缓冲液调节制剂的pH，以增强所配制的化合物或其传送形式的稳定性。本文所用的术语非肠道包括皮下、皮内、静脉内、肌内、关节内、滑液内、胸骨内、鞘内和损害内注射或输注技术。

本药物组合物可以是无菌的可注射制剂形式，例如，无菌的可注射含水悬浮液或油状悬浮液。可根据本领域已知的技术、使用适合的分散剂或润湿剂(例如吐温80)和悬浮剂制备该悬浮液。

本发明的药物组合物可以以任何口服可接受的剂型进行口服给药，它包括但不限于，胶囊、片剂以及含水悬浮液和溶液。在口服使用的片剂中，通常使用的载体包括乳糖和玉米淀粉。也可以有代表性地加入诸如硬脂酸镁之类的润滑剂。对于胶囊形式的口服给药，有用的稀释剂包括乳糖和干玉米淀粉。当将含水悬浮液口服给药时，可将活性成分与乳化剂和悬浮液组合使用。如需要，可以加入某些甜咪剂和/或调味剂和/或着色剂。

用于上述制剂和组合物的其它适合的赋形剂或载体可以在标准的药物教科书中找到，例如在《药学科学和实践》第19版，Mack出版公司，Easton,Penn.,(1995)的“Remington的药物科学”中。

剂量为大约0.01-100mg/kg体重/天的本文所述的蛋白酶抑制剂化合物可用于预防和治疗HCV介导性疾病的单一疗法，其剂量优选约0.5-75mg/kg体重/天。典型的是，本发明药物组合物可以每天给药约1-5次，或者连续输注。这种给药方法可用于慢性或急性治疗。可与载体物质结合而产生单一剂型的活性成分的用量将根据所治疗的患者和给药的特殊方式的不同而改变。典型的制剂包含约5％-约95％的活性化合物(w/w)。这种制剂优选包含约20％-约80％活性化合物。

正如本领域熟练技术人员所共知的，可能需要较上述剂量更低或更高的用量。对任何特殊患者的特定剂量和治疗方案是根据各种因素而决定的，该因素包括所用的特定化合物的活性、年龄、体重、一般健康状况、性别、饮食、给药时间、排泄速度、联合用药、感染的严重程度和过程、患者对感染的处置和主治医生的判断。一般而言，基本上以小于肽的最佳剂量的小剂量开始治疗。此后，按小增量增大剂量直至在该情况下达到最佳效果。总之，最合乎需要的是将该化合物以能达到抗病毒效果而不产生任何有害或造成伤害的副作用的浓度水平进行给药。

当本发明组合物包括式Ⅰ化合物和一种或多种附加治疗剂或预防剂的组合时，该化合物和附加剂两者应大约占单一治疗方案中的正常给予剂量的10-100％，更优选约10-80％。

当将这些化合物或其药学上可接受的盐与药学上可接受的载体一同进行配制时，所得到的组合物可以对诸如人的哺乳动物体内给药，以抑制HCV NS3蛋白酶或者治疗或预防HCV病毒感染。也可联合使用本发明化合物与包括但不限于下列试剂达到这种治疗：免疫调节剂、例如α-、β-、γ-干扰素；其它抗病毒剂，例如病毒唑、金刚胺；其它HCV NS3蛋白酶抑制剂；HCV生存期的其它目标的抑制剂，它包括但不限于解旋酶、聚合酶、金属蛋白、或内部核糖体进入位点(IRES)、或其组合。也可将附加剂与本发明化合物组合以形成单一剂型。或者将这些附加剂作为复合剂型的一部分单独给哺乳动物服用。

因此，本发明的另一个实施方式是提供服用式Ⅰ化合物(其中取代基如上所述)而抑制哺乳动物的HCV NS3蛋白酶活性的方法。

在一个优选的实施方式中，这些方法用于降低哺乳动物的HCV NS3蛋白酶活性。如果药物组合物仅包括本发明化合物作为活性成分，则这些方法可另外包括下列步骤：给所述哺乳动物服用选自下列的试剂：免疫调节剂，抗病毒剂，HCV蛋白酶抑制剂，或HCV生存期的其它目标的抑制剂，例如解旋酶、聚合酶、金属蛋白、或IRES。这些附加试剂可以在本发明化合物之前、同时、或之后服用。

在一种替代的优选实施方式中，这些方法用于抑制哺乳动物的病毒复制。这类方法用于治疗或预防HCV疾病。如果药物组合物仅包括本发明化合物作为活性成分，则这些方法可另外包括下列步骤：给所述哺乳动物服用选自下列的试剂：免疫调节剂，抗病毒剂，HCV蛋白酶抑制剂，或HCV生存期的其它目标的抑制剂。这些附加剂可以在本发明化合物之前、同时、或之后服用。

前面所述化合物也可用作实验室试剂。本发明化合物也可用于治疗或预防物质的病毒污染，因而降低与这些物质(如血液、组织、外科仪器和覆盖物、实验室仪器和覆盖物、以及血液收集装置和物质)接触的实验室人员或医疗人员或患者感染病毒的危险。

前面所述化合物也可用作研究试剂。也可将本发明化合物用作阳性控制以验证基于细胞的代用品测定或者体外或体内病毒复制测定。方法

根据下列合成方案举例说明的方法合成本发明化合物(其中CPG为羧基保护基团、APG为氨基保护基团)：

合成方案Ⅰ

简言之，P1、P2、P3、P4、和可存在或不存在的P5和P6可通过公知的肽偶联技术连接。P1、P2、P3、P4、和可存在或不存在的P5和P6基团可以以任何顺序连接在一起，只要最终化合物与式Ⅰ的肽一致。例如，P6可与P5连接得到与P4-P3-P2-P1相连的P5-P6；或者P6与P5-P4-P3-P2连接、然后与适合的C末端保护性P1相连。

通常，通过使用上述方法、脱保护N-末端残基的α氨基、并通过肽连接而偶联下一个适合的N-保护性氨基酸的未保护羧基，从而使肽延长。重复这种脱保护和偶联过程直至得到所需的序列。这种偶联可以用如方案Ⅰ所述的分段方式中的氨基酸组分来进行，或者通过片段(两个或数个氨基酸)的缩合，或两种方法的结合，或通过在此引用的Merrifield，《美国化学会杂志》(1963),85,2149-2154中原来所述的方法的固相肽合成来进行。

可以用标准的偶联方法进行两个氨基酸、一个氨基酸和一个肽、或两个肽片段之间的偶联，这些标准的偶联方法例如叠氮化物法、混合碳酸-羧酸酐(氯甲酸异丁酯)法、碳二亚胺(二环己基碳二亚胺、二异丙基碳二亚胺、或水溶性碳二亚胺)法、活性酯(对硝基苯基酯、N-羟基琥珀亚氨基酯)法、Woodward试剂K方法、羰基二咪唑法、磷试剂法或氧化-还原法。这些方法中有些方法(尤其是碳二亚胺法)可通过加入1-羟基苯并三唑使其增强。这些偶联反应可以在溶液(液相)或固相中进行。

更清楚地说，这种偶联步骤包括在偶联剂存在下一个反应物的游离羧基与另一个反应物的游离氨基的脱水偶联、以形成连接酰胺键。这些偶联剂的说明可在有关肽化学的普通教科书中找到，例如，M.Bodanszky,“肽化学”，第二次修订版，Springer-Verlag，柏林，德国，(1993)。适合的偶联剂例如有N,N’-二环己基碳二亚胺、N,N’-二环己基碳二亚胺中的1-羟基苯并三唑或N-乙基-N’-[(3-二甲基氨基)丙基]碳二亚胺。非常实际且有用的偶联剂是单独形式或存在于1-羟基苯并三唑中的市售可得到的(苯并三唑-1-基氧)三-(二甲基氨基)六氟磷酸盐。另一种非常实际且有用的偶联剂是市售可得到的2-(1H-苯并三唑-1-基)-N,N,N’,N’-四甲基四氟硼酸脲。还有一个非常实际且有用的偶联剂是市售可得到的O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N’,N’-四甲基六氟磷酸脲。

偶联反应是在惰性溶剂中进行的，该惰性溶剂例如二氯甲烷、乙腈或二甲基甲酰胺。加入过量的叔胺例如二异丙基乙基胺、N-甲基吗啉或N-甲基吡咯烷以保持反应混合物pH约为8。反应温度通常是在0℃-50℃的范围内，反应时间通常为15分钟至24小时。

当使用固相合成法时，将C末端羧酸与不溶性载体(通常为聚苯乙烯)相连。这些不溶性载体包括与羧基反应形成一种键的载体，这种键对于延长情况是稳定的、但此后易于裂解。这些载体例如有：氯或溴甲基树脂、羟甲基树脂、和氨基甲基树脂。这些树脂中有许多是市售可得到的、并已经加入了所需的C末端氨基酸。或者，可以按照Wang,S.-S.,《美国化学会杂志》(1973),95,1328；Atherton,E.,Shepard,R.C.“固相肽合成；一种实用方法”牛津IRL出版社，(1989)；131-148中的已知方法将氨基酸加在固体载体上。除了上述以外，其它肽合成方法在Stewart和Young,“固相肽合成”，第二版，Pierce化学公司，Rockford,IL(1984)；Gross,Meienhofer,Udenfriend，编辑，“肽：分析、合成、生物学”，卷1、2、3、5和9,Academic出版社，纽约，(1980-1987)；Bodansky等，“肽合成实践”Springer-Verlag，纽约(1984)中有描述，将这些公开出版物均为本发明参考文献。

在偶联反应过程中通常必须保护组分氨基酸的功能基团，以避免形成不必要的键。可以使用的保护基团列在Greene，“有机化学的保护性基团”，JohnWiley和Sons，纽约(1981)和“肽：分析、合成、生物学”卷3,Academic出版社，纽约，(1981)中，将这些公开出版物均为本发明参考文献。

通常将C末端残基的α羧基保护成一种可裂解形成羧酸的酯(CPG)。可以使用的保护性基团包括：1)烷基酯，例如甲基酯、三甲基甲硅烷基乙基酯和叔丁基酯，2)芳烷基酯，例如苄基酯和取代的苄基酯，或3)可以通过弱碱处理或轻度还原方法而被裂解的酯，例如三氯乙基和苯甲酰甲基酯。

与生长肽链偶联的每个氨基酸的α氨基(APG)必须保护。可以使用任何本领域已知的保护性基团。这些基团例如包括：1)酰基，例如甲酰基、三氟乙酰基、邻苯二酰基、和对甲苯磺酰基；2)芳族氨基甲酸酯基团，例如苄氧基羰基(Cbz或Z)和取代的苄氧基羰基，以及9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)；3)脂族氨基甲酸酯基团，例如叔丁氧基羰基(Boc)、乙氧基羰基、二异丙基甲氧基羰基、和烯丙氧基羰基；4)环烷基氨基甲酸酯基团，例如环戊氧基羰基和金刚烷氧基羰基；5)烷基，例如三苯基甲基和苄基；6)三烷基甲硅烷基，例如三甲基甲硅烷基；和7)含诸如苯基硫代羰基和二硫琥珀酰基的基团的巯基。优选的α氨基保护基团是Boc或Fmoc。适合用于肽合成保护的许多氨基酸衍生物可从市售获得。

新近所加的氨基酸残基的α氨基保护基团在下一个氨基酸偶联之前被裂解。当使用Boc基团时，选择的方法是净三氟乙酸或二氯甲烷中的三氟乙酸、或二噁烷或乙酸乙酯中的HCl。然后在偶联之前或在偶联的当时用碱性溶液例如含水缓冲液、或二氯甲烷中的叔胺或乙腈或二甲基甲酰胺中和所得到的铵盐。当使用Fmoc基团时，选择的试剂是二甲基甲酰胺中的哌啶或取代的哌啶，但是也可使用任何仲胺。脱保护是在0℃-室温(RT)的温度下进行的，通常是20-22℃。

具有侧链官能度的任何氨基酸必须在肽制备过程中用任何上述基团进行保护。本领域熟练技术人员知道用于这些侧链官能度的适合的保护基团的选择和使用是根据氨基酸和肽中的其它保护性基团的存在而决定的。对这些保护性基团的选择的重要性在于该基团在脱保护和α氨基的偶联过程中必须不被去除。

例如，当Boc用作α氨基保护性基团，下列侧链保护性基团是适合的：可用于保护诸如Lys和Arg的氨基酸的氨基侧链的对甲苯磺酰基(甲苯磺酰基)部分；可用于保护半胱氨酸的含硫化物侧链的乙酰氨基甲基、苄基(Bn)、或叔丁基磺酰基部分；可用于保护丝氨酸、苏氨酸或羟基脯氨酸的含羟基侧链的苄基(Bn)醚；以及可用于保护天门冬氨酸和谷氨酸的含羧基侧链的苄基酯。

当选择Fmoc用于α-氨基保护时，通常基于叔丁基的保护性基团是可以接受的。例如，可用于赖氨酸和精氨酸的Boc，用于丝氨酸、苏氨酸或羟基脯氨酸的叔丁基醚；和用于天门冬氨酸和谷氨酸的叔丁基酯。三苯基甲基(三苯甲基)部分可用于保护半胱氨酸的含硫化物侧链。

当W为酰胺(w)时，P1在与P2偶联之前与适合的胺偶联。对于本领域熟练技术人员来说很容易明白这种胺化作用。

一旦完成了肽的延长，则去除所有保护性基团。当使用液相合成时，在选择保护性基团所采取的无论什么方法中，应将保护性基团去除。这些方法对于本领域熟练技术人员来说是公知的。

当使用固相合成时，肽从树脂裂解、同时伴有保护性基团的去除。当Boc保护方法用于合成时，用0℃的含无水HF的添加剂例如二甲硫、茴香醚、茴香硫醚或对甲酚进行处理是从树脂裂解肽的优选方法。肽的裂解也可通过其它诸如三氟甲烷磺酸/三氟乙酸混合物的酸性试剂而实现。如果使用Fmoc保护方法，则用较早所述的试剂使N末端Fmoc基团裂解。用三氟乙酸溶液和各种添加剂如茴香醚等使其它保护性基团和肽从树脂裂解。端基基团B和P6、P5、P4和P3部分的合成

使用市售的或本领域所公知的方法合成的适当的酰基氯或磺酰氯，将不同的端基基团B引入到保护的P4、P5或P6或引入到任何肽片段。

不同的P6-P3部分可从市售获得或者其合成是本领域公知的。1．P2部分的合成。1．1前体的合成：A)卤芳基甲烷衍生物的合成。

根据K.N.Campbell等，《美国化学会杂志》，(1946),68,1844所述的方法进行卤甲基-8-喹啉Ⅱd的制备。

合成方案Ⅱ

简言之，通过相应的酰基卤化物Ⅱb与诸如氢化铝锂的还原剂的还原反应将8-喹啉羧酸Ⅱa转化为相应的醇Ⅱc。用适当的氢卤酸处理醇Ⅱb得到所需的卤衍生物Ⅱd。这种方法的一个具体实施方式见实施例1A。B)芳基醇衍生物的合成：

根据Giardina等(《美国化学会杂志》，(1997),40,1794-1807)所述的方法制备2-苯基-4-羟基喹啉衍生物Ⅲc。

合成方案Ⅲ

R₂₂和R_21B=烷基、OH、SH、卤、NH₂或NO₂。

将苯甲酰基乙酰胺(Ⅲa)与适合的苯胺(Ⅲb)缩合、并用多磷酸使所得到的亚胺环化得到相应的2-苯基-4-羟基喹啉(Ⅲc)。这种方法的一个具体实施方式见实施例1B和1C。1．2．P2的合成：A)4-取代的脯氨酸(其中R2通过碳原子与环相连)(立体化学如下所示)的合成：

是根据J.Ezquerra等(《四面体》,(1993),38,8665-8678)和C.Pedregal等(《四面体快报》,(1994),35,2053-2056)所述的方法按方案Ⅳ所示的方法进行：合成方案Ⅳ

简言之，将Boc-焦谷氨酸保护为苄基酯。酰胺的还原反应和酯的脱保护后，用诸如二异丙基酰胺锂的强碱处理、然后加入烷化剂(Br-R²⁰或I-R²⁰)得到所需的化合物Ⅳe。

B)O-芳烷基化4-(R)-羟基脯氨酸的合成：

当R²⁰为芳基、Het、芳烷基、或(低级烷基)-Het时，该合成过程根据E.M.Smith等(《医用化学杂志》(1988),31,875-885)所述的方法进行。简言之，用诸如氢化钠或K-tBuO的碱处理市售的Boc-4(R)-羟基脯氨酸，所得到的醇化物与卤-R²⁰(Br-R²⁰,I-R²⁰，等)反应生成所需的化合物。这种方法的一个具体实施方式见实施例2、3和4B。

C)或者，当R²⁰为芳基、Het时，这些化合物也可通过Mitsunobu反应(Mitsunobu(1981)，合成，1月，1-28；Rano等(1995)；《四面体快报》36(22),3779-3792；Krchnak等，(1995)；《四面体快报》36(5),62193-6196；Richter等，(1994)；《四面体快报》快报35(27),4705-4706)来制备。简言之，即用三苯基膦和二乙基偶氮二羧酸盐(DEAD)中的适当的芳基醇或硫醇处理Boc-4(S)-羟基脯氨酸甲基酯，将所得到的酯水解成酸。这种方法的具体实施方式见实施例4A。

合成方案Ⅴ

或者，可在固相中进行Mitsunobu反应(合成方案Ⅴ)。将等分树脂结合的化合物(Ⅴa)加入396型合成器(高级Chem Tech)的96孔分块(block)中，再加入各种芳基醇或硫醇和适当的试剂。培养后，洗涤、干燥每一树脂结合的产品(Ⅴb)，并使其从树脂裂解。

Suzuki反应(Miyaura等，(1981),《工业合成》11,513；Sato等，(1989),《化学快报》1405；Watanabe等，(1992),Syn快报，207；Takayuki等，(1993),《有机化学杂志》58,2201；Frenette等，(1994),Tet.快报35(49),9177-9180；Guiles等，(1996),《有机化学杂志》61,5169-5171)也可用于进一步使芳基取代基官能化。2．P1部分(2-取代的1-氨基环丙基羧酸)的合成

根据方案Ⅵ进行合成。

合成方案Ⅵ

a)简言之，即在碱条件下使二保护性丙二酸盐Ⅵa和1,2-二卤烷烃Ⅵb或环硫酸盐Ⅵc(根据K.Burgess和Chun-Yen KE(合成，(1996),1463-1467的方法合成的)反应得到二酯Ⅵd。b)进行较少受阻酯的区域选择性水解得到酸Ⅵe。c)将这种酸Ⅵe进行Curtius重排得到1-氨基环丙基羧酸衍生物Ⅵf的外消旋混合物，其中R¹与羧基同向。这种合成方法的具体实施方式见实施例5。d,e)或者，从酸Ⅵe选择性形成的酯与适合的卤化物(P^*Cl)或醇(P*OH)形成二酯Ⅵg，其中P^*与P酯的选择性水解是相容的。P酯的水解得到酸Ⅵh。f)Ⅵh的Curtius重排得到1-氨基环丙基羧酸衍生物Ⅵi的外消旋混合物，其中R¹基团与羧基反向。这种合成方法的具体实施方式见实施例10。

另一种制备衍生物Ⅵf(当R¹为乙烯基、与羧基同向时)的合成法如下所述。

合成方案Ⅶ

用碱中的1,4-二卤丁烯Ⅶb处理市售的亚胺Ⅶa，所得的亚胺Ⅶc水解后，产生与羧基同向的烯丙基取代基的Ⅶd，这种方法见实施例11。

所有上述碳1(Ⅵe和Ⅶd)上的对映异构混合物可通过以下方法进行拆分：1) 酶分离(实施例9和13)；2)用手性酸结晶(实施例14)；或3)化学衍生(实施例6)。

拆分后，可按实施例7所示进行绝对立体化学的判定。

可以以同样的方法对碳1上的对映异构混合物进行拆分和立体化学判定，该混合物中C2上的取代基与羧基反向(Ⅵi)。

因此，本发明进一步包括式(Ⅰ)的肽类似物的制备方法，其中P1为取代的氨基环丙基羧酸残基，该方法包括下列步骤：

将选自APG-P6-P5-P4-P3-P2、APG-P5-P4-P3-P2、APG-P4-P3-P2、APG-P3-P2和APG-P2的肽；

与下式的P1中间体偶联：

其中R₁为可不被取代或被卤原子取代的C_1-6烷基或C_2-6链烯基，CPG是羧基保护基团，APG是氨基保护基，P6-P2如上所定义。

最后，本发明还包括下式的中间体用于制备如上所述式Ⅰ化合物的应用：

其中R₁为可不被取代或被卤原子取代的C_1-6烷基或C_2-6链烯基。

实施例

通过下列非限定性实施例对本发明进一步举例说明。

将温度设为摄氏温度。除非另有说明，溶液百分比表示重量与体积关系，溶液比例表示体积与体积关系。在Bruker 400MHz分光计上记录核磁共振(NMR)光谱；将化学位移(a)记作部分/百万。根据Still的闪光色谱技术(W.C.Still等，《有机化学杂志》,(1978),43,2923)在硅胶(SiO₂)上进行闪光色谱法。

用于本实施例的缩写包括：Bn：苄基；Boc：叔丁氧基羰基{Me₃COC(O)｝；BSA：牛血清白蛋白；CHAPS:3-[(3-氯酰氨基丙基)-二甲基铵]-1-丙烷磺酸盐；DBU:1,8-二氮杂二环[5.4.0]十一碳-7-烯；CH₂Cl₂=DCM：二氯甲烷；DEAD：二乙基偶氮二羧酸盐；DIAD：二异丙基偶氮二羧酸盐；DIPEA：二异丙基乙胺；DMAP：二甲基氨基吡啶；DDC:1,3-二环己基碳二亚胺；DME:1,2-二甲氧乙烷；DMF：二甲基甲酰胺；DMSO：二甲基亚砜；DTT：二硫苏糖醇或苏-1,4-二巯基-2,3-丁二醇；DPPA：二苯基磷酰基叠氮化物；EDTA：乙二胺四乙酸；Et：乙基；EtOH：乙醇；EtOAc：乙酸乙酯；Et₂O：二乙醚；HATU:[O-7-(氮杂苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基六氟磷酸脲]；HPLC：高效液相层析；MS：质谱(MALDI-TOF：基质辅助性激光解吸(disorption)电离-飞行时间，FAB：快速原子轰击)；LAH：氢化铝锂；Me：甲基；MeOH：甲醇；MES:(2-{N-吗啉代}乙烷-磺酸)；NaHMDS:双(三甲基甲硅烷基)酰胺钠；NMM:N-甲基吗啉；NMP:N-甲基吡咯烷；Pr：丙基；Succ:3-羧基丙酰基(propanoyl)；PNA:4-硝基苯基氨基或对硝基苯胺；TBAF：叔-丁基氟化物铵；TBTU:2-(1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基四氟硼酸脲；TCEP：盐酸三(2-羧乙基)膦；TFA：三氟乙酸；THF：四氢呋喃；TIS：三异丙基硅烷；TLC：薄层色谱法；TMSE：三甲基甲硅烷基乙基；Tris/HCl：盐酸三(羟甲基)氨基甲烷。

P2结构单元实施例1A溴甲基-8-喹啉(1A)的合成：

向市售获得的8-喹啉羧酸(2.5g,14.4mmol)中加入纯亚硫酰氯化物(10ml,144mmol)中。在过量的亚硫酰氯化物在减压下被蒸馏之前将此混合物在80℃加热1小时。将在80℃加热了1小时的无水乙醇(15mL)在真空浓缩之前加入所得到的呈褐色固体中。残余物分配在EtOAc和饱和含水NaHCO₃之间，并将有机相干燥(MgSO₄)、过滤和浓缩得到呈褐色的油(2.8g)。将该物质(约14.4mmol)在35分钟内滴加到冷却至-60℃的LAH(0.76g,20.2mmol)/Et₂O悬浮液中，反应完成之前，将反应混合物在1.5小时内缓慢升温至-35℃。在30分钟内缓慢加入MgSO₄·10H₂O然后加湿THF使该反应停止。将混合物分配在Et₂O和10％含水NaHCO₃之间。并将有机相干燥(MgSO₄)、过滤和浓缩得到相应的醇呈黄色的固体(2.31g,2步80％)。将该醇(2.3g,11.44mmol)溶解在AcOH/HBr(20Ml,Aldrich的30％溶液)中并在70℃加热2.5小时。将混合物在真空下浓缩至干燥，分配在EtOAc(100mL)和饱和含水NaHCO₃之间，然后干燥(MgSO₄)、过滤和浓缩得到呈褐色固体(2.54g,100％)的所需化合物(1A)。实施例1B2-苯基-4-羟基喹啉(1B)的合成：

将市售可获得的苯甲酰乙酸乙酯(6.00g,31.2mmol)于85℃(封闭管)在75mL30％的NH₄OH中加热2小时。冷却后的固体过滤并在水中回流2小时。用CH₂Cl₂萃取该溶液三次。合并有机层、经MgSO₄干燥、过滤并浓缩。将黄色残余物在硅胶上进行闪光色谱分析、用EtOAc∶己烷(3∶7)洗脱、得到1.60g呈白色固体的相应酰胺，得率31％。

使用Dean-Stark装置用苯胺(143mg,1.53mmol)和甲苯(10mL)中的盐酸苯胺(10mg,0.08mmol)回流此酰胺(250mg,1.53mmol)。浓缩该溶液得到棕色油，将这种油与多磷酸(2g)混合并在135℃加热20分钟。将该反应混合物注入水中并用5M NaOH调节pH为8。用乙酸乙酯萃取该含水悬浮液两次。有机层合并、用盐水洗涤、经MgSO₄干燥、过滤并浓缩。将残余物在硅胶上进行闪光色谱分析、用乙酸乙酯中的3％MeOH洗脱、得到67mg2-苯基-4-羟基喹啉(1B)，得率20％。¹H NMR(DMSO-d₆)δ8.11(d,J=7Hz,1H),7.86-7.83(m,2H),7.77(d,J=8Hz,1H),7.68(dd,J=8,7Hz,1H),7.61-7.58(m,3H),7.35(dd,J=8,7Hz,1H),6.34(s,1H).实施例1C4-羟基-2-苯基-7-甲氧喹啉(1C)的合成 4-羟基-2-苯基-7-甲氧喹啉(e)：

将苯甲酰基乙酸乙酯(b)(100.0g,0.52mol)、间茴香胺(a)(128.1g,1.04mmol)和4N HCl/二烷(5.2mL)的甲苯(1.0L)溶液在Dean-Stark装置中回流6.25小时。用含水10％HCl(2×300mL)、1N NaOH(2×300mL)、H₂O(300mL)和盐水(15mL)依次洗涤被冷却的甲苯溶液。将甲苯相干燥(MgSO₄)、过滤并在减压下浓缩得到1.2∶1.0的酯c和酰胺d混合物(144.6g,45％/38％粗制得率)，它是一种深棕色油。将该粗的油加热80分钟至280℃、同时蒸馏所产生的乙醇。用CH₂Cl₂(200mL)研制所得到的冷却暗色固体。过滤悬浮液、用CH₂Cl₂洗涤所得到的固体，得到浅褐色固体e(22.6g,由a得到17％)：

¹H NMR(DMSO-d₆)δ8.00(d,J=9.0Hz,1H),7.81-7.82(m,2H),7.57-7.59(m,3H),7.20(d,J=2.2Hz,1H),6.94(dd,J=9.0,2.2Hz,1H),6.26(s,1H),3.87(s,3H).4-氯-2-苯基-7-甲氧喹啉(1C)：

将e(8.31g,33.1mmol)的POCl₃(90mL)悬浮液加热回流2小时(加热后得到的清亮溶液)。在减压下浓缩该反应混合物。将残余物分配在1NNaOH(加入放热的10N NaOH以保持高pH)和EtOAc(500mL)之间。用H₂O(100mL)和盐水(100mL)洗涤有机层、然后干燥(MgSO₄)、过滤和在减压下浓缩得到浅黄色固体1C(8.60g,96％)：

¹H NMR(DMSO-d₆)δ8.28-8.30(m,2H),8.20(s,1H),8.10(d,J=9.1Hz,1H),7.54-7.58(m,3H),7.52(d,J=2.5Hz,1H),7.38(dd,J=9.1,2.5Hz,1H),3.98(s,3H).This reaction was repeated three times and always gave 96-98％yield which is significantly higher that the 68％ yield reported in J.Med.Chem.1997,40,1794.该反应重复三次，总是得到96-98％的得率，这明显高于《医用化学杂志》1997,40,1794中所报道的68％得率。实施例2Boc-4(R)-(萘-1-基甲氧基)脯氨酸(2)的合成：

将市售的BoC-4(R)-羟基脯氨酸(5.00g,21.6mmol)溶解在THF(100mL)中并冷却至0℃。在10分钟内分批添加氢化钠(60％油悬浮液，1.85g,45.4mmol)，将悬浮液在室温搅拌1小时。然后，加入1-(溴甲基)萘(8.00g,36.2mmol)(如EA.Dixon等，《加拿大化学杂志》(1981),59,2629-2641所述的制备)、将混合物回流加热18小时。将混合物注入水(300mL)中、用己烷洗涤。用10％含水HCl酸化含水层、并用乙酸乙酯提取两次。合并有机层并用盐水洗涤、干燥(MgSO₄)、过滤并浓缩。将残余物通过闪蒸色谱法(49∶49∶2∶己烷∶乙酸乙酯∶乙酸)纯化得到为无色油的标题化合物(4.51g,56％得率)。¹H NMR(DMSO-d₆)显示存在两种旋转异构体：

δ8.05(m,1H),7.94(m,1H),7.29(d,J=14Hz,1H),7.55-7.45(m,4H),4.96(m,2H),4.26(br.s,1H),4.12(dd,J=J=8Hz,1H),3.54-3.42(m,2H),2.45-2.34(m,1H),2.07-1.98(m,1H)1.36(s,(3/9)9H),1.34(s,(6/9)9H).实施例3Boc-4(R)-(8-喹啉-甲氧基)脯氨酸(3)的合成：

将无水THF(20mL)中的Boc-4(R)-羟基脯氨酸(1.96g,8.5mmol)加入THF(100mL)中的NaH(1.4g,60％油,34mmol)悬浮液中。在将实施例1A的甲基-8-喹啉(2.54g,11.44mmol)加入THF(30mL)之前搅拌该混合物30分钟。在70℃加热该反应混合物(5小时)后用湿THF仔细去除过量NaH。真空浓缩反应物、并将所得到的物质溶解在EtOAc和水中。分离碱性含水相并在用EtOAc(150mL)提取之前用10％含水HCl酸化至pH约为5。将有机相干燥(MgSO₄)、过滤并浓缩得到一种棕色油。通过闪蒸色谱法(洗脱液：10％MeOH/CHCl₃)纯化得到为浅黄色固体的所需化合物(2.73g,86％得率)。HPLC(97.5％)；¹H NMR(DMSO-d₆)显示比例为6∶4的旋转异构体数： δ12-11.4(bs,1H),8.92(2×d,J=4.14and4.14Hz,1H),8.38(2×d,J=8.27and8.27Hz,1H),7.91(d,J=7.94Hz,1H),7.77(d,J=7.0Hz,1H),7.63-7.54(m,2H),5.14(2×s,2H),4.32-4.29(m,1H),4.14-4.07(m,1H),3.52-3.44(m,2H),2.43-2.27(m,1H),2.13-2.04(m,1H),1.36 and 1.34(2×s,9H).实施例4ABoc-4(R)-(7-氯喹啉-4-氧)脯氨酸(4A)的制备：

将市售可获得的Boc-4(S)-羟基脯氨酸甲基酯(500mg,2.04mmol)和7-氯-4-羟基喹啉(440mg,2.45mmol)置于0℃的干THF(10mL)中。加入三苯基膦(641mg,2.95mmol)，然后缓慢加入DIAD(642mg,2.45mmol)。将混合物在室温搅拌20小时。然后,浓缩该反应混合物，将其溶解在乙酸乙酯中，用1N HCl提取三次。用Na₂CO₃碱化含水相、并用乙酸乙酯提取两次。混合有机层、经MgSO₄干燥、过滤并浓缩得到一种黄色油。将这种油通过闪蒸色谱法纯化得到498mg为白色固体的化合物4A甲基酯，58％得率。

用甲醇(4mL)中的1M含水氢氧化钠(1.7 M1,1.7mmol)在0℃水解这种甲基酯(400mg,0.986mmol)3小时。浓缩该溶液以去除甲醇，并用1M含水HCl中和。浓缩悬浮液至干、并溶解在甲醇(20mL)中，过滤掉盐、浓缩滤液得到387mg定量得率的所需化合物4A，为白色固体。

¹H NMR(DMSO-d₆)(约1∶1旋光异构体的混合物)：

δ8.74(d,J=5Hz,1H),8.13-8.09(m,1H),7.99and7.98(s,1H),7.58(d,J=9Hz,1H),7,02(d,J=5Hz,1H),5.26-5.20(m,1H),4.10-4.01(m,1H),3.81-3.72(m,1H),3.59(dd,J=12,10Hz,1H),2.41-2.31(m,2H),1.34and1.31(s,9H).实施例4BBoc-4(R)-(2-苯基-7-甲氧基喹啉-4-氧)脯氨酸(4B)的合成：

1-[(1,1-二甲基甲氧基)羰基]-4(R)-(7-甲氧基-2-苯基-4-喹啉基)氧]-L-脯氨酸(4B)：

将叔丁氧化钾(8.16g,72.7mmol)在15分钟内分小批加入市售的、保持在25℃的DMSO(83mL)中的4(S)-羟基脯氨酸(6.73g,29.1mmol)中,共计15分钟以上。将混合物在25℃搅拌1.5小时。将氯-2-苯基-7-甲氧基喹啉1C(8.61g,32.0mmol)分4批加入该反应混合物中(在15分钟内)。将该反应混合物在25℃搅拌19小时。将所得到的悬浮液注入水(650mL)中、并用Et₂O(3×150mL)洗涤混合物以去除过量的氯喹啉(后来发现EtOAc更有效)。用含水1N HCl(约1.5当量、38mL，需要43.6mL)酸化含水层至pH为4-5。通过过滤回收被沉淀的白色固体。在减压下经P₂O₅干燥湿的固体得到为浅褐色固体的脯氨酸衍生物4B(12.6g,91％，含2.3％w/w DMSO)：¹H NMR(DMSO-d₆)δ(2∶1旋转异构体的混合物)：

8.27(d,J=7.0Hz,2H),8.00,7.98(2d,J=9.2,-9.2Hz,1H),7.48-7.56(m,3H),7.45,7.43(2s,1H),7.39(d,J=2.5Hz,1H),7.17(dd,J=9.2,2.5Hz,1H),5.53-5.59(m,1H),4.34-4.41(m,1H),3.93(s,3H),3.76(broad s,2H),2.63-2.73(m,1H),2.32-2.43(m,1H),1.36,1.33(2s,9H).

P1结构单元实施例5(1R,2R)/(1S,2R)1-氨基-2-乙基环丙基羧酸的混合物的合成

a)将二叔丁基丙二酸盐(20.0g,92.47mmol)和1,2-二溴丁烷(30.0g,138.93mmol)依次加入50％NaOH水溶液(185mL H₂O中含92.4g)中的苄基三乙基氯化铵(21.0g,92.19mmol)中。在室温下用力搅拌该反应混合物过夜，然后加入冰和水的混合物。用CH₂Cl₂(3x)提取粗制品，接着用水(3x)和盐水洗涤。将有机层干燥(MgSO₄)、过滤并浓缩。将残余物通过闪蒸色谱分析(7cm，己烷中含2-4％Et₂O)得到所需环丙烷衍生物5c(19.1g,70.7mmol,76％得率)。

¹H NMR(CDCl₃)δ1.78-1.70(m,1H),147(s,9H)1.46(s,9H),1.44-

1.39(m,1H),1.26-1.64(m,3H),1.02(t,3H,J=7.6Hz).b)在0℃干醚(100 mL)中的叔丁氧化钾(6.71g,59.79mmol,4.4当量)悬浮液中加入水(270ìL,15.00mmol,1.1当量)。5分钟后，将醚(10mL)中的二酯5c(3.675g,13.59mmol)加入悬浮液中。在室温下将反应混合物搅拌过夜，然后加入冰和水的混合物并用醚(3x)洗涤。在0℃用10％柠檬酸水溶液酸化含水层、并用AcOEt(3x)提取。用水(2x)和盐水连续洗涤混合的有机层。常规处理(Na₂SO₄，过滤，浓缩)后，分离出为浅黄色油的所需酸5d(1.86g,8.68mmol,64％得率)。

¹H NMR(CDCl₃)δ2.09-2.01(m.1H),1.98(dd,J=3.8,9.2Hz,1H),1.81-1.70(m,1H),1.66(dd,J=3.0,J=8.2Hz,1H),1.63-1.56(m,1H),1.51(s,9H),1.0(t,J=7.3Hz,3H).c)在干苯(32mL)中的酸5d(2.017g,9.414mmol)中依次加入Et₃N(1.50mL,10.76mmol,1.14当量)和DPPA(2.20mL,10.21mmol,1.08当量)。将反应混合物回流3.5小时，然后加入2-三甲基甲硅烷基乙醇(2.70mL,18.84mmol,2.0当量)。使回流保持过夜，然后用Et₂O稀释反应混合物，并依次用10％柠檬酸水溶液、水、饱和含水NaHCO₃、水(2x)和盐水连续洗涤。常规处理(MgSO₄，过滤，浓缩)后，将残余物通过闪蒸色谱(5cm,10％AcOEt-己烷)纯化得到为浅黄色油的所需氨基甲酸酯5e(2.60g,7.88 mmol,84％得率)。MS(FAB)330(MH⁺)；

¹H NMR(CDCl₃)δ5.1(bs,1H),4.18-4.13(m,2H),1.68-1.38(m,4H),1.45(s,

9H),1.24-1.18(m,1H),1.00-0.96(m,5H),0.03(s,9H).d)在氨基甲酸酯5e(258mg,0.783mmol)中加入THF(940ìL,0.94mmol,0.8当量)中的1.0M TBAF溶液。4.5小时后，另外加入(626ìL,0.63mmol,0.8当量)1.0M TBAF。在室温下将反应混合物搅拌过夜，回流30分钟，然后用AcOEt稀释。用水(2x)和盐水连续洗涤该溶液。常规处理(MgSO₄，过滤和浓缩)后，分离出(84mg,0.453mmol,58％得率)为浅黄色液体的所需胺5f。

¹H NMR(CDCl₃)61.96(bs,2H),1.60-1.40(m,2H),1.47(s,

9H),1.31-1.20(m,1H),1.14(dd,J=4.1,7.3Hz,1H),1.02(dd,J=4.1,9.2Hz,1H),

0.94(t,J=7.3Hz,3H).实施例6叔丁基-(1R,2R)/(1S,2R)1-氨基-2-乙基环丙基羧酸盐(来自实施例5)的化学拆分：

用1M TBAF/THF(26mL)回流处理由实施例5得到的混合物5e(8.50g,25.86mmol)45分钟。用AcOEt稀释冷却的反应混合物，用水(3x)和盐水(1x)洗涤，然后干燥(MgSO₄)、过滤并蒸发得到为浅黄色油的游离胺。将该游离胺溶解在无水CH₂Cl₂(120mL)中，依次加入NMM(8.5mL,77.57mmol)、化合物2(实施例2)(10.08g,27.15mmol)和HATU(11.79g,31.03mmol)。将反应混合物搅拌过夜，然后按前面所述逐步进行。通过闪蒸色谱(洗脱液-己烷∶Et₂O；25∶75)分离粗制非对映异构体混合物得到白色泡沫(4.42g,64％理论得率)的二肽6a(较少极性洗脱斑)和为乳白色泡沫(4g,57％理论得率)的6b(较多极性洗脱斑)。此时分离出两种异构体，但绝对的立体化学仍是未知的。实施例7通过与已知的叔丁基(1R-氨基-2R-乙基环丙基)羧酸盐的相互关系确定化合物6a和6b的绝对立体化学

Montreal大学的A.Charette教授提供了具有所示绝对立体化学的化合物7a，它是通过X线结晶学(《美国化学会杂志》1995,117,12721)确定的。将化合物7a(13.2mg,0.046mmol)溶解在1M HCl/EtOAc(240 L)中，并搅拌约48小时。蒸发该混合物至干得到呈浅黄色膏的化合物7b，再按实施例6所述、使用CH₂Cl₂中的NMM(20.3ìL,0.185mmol)和HATU(21.1mg,0.056mmol)将该化合物与化合物2(18mg,0.049mmol)偶联。通过闪蒸色谱(洗脱液-己烷：Et₂O；50祆0)纯化该粗制物质得到二肽7c为一种油(7.7mg,31％)。通过TLC、HPLC和NMR对比，发现二肽7c与实施例6所得到的较低极性化合物6a是相同的，由此确定6a的绝对立体化学为(1R,2R)。实施例8(1R,2R)/(1S,2R)1-Boc-氨基-2-乙基环丙基羧酸(8a)的制备：

将实施例5的氨基甲酸酯(2.6g,7.88mmol)在TFA中于0℃搅拌40分钟。然后浓缩该混合物，用THF(10mL)稀释。加入NaOH水溶液(700mg,8.8mL水中含17.5mmol)、再加入(Boc)₂O(2.06g,9.44mmol,1.2当量)的THF(13mL)溶液。在室温下搅拌该反应混合物过夜(需要时通过加入10％NaOH水溶液保持pH为8)，然后用水稀释，用Et₂O(3X)洗涤，再在0℃用10％柠檬酸水溶液酸化。用EtOAc(3x)提取含水层，再用水(2x)和盐水连续洗涤。常规处理(MgSO₄，过滤和浓缩)后，分离出所需的Boc-保护性氨基酸(8a)(788mg,3.44mmol,44％得率)。

¹H NMR(CDCl₃)δ

5.18(bs,1H),1.64-1.58(m,2H),1.55-1.42(m,2H),1.45(s,9H),1.32-1.25(m,1H),

0.99(t,3H,J=7.3Hz).(1R,2R)/(1S,2R)1-Boc-氨基-2-乙基环丙基羧酸甲基酯(8b)的制备：

将Boc衍生物8a(0.30g,1.31mmol)溶解在Et2O(10mL)中，并在0℃用刚刚制备的Et₂O中的二偶氮甲烷处理，直至留下黄色稍过量的二偶氮甲烷。在室温下搅拌20分钟后，浓缩该反应混合物至干得到为澄清无色油的8b(0.32g,100％)。

¹H NMR(CDCl₃)δ5.1(bs,1H),3.71(s,3H),1.62-1.57(m,2H),1.55(s,9H),

1.53-1.43(m,1H),1.28-1.21(m,2H),0.95(t,J=7.3Hz,3H).实施例9甲基(1R,2R)/(1S,2R)Boc-1-氨基-2-乙基环丙基羧酸盐的酶促拆分： ^*使用ChiralcelOD-H柱的HPLC分析

^**也可接受的其它酯(如Et)a)将实施例8的(1R,2R)/(1S,2R)1-Boc-氨基-2-乙基环丙基羧酸甲基酯(0.31g,1.27mmol)对映异构体混合物溶解在丙酮(3mL)中，然后用水(7mL)稀释，同时快速搅拌。在加入阿卡酶(Alcalase)[2.4 L从Novo Nordisk工业公司提取](300mg)之前用0.05M含水NaOH将溶液pH调至7.5。培养过程中用NaOH稳定pH，设立pH稳定计以监控NaOH溶液的加入。40小时后用EtOAc和水(含5mL饱和NaCO₃)稀释混合物，并分离该相。用10％含水HCl酸化含水相、并用EtOAc提取、干燥(MgSO₄)、过滤并浓缩得到酸9a(48.5mg)。使用实施例6和7所述的相互关系确定绝对立体化学。b)用Et₂O中的二偶氮甲烷处理等分酸9a，得到甲基酯，然后通过使用手性柱[ChiralcelOD-H,2.5％异丙醇/己烷，等度]的HPLC分析显示(1S,2R)异构体的比例为51∶1。a)将有机相干燥(MgSO₄)、过滤并浓缩得到未水解酯(0.248mg)。将这种物质再进行上述酶方法直至pH保持稳定(98小时)。按照上述提取后，回收到0.146mg(100％)未水解酯。通过使用手性柱的HPLC分析显示(1R,2R)异构体的比例＞50∶1。b)用10％含水HCl酸化含水相，并用EtOAc提取、干燥(MgSO₄)、过滤并浓缩得到酸类似物(82mg)。用二偶氮甲烷处理一部分这种物质，然后按上述通过使用手性柱的HPLC分析显示(1S,2R)衍生物的比例为65∶1。实施例10(1R,2S)/(1S,2S)1-氨基-2-乙基环丙基羧酸的合成：

从实施例5所述的酸5d起始：c)向CH₃CN(25mL)中的5d(1.023g,4.77mmol)中依次加入DBU(860ìL,5.75mmol,1.2当量)和烯丙基溴化物(620ìL,7.16mmol,1.5当量)。在室温下搅拌该反应混合物4小时，然后浓缩。用Et₂O稀释残余物，并依次用10％柠檬酸水溶液(2X)、水、饱和含水NaHCO₃、水(2x)和盐水洗涤。常规处理(MgSO₄，过滤和浓缩)后，分离出为无色油的所需酯10a(1.106g,3.35mmol,91％得率)。MS(FAB)255(MH⁺)；

¹H NMR(CDCl₃)δ

5.96-5.86(m,1H),5.37-5.22(m,2H),4.70-4.65(m,1H),4.57-4.52(m,1H),1.87-

1.79(m,1H),1.47(s,9H),1.45-1.40(m,1H),1.33-1.24(m,3H),1.03(t,J=7.3Hz,

3H).d)将TFA(5mL)加入室温的干CH₂Cl₂(5mL)中的酯10a(1.106g,4.349mmol)中。搅拌该反应混合物1小时，然后浓缩得到10b(854mg,4.308mmol,99％得率)。MS(FAB)199(MH⁺)；

¹H NMR(CDCl₃)δ5.99-

5.79(m,1H),5.40-5.30(m,2H),4.71-4.62(m,2H),2.22-2.00(m,2H),1.95-1.88(m,

1H),1.84-1.57(m,2H),0.98(t,J=7.3Hz,3H).e)在干苯(14.8mL)中的酸10b(853mg,4.30mmol)中依次加入Et₃N(684ìL,4.91mmol,1.14当量)和DPPA(992ìL,4.60mmol,1.07当量)。将反应混合物回流4.5小时，然后加入2-三甲基甲硅烷基乙醇(1.23mL,8.58mmol,2.0当量)。使回流保持过夜，然后用Et₂O稀释反应混合物，并依次用10％柠檬酸水溶液、水、饱和含水NaHCO₃、水(2x)和盐水连续洗涤。常规处理(MgSO₄，过滤，浓缩)后，将残余物通过闪蒸色谱(5cm,10-15％AcOEt-己烷)纯化得到为浅黄色油的所需氨基甲酸酯10c(1.212g,3.866mmol,90％得率)。MS(FAB)314(MH⁺)；

¹H NMR

(CDCl₃)δ5.93-5.84(m,1H),5.32-5.20(m,2H),5.05(bs,1H),4.60-4.56(m,2H),

4.20-4.11(m,2H),1.71-1.60(m,3H),1.39-1.22(m,1H),1.03(t,J=7.6Hz,3H),

0.96-0.86(m,1H),0.04(s,9H).f)在氨基甲酸酯10c(267mg,0.810mmol)中加入THF(1.62mL,162mmol,2.0当量)中的1.0 M TBAF溶液。在室温下将反应混合物搅拌过夜，回流30分钟，然后用AcOEt稀释。用水(2x)和盐水依次洗涤该溶液。常规处理(MgSO₄，过滤和浓缩)后，分离出(122mg,0.721mmol,89％得率)为浅黄色液体的所需胺10d。

¹H NMR(CDCl₃)δ5.94-5.86(m,1H),5.31-5.22(m,2H),4.58

(d,J=5.7Hz,2H),1.75(bs,2H),1.61-1.53(m,2H),1.51-1.42(m,2H),1.00(t,J=

7.3Hz,3H),0.70-0.62(m,1H).实施例11乙基-(1R,2S)/(1S,2S)-1-氨基-2-乙烯基环丙基羧酸盐的合成：

a)将市售可获得的THF(45mL)中的亚胺11a(10.0g,37.41mmol)加到-78℃的叔丁氧化钾(4.62g,41.17mmol,1.1当量)的THF溶液(180mL)中。将反应混合物升温至0℃，并在此温度下搅拌40分钟。然后加入1,4-二溴丁烯11b(8.0g,37.40mmol)将混合物冷却至-78℃，再在0℃搅拌1小时，加入叔丁氧化钾(4.62g,41.17mmol,1.1当量)使之冷却回到-78℃。最后再在0℃将反应混合物搅拌1小时、并浓缩得到化合物11c。b,c,d)将11c溶解在Et₂O(265mL)中、并用1N HCl水溶液(106mL)处理。在室温下3.5小时后，分离各层，用Et₂O(2X)洗涤含水层，并用饱和NaHCO₃水溶液使之碱化。用Et₂O(3X)提取所需的胺，并用盐水洗涤混合的有机提取物。常规处理(MgSO₄、过滤并浓缩)后，用二噁烷(187mL,748mmol)中的4N HCl溶液处理残余物。浓缩后，分离出棕色固体的盐酸盐11d(2.467g,12.871mmol,34％得率)。

¹H NMR(CDCl₃)δ9.17(bs,3H),5.75-5.66(m,1H),5.39(d,J=17.2Hz,1H),5.21(d,J=10.2 Hz,1H),4.35-4.21(m,2H),2.77-2.70(m,1H),2.05(dd,J=6.4,10.2Hz,1H),1.75(dd,J=6.4,8.3Hz,1H),1.33(t,J=7.0Hz,3H).实施例12(1R,2R)/(1S,2R)-1-Boc-氨基-2-乙烯基环丙基羧酸乙基酯的制备：

乙烯基与酯顺式定向

将盐酸盐Ⅱd(1.0g,5.2mmol)和(Boc)₂O(1.2g,5.7mmol)溶解在THF(30mL)中，并用DMAP(0.13g,1.04mmol,0.2当量)和二异丙基乙基胺(2.8mL,15.6mmol)处理。在用EtOAc(40mL)稀释前搅拌该反应化合物24小时，依次用饱和NaHCO₃(含水)、5％含水HCl和饱和盐水洗涤。将有机相干燥(MgSO₄)、过滤和浓缩，通过闪蒸色谱(15％EtOAc/己烷)得到12a(0.29g,23％)。

¹H NMR(CDCl₃)δ5.80-5.72(m,1H),5.29-5.25

(dd,J=17.2,17.2Hz,1H),5.24-5.1(bs,1H),5.10(dd,J=9.2,9.2Hz,1H),4.22-

4.13(m,2H),2.15-2.04(m,1H),1.85-1.73(bs,1H),1.55-1.5(m,1H),1.49(s,9H),

1.26(t,J=7.3Hz,3H).实施例13(1R-2S)/(1S,2S)1-氨基-2-乙烯基环丙基羧酸乙酯的酶促拆分：

^*使用Chiralcel OD-H柱的HPLC分析a)将外消旋衍生物12a(0.29g,1,14mmol)溶解在丙酮(5mL)中，再用水(10mL)稀释。在加入Alcalase(300mg)之前用0.2N含水NaOH将pH调至7.2。为了在培养过程中保持pH恒定，通过pH稳定滴定计加入NaOH溶液9天以上，直至加入了理论数量的碱。接着按实施例9所述进行酸/碱提取，分离出未水解酯(0.15g,100％)和水解物质(0.139g,95％)。通过使用手性柱的HPLC对未水解酯分析显示所需化合物13c的比例为43∶1。将化合物206(其中R₁为乙烯基，表2)氢化(10.8mg,0.015mmol，在含约1mL 20％Pd(OH)₂的1mL EtOH中，在1个H₂大气压下，氢化45分钟)得到化合物214(其中R₁为乙基，表2)。化合物214的(1R,2R)立体化学排布是基于如实施例6和7所述的化学上相互关系，这表明化合物206(R₁为乙烯基)具有13c(尽管1R,2S，因为R₁为乙烯基)所代表的同样的绝对构型。

HPLC分析的条件：ChiralcelOD-H(4.6mm×25cm)，使用2.5％异丙醇/己烷流动相的等度条件。实施例14用二苯甲酰基-D-酒石酸结晶对(1R-2S)/(1S,2S)1-氨基-2-乙烯基环丙基羧酸盐进行拆分：

将二苯甲酰基-D-酒石酸(33.5g,93.5mmol)加到EtOAc(800mL)中的粗制外消旋(1S,2S和1R,2S)1-氨基-2-乙烯基环丙基羧酸乙酯[按实施例13所述从N-(二苯基亚甲基)甘氨酸乙基乙酯(25.0g,93.5mmol)获得]溶液中。将混合物加热回流，在室温下放置15分钟，然后冷却至0℃。30分钟后得到白色固体。过滤该固体，用EtOAc(100mL)洗涤并风干。将固体悬浮在丙酮(70mL)中，超声(sonicated)并过滤(3x)。在热丙酮中将该固体再结晶两次(A批)。浓缩母液、在热丙酮中将该残余物再结晶三次(B批)。混合(5.53g)二苯甲酰基-D-酒石酸盐的两批无水白色固体，并将其悬浮在Et₂O(250mL)和饱和NaHCO₃溶液(150mL)的混合物中。用盐水洗涤有机层，干燥(MgSO₄)并过滤。用1N HCl/Et₂O(100mL)稀释滤液，并在减压下浓缩。用CCl₄蒸发油性残余物得到为白色吸湿性固体的盐酸1(R)-氨基-2(R)-乙烯基环丙烷羧酸乙酯(940mg,11％得率)，其绝对立体化学根据与实施例13的化合物13c的相互关系进行排布。[α]²⁵ _D+39.5℃(c1.14MeOH)；[a]²⁵ ₃₆₅+88.5℃(c1.14MeOH)；¹H NMR(DMSO-d₆)δ9.07(broad s,2H),5.64(ddd,J=17.2,10.4,8.7Hz,1H),5.36(dd,J=17.2,1.6Hz,1H),5.19(dd,J=10.4,1.6Hz,1H),4.24-4.16(m,2H),2.51-2.45(m,peaks hinderedby DMSO,1H),1.84(dd,J=10.0,6.0Hz,1H),1.64(dd,J=8.3,6.0Hz,1H),1.23(t,J=7.1Hz,3H)；MS(ESl)m/z156(MH)⁺；

通过Boc衍生物的HPLC分析(CHIRALPAK AS嚨-Hex:I-PrOH)确定对映体的纯度约为91％ee。(实施例13)

P4-P2结构单元实施例15Ac-Chg-Chg-Pro-(4(R)-萘-1-基甲氧基)-OH(15g)片段的合成

将化合物15a(与实施例2的化合物2相同)(4.45g,11.98mmol)溶解在无水CH₃CN(60mL)中，依次加入DBU(2.2mL,14.38mmol)和烯丙基溴化物(1.1mL,13.18mmol)并在室温下搅拌该反应混合物24小时。浓缩该混合物，用EtOAc和水稀释所得到的油，并用水(2x)和盐水(1x)连续洗涤。将EtOAc层干燥(MgSO₄)、过滤并蒸发至干。通过闪蒸色谱(洗脱液∶己烷∶EtOAc；90∶10-85∶15)纯化该黄色油得到为黄色油的产品15b(2,4.17g,85％得率)。MS(FAB)412 MH⁺

¹H NMR(CDCl₃)，旋转异构体混合物约1∶2,

δ(d,J=8Hz,1H),7.87(d,J=8Hz,1H),7.82(d,J=8Hz,1H),7.55-7.41(m,4H),5.95-5.85(m,1H),5.34-5.21(m,2H),5.03-4.88(m,2H),4.70-4.56(m,2H),4.48 & 4.39(t,J=8,15Hz,1H),4.28-4.23(m,1H),3.81-3.55(m,2H),2.46-2.36(m,1H),2.13-2.05(m,1H),1.44 & 1.41(s,9H).

在室温下用4N HCl/二噁烷处理化合物15b(2.08g,5.05mmol)30分钟。蒸发至干得到相应的一种油盐酸胺。将盐酸胺15c溶解在无水DCM(25mL)和NMM(2.2mL,20.22mmol)中，依次加入Boc-Chg-OH·H₂O(1.53g,5.56mmol)和TBTU(1.95g,6.07mmol)。在室温下搅拌反应混合物过夜，然后，用EtOAc稀释，并用10％含水柠檬酸(2x)、饱和含水NaHCO₃(2x)、水(2x)和盐水(1x)连续洗涤。将EtOAc层干燥(MgSO₄)、过滤并蒸发至干得到为黄白色泡沫的粗制品15d(约2.78g,100％得率)。MS(FAB)551.4 MH⁺。¹H NMR(CDCl₃)δ8.03(d,J=8Hz,1H),7.86(bd,J=8.5Hz,1H),7.84(d,J=8Hz,1H),7.56-7.40(m,4H),5.92-5.85(m,1H),5.31(dd,J=1,17Hz,1H),5.22(dd,J=1,10Hz,1H),5.17(d,J=9Hz,1H),5.05(d,J=12Hz,1H),4.91(d,J=12Hz,1H),4.67-4.60(m,3H),4.31-4.27(m,2H),4.16(bd,J=11Hz,1H),3.71(dd,J=4,11Hz,1H),2.47-2.41(m,1H),2.08-1.99(m,1H),1.85-1.63(m,5H),1.44-1.40(m,1H),1.36(s,9H),1.28-1.00(m,5H).

按照所述的化合物15c的合成法用4N HCl/二噁烷(25mL)处理粗制二肽15d(约5.05mmol)。按照所述的化合物15d的合成法用DCM(25mL)中的NMM(2.22mL,20.22mmol)和TBTU(1.95g,6.07mmol)使粗制盐酸盐与Boc-Chg-OH·H₂O(1.53g,5.55mmol)偶联，得到黄色油泡沫的粗制三肽15e。粗制物用闪蒸色谱纯化(洗脱液∶EtOAC；80∶20-75∶25)得到三肽15e白色泡沫(2.75g,2步以上79％得率)。MS(FAB)690.5 MH⁺。¹H NMR(CDCl₃)，主要是一种旋转异构体，

δ 8.06(d,J=8Hz,1H),7.87(bd,J=8.5Hz,1H),7.82(d,J=8Hz,1H),7.57-7.40(m,4H),6.41(d,J=8.5Hz,1H),5.92-5.84(m,1H),5.31(dd,J=1,17Hz,1H),5.23(dd,J=1,10.5Hz,1H),5.04(d,J=12Hz,1H),4.98(bd；J=7Hz,1H),4.93(d,J=12Hz,1H),4.63-4.58(m,4H),4.29-4.25(m,1H),4.10-4.07(m,1H),3.90-3.84(m,1H),3.72(dd,J=4,11Hz,1H),2.48-2.40(m,1H),2.07-1.99(m,1H),1.83-1.55(m,12H),1.43(s,9H),1.23-0.89(m,10H).

按照所述的化合物15c的合成法用4N HCl/二噁烷(25 mL)处理三肽15e(2.75g,3.99mmol)。将粗制盐酸盐溶解在无水DCM(20mL)中，并依次加入NMM(1.75mL,15.94mmol)和乙酸酐(752ìL,15.94mmol)。在室温下搅拌反应混合物过夜，然后，用EtOAc稀释。并用10％含水柠檬酸(2x)、饱和含水NaHCO₃(2x)、水(2x)和盐水(1x)依次洗涤有机层，干燥(MgSO₄)、过滤并蒸发至干得到为白色泡沫的粗制三肽15f(2.48g,98％得率)。

MS(FAB)632.4 MH⁺。¹H NMR(CDCl₃)，主要是一种旋转异构体。

δ 8.06(bd,J=8Hz,1H),7.87(bd,J=8Hz,1H),7.83(d,J=8Hz,1H),7.58-7.40(m,4H),6.36(d,J=9Hz,1H),6.01(d,J=9Hz,1H),5.94-5.83(m,1H),5.34-5.28(m,1H),5.25-5.21(m,1H),5.05(d,J=12Hz,1H),4.94(d,J=12Hz,1H),4.64-4.57(m,4H),4.30-4.23(m,2H),4.12-4.08(m,1H),3.73(dd,J=4,11Hz,1H),2.49-2.42(m,1H),2.08-2.01(m,1H),1.99(s,3H),1.85-1.53(m,11H),1.25-0.88(m,11H).

将粗制三肽15f(2.48g,3.93mmol)溶解在CH₃CN∶DCM(20mL)的无水混合物中。依次加入三苯基膦(53.5mg,0.200mmol)和四(三苯基膦)-钯(O)催化剂(117.9mg,0.102mmol)，再加入吡咯烷(353.9L,4.24mmol)。在室温下搅拌反应混合物18小时。此后，蒸发溶剂。将残余物溶解在EtOAc和10％含水柠檬酸中，进一步用10％含水柠檬酸、水(2x)和盐水(1x)洗涤两次以上。将有机层干燥(MgSO₄)、过滤并蒸发。在Et₂O∶DCM(85∶15)中研制粗制品、过滤后得到为白色固体的三肽15g(2.09g,90％得率)。MS(FAB)592.4 MH⁺。¹H NMR(CDCl₃)，主要是一种旋转异构体，

δ 8.08(d,J=8Hz,1H),7.93(bd,J=9Hz,1H),7.88(bd,J=8Hz,1H),7.82(d,J=8Hz,1H),7.57-7.41(m,4H),6.47(d,J=8.5Hz,1H),5.05(d,J=12.5Hz,1H),4.94(d,J=12.5Hz,1H),4.73(t,J=9.5,19Hz,1H),4.44-4.35(m,2H),4.26(bs,1H),4.19(d,J=11.5Hz,1H),3.75(dd,J=4,11Hz,1H),2.47(bdd,J=7.5,13.5Hz,1H),2.20-2.11(m,1H),2.04(s,3H),1.88-1.41(m,11H),1.30-0.80(11H).实施例16Ac-Chg-Val-Pro-(4(R)-萘-1-基甲氧基)-OH(16e)片段的合成

16a 16b

16c 16d16e

按照所述的化合物15c的合成法用4N HCl/二噁烷(30mL)处理化合物16a(2.89g,7.02mmol)。按照所述的化合物15d的合成法用DCM(35mL)中的NMM(3.1mL,28.09mmol)和TBTU(2.71g,8.43mmol)使粗制盐酸盐与Boc-Val-OH(1.53g,7.73mmol)偶联3.5小时，得到乳白色油状泡沫的粗制二肽16b(约3.60g,100％得率)。

MS(FAB)509.3 MH^-511.3 MH⁺533.2(M+Na)⁺.¹H NMR(CDCl₃)δ8.04(bd,J=8Hz,1H),7.87(bd,J=7Hz,1H),7.82(d,J=8Hz,1H),7.56-7.40(m,4H),5.93-5.85(m,1H),5.34-5.28(m,1H),5.24-5.19(m,2H),5.04(d,J=12Hz,1H),4.92(d,J=12Hz,1H),4.67-4.60(m,3H),4.31-4.26(m,2H),4.11-4.09(m,1H),3.72(dd,J=4,11Hz,1H),2.48-2.41(m,1H),2.07-1.99(m,1H),1.44-1.36(m,1H),1.37(s,9H),1.01(d,J=7Hz,3H),0.93(d,J=7Hz,3H).

按照所述的化合物15c的合成法用4N HCl/二噁烷(30mL)处理粗制二肽16b(约7.02mmol)。按照所述的化合物15d的合成法用CH₂Cl₂(35mL)中的NMM(3.1mL,28.09mmol)和TBTU(2.71g,8.43mmol)使粗制盐酸盐与Boc-Chg-OH?H₂O(2.13g,7.73mmol)偶联，得到乳白色泡沫的粗制三肽16c(约4.6g,100％得率)。MS(FAB)648.5 MH^- 672.4(M+Na)⁺.1H NMR(CDCl₃)δ8.06(bd,J=8Hz,1H),7.87(bd,J=7.5Hz,1H),7.82(bd,J=8Hz,1H),7.57-7.40(m,4H),6.46(bd,J=8.5Hz,1H),5.94-5.84(m,1H),5.31(dd,J=1,17Hz,1H),5.23(dd,J=1,10.5Hz,1H),5.03(d,J=12Hz,1H),5.00-4.97(m,1H),4.93(d,J=,12Hz,1H),4.63-4.59(m,4H),4.29-4.27(m,1H),4.10-4.07(m,1H),3.92-3.86(m,1H),3.72(dd,J=5,11Hz,1H),2.48-2.41(m,1H),2.10-1.99(m,1H),1.76-1.57(m,6H),1.43(s,9H),1.20-0.92(m,6H),1.00(d,J=7Hz,3H),0.93(d,J=7Hz,3H).

按照所述的化合物15c的合成法用4N HCl/二噁烷(30mL)处理粗制三肽16c(约7.02mmol)。按照所述的化合物15d的合成法用CH₂Cl₂(35mL)中的乙酸酐(1.33g,14.05mmol)和NMM(3.1mL,28.09mmol)进一步处理粗制盐酸盐。将粗制品经过色谱纯化(洗脱液∶己烷∶EtOAc；30∶70)得到白色泡沫的乙酰化保护性三肽16d(3.39g，三步以上81％得率)。MS(FAB)590.3 MH⁺592.4 MH⁺ 614.4(M+Na)⁺

¹H NMR(CDCl₃)，主要是一种旋转异构体，

δ8.06(d,J=8Hz,1H),7.88(bd,J=8Hz,1H),7.83(d,J=8Hz,1H),7.58-7.41(m,4H),6.37(d,J=9Hz,1H),5.97(d,J=8.5Hz,1H),5.94-5.84(m,1H),5.31(dd,J=1,17Hz,1H),5.24(dd,J=1,10.5Hz,1H),5.05(d,J=12Hz,1H),4.94(d,J=12Hz,1H),4.66-4.57(m,4H),4.31-4.22(m,2H),4.11-4.05(m,1H),3.73(dd,J=4.5,11Hz,1H),2.50-2.43(m,1H),2.09-2.01(m,2H),2.00(s,3H),1.68-1.55(m,5H),1.15-0.89(m,6H),0.99(d,J=7Hz,3H),0.91(d,J=7Hz,3H).

按照所述的化合物15g的合成法，通过四(三苯基膦)-钯(O)催化剂(117.9mg,0.102mmol)与在无水CH₃CN∶DCM(20mL)的1∶1混合物中的三苯基膦(78.1mg,0.298mmol)和吡咯烷(516ìL,6.19mmol)使乙酰化三肽16d(3.39g,5.73mmol)脱保护。在Et₂O∶DCM(85∶15)中研制粗制浅黄色泡沫制品、过滤后得到为灰白色固体的三肽16e(3.0g,95％得率)。MS(FAB)550.3 MH⁺。¹H NMR(CDCl₃)δ8.08(d,J=8Hz,1H),8.04(bd,J=9Hz,1H),7.88(bd,J=7.5Hz,1H),7.82(d,J=8Hz,1H),7.58-7.37(m,5H),5.05(d,J=12Hz,1H),4.94(d,J=12Hz,1H),4.61(t,J=9.5,19.5Hz,1H),4.46-4.37(m,2H),4.27(bs,1H),4.17(d,J=11Hz,1H),3.74(dd,J=4,11Hz,1H),2.49(bdd,J=7.5,13Hz,1H),2.17-2.09(m,1H),2.04(s,3H),2.03-1.94(m,1H),1.79(bd,J=12.5Hz,1H),1.62-1.43(m,5H),1.08-0.85(m,5H),1.00(d,J=7Hz,3H),0.90(d,J=7Hz,3H).

表1-4的化合物实施例17表1的化合物104的合成

17a=6a

17b 17c17d 17e17f 化合物104

按照所述的化合物15c的方法用4N HCl/二噁烷(40mL)处理化合物17a(4.27g,7.93mmol，如实施例6的化合物6a所述)5小时。将粗制盐酸盐溶解在THF(10mL)中，加入NaOH(348.7mg,8.72mmol)的水(5mL)溶液，接着逐滴加入溶解在THF(13mL)中的(Boc)₂O(1.73g,7.93mmol)。根据需要加入10％含水NaOH使pH保持8。用力搅拌该反应混合物，然后用Et₂O和水稀释、并用Et₂O提取一次以上。用10％含水柠檬酸酸化水层至pH为3。用EtOAc(3x)提取混合物。用水(3x)和盐水(1x)洗涤混合的EtOAc提取物，干燥(MgSO₄)、过滤并蒸发至干得到乳白色泡沫的粗制混合物17b(约7.93mmol)。MS(FAB)481.3 MH⁺ ¹H NMR(CDCl₃)，约1∶1旋转异构体的混合物， δ8.04(bd,J=7.5Hz,1H),7.87(bd,J=7.5Hz,1H),7.82(d,J=7.5Hz,1H),7.56-7.40(m,5H),4.96(bs,2H),4.33(t,J=7.5,14.5Hz,1H),4.21-4.09(m,0.5H),3.99-3.84(m,0.5H),3.78-3.75(m,0.5H),3.68-3.62(m,0.5H),3.61-3.42(m,1H),2.55-2.41(m,1H),2.22-2.11(m,1H),1.61-1.52(m,3H),1.43(s,9H),1.40-1.31(m,1H),1.25-1.19(m,1H),0.99(t,J=7.5,14.5Hz,3H).

按照所述的化合物15b的方法用无水CH₃CN(40mL)中的DBU(1.18 Ml,93mmol)和烯丙基溴化物(4.12mL,47.61mmol)处理化合物17b(约7.93mmol)48小时、得到乳白色泡沫的烯丙基化二肽17c(3.54g；2步以上86％得率)。MS(FAB)521.3 MH⁺ 545.2(M+Na)⁺1H NMR(CDCl₃),(约)1∶1旋转异构体的混合物，

δ8.05(bd,J=8Hz,1H),7.86(bd,J=7.5Hz,1H),7.82(d,J=8Hz,1H),7.55-7.40(m,5H),5.88-5.79(m,1H),5.27(bd,J=17.5Hz,1H),5.18(bd,J=10Hz,1H),5.03-4.89(m,2H),4.63-4.50(m,2H),4.44-4.19(m,2H),4.00-3.40(m,2H),2.70-2.02(m,2H),1.66-1.35(m,5H),1.44(s,9H),0.95(t,J=7.5,14.5Hz,3H).

按照所述的化合物15c的方法用4N HCl/二噁烷(35mL)处理粗制二肽17c(1.18g,2.26mmol)。按照所述的化合物15d的方法用DCM(11mL)中的NMM(993μL,9.03 mmol)和TBTU(870 mg,2.71 mmol)使粗制盐酸盐与Boc-Chg-OH?H₂O(684 mg,2.48 mmol)偶联，得到乳白色泡沫的粗制三肽17d(1.41g,95％)。MS(FAB)660.4 MH⁺662.3 MH⁺。¹H NMR(CDCl₃)，主要是一种旋转异构体， δ 8.03(bd,J=8Hz,1H),7.85(bd,J=8Hz,1H),7.81(d,J=8Hz,1H),7.56-7.39(m,5H),5.88-5.77(m,1H),5.26(dd,J=1.5,17Hz,1H),5.15(dd,J=1.5,10.5Hz,1H),5.12(s,1H),5.02-4.92(m,2H),4.72-4.59(m,1H),4.57-4.46(m,1H),4.42-4.35(m,1H),4.33-4.20(m,1H),4.02-3.90(m,1H),3.78-3.70(m,1H),3.67-3.51(m,1H),2.71-2.61(m,1H),2.12-2.02(m,1H),1.79-1.48(m,10H),1.45-1.39(m,1H),1.38(s,9H),1.25-1.01(m,5H),0.94(t,J=7.5.14Hz,3H).

按照所述的化合物15c的方法用4N HCl/二噁烷(35mL)处理粗制S三肽17d(265mg,0.400mmol)。按照所述的化合物15d的方法用DCM(3mL)中的NMM(176μL,1.60mmol)和TBTU(154.3mg,0.481mmol)使粗制盐酸盐与Boc-Chg-OH?H₂O(143.3mg,0.521mmol)偶联，得到乳白色泡沫的粗制四肽17e(约0.400mmol；100％)。MS(FAB)799.5 MH⁺ 801.5 MH⁺823(M+Na)⁺ ¹H NMR(CDCl₃)，约1∶1旋转异构体的混合物，

δ8.05(bd,J=8.5Hz,1H),7.87(bd,J=7.5Hz,1H),7.81(d,J=8.5Hz,1H),7.55-7.40(m,4H),7.37(s,1H),6.58-6.41(m,1H),5.89-5.78(m,1H),5.26(bdd,J=1.5,17Hz,1H),5.16(bdd,J=1.5,10.5Hz,1H),5.20-4.92(m,3H),4.68-4.58(m,2H),4.57-4.47(m,1H),4.43-4.26(m,1H),3.99-3.81(m,2H),3.78-3.60(m,2H),2.67-2.60(m,1H),2.11-2.02(m,1H),1.78-1.42(m,14H),1.44 & 1.43(s,9H),1.25-0.91(m,13H),0.95(t,J=7.5,15Hz,3H).

按照所述的化合物15c的方法用4N HCl/二噁烷(3mL)处理粗制四肽17e(约0.400mmol)。按照所述的化合物15f的方法用DCM(3mL)中的乙酸酐(83μL,0.884mmol)和NMM(194μL,1.77mmol)进一步处理粗制盐酸盐得到乳白色泡沫的粗制乙酰化四肽17f(约0.400mmol)。

MS(FAB)741.5MH⁺ 743.4MH⁺765.4(M+Na)⁺ ¹H NMR(CDCl₃)δ8.05(bd,J=8.5Hz,1H),7.87(bd,J=7.5Hz,1H),7.82(d,J=8.5Hz,1H),7.55-7.41(m,4H),7.39(s,1H),6.63-6.48(m,1H),6.01(d,J=8.5Hz,1H),5.90-5.79(m,1H),5.27(bdd,J=1.5,17Hz,1H),5.16(bdd,J=1.5,10.5Hz,1H),5.01(d,J=12Hz,1H),4.96(d,J=12Hz,1H),4.69-4.48(m,3H),4.44-4.37(m,1 H),4.36-4.22(m,1H),3.96(dd,J=4,11Hz,1H),3.78-3.60(m,2H),2.67-2.59(m,1H),2.10-2.00(m,1H),2.01(s,3H),1.78-1.48(m,13H),1.45-1.35(m,1H),1.26-0.89(m,13H),0.95(t,J=7.5,15Hz,3H).

按照所述的化合物15g的方法，通过四(三苯基膦)-钯(O)催化剂(11.3mg,0.010mmol)与在无水CH₃CN∶DCM(2mL)的1∶1混合物中的三苯基膦(5.12mg,0.020mmol)和吡咯烷(34ìL,0.406mmol)使乙酰化四肽17f(约0.400mmol)脱保护。将粗制品经闪蒸色谱(洗脱液-首先EtOAc，然后，1.92％HOAc,DCM中的3.85％MeOH)纯化、冷冻干燥后得到为灰白色无定形固体的表1中的四肽化合物104(193.1mg,5步以上73％得率)。

MS(FAB)701.4MH⁺ 703.4MH⁺725.4(M+Na)⁺

¹H NMR(CDCl₃)，约1∶5旋转异构体的混合物，δ8.57 & 8.32(s,1H),8.04(d,J=7.5Hz,1H),7.94(bd,J=7.5Hz,1H),7.88(d,J=8Hz,1H),7.83-7.78(m,2H),7.58-7.30(m,4H),4.99(d,J=12Hz,1H),4.90(d,J=12Hz,1H),4.44-4.29(m,2H),4.29-4.05(m,3H),3.87-3.73(m,1H),2.23-2.13(m,1H),2.05-1.95(m,1H),1.91 & 1.84(s,3H),1.75-1.40(m,15H),1.29-0.84(m,12H),0.91(t,J=7.5,14.5Hz,3H).实施例18表1的化合物105的合成

18a 18b

化合物105

将化合物18b，即相应于实施例5的化合物5f，与前面实施例15所述的预制三肽18a偶联。尤其是，将化合物18b(约0.521mmol)与化合物18a(323.6mg,0.547mmol)在DCM(3mL)和NMM(172μL,1.562mmol)中混合，然后加入HATU(237.6mg,0.625mmol)。在室温下搅拌该反应混合物18小时，然后按化合物15d中所述的进行、得到P1上的外消旋混合物粗制四肽。通过闪光色谱(洗脱液-甲苯∶EtOAc；40∶60)使两种异构体部分分离。合并首先洗脱部分得到9∶1混合物，其中主要成分(58mg)为17f的类似物叔丁基酯。中间部分含不同比例的17f的相应叔丁基酯和化合物105叔丁基酯(163mg)。后洗脱部分提供了作为主要异构体(75.8mg)的化合物105的相应叔丁基酯。

将后者的酯(74mg,0.0975mmol)溶解在4N HCl/二噁烷(2mL)中，在室温下搅拌5.5小时，然后蒸发至干得到一种油。经闪蒸色谱(洗脱液-首先EtOAc，然后，1.92％HOAc,3.85％MeOH,DCM中)纯化、冷冻干燥后得到为白色无定形固体的化合物105(38.7mg,56％得率)。HPLC分析显示化合物105与化合物104的比例为3∶1。化合物105的MS和NMR数据：MS(FAB)701.5 MH⁺ 703.5 MH⁺ 725.6(M+Na)⁺。¹H NMR(DMSO)，约1∶2.5旋转异构体的混合物，

δ8.76 & 8.34(s,1H),8.05(bd,J=7.5Hz,1H),7.94(bd,J=8Hz,1H),7.88(d,J=8.5Hz,1H),7.85-7.78(m,2H),7.59-7.43(m,4H),4.99(d,J=12Hz,1H),4.89(d,J=12Hz,1H),4.41-4.05(m,5H),3.82-3.66(m,1H),2.25-2.11(m,1H),2.11-1.98(m,1H),1.90 & 1.84(s,3H),1.78-1.40(m,15H),1.39-0.82(m,12H),0.90(t,J=7,14Hz,3H).实施例19表1化合物103的合成

根据实施例17所述的化合物104的合成方法，将实施例10制备的中间体化合物10d的1(R),2(R)和1(R),2(S)异构体的混合物与化合物2偶联得到异构中间体化合物19a和19b的化合物。19a 19b

按照实施例18的方法，分离异构化合物19a和19b，并将其转化为其相应的式Ⅰ化合物；分离表1的相应化合物103。

光谱数据：

化合物103：通过NMR的旋转异构体数约(1∶8.7)：MS(FAB)m/z:703(MH⁺)；¹H-NMR(DMSO-d₆)δ8.21-8.09(bs,1H),8.05(bd,J=7.63Hz,1H),7.94(bd,J=7.0Hz,1H),7.91-7.83(m,2H),7.83-7.76(m,1H),7.59-7.5(m,3H),7.5-7.43(m,1H),4.99(d,J=11.8Hz,1H),4.89(d,J=11.8Hz,1H),4.43-4.30(m,3H),4.23-4.16(m,1H),4.13(bd,J=10.8Hz,1H),3.71(dd,J=11.1,4Hz,1H),2.2-2.02(m,2H),1.87and1.84(2×s,3H),1.81-1.71(m,2H),1.70-1.40(m,12H),1.26-1.06(m,4H),1.04-0.83(m,11H),0.59(m,1H).实施例20表1的化合物108的合成

20c20d 化合物108

按照所述的化合物15c的方法用4N HCl/二噁烷(5mL)处理实施例17的粗制四肽17e(约0.963mmol)。按所述的化合物15d的方法用DCM(5mL)中的NMM(423μL,3.850mmol)和TBTU(370.8mg,1.155mmol)使粗制盐酸盐与Boc-(D)Glu(O-烯丙基)-OH(331.9mg,1.155mmol)偶联，得到乳白色泡沫的粗制五肽20b(约933.9mg,0.963mmol)。MS(FAB)968.6 MH⁺ 970.6 MH⁺992.5(M+Na)⁺

¹H NMR(CDCl₃)，约1∶4旋转异构体的混合物，

δ8.05(d,J=8.5Hz,1H),7.87(bd,J=7.5Hz,1H),7.81(d,J=8.5Hz,1H),7.58-7.34(m,5H),6.77-6.25(m,2H),5.98-5.77(m,2H),5.38-5.21(m,4H),5.16(dd,J=1.5,10.5Hz,1H),5.06-4.89(m,2H),4.68-4.13(m,7H),3.96-3.52(m,4H),2.69-2.38(m,3H),2.23-1.87(m,2H),1.78-1.37(m,17H),1.46 & 1.44(s,9H),1.22-0.87(m,11H),0.95(t,J=7,14.5Hz,3H).

按照所述的化合物15c的方法用4N HCl/二噁烷(5mL)处理实施例17的粗制五肽20b(约0.963mmol)。按所述的化合物15d的方法用DCM(5mL)中的NMM(423μL,3.85mmol)和TBTU(370.8mg,1.155mmol)使粗制盐酸盐与Boc-Asp(O-烯丙基)-OH(315.6mg,1.155mmol)偶联，得到乳白色泡沫的粗制六肽20c(约1.083g,0.963mmol)。MS(FAB)1147.6(M+Na)⁺

¹H NMR(CDCl₃)，约1∶1旋转异构体的混合物，

δ8.06(bd,J=8Hz,1H),7.86(d,J=8Hz,1H),7.81(d,J=8Hz,1H),7.59-7.39(m,5H),7.39-6.34(m,4H),5.98-5.76(m,3H),5.38-5.10(m,6H),5.10-4.89(m,2H),4.66-4.05(m,10H),3.87-3.58(m,4H),3.30-2.65(m,2H),2.65-1.89(m,3H),1.79-1.33(m,19H),1.47 & 1.45(s,9H),1.33-0.86(m,14H).

按照所述的化合物15c的方法用4N HCl/二噁烷(5mL)处理粗制六肽20c(约0.963mmol)。按照所述的化合物15f的方法用DCM(5mL)中的乙酸酐(182μL,1.193mmol)和NMM(423.5μL,3.850mmol)使粗制盐酸盐乙酰化得到粗制乙酰化四肽。将泡沫残余物经闪蒸色谱(洗脱液-首先己烷∶EtOAc 20∶80-10∶90，然后，纯EtOAc)纯化得到为乳白色泡沫的乙酰化六肽20d(528mg,4步以上51％得率)。MS(FAB)1067.6(MH⁺)1088.6(M+Na)。

将乙酰化六肽20d(528mg,0.495mmolr)溶解在DCM(3mL)中,并用预混合的、DCM(3mL)中的四(三苯基膦)-钯(O)催化剂(90mg,0.078mmol)与吡咯烷(134ìL,1.603mmol)的15分钟搅拌溶液进行处理。在室温下搅拌反应化混合物48小时，然后蒸发溶剂。通过在Et₂O∶DCM(85∶15)中研制使粗制品部分纯化，然后，通过制备HPLC分两批纯化。将部分纯化的物质的一半溶解在冰HOAc(5mL)中，通过MilliporeMillexHV 0.45μm过滤器过滤，并注入平衡Whatman Partisil10-ODS-3(2.2×50cm)C18反相柱中。纯化程序：15mL/分钟的线性梯度，230μm，以5％A注入；一旦所有HOAc被洗脱则开始下列程序-以5％A 10分钟，5-58％A 70分钟；A:0.06％TFA/CH₃CN；B:0.06％TFA/H₂O。通过分析HPLC对各部分进行分析，收集两种HPLC纯化的适当部分、并冷冻干燥得到白色无定形固体的所需六肽化合物108(218.3mg,47％得率)。

MS(FAB)945.5 MH-947.4 MH+ 969.5(M+Na)+ 985.4(M+K)+

¹H NMR(CDCl₃)，约1∶9旋转异构体的混合物，

δ8.55 & 8.31(s,1H),8.16(d,J=7.5Hz,1H),8.11(d,J=8Hz,1H),8.05(d,J=8.5Hz,1H),7.97-7.85(m,2H),7.88(d,J=8.5Hz,1H),7.75(d,J=9Hz,1H),7.59-7.39(m,4H),4.99(d,J=12Hz,1H),4,89(d,J=12Hz,1H),4.53(dd,J=7,14Hz,1H),4.08-4.45(m,6H),3.77(bdd,J=4,11Hz,1H),2.64(dd,J=6.5,16.5Hz,1H),2.48-2.41(m,1H),2.25-2.12(m,3H),2.07 & 1.82(s,3H),2.04-1.86(m,2H),1.80-1.35(m,14H),1.32-0.80(m,14H),0.91(t,J=7.5,14.5Hz,3H).实施例21表3的化合物301的合成21a≡9c 21b

21c

化合物301

将水(4mL)中的氢氧化锂一水合物(23mg,0.56mmol)加入MeOH(3.5mL)和THF(3.5mL)中的酯化合物21a(45mg,0.185mmol，如前面所述的(R,R)异构体9c)的溶液中。用力搅拌所得到的溶液16小时，然后将其分配在EtOAc(60mL)和10％含水HCl(20mL)之间。分离有机相，干燥(MgSO₄)、过滤并浓缩得到定量得率的相应酸。

将此物质(约0.185mmol)与DCM(5mL)中的(S)-(-)-α甲基苄基胺(27mg,0.22mmol)、HATU(77mg,0.22mmol)和DIPEA(0.11mL,0.65mmol)混合。20小时后，浓缩反应物。将残余物溶解在EtOAc中，随后用饱和含水NaHCO₃、10％含水HCl和盐水洗涤该溶液，然后干燥(MgSO₄)、过滤并真空浓缩。经闪蒸色谱(洗脱液-35％EtOAc/己烷)纯化得到11mg(28％)偶联产品21b。用4N HCl/二噁烷处理该物质(11mg,0.033mmol)35分钟。此后浓缩该反应化合物至干得到相应胺的盐酸盐。将后一产品与DMF(4mL)中的式

(33mg,0.036mmol，用实施例15和20的类似方法制备)、HATU(14mg,0.036mmol)和DIPEA(0.116mg,0.02mmol)偶联。反应混合物搅拌16小时后浓缩将残余物溶解在EtOAc中。随后用饱和含水NaHCO₃、10％含水HCl和盐水洗涤该溶液，干燥(MgSO₄)、过滤并真空浓缩得到白色固体。将物质(约0.033)溶解在EtOH(6mL)中、并在氢气大气压下用乙酸铵(7mg,0.09mmol)和10％Pd/C(10mg)处理。3小时后，通过硅藻土过滤该反应混合物。将滤液浓缩至干。然后将残余物溶解在DMSO中、通过制备HPLC纯化，冷冻干燥后得到白色固体(17.6mg,2步以上57％得率)。

光谱数据：MS(FAB)ES-932.6(M-H)^-,954.5(M-Na)；HRMS calcd forC₄₈H₆₇N₇O₁₂(MH⁺)934.49261,found:934.49010；¹H-NMR(DMSO,d₆)δ8.90(s,1H),8.24(d,J=7.95Hz,1H),8.14(d,J=7.63Hz,1H),7.99(d,J=8.26Hz,1H),7.79(d,J=8.9Hz,1H),7.75(d,J=8.26Hz,1H),7.42-7.17(m,10H),5.00(quintet,J=7.63Hz,1H),4.7(m,1H),4.52(d,J=11.76Hz,1H),4.43(d,J=11.4Hz,1H),4.33-4.2(m,6H),3.70(dd,J=11.4and11.1Hz,2H),2.63(dd,J=5.7and5.7Hz,1H),2.45(dd,J=7.95and7.95Hz,1H),2.21-2.11(m,3H),2.07-1.97(m,1H),1.93-1.83(m,2H),1.81(s,3H),1.78-1.63(m,2H),1.54-1.41(m,2H),1.39(d,J=7.0Hz,3H),1.29(dd,J=7.94and7.63Hz,1H),1.15(quintet,J=7.0Hz,1H),1.05(m,1H),0.90(d,J=6.36Hz,6H),0.88-0.83(m,1H),0.71(m,9H).实施例22

根据实施例17所述的方法合成表1的化合物107

通过NMR的旋转异构体数(1∶7.6)MS(FAB)m/z:675(MH⁺)；¹H-NMR(DMSO-d₆)δ8.35-8.19(bs,1H),8.04(d,J=7.63Hz,1H),7.93(bd,J=7.31Hz,1H),7.88(d,J=8.27Hz,1H),7.86-7.79(m,2H),7.59-7.49(m,3H),7.46(dd,J=7.95,7.95Hz,1H),4.98(d,J=11.8Hz,1H),4.89(d,J=11.8Hz,1H),4.40-4.34(m,1H),4.32(bs,1H),4.29-4.24(m,1H),4.22-4.15(m,1H),4.09(d,J=11.8Hz,1H),3.74(dd,J=11.1,4Hz,1H),2.20-2-12(m,1 H),2.05-1.94(m,2H),1.84(s,3H),1.72-1.42(m,7H),1.20-1.13(m,1H),1.08-0.87(m,13H),0.85(d,J=6.68Hz,6H).实施例23

根据实施例17所述的方法合成表1的化合物114

通过NMR的旋转异构体数(1∶7.5)MS(FAB)m/z:747(M+Na⁺)；¹H-NMR(DMSO-d₆)δ8.40-8.24(bs,1H),8.07-8.01(m,1H),7.96-7.91(m,1H),7.87(dJ=8.26Hz,1H),7.85-7.78(m,2H),7.58-7.49(m,3H),7.46(dd,J=7.95,7.95Hz,1H),7.30-7.21(m,4H),7.20-7.14(m,1H),4.98(d,J=11.8Hz,1H),4.89(d,J=11.8Hz,1H),4.40-4.34(m,1H),4.34-4.29(m,1H),4.29-4.25(m,1H),4.22-4.15(m,1H),4.09(d,J=11.8Hz,1H),3.74(dd,J=11.1,4Hz,1H),2.95-2.79(m,2H),2.21-2.11(m,1H),2.05-1.94(m,2H),1.89-1.83(2×s,3H),1.63-1.41(m,7H),1.38-1.30(m,1H),1.27-1.22(m,1H),1.12-0.94(m,5H),0.89(d,J=6.4Hz,3H),0.84(d,J=6.4Hz,3H).实施例24

根据实施例17所述的方法合成表1的化合物118

通过NMR的旋转异构体数(1∶6.3)MS(FAB)m/z:677.4(MH⁺)；¹H-NMR(DMSO-d₆)δ8.58and8.38(2×bs,1H),8.04(d,J=7.63Hz,1H),7.93(d,J=7.63Hz,1H),7.91-7.81(m,3H),7.59-7.49(m,3H),7.49-7.43(m,1H),4.98(d,J=12.1Hz,1H),4.89(d,J=12.1Hz,1H),4.41-4.29(m,2H),4.29-4.14(m,2H),4.1(d,J=10.8Hz,1H),3.74(bd,J=7.63Hz,1H),2.21-2.12(m,1H),2.04-1.92(m,2H),1.90and1.84(2×s,3H),1.63-1.41(m,9H),1.39-1.26(m,3H),1.21-1.15(m,1H),1.06-0.92(m,5H),0.92-0.80(m,9H).实施例25

根据实施例17所述的方法合成表1的化合物116¹H NMR(DMSO-d₆)δ8.36(s,1H),8.14(d,J=8Hz,1H),8.04(d,J=8Hz,1H),7.99(d,J=9Hz,1H),7.79(d,J=9Hz,1H),7.33-7.26(m,5H),4.54-4.42(m,3H),4.30-4.21(m,5H),4.06(d,J=11Hz,1H),3.69(dd,J=Hz,1H),2.62(dd,J=16,10Hz,1H),2.47-2.42(m,1H),2.18-2.14(m,3H),2.02-1.87(m,2H),1.82(s,3H),1.74-1.66(m,2H),1.54-1.47(m,2H),1.38-1.27(m,2H),1.21-1.18(m,1H),0.97-0.85(m,11H),0.80-0.70(m,7H).实施例26

根据实施例17所述的方法合成表1的化合物121¹H NMR(DMSO-d₆)δ9.12(d,J=6Hz,1H),8.64(s,1H),8.30(d,J=8Hz,1H),8.12(d,J=9Hz,1H),8.05(dd,J=8,7Hz,1H),7.97(d,J=8Hz,1H),7.80(dd,J=8,7Hz,1H),7.66(d,J=9Hz,1H),7.54(d,J=6Hz,1H),5.70-5.61(m,2H),5.26(d,J=17Hz,1H),5.07(d,J=12Hz,1H),4.52(d,J=12Hz,1H),4.39(dd,J=9,8Hz,1H),4.23-4.12(m,2H),4.03-3.99(m,1H),2.66-2.54(m,1H),2.35-2.28(m,1H),2.08(dd,J=9,17Hz,1H),2.01-1.93(m,1H),1.83(s,3H),1.65-1.46(m,5H),1.41-1.38(m,1H),1.24-1.20(dd,J=9,5Hz,1H),01.05-0.78(m,12H).实施例27

根据实施例17所述的方法合成表1的化合物205¹H NMR(DMSO-d₆)δ9.14(d,J=6Hz,1H),8.60(s,1H),8.32(d,J=8Hz,1H),8.14-8.06(m,2H),7.98(d,J=8Hz,1H),7.82(dd,J=8,7Hz,1H),7.66(d,J=9Hz,1H),7.55(d,J=8Hz,1H),5.75-5.66(m,2H),5.22(d,J=17Hz,1H),5.07(d,J=10Hz,1H),4.50(d,J=12 Hz,1H),4.39(dd,J=9,9Hz,1H),4.23-4.08(m,3H),2.56-2.50(m,1H),2.36-2.28(m,1H),2.04-1.97(m,1H),1.82(s,3H),1.62-1.41(m,7H),1.24(dd,J=5,4Hz,1H),0.94-0.75(m,12H).实施例28

根据实施例20所述的方法合成表1的化合物117¹H NMR(DMSO-d₆)δ8.36(s,1H),8.17(d,J=8Hz,1H),8.09(d,J=8Hz,1H),8.04(d,J=8Hz,1H),7.96-7.92(m,2H),7.87(d,J=8 Hz,1H),7.77(d,J=9Hz,1H),7.56-7.45(m,4H),4.99(d,J=12Hz,1H),4.89(d,J=12Hz,1H),4.52(dd,J=14,7Hz,1H),4.37-4.12(m,6H),3.78-3.73(m,1H),2.63(dd,J=17,6Hz,1H),2.47-2.42(m,1H),2.22-2.16(m,3H),2.04-1.86(m,2H),1.82(s,3H),1.77-1.71(m,1H),1.69-1.42(m,8H),1.30(quint.,J=8Hz,1H),1.20(dd,J=12,8Hz,1H),1.10-0.85(m,15H),0.76-0.72(m,1H).实施例29

根据实施例20所述的方法合成表1的化合物120¹H NMR(DMSO-d₆)δ8.34(s,1H),8.12(d,J=8Hz,1H),8.05(d,J=8Hz,1H),7.95-7.87(m,3H),7.81(d,J=9Hz,1H),7.64-7.52(m,4H),7.46(dd,J=8,7Hz,1H),4.99(d,J=12Hz,1H),4.89(d,J=12Hz,1H),4.63(dd,J=14,7Hz,1H),4.37-4.14(m,4H),3.74(dd,J=11,4Hz,1H),3.41-3.35(m,2H),2.61(dd,J=16,7Hz,1H),2.44(dd,J=16,8Hz,1H),2.20-2.15(m,1H),2.04-1.96(m,3H),1.82(s,3H),1.70-1.64(m,1H),1.56-1.43(m,7H),1.30(quint.,J=8Hz,1H),1.20(dd,J=8,5Hz,1H),0.99-0.72(m,21H).实施例30重组HCV NS3蛋白酶1b型的克隆、表达和纯化

通过外部合作(Bernard Willems MD,Hópital St-Luc,Montréal,Canada和Dr.Donald Murphy,Laboratoire de SantéPublique du Québec,Ste-Anna deBellevue,Canada)获得感染HCV的患者的血清。从通过血清RNA的逆转录-PCR(RT-PCR)获得的DNA片段并使用根据其它1b系基因型之间的同源性所选择的特异性引物，构建HCV基因组的基因工程全长cDNA模板。由整个基因组序列的确定，根据Simmonds等(《临床微生物学杂志》(1993),31,1493-1503)的分类将1b基因型排布于HCV分离物。非结构区域NS2-NS4B的氨基酸序列显示93％以上与HCV 1b基因型(BK、JK和483分离物)相同，88％与HCV 1a基因型(HCV-1分离物)相同。通过PCR产生编码多蛋白前体(NS3/NS4A/NS4B/NS5A/NS/5B)DNA片段，并将其引入真核生物表达载体。瞬时转染后，通过成熟NS3蛋白的存在、使用蛋白质印迹分析说明由HCV NS3蛋白酶介导的多蛋白加工。没有观察到成熟NS3蛋白伴有含突变S1165A的多蛋白前体的表达，其中的突变S1165A可使NS3蛋白酶失活，这一发现进一步证实了HCV NS3蛋白酶的功能。

在pET11的细菌表达载体中克隆编码重组HCV NS3蛋白酶(氨基酸1027-1206)的DNA片段。通过在20℃用1mM IPTG培养3小时诱导大肠杆菌BL21(DE3)pLys中的NS3蛋白酶表达。典型的发酵(18L)得到约100g湿细胞糊。将该细胞再悬浮在由25mM磷酸钠、pH7.5 10％甘油(v/v)、1mM EDTA、0.01％NP-40的裂解缓冲液(3.0mL/g)中、并于-80℃储藏。加入5mM DTT使细胞解冻和均化。然后在最后浓度分别为20mM和20μg/mL匀浆中加入氯化镁和DN酶。在4℃培养25分钟后，将匀浆在4℃超声并以15000×g离心30分钟。然后用1M磷酸钠溶液调节上清液的pH至6.5。

将另外一种凝胶过滤层析步骤加到WO95/22985(本发明参考文献)所述的2步纯化方法中。简言之，即将从细菌提取物得到的上清液载在SPHiTrap柱(Pharmacia)上，此柱在缓冲液A(50mM磷酸钠、pH6.5 10％甘油、1mM EDTA、0.01％NP-40)中以2mL/分钟的流速预先进行了平衡。然后用含0.15 M NaCl的缓冲液A洗涤该柱，通过使用10柱体积的线性0.15-0.3M NaCl梯度洗脱蛋白酶。合并含蛋白酶的NS3组分并稀释至0.1M的最终NaCl浓度。将酶在HiTrap肝素柱(Pharmacia)上进-步纯化，该柱在缓冲液B(25mM磷酸钠、pH7.5 10％甘油、5mM DTT、0.01％NP-40)中进行了平衡。以3mL/分钟的流速加样。然后用含0.15 M NaCl的缓冲液B以1.5mL/分钟的流速洗涤该柱。两步洗涤是在含0.3或-1M NaCl的缓冲液B存在时进行的。在0.3M NaCl洗涤中回收蛋白酶，并用缓冲液B稀释3倍，再将其用于HiTrap肝素柱上、并用含0.4M NaCl的缓冲液B洗脱。最后，将含蛋白酶的NS3组分用于Superdex 75HiLoad 16/60柱(Pharmacia)上，该柱在含0.3M NaCl的缓冲液B中进行了平衡。通过SDS-PAGE、再通过光密度测定分析判定从混合组分获得的HCV NS3蛋白酶的纯度大于95％。实施例31重组HCV NS3蛋白酶/NS4A辅因子肽放射分析测定。

根据实施例30所述的方案对酶进行克隆、表达和制备。将酶储藏在-80℃，在用于含NS4A辅因子肽的测定缓冲液中之前将其在冰上解冻并稀释。

将用于NS3蛋白酶/NS4A辅因子肽放射测定的底物，DDIVPC-SMSYTW，在半胱氨酸和丝氨酸残基之间通过酶进行裂解。序列DDIVPC-SMSYTW相应于NS5A/NS5B天然裂解位点，其中P2中的半胱氨酸残基取代了脯氨酸。在有或无抑制剂时，用重组NS3蛋白酶和NS4A肽辅因子KKGSVVIVGR[ILSGRK(酶与辅因子的摩尔比1∶100)培养肽底物DDIVPC-SMSYTW和示踪生物素-DDIVPC-SMS[¹²⁵I-Y]TW。通过在过滤后的测定混合物中加入包覆亲和素的琼脂糖珠而从产品分离底物。在滤液中出现的SMS[¹²⁵I-Y]TW产品数量可用于计算底物转化的百分比和抑制百分比。A．试剂

从Gibco-BRL.获得Tris和Tris-HCl(超纯的)。甘油(超纯的)、MES和BSA是从Sigma购得。从Pierce获得TCEP,DMSO来自Aldrich,NaOH来自Anachemia。

测定缓冲液：50mM Tris HCl,pH7.5,30％(w/v)甘油，1mg/mLBSA,1mM TCEP(使用前所加入的TCEP是来自水中的1M贮存液)。

底物：DDIVPCSMSYTW，最终浓度25μM(来自储藏在-20℃的DMSO中的2mM贮存液，以避免氧化)。

示踪物：还原的单碘化底物生物素DDIVPC SMS[¹²⁵I-Y]TW(终浓度约1nM)。

HCV NS3蛋白酶1b型，最终浓度25nM(来自50mM磷酸钠、pH7.510％甘油、300mM NaOH,5mM DTT、0.01％NP-40中的贮存液)。

NS4A辅因子肽：KKGSVVIVGRIILSGRK，最终浓度2.5μM(来自储藏于-20℃的DMSO中的2mM贮存液)。B．方法

测定是在Coster的96孔聚丙烯平板上进行的，每个孔包含：

·测定缓冲液中的20μL底物/示踪物；

·10μL±20％DMSO/测定缓冲液中的抑制剂；

·10μLNS3蛋白酶1b/NS4辅因子肽(摩尔比例1∶100)。

空白(无抑制剂和酶)和对照(无抑制剂)在同样的测定平板上进行制备。

通过加入酶/NS4A肽溶液开始酶促反应，将测定混合物在23℃在温和的振荡下培养40分钟。加入10μL 0.5 NaOH，再加入10μL MES pH5.8以使酶促反应猝停。

在Millipore MADP N65过滤板上加入20μL包覆亲和素的琼脂糖珠(从Pierce购得)。将猝停的测定混合物转移至过滤板，并在23℃在温和的振荡下培养60分钟。

用Milipore Multiscreen Vacuum Manifold过滤装置过滤该平板，将40μL滤液转移在不透明的96孔平板上，每孔含60μL闪烁液。

用¹²⁵I液体方法在Packard TopCount仪对滤液进行计数1分钟。

采用下列等式计算抑制％：

100-[(抑制数-空白数)/(对照数-空白数)×100]

将与希尔模型拟合的非线性曲线用于抑制-浓度数据，通过使用SAS软件(数据软件系统；SAS协会，Inc.Cary,N.C.)计算50％有效浓度(IC₅₀)。实施例32全长NS3-NS4A异二聚体蛋白测定

使用从HCV 1b基因型感染个体的血清(由Dr.Bernard Wilems,HōpitalSt-Luc,Montrēal,Quēbec,Canada提供)提取的RNA、通过RT-PCR将NS2-NS5B-3’非编码区克隆在pCR3载体(Invitrogen)上。然后通过PCR将NS3-NS4A DNA区亚克隆在pFastBacTMHTa杆状病毒表达载体(Gibol/BRL)上。该载体序列包括编码含六组氨酸tag的28-残基N-末端序列的区域。将Bac-to-Bac^TM杆状病毒表达系统(Gibol/BRL)用于制备重组杆状病毒。通过在27℃以0.1-0.2感染复数用重组杆状病毒感染10⁶Sf21细胞/mL，来对全长成熟NS3和NS4A异二聚体蛋白(His-NS3-NS4AFL)进行表达。收获感染的培养物48-64小时后在4℃离心。在蛋白酶抑制剂混合物存在下，将细胞粒状沉淀在50mM NaPO₄、pH7.5、40％甘油(w/v)、2mM β-氢硫基乙醇中匀浆。然后用1.5％NP-40、0.5％Triton X-100、0.5M NaCl和DN酶处理从细胞裂解物中提取His-NS3-NS4AFL。超离心后，将可溶性提取物稀释4倍，并结合在Pharmacia Hi-Trap Ni-螯合柱上。使用50-400 mM咪唑梯度，将His-NS3-NS4AFL在＞90％纯形式(如SDS-PAGE所判定)中洗脱。将His-NS3-NS4AFL在-80℃贮存在50mM磷酸钠、pH7.5、10％(w/v)甘油、0.5M NaCl、0.25M咪唑、0.1％NP-40中。将其在冰上解冻、并在使用前稀释。

在50mM Tris-HCl、pH8.0、0.25M柠檬酸钠、0.01％(w/v)n-十二烷基-β-D-麦芽糖甙、1mM TCEP中测定His-NS3-NS4AFL的蛋白酶活性。在23℃用1.5nM His-NS3-NS4AFL对各种浓度的抑制剂中的内部骤冷的底物氨茴内酐基-DDIVPAbu[C(O)-O]-AMY(3-NO₂)TW-OH进行培养45分钟。最终的DMSO浓度没有超过5.25％。加入pH5.8的1M MES使反应终止。在装有96孔平板读数器的Perkin-Elmer LS-50B荧光计(激发波长：325nm；发射波长：423nm)上监测N-末端产品的荧光。然后将使用希尔模型的非线性曲线拟合用于％抑制-浓度数据，并通过使用SAS(数据软件系统；SAS协会，Inc-Cary,N.C.)计算50％有效浓度(IC₅₀)。实施例33基于NS3蛋白酶细胞的测定

用Huh-7细胞进行该测定，此细胞来源于肝癌的人细胞系，用2 DNA构件共转染：

-一种表达多蛋白的构件(叫做NS3)，该蛋白包含与按下列页序NS3-NS4A-NS4B-NS5A-tTA的tTA融合的HCV非结构蛋白；

-另一种在tTA控制下表达报道蛋白、分泌碱性磷酸酶的构件(叫做SEAP)。

必须通过用于成熟蛋白酶释放的NS3蛋白酶使多蛋白裂解。在成熟蛋白释放时，一般认为病毒蛋白会在内质网的膜上形成一种复合体，同时tTA将向核迁移并反式激活SEAP基因。因此，NS3蛋白酶解活性的降低将导致成熟tTA水平下降和伴随SEAP活性降低。

为了控制化合物的其它作用，进行了平行转染，而将仅表达tTA的构件(叫做tTA)与SEAP构件共转染以便SEAP活性不依赖于NS3蛋白酶解活性。

测定方法：使用FuGene方法(Boehringer Mannheim)将Huh-7细胞(生长在CHO-SFMII+10％FCS(胎牛血清)中)与NS3和SEAP或者与tTA和SEAP共转染。在37℃放置5小时后，洗涤细胞，进行胰蛋白酶消化、并在含一定浓度范围的试验化合物的96孔平板中制板(80000细胞/孔)。为期24小时的培养后，抽取等份培养基，并用Phospha-Light试剂盒(Ttopix)测定此等份中的SEAP活性。

用SAS软件分析关于化合物浓度的SEAP活性的百分抑制得到EC₅₀。

然后用下列MTT测定法测定化合物的毒性(TC₅₀)：

每孔中加入20μL MTT溶液(5mg/ml培养基)并在37℃培养4小时；

去除培养基，并加入50μL 0.01N HCl+10％Triton X-100；在室温下摇动至少1小时后在595nm波长处读取每个孔的OD。

按与EC₅₀同样的方法计算TC₅₀。实施例34特异性测定

测定化合物对抗各种丝氨酸蛋白酶的特异性，这些蛋白酶为：人白细胞弹性蛋白酶、猪胰腺弹性蛋白酶和牛胰腺α糜蛋白酶和一种半胱氨酸蛋白酶：人肝脏B组织蛋白酶。在所有情况下均使用对每种酶特异的比色的对硝基苯胺(pNA)底物的96孔平板式方法，每种测定包括1小时于30℃的酶抑制剂预培养、然后加入底物并水解至UV Thermomax微板读数器所测定的约30％转化。尽可能使底物浓度保持可与K_M相比的低水平、以减少底物的竞争。根据化合物的效价，其浓度可在300--0.06μM不等。每种测定的最终条件如下：

50 mM Tris-HCl pH8,0.5 M Na₂SO₄,50mM NaCl,0.1 mMEDTA,3％DMSO,0.01％Tween-20与；

[100mM Succ-AAPF-pNA和250pMα糜蛋白酶]，[133μM Succ-AAA-pNA和8nM猪弹性蛋白酶],[133μM Succ-AAA-pNA和8nM白细胞弹性蛋白酶]；或

[100mM NaHPO₄ pH6,0.1mM EDTA,3％DMSO,1 mM TCEP,0.01％Tween-20,30μM Z-FR-pNA和5nM B组织蛋白酶(使用前在含20mM TCEP的缓冲液中激活贮存酶)]。

有关猪胰腺弹性蛋白酶的代表性例子总结如下：

用Biomek液体操作器(handler)(Beckman)在聚苯乙烯平底96孔平板中加入：

·40μL测定缓冲液(50mM Tris-HCl pH8,50mM NaCl,0.1 mM EDTA)

·20μL酶溶液(50mM Tris-HCl pH8,50mM NaCl,0.1 mMEDTA,0.02％Tween-20,40nM猪胰腺弹性蛋白酶)；和

·20μL抑制剂溶液(50mM Tris-HCl pH8,50mM NaCl,0.1 mMEDTA,0.02％Tween-20,1.5mM-0.3μM抑制剂，15％v/v DMSO)。

在30℃预培养60分钟后，在每孔中加入20μL底物溶液(50mMTris/HCl pH8,0.5 M Na₂SO₄,50mM NaCl,0.1 mM EDTA,655μM Succ-AAA-pNA)，并将该反应在30℃进一步培养60分钟，然后在UVThermomax板读数器上读取吸光度。将各排孔分配为对照(无抑制剂)和空白(无抑制剂和酶)。

通过液体操作器、用50mM Tris-HCl pH8,50mM NaCl,0.1mMEDTA,0.02％Tween-20,15％DMSO在分离平板上对抑制剂溶液依序进行的2倍稀释。所有其它特异性测定按同样方式进行。

采用下式计算抑制百分比：

[1-((UV_抑制-UV_空白)/(UV_对照-UV_空白)×100]

将与希尔模型拟合的非线性曲线用于抑制-浓度数据，通过使用SAS软件(数据软件系统；SAS协会，Inc.Cary,N.C.)计算50％有效浓度(IC₅₀)。

化合物表

在实施例31测定法和实施例32测定法之一或两者中对本发明化合物进行了测定，发现本发明化合物小于50μM(4)、5μM(B)或0.5μM(C)的IC₅₀具有活性。细胞中的活性和特异性：

本发明的一些有代表性化合物也在实施例33的基于替代细胞测定法和实施例34的一种或几种测定法中进行了测试。例如，发现表2的化合物233在实施例32的测定法中测得1nM的IC₅₀。通过实施例33的测定法所测定的EC₅₀为5.4μM，而在高达120μM的浓度时无法检测到其它作用(tTA)。在MTT测定法中也对化合物233进行了测试，其测出TC₅₀大于120μM，这表明该化合物在其有效浓度时没有毒性。在实施例34的特异性测定中，发现同一化合物具有下列活性：HLE＞75μM；PE＞75μM；α-Chym.＞75μM；Cat.B＞75μM.

这些结果显示此化合物族对NS3蛋白酶具有高度特异性。

下表列出了本发明的代表性化合物。使用了下列缩写：MS：质谱数据；Ac：乙酰基；Bn：苄基；Chg：环己基甘氨酸(2-氨基-2-环己基-乙酸)；Dnl：丹磺酰；O-Bn：苄氧基；Pip:2-哌啶酸；Tbg：叔丁基甘氨酸。

表1

表1化合物	B	P6	P5	P4	P3	R₂	R₁	P1C₁-C₂	MS(MH⁺)	活性等级
表1化合物	B	P6	P5	P4	P3	R₂	R₁	P1C₁-C₂	MS(MH⁺)	活性等级	101	Ac	-	-	Chg	Val	OBn	Et	1R,2R	613.4	A
102	Ac	-	-	Chg	Val	OBn	Et	1R,2？	613.4	A	101	Ac	-	-	Chg	Val	OBn	Et	1R,2R	613.4	A
102	Ac	-	-	Chg	Val	OBn	Et	1R,2？	613.4	A	103	Ac	-	-	Chg	Chg	1-NpCH₂O	Et	1R,2？	703	B
104	Ac	-	-	Chg	Chg	1-NpCH₂O	Et	1R,2R	703.4	B	103	Ac	-	-	Chg	Chg	1-NpCH₂O	Et	1R,2？	703	B
104	Ac	-	-	Chg	Chg	1-NpCH₂O	Et	1R,2R	703.4	B	105	Ac	-	-	Chg	Chg	1-NpCH₂O	Et	1S,2S	703.5	B
106	Ac	-	-	Chg	Val	1-NpCH₂O	Me	1R,2？	649.5	A	105	Ac	-	-	Chg	Chg	1-NpCH₂O	Et	1S,2S	703.5	B
106	Ac	-	-	Chg	Val	1-NpCH₂O	Me	1R,2？	649.5	A	107	Ac	-	-	Chg	Val	1-NpCH₂O	CHMe₂	1R,2？	M+Na699	B
108	Ac	Asp	D-Glu	Chg	Chg	1-NpCH₂O	Et	1R,2R	947.4	C	107	Ac	-	-	Chg	Val	1-NpCH₂O	CHMe₂	1R,2？	M+Na699	B
108	Ac	Asp	D-Glu	Chg	Chg	1-NpCH₂O	Et	1R,2R	947.4	C	109	Ac	-	-	Chg	Val	1-NpCH₂O	CH₂OCH₂Ph	1R,2？	M+Na777.4	A
110	Ac	-	-	Chg	Va1	1-NpCH₂O	CH₂OCH₂Ph	1R,2？	M+Na777.4	A	109	Ac	-	-	Chg	Val	1-NpCH₂O	CH₂OCH₂Ph	1R,2？	M+Na777.4	A
110	Ac	-	-	Chg	Va1	1-NpCH₂O	CH₂OCH₂Ph	1R,2？	M+Na777.4	A	111	Ac	-	-	Chg	Val	1-NpCH₂O	(CH₂)₂Ph	1R,2？	M+Na761	A
112	Ac	-	-	Chg	Val	1-NpCH₂O	Et	1R,2R	M+Na685	B	111	Ac	-	-	Chg	Val	1-NpCH₂O	(CH₂)₂Ph	1R,2？	M+Na761	A
112	Ac	-	-	Chg	Val	1-NpCH₂O	Et	1R,2R	M+Na685	B	113	Ac	-	-	Chg	Val	1-NpCH₂O	Et	1S,2S	M+Na685	A
114	Ac	-	-	Chg	Val	1-NpCH₂O	Bn	1R,2？	M+Na747	A	113	Ac	-	-	Chg	Val	1-NpCH₂O	Et	1S,2S	M+Na685	A
114	Ac	-	-	Chg	Val	1-NpCH₂O	Bn	1R,2？	M+Na747	A	115	Ac	-	-	Chg	Val	1-NpCH₂O	Bn	1R,2？	M+Na	A

表2

^*Br异构体比率5.5∶2

表3

表4

表5

Claims

1．一种式(Ⅰ)化合物，包括外消旋物、非对映异构体和旋光异构体、或其药学上可接受的盐或酯：其中a为0或1；b为0或1；Y为H或C_1-6烷基；B为H、式R₇-C(O)-的酰基衍生物或式R₇-SO₂的磺酰基衍生物，其中

R₇为(ⅰ)可不被取代或被羧基、C_1-6链烷醇氧基(alkanoyloxy)或

C_1-6烷氧基取代的C_1-10烷基；

(ⅱ)可不被取代或被羧基、(C_1-6烷氧基)羰基或苯基甲氧羰基

取代的C_3-7环烷基；

羟基、或可不被取代或被C_1-6烷基取代的氨基取代；或

(ⅳ)可不被取代或被C_1-6烷基、羟基、可不被取代或被C_1-6烷

的Het；R₆，当存在时，它是用羧基取代的C_1-6烷基；R₅，当存在时，它是可被羧基取代或不取代的C_1-6烷基；R₄是C_1-10烷基、C_3-7环烷基或C_4-10(烷基环烷基)；R₃是C_1-10烷基、C_3-7环烷基或C_4-10(烷基环烷基)；R₂为CH₂-R₂₀、NH-R₂₀、O-R₂₀或S-R₂₀，其中R₂₀为可不被取代或被R₂₁单、二或三取代的饱和或不饱和的C_3-7环烷基或C_4-10(烷基环烷基)，或R₂₀为C₆或C₁₀芳基或C_7-16芳烷基可不被取代或被R₂₁单、二或三取代，或R₂₀为可不被取代或被R₂₁单、二或三取代的Het或(低级烷基)-Het，其中每个R₂₁各自为C_1-6烷基；C_1-6烷氧基；可不被取代或被C_1-6烷基单或二取代的氨基；磺酰基；NO₂；OH；SH；卤素；卤代烷基；可不被取代或被C_1-6烷基、C₆或C₁₀芳基、C_7-16芳烷基、Het或(低级烷基)-Het单取代的酰氨基；羧基；羧(低级烷基)；C₆或C₁₀芳基，C_7-16芳烷基或Het，所述的芳基、芳烷基或Het均可不被取代或被R₂₂取代；其中R₂₂是C_1-6烷基；C_1-6烷氧基；可被C_1-6烷基取代或不取代的氨基；磺酰基；NO₂；OH；SH；卤素；卤烷基；羧基；酰胺基；(低级烷基)酰胺基；R₁是可被卤素取代或不取代的C_1-6烷基或C_2-6链烯基；和W为羟基或N-取代的氨基。

2．根据权利要求1的化合物，其中，B为H或式R₇C(O)-的酰基衍生物，其中R₇为C_1-6烷基；C_1-6烷氧基；可被羟基取代或不取代的C_3-7环烷基；可被C_1-6烷基或Het取代或不取代的酰氨基；C₆或C₁₀芳基、C_7-16芳烷基或Het，它们均可被C_1-6烷基或羟基取代或不取代。

3．根据权利要求2的化合物，其中R₇为C_1-6烷基或Het。

4．根据权利要求3的化合物，其中所述的Het是选自下组：

5．根据权利要求2的化合物，其中B选自H；乙酰；

6．根据权利要求5的化合物，其中B为乙酰基。

7．根据权利要求1的化合物，其中B为R₇-SO₂,R₇为C₆或C₁₀芳基、C_7-16芳烷基或Het，它们均可被C_1-6烷基取代或不取代。

8．根据权利要求1的化合物，其中当R₆存在时，它是Asp或Glu的侧链。

9．根据权利要求8的化合物，其中当R₆存在时，它是Asp的侧链。

10．根据权利要求1的化合物，其中a为0、并且没有R₆。

11．根据权利要求1的化合物，其中，当R₅存在时，它是一种氨基酸的侧链，该氨基酸选自：D-Asp、L-Asp、D-Glu、L-Glu、D-Val、L-Val、D-叔-丁基甘氨酸(Tbg)和L-Tbg。

12．根据权利要求11的化合物，其中当R₅存在时，它是D-Asp、D-Val或D-Glu的侧链。

13．根据权利要求12的化合物，其中当R₅存在时，它是D-Glu的侧链。

14．根据权利要求1的化合物，其中a为0且b为0，并且均不存在R₆和R₅。

15．根据权利要求1的化合物，其中R₄是一种氨基酸的侧链，该氨基酸选自：Val、环己基甘氨酸(Chg)、Tbg、Ile或Leu。

16．根据权利要求15的化合物，其中R₄是Chg或Ile的侧链。

17．根据权利要求16的化合物，其中R₄是Chg的侧链。

18．根据权利要求1的化合物，其中Y是H或Me。

19．根据权利要求18的化合物，其中Y是H。

20．根据权利要求1的化合物，其中R₃是一种氨基酸的侧链，该氨基酸选自：Ile、Chg、Val或Tbg。

21．根据权利要求20的化合物，其中R₃是Val、Chg或Tbg的侧链。

22．根据权利要求21的化合物，其中R₃是Val或Tbg的侧链。

23．根据权利要求1的化合物，其中R₂是S-R₂₀、O-R₂₀，其中R₂₀为C₆或C₁₀芳基、C_7-16芳烷基、Het或-CH₂-Het，它们均可被R₂₁单、二或三取代或不取代；

其中R₂₁为C_1-6烷基；C_1-6烷氧基；氨基、单或二(低级烷基)氨基；可被C_1-6烷基、C₆或C₁₀芳基、C_7-16芳烷基、Het或(低级烷基)-Het单取代或不取代的酰氨基；NO₂；OH；卤素；三氟甲基；羧基；C₆或C₁₀芳基，C_7-16芳烷基，或Het，所述的芳基、芳烷基或Het可被R₂₂取代或不取代；

其中R₂₂为C_1-6烷基；C_1-6烷氧基；氨基；单或二(低级烷基)氨基；(低级烷基)酰胺；NO₂；OH；卤素；三氟甲基；羧基。

24．根据权利要求23的化合物，其中R₂₁为C_1-6烷基；C_1-6烷氧基；氨基、二(低级烷基)氨基；(低级烷基)酰胺；C₆或C₁₀芳基，或Het，所述的芳基或Het可被R₂₂取代或不取代；其中R₂₂为C_1-6烷氧基；氨基；二(低级烷基)氨基；(低级烷基)酰胺；卤素或三氟甲基。

25．根据权利要求23的化合物，其中R₂为1-萘甲氧基；2-萘甲氧基；苄氧基；1-萘氧基；2-萘氧基；或喹啉氧基，可被R₂₁单或二取代或不取代，其中R₂₁如权利要求23所述。

26．根据权利要求23的化合物，其中为R₂为1-萘甲氧基；喹啉氧基，被R₂₁单或二取代或不取代，其中R₂₁如权利要求23所述。

27．根据权利要求26所述的化合物，其中R₂为：其中R_21A为可被C_1-6烷基、C₆或C₁₀芳基、C_7-16芳烷基或Het取代或不取代的酰氨基；可被R₂₂取代或不取代的C₆或C₁₀芳基或Het，且R₂₂为氨基、二(低级烷基)氨基；或(低级烷基)酰胺；R_21B为C_1-6烷基；C_1-6烷氧基；氨基；二(低级烷基)氨基；(低级烷基)酰胺；NO₂；OH；卤素；三氟甲基或羧基。

28．根据权利要求27的化合物，其中R_21A为C₆或C₁₀芳基或Het，它们均可被R₂₂取代或不取代而R₂₂为氨基、二甲基氨基或乙酰氨基。

29．根据权利要求27的化合物，其中R_21B为C_1-6烷氧基或二(低级烷基)氨基。

30．根据权利要求29的化合物，其中R_21B为甲氧基。

31．根据权利要求1的化合物，其中位置1上的不对称碳原子具有R构型，它以下列绝对构型表示：

其中R₁如权利要求1所述。

32．根据权利要求31的化合物，其中P1上的R₁取代基与羰基以顺式定向如下列绝对构型表示：

其中R₁为甲基、乙基、丙基、乙烯基，它们均可被卤素取代或不取代。

33．根据权利要求32的化合物，其中R₁为乙基、乙烯基或溴乙烯基。

34．根据权利要求33的化合物，其中R₁为乙烯基。

35．根据权利要求1的化合物，其中W为羟基或其药学上可接受的盐或酯；或(低级烷基)氨基、二(低级烷基)氨基或氨基芳烷基。

36．根据权利要求33的化合物，其中W为羟基、或N(R_13a)R_13b，其中R_13a和R_13b各自为H、芳基或可被羟基或苯基取代或不取代的C_1-6烷基；或其药学上可接受的盐。

37．根据权利要求36的化合物，其中W为-OH、-NH-苄基或-NH-CH(Me)Ph。

38．根据权利要求37的化合物，其中W为-OH或-NH-(S)CH(Me)-苯基。

39．根据权利要求38的化合物，其中当W为一种酯时，所述的酯选自C_1-6烷氧基、苯氧基、或芳基(C_1-6烷氧基)。

40．根据权利要求39的化合物，其中所述的酯是甲氧基、乙氧基、苯氧基、苄氧基或PhCH(Me)-O-。

41．根据权利要求1的式Ⅰ化合物，其中B为H、低级烷基-C(O)-或Het-C(O)-；R₆，当它存在时，它是Asp或Glu的侧链；R₅，当它存在时，它是D-或L-：Asp、Glu、Val或Tbg的侧链；Y是H或甲基；R₄是Val、Chg、Tbg、Ile或Leu的侧链；R₃是氢或Ile、Chg、Val或Tbg的侧链；R₂是1-萘甲氧基、2-萘甲氧基、O-Bn、

其中R₂₂为氨基、二(低级烷基)氨基、(低级烷基)酰胺、NO₂、OH、卤素、CF₃或COOH；P1为下式的环丙基环系统

其中R₁为乙基、乙烯基或溴乙烯基；和W为羟基或N(R_13a)R_13b，其中R_13a和R_13b各自为H、芳基或者可被羟基或苯基取代或不取代的C_1-6烷基；或其药学上可接受的盐或酯。

42．根据权利要求1的式Ⅰ化合物，其中B为H、乙酰基或Het-C(O)-；

R₆，当它存在时，它是Asp的侧链；R₅，当它存在时，它是D-Asp、D-Glu、或D-Val的侧链；Y是H；R₄是Chg或Ile的侧链；R₃是Val、Chg或Tbg的侧链；R₂是1-萘甲氧基、苄氧基、4-喹啉氧基、或

P1为下式的环丙基环系统

其中R₁为Et或CH=CH₂或CH=CHBr；和W为羟基或NH-(S)-CHMePh，或其药学上可接受的盐。

43．根据权利要求1的式Ⅰ化合物，其中B为乙酰基；R₆，当它存在时，它是Asp的侧链；R₅，当它存在时，它是D-Glu的侧链；Y是H；R₄是Chg的侧链；R₃是Val或Tbg的侧链；R₂是式

P1为；和W为羟基，或其药学上可接受的盐或酯。

44．根据权利要求41的化合物，它由下式表示：

式见原文第94页其中B,P6,P5,P4,P3,R₂，和R₁定义如下：

表1 B P6 P5 P4 P3 R₂ R₁ P1

化合物 C₁-C₂

101 Ac -- -- Chg Val OBn Et 1R,2R

102 Ac -- -- Chg Val OBn Et 1R,2？

103 Ac -- -- Chg Chg 1-NpCH₂O Et 1R,2？

104 Ac -- -- Chg Chg 1-NpCH₂O Et 1R,2R

105 Ac -- -- Chg Chg 1-NpCH₂O Et 1S,2S

106 Ac -- -- Chg Val 1-NpCH₂O Me 1R,2？

107 Ac -- -- Chg Val 1-NpCH₂O CHMe₂ 1R,2？

108 Ac Asp D-Glu Chg Chg 1-NpCH₂O Et 1R,2R

109 Ac -- -- Chg Val 1-NpCH₂O CH₂O 1R,2？

CH₂Ph

110 Ac -- -- Chg Val 1-NpCH₂O CH₂OCH₂1R,2？

Ph

111 Ac -- -- Chg Val 1-NpCH₂O (CH₂)₂ 1R,2？

Ph

112 Ac -- -- Chg Val 1-NpCH₂O Et 1R,2R

113 Ac -- -- Chg Val 1-NpCH₂O Et 1S,2S

114 Ac -- -- Chg Val 1-NpCH₂O Bn 1R,2？

115 Ac -- -- Chg Val 1-NpCH₂O Bn 1R,2？

116 Ac Asp D-Glu Ile Val OBn Et 1R,2R

117 Ac Asp D-Glu Chg Val 1-NPCH₂O Et 1R,2R

表1 B P6 P5 P4 P3 R₂ R₁ P1

化合物 C₁-C₂

118 Ac -- -- Chg Val 1-NpCH₂O Pr 1R,2？

119 Ac -- -- Chg Val 1-NpCH₂O Pr 1R,2？

120 Ac Asp D-Val Chg Val 1-NpCH₂O Et 1R,2R

45、权利要求41的化合物，由下式表示

其中P6,P5,P4,P3,R₂，和R₁定义如下：

表2 P6 P5 P4 P3 R₂ R₁

化合物

201 -- -- Chg Val OBn CH=CH₂

202 -- -- Chg Chg 1-NpCH₂O CH=CH₂

203 -- -- Chg Val 1-NpCH₂O CH=CH₂

204 -- -- Chg Val OBn CH=CHBr^*

表2 P6 P5 P4 P3 R₂ R₁

化合物

表2 P6 P5 P4 P3 R₂ R₁

化合物

表2 P6 P5 P4 P3 R₂ R₁

化合物

表2 P6 P5 P4 P3 R₂ R₁

化合物

48、权利要求41的化合物，由下式表示：其中B,P6,P5,P4,P3,R₂,R₁和W定义如下：

47、权利要求41的化合物，由下式表示：

其中B,Y,P4,P3,R₂，和R₁定义如下：

48、权利要求41的化合物，由下式表示：

其中B和R₂₀定义如下：

49．一种如权利要求44所述式Ⅰ的六肽，它选自化合物#:116；117；和120。

50．一种如权利要求45所述式Ⅰ的六肽，它选自化合物#:212；222；236；和238。

51．一种如权利要求46所述式Ⅰ的六肽，它选自化合物#:301和302。

52．一种如权利要求44所述式Ⅰ的四肽，它选自化合物#:122；和123。

53．一种如权利要求45所述式Ⅰ的四肽，它选自化合物#:202；203；205；206；207；208；209；210；211；214；215；216；218；219；220；221；223；224；225；226；228；229；230；231；232；233；234；235。

54．一种如权利要求47所述式Ⅰ的四肽，它选自化合物#:401。

55．一种如权利要求或48所述式Ⅰ的四肽，它选自化合物#:501；502；503；504；505；506；507；508；509；510和511。

56．一种药物组合物，包括病毒学上有效量的抗丙型肝炎的权利要求1所述式Ⅰ化合物、或其治疗上可接受的盐或酯，以及包括药学上可接受的载体介质或辅助剂。

57．一种治疗哺乳动物丙型肝炎病毒感染的方法，即给哺乳动物服用病毒学上有效量的抗丙型肝炎的权利要求1所述式Ⅰ化合物、或其治疗上可接受的盐或者酯或者上述组合物。

58．一种抑制丙型肝炎病毒复制的方法，将病毒暴露于丙型肝炎病毒的NS3蛋白酶抑制量的权利要求1所述式Ⅰ化合物、或其治疗上可接受的盐或酯、或权利要求56所述的组合物。

59．一种治疗哺乳动物丙型肝炎病毒感染的方法，即给该哺乳动物服用病毒学上有效量的抗丙型肝炎的权利要求1所述式Ⅰ化合物、或其治疗上可接受的盐或酯、以及干扰素的组合物。

60．根据权利要求56所述的药物组合物，还包括第二抗病毒剂。

61．根据权利要求60所述的药物组合物，其中第二抗病毒剂是病毒唑或金刚胺。

62．根据权利要求56所述的药物组合物，还包括其它HCV蛋白酶的抑制剂。

63．根据权利要求56所述的药物组合物，还包括HCV生存期中其它目标的抑制剂，选自：解旋酶、聚合酶、金属蛋白酶或IRES。

64．一种制备权利要求1的式(Ⅰ)的肽类似物的方法，其中P1是取代的氨基环丙基羧酸残基，该方法包括下列步骤：

·将选自APG-P6-P5-P4-P3-P2、APG-P5-P4-P3-P2、APG-P4-P3-P2、APG-P3-P2和APG-P2的肽；

·与下式P1中间体偶联：其中R₁为可被卤原子取代或不取代的C_1-6烷基或C_2-6链烯基，CPG是羧基保护基团、P6-P2如权利要求1所定义。

65．一种制备权利要求1的式(Ⅰ)的肽类似物的方法，其中P1是取代的氨基环丙基羧酸残基，该方法包括下列步骤：

·将选自APG-P6-P5-P4-P3-P2、APG-P5-P4-P3-P2、APG-P4-P3-P2、APG-P3-P2和APG-P2的肽；·与下式P1中间体偶联：

其中R₁为乙基、乙烯基或溴乙烯基，CPG是羧基保护基团、P6-P2如权利要求1所定义。

66．一种制备权利要求1的式(Ⅰ)的肽类似物的方法，其中P1是取代的氨基环丙基羧酸残基，该方法包括下列步骤：

·与下式P1中间体偶联：其中CPG是羧基保护基团、P6-P2如权利要求1所定义。

67．根据权利要求64、65或66的方法，其中所述的羧基保护基团(CPG)选自：烷基酯、芳烷基酯、和可通过弱碱法或轻度还原法裂解的酯。

68．下式的氨基酸类似物用于制备权利要求1所述式Ⅰ化合物的应用：

其中R₁为可被卤原子取代或不取代的C_1-6烷基或C_2-6链烯基。

69．下式的氨基酸类似物用于制备权利要求1所述式Ⅰ化合物的应用：

其中R₁为乙基、乙烯基或溴乙烯基。

70．下式的氨基酸类似物用于制备权利要求1所述式Ⅰ化合物的应用：