CN1360632A

CN1360632A - 鞘翅目毒性多肽组合物和抗虫转基因植物

Info

Publication number: CN1360632A
Application number: CN00809985A
Authority: CN
Inventors: M·J·鲁帕; W·P·多诺范; C·－R·楚; E·佩斯; Y·谭; A·C·斯拉尼; T·M·马尔瓦; J·A·鲍姆
Original assignee: Monsanto Technology LLC
Current assignee: Monsanto Co; Monsanto Technology LLC
Priority date: 1999-05-04
Filing date: 2000-05-03
Publication date: 2002-07-24
Also published as: US7772369B2; WO2000066742A2; US20060260008A1; EP1173578A2; AR026120A1; US7078592B2; US7320958B2; US6555655B1; US20060253925A1; PL353437A1; BR0010303A; ZA200108918B; BG106076A; AU4698700A; US7442540B2; CA2371442A1; US20030232757A1; WO2000066742A3; AU769939B2; CZ20013894A3

Abstract

本文公开了新的杀虫多肽以及包括这些多肽的组合物、包括其肽片段的组合物,及其特异性抗体。本文也公开了包含编码公开的δ－内毒素(δ－endotoxin)多肽核酸区段的载体、转化的寄主细胞以及转基因植物。本文还公开了有关多肽和多核苷酸的鉴定方法、包括这些多肽序列的转基因细胞的制备方法和使用方法,以及昆虫群体如马铃薯甲虫(Coloradopotato beetle)、南方玉米根虫(Southern cornrootworm)和西方玉米根虫(western corn rootworm)的防治方法,以及赋予植物对靶昆虫抗性的方法。

Description

鞘翅目毒性多肽组合物和抗虫转基因植物

本申请是在1999年5月4日签订的美国临时申请60/172240的基础上提出的，其完整内容在此引入作为参考。1.0发明背景

1.1发明领域

本发明主要涉及分子生物学领域。某些实施方案更特别涉及包括来自细菌的DNA区段和蛋白质的方法和组合物。本发明更特别涉及来自苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)的编码鞘翅目毒性晶体蛋白的新基因。本文公开了这些DNA区段、编码合成修饰的δ-内毒素多肽的DNA区段以及编码天然蛋白质和合成蛋白质的DNA区段的多种制取方法和使用方法。例如，DNA区段用作诊断探针以及蛋白质生产的模板，蛋白质、融合蛋白质载体和多肽在多种免疫和诊断方面的应用。本文还公开了在发展包含本文公开多核苷酸的转基因植物细胞过程中核酸区段的制取方法和使用方法。

1.2相关领域

有商业效益的作物通常是昆虫的攻击目标，所以在许多情况下需要的是防治和根除昆虫侵袭的环境敏感方法。对于农民、苗圃工、栽培者以及商业区和住宅区来说尤其如此，因为他们使用有利于生态的组合物防治昆虫群体。近年来发展的使用最广泛的环境敏感杀虫剂由来自于细菌苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)的微生物杀虫剂组成。苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)是一种革兰氏阳性细菌，产生的晶体蛋白或包含体对某些目和种的昆虫有特异的毒杀作用。许多苏云金芽孢杆菌菌株产生杀虫晶体蛋白。包括能产生杀虫蛋白质的苏云金芽孢杆菌菌株的组合物可商购。因为它们对特异的靶昆虫有特别强的毒杀作用而对植物以及其它非靶生物无害，因此可以用作环境可接受的杀虫剂。1.2.1 δ-内毒素

δ-内毒素可以用来防治多种食叶毛虫、甲虫以及蚊子。这些蛋白质类的伴孢晶体，亦即杀虫晶体蛋白、晶体蛋白、Bt内含物、晶状包含体、包含体(inclusion body)以及Bt毒素(Bt toxin)，是由苏云金芽孢杆菌产生的晶体蛋白的大量集合体，对易感昆虫寄主的摄食有毒杀作用。过去的十年以来，有关苏云金芽孢杆菌毒素结构和功能的研究覆盖了所有主要毒素类别；虽然这些毒素在特异的结构和功能上有所不同，但是还是认为它们在结构和功能上有着普遍的相似性。在积累的苏云金芽孢杆菌毒素知识的基础上，提出来一种有关苏云金芽孢杆菌毒素普遍的作用模式，该模式包括：昆虫摄食，昆虫中肠(由胃和小肠组成)中的溶解，对消化酶产生抗性(有时毒素的部分消化实际上却“激活”了毒素)，结合到中肠细胞上，昆虫细胞上形成穿孔并且破坏细胞内环境(English和Slatin，1992)。

苏云金芽孢杆菌的独特特征之一是它在芽孢形成过程中产生晶体蛋白，晶体蛋白对某些目和种的昆虫有特异的毒杀作用。许多种苏云金芽孢杆菌菌株产生杀虫晶体蛋白。包括能产生对鳞翅目(lepidopteran)昆虫和双翅目(dipteran)昆虫有杀虫活性蛋白质的苏云金芽孢杆菌菌株的组合物可商购。因为它们对特异的靶昆虫有特别强的毒杀作用而对植物以及其它非靶生物无害，因此可以用作环境可接受的杀虫剂。

过去十年中对苏云金芽孢杆菌晶体蛋白的杀虫作用机制进行了大量的研究。研究表明，只有在晶体蛋白被昆虫摄食后蛋白质才对昆虫有毒杀作用。昆虫中肠中的碱性pH值和水解蛋白质的酶类将蛋白质溶解，因此使得对昆虫有毒杀作用的成分释放出来。这些毒性成分使中肠细胞破裂，使昆虫停止进食并最终导致昆虫死亡。正是因为这个原因，才证实苏云金芽孢杆菌在对付各种害虫时是一种有效且环境安全的杀虫剂。

正如Hfte等(1989)所注意到的一样，大多数杀虫苏云金芽孢杆菌菌株对鳞翅目昆虫如毛虫(caterpillar insect)有活性。其它苏云金芽孢杆菌菌株对双翅目昆虫如蝇(fly)和蚊子(mosquito)有杀虫活性，或既对鳞翅目昆虫有杀虫活性又对双翅目昆虫有杀虫活性。近年来，有人报道几种苏云金芽孢杆菌菌株产生的晶体蛋白对鞘翅目(Coleoptera)昆虫如甲虫(beetle)有毒杀作用(Krieg等，1983；Sick等，1990；Donovan等，1992；Lambert等，1992a；1992b)。1.2.2编码晶体蛋白的基因

许多δ-内毒素由于其氨基酸序列相似性而有不同程度的相关性。从研究过程来看，蛋白质以及编码这些蛋白质的基因主要在其杀虫谱的基础上进行分类。Hfte和Whiteley(1989)在综述中讨论了1990年以前苏云金芽孢杆菌中鉴定的基因和蛋白质，并且列出了苏云金芽孢杆菌基因和蛋白质常规使用的命名法和分类法。cry I基因编码毒杀鳞翅目的Cry I蛋白质，而cry II基因编码的Cry II蛋白质既对鳞翅目有毒杀作用又对双翅目有毒杀作用。cry III编码毒杀鞘翅目的Cry III蛋白质，而cry IV基因编码毒杀双翅目的Cry IV蛋白质。

在序列相似性不同程度的基础上，蛋白质又分类到了亚族(subfamily)；每个家族(family)中更高程度相关的蛋白质用分类字母表示，如Cry IA、Cry IB、Cry IC，等等。每个分类中更为相关的蛋白质称为Cry IC1、Cry IC2等。

近年来发展起来一种新的命名法，以氨基酸序列同源性为基础进行系统分类而并不是在靶昆虫特性的基础上进行分类(Crikmore等，1998)。4.3部分中概括了许多已知毒素的分类方法，其中并不包括各蛋白质中的等位变异(allelic variation)。1.2.3对鞘翅目昆虫有毒杀作用的晶体蛋白

已有人对cry3Bb基因的克隆和表达作了描述(Donovan等，1992)。该基因编码的74-kDa蛋白质对鞘翅目昆虫如马铃薯甲虫(Coloradopotato beetle，CPB)和南方玉米根虫(southern corn rootworm，SCRW)有杀虫活性。

据报道，苏云金芽孢杆菌菌株PS201T6对西方玉米根虫(WCRW，Diabrotica virgifera virgifera)有效，美国专利5436002(其完整内容在此特别引入作为参考)对该菌株作了描述。该菌株对Muscadomestica、Aedes aegypti以及Liriomyza trifoli也显示了活性。

也有人对cryET29基因的克隆和表达作了描述(Intl.Pat.Appl.Publ.Ser.No.WO97/17507，1997)。该基因编码的25-kDa蛋白质对鞘翅目昆虫尤其是CPB、SCRW、WCRW以及跳蚤(cat flea)和Ctenocephalides felis有效。

有人对cryET33基因和cryET34基因的克隆和表达作了描述(Intl.Pat.Appl.Publ.Ser.No.WO97/17600，1997)。这两个基因分别编码～30kDa和～15kDa的蛋白质，对鞘翅目昆虫尤其是CPB幼虫和日本甲虫(Popillia japonica)有效。

vip1A基因产生的是营养期(vegetative)可溶性蛋白质，该基因已经克隆并测序(Intl.Pat.Appl.Publ.Ser.No.WO96/10083，1996)。该基因编码的蛋白质大约为80kDa，既对WCRW有效又对北方玉米根虫(northern corn rootworm，NCRW)有效。

另一个对包括WCRW的鞘翅目昆虫有效的内毒素是Cry1 Ia(Intl.Pat.Appl.Publ.Ser.No.WO90/13651，1990)。编码此81kDa多肽的基因已经克隆并测序。

其它对WCRW有毒杀作用的晶体蛋白业已进行描述(Intl.Pat.Appl.Publ.Ser.No.WO97/40162，1997)。这些蛋白质似乎作为双元毒素(binary toxin)行使功能，与分离自B.sphaericus的杀蚊蛋白质有序列相似性。

某些B.sphaericus菌株对蚊子幼虫有很强的作用。这些菌株在芽孢形成过程中产生一种由两种蛋白质毒素组成的晶状包含体。编码这些蛋白质的基因分析情况已经由Baumann等(1988)描述过。推测毒素的分子量分别是51.4 kDa和41.9kDa，因此将这两种毒素分别命名为P51和P42。单独的P42蛋白质对蚊子幼虫的效果是微弱的。P51蛋白质本身没有杀蚊活性。完全的杀虫活性既需要P51又需要P42。除了对蚊子有效外，还没有B.sphaericus晶体蛋白对其它昆虫有效的报道(参照近来Charles等的综述，1996a；1996b)。

某些B.sphaericus菌株产生第二种杀蚊蛋白质毒素。这些蛋白质即Mtx毒素是在营养生长过程中产生的，并不形成晶状包含体。两种已经鉴定的Mtx毒素分别称作Mtx和Mtx2，分子量分别为100kDa和30.8kDa。这两种毒素的基因分别记作mtx和mtx2，有人对其基因的克隆和测序进行了描述(Thanabalu等，1991；Thanabalu和Porter，1995)。Mtx和Mtx2蛋白质与包括B.sphaericus晶体蛋白和苏云金芽孢杆菌晶体蛋白在内的其它已知杀虫蛋白质都没有序列相似性(sequencesimilarity)。

2.0发明概述

本发明提供了新的杀虫多肽以及编码这些多肽的DNA序列。对于这些多肽中的其中5种多肽，因为它们与目前已知杀虫多肽的氨基酸序列同一性(sequence identity)都低于65％。它们与已知晶体蛋白的相似性很低，说明存在新的一类或新的一亚类(sub-class)苏云金芽孢杆菌晶体蛋白。本发明也提供一些新的多肽，这些多肽组合时就能产生出有杀虫活性的晶体蛋白。本发明还提供转化寄主细胞、转基因植物、载体以及新的多肽和新的多核苷酸的制取方法和使用方法。

在第一个实施方案中，本发明提供了一种分离出来的CryET69多肽，该多肽包括SEQ ID NO：14中至少7个连续氨基酸。更优选的是，该多肽包括SEQ ID NO：14中至少9个或至少11个连续氨基酸。更为优选的是，该多肽包括SEQ ID NO：14中至少13个或至少15个连续氨基酸。更为优选的是，该多肽包括SEQ ID NO：14中至少17个或至少19个连续氨基酸。在一个典型的实施方案中，该多肽包括SEQID NO：14中的序列。优选编码该多肽的核酸区段包括由SEQ ID NO：13中至少45个连续碱基对组成的核苷酸序列。更优选的是，编码该多肽的核酸区段包括由SEQ ID NO：13中至少90个连续碱基对组成的序列。更为优选的是，编码该多肽的核酸区段包括SEQ ID NO：13中至少150个连续碱基对组成的序列。典型的编码该杀虫多肽的多核苷酸包括SEQ ID NO：13中至少150个连续碱基对组成的核苷酸序列，其中的一个实施方案中包括SEQ ID NO：13中的核苷酸序列。

同时公开和申请专利的是分离出来的CryET84多肽，该多肽包括SEQID NO：19中至少15个连续氨基酸。更优选的是，该多肽包括SEQ IDNO：19中至少30个至45个连续氨基酸。更为优选的是，该多肽包括SEQ ID NO：19中至少45个至90个连续氨基酸。更为优选的是，该多肽包括SEQ ID NO：19中至少90个至150个连续氨基酸。在一个典型的实施方案中，该多肽包括SEQ ID NO：19中的序列。优选编码该多肽的核酸区段包括SEQ ID NO：18中至少45个连续碱基对组成的核苷酸序列。更优选的是，编码该多肽的核酸区段包括SEQ ID NO：18中至少90个连续碱基对组成的序列。更为优选的是，编码该多肽的核酸区段包括SEQ ID NO：18中至少150个连续碱基对组成的序列。典型的编码该杀虫多肽的多核苷酸包括SEQ ID NO：18中至少300个连续碱基对组成的核苷酸序列，其中的一个实施方案中包括SEQID NO：18中的核苷酸序列。

同时公开和申请专利的是分离出来的CryET75多肽，该多肽包括SEQID NO：16中至少15个连续氨基酸。更优选的是，该多肽包括SEQ IDNO：16中至少30个至45个连续氨基酸。更为优选的是，该多肽包括SEQ ID NO：16中至少45个至90个连续氨基酸。更为优选的是，该多肽包括SEQ ID NO：16中至少90个至150个连续氨基酸。在一个典型的实施方案中，该多肽包括SEQ ID NO：16中的序列。优选编码该多肽的核酸区段包括SEQ ID NO：15中至少45个连续碱基对组成的核苷酸序列。更优选的是，编码该多肽的核酸区段包括SEQ ID NO：15中至少90个连续碱基对组成的序列。更为优选的是，编码该多肽的核酸区段包括SEQ ID NO：15中至少150个连续碱基对组成的序列。典型的编码该杀虫多肽的多核苷酸包括SEQ ID NO：15中至少300个连续碱基对组成的核苷酸序列，其中的一个实施方案中包括SEQID NO：15中的核苷酸序列。

另一个实施方案中，本发明公开并申请专利的是分离出来的CryET80多肽，该多肽包括SEQ ID NO：4中至少17个连续氨基酸。更优选的是，该多肽包括SEQ ID NO：4中至少20个或至少23个连续氨基酸。更为优选的是，该多肽包括SEQ ID NO：4中至少26个或至少29个连续氨基酸。更为优选的是，该多肽包括SEQ ID NO：4中至少32个或至少35个连续氨基酸。在一个典型的实施方案中，该多肽包括SEQ ID NO：4中的序列。优选编码该多肽的核酸区段包括SEQ ID NO：3中至少51个连续碱基对组成的核苷酸序列。更优选的是，编码该多肽的核酸区段包括SEQ ID NO：3中至少60个连续碱基对组成的序列。更为优选的是，编码该多肽的核酸区段包括SEQ ID NO：3中至少78个连续碱基对组成的序列。典型的编码该杀虫多肽的多核苷酸包括SEQ ID NO：3中至少96个连续碱基对组成的核苷酸序列，其中的一个实施方案中包括SEQ ID NO：3中的核苷酸序列。

另一个实施方案中，本发明提供分离的CryET76多肽，该多肽包括SEQ ID NO：2中至少55个连续氨基酸。更优选的是，该多肽包括SEQ ID NO：2中至少60个或至少70个连续氨基酸。更为优选的是，该多肽包括SEQ ID NO：2中至少75个或至少80个连续氨基酸。更为优选的是，该多肽包括SEQ ID NO：2中至少85个或至少90个连续氨基酸。在一个典型的实施方案中，该多肽包括SEQ ID NO：2中的序列。优选编码该多肽的核酸区段包括SEQ ID NO：1中至少165个连续碱基对组成的核苷酸序列。更优选的是，编码该多肽的核酸区段包括SEQ ID NO：1中至少180个连续碱基对组成的序列。更为优选的是，编码该多肽的核酸区段包括SEQ ID NO：1中至少225个连续碱基对组成的序列。典型的编码该杀虫多肽的多核苷酸包括SEQ ID NO：1中至少270个连续碱基对组成的核苷酸序列，其中的一个实施方案中包括SEQ ID NO：1中的核苷酸序列。

另外一个实施方案中，本发明公开并申请专利的是分离出来的CryET71多肽，该多肽包括SEQ ID NO：12中至少146个连续氨基酸。更优选的是，该多肽包括SEQ ID NO：12中至少150个或至少154个连续氨基酸。更为优选的是，该多肽包括SEQ ID NO：12中至少158个或至少162个连续氨基酸。更为优选的是，该多肽包括SEQ ID NO：12中至少166个或至少170个连续氨基酸。在一个典型的实施方案中，该多肽包括SEQ ID NO：12中的序列。优选编码该多肽的核酸区段包括SEQ ID NO：11中至少438个连续碱基对组成的核苷酸序列。更优选的是，编码该多肽的核酸区段包括SEQ ID NO：11中至少450个连续碱基对组成的序列。更为优选的是，编码该多肽的核酸区段包括SEQ ID NO：11中至少462个连续碱基对组成的序列。典型的编码该杀虫多肽的多核苷酸包括SEQ ID NO：11中至少510个连续碱基对组成的核苷酸序列，其中的一个实施方案中包括SEQ ID NO：11中的核苷酸序列。

本发明也提供了分离的CryET74多肽，该多肽包括SEQ ID NO：6中的序列。优选编码该多肽的核酸区段包括SEQ ID NO：5中至少45个连续碱基对组成的核苷酸序列。更优选的是，编码该多肽的核酸区段包括SEQ ID NO：5中至少90个连续碱基对组成的序列。更为优选的是，编码该多肽的核酸区段包括SEQ ID NO：5中至少150个连续碱基对组成的序列。典型的编码该杀虫多肽的多核苷酸包括SEQ ID NO：5中至少300个连续碱基对组成的核苷酸序列，其中的一个实施方案中包括SEQ ID NO：5中的核苷酸序列。

此外，本发明提供了分离的CryET39多肽，该多肽包括SEQ ID NO：8中的序列。优选编码该多肽的核酸区段包括SEQ ID NO：7中至少45个连续碱基对组成的核苷酸序列。更优选的是，编码该多肽的核酸区段包括SEQ ID NO：7中至少90个连续碱基对组成的序列。更为优选的是，编码该多肽的核酸区段包括SEQ ID NO：7中至少150个连续碱基对组成的序列。典型的编码该杀虫多肽的多核苷酸包括SEQID NO：7中至少300个连续碱基对组成的核苷酸序列，其中的一个实施方案中包括SEQ ID NO：7中的核苷酸序列。

另外，本发明提供分离的CryET79多肽，该多肽包括SEQ ID NO：10中的序列。优选编码该多肽的核酸区段包括SEQ ID NO：9中至少45个连续碱基对组成的核苷酸序列。更优选的是，编码该多肽的核酸区段包括SEQ ID NO：9中至少90个连续碱基对组成的序列。更为优选的是，编码该多肽的核酸区段包括SEQ ID NO：9中至少150个连续碱基对组成的序列。典型的编码该杀虫多肽的多核苷酸包括SEQ ID NO：9中至少300个连续碱基对组成的核苷酸序列，其中的一个实施方案中包括SEQ ID NO：9中的核苷酸序列。

本发明同时公开包括一种或多种本文公开多肽的组合物和制剂。这样的组合物可以是细菌细胞的细胞抽提物、细胞悬浮液、细胞匀浆、细胞裂解物、细胞上清液、细胞滤液或者细胞沉淀，在细菌细胞中包括编码这些多肽的多核苷酸。典型的产生这些多肽的细菌细胞包括苏云金芽孢杆菌EG4550(1997年5月30日于NRRL保藏的NRRL B-21784)、EG5899(1997年5月30日于NRRL保藏的NRRL B-21783)、EG11529(1998年2月12日于NRRL保藏的NRRL B-21917)、EG4100(1997年5月30日于NRRL保藏的NRRL B-21786)、EG11647(1997年5月30日于NRRL保藏的NRRL B-21787)、EG9444(1997年5月30日于NRRL保藏的NRRL B-21785)、EG11648(1997年5月30日于NRRL保藏的NRRLB-21788)、EG4851(1998年2月12日于NRRL保藏的NRRL B-21915)以及EG11658(1998年2月12日于NRRL保藏的NRRL B-21916)。

本文公开内容中详细描述的组合物可以制作成粉末、粉剂、药片、颗粒、乳剂、胶体、溶液等等，可优选通过常规方法如干燥、冷冻干燥、匀浆、提取、过滤、离心、沉降和浓缩制备包括多肽的细胞培养物。这些组合物优选从一种或多种本文所述苏云金芽孢杆菌细胞中获得。在所有包含至少其中一种杀虫多肽的组合物中，多肽的浓度可以是大约1％到大约99％(按重量计)。

典型的杀虫多肽制剂的制备过程中包括的步骤有：在能有效产生杀虫多肽的条件下培养适当的苏云金芽孢杆菌细胞；收获产生出的杀虫多肽。

例如，本发明公开并申请专利的是对鞘翅目昆虫或鳞翅目昆虫有杀虫活性的δ-内毒素多肽的制备方法。该方法主要包括从在合适条件下生长的苏云金芽孢杆菌细胞培养物中分离一种或多种细胞所产生得δ-内毒素多肽。这些多肽可以从细胞培养物或细胞上清液中分离或者从来自于细胞培养物的芽孢悬浮液从分离并以天然形式使用。这些多肽也可以纯化和浓缩，以供特定使用。

本发明也提供了一种防治昆虫群体的方法。本方法主要包括给虫群施以有效杀虫量的多肽，多肽中包括SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16或19中的氨基酸序列。这些方法可以用于杀死或减少指定区域靶昆虫的数量，也可以预防性地用于某一环境地区以防止易感昆虫的侵袭。昆虫优选摄取有效杀虫量的多肽或优选接触有效杀虫量的多肽。

此外，本发明提供一种能与本文所公开杀虫多肽特异结合的纯化抗体。本文也提供了制备抗体的方法，也提供了使用抗体分离、鉴定和/或纯化与抗体特异结合的多肽的方法。本文详细提供在鉴定多肽和多肽片段和/或其表位中有用的免疫试剂盒和免疫检测方法，这也是本发明的重要内容。

这些抗体可以用于检测样品中以上多肽的存在，或如下文所述可用于多种免疫方法中。在生物样品种检测δ-内毒素多肽的典型的方法主要包括：获得怀疑含有δ-内毒素多肽的生物样品；在能有效形成抗原-抗体复合物的条件下，样品与能与多肽特异结合的抗体接触；检测所形成的复合物。

针对这些方法，本发明也提供了免疫检测试剂盒(immunodetectionkit)。在合适的容器中，这样的试剂盒中一般包括能与δ-内毒素多肽结合的抗体，以及至少一种第一免疫检测试剂。另外，试剂盒还可以提供其它试剂或用抗体检测样品中δ-内毒素多肽的说明书。

正如下文所述，使用所公开的多肽作为抗原可以在动物中完成这些抗体的制备过程。抗原表位、短肽、融合肽、与载体连接的肽片段等等也都可以从本文公开的多肽序列的全部或部分中产生得到。

本发明的另一方面涉及表9中所示苏云金芽孢杆菌细菌的生物纯培养物，培养物于Agricultural Research Culture Collection，Northern Regional Research Laboratory(NRRL)保藏。

本发明的另一个实施方案涉及的载体中包括的序列编码包括本文公开的一个或多个氨基酸序列的多肽，涉及用此重组载体转化的重组寄主细胞，涉及用编码本文公开多肽的多核苷酸序列转化的重组细菌的生物纯培养。所有的菌株是递交Patent Culture Collection于NRRL保藏的，依照International Receipt Form BP/4获得了存活性声明。下文中对可用载体、重组寄主细胞、转基因细胞系、多能植物细胞(pluripotent plant cell)以及转基因植物进行了详细描述，它们包括至少第一个序列编码包括一种或多种本文公开序列在内的多肽。

本发明的另一个实施方案提供了杀虫多肽组合物的制备方法。在典型的实施方案中，这样的多肽可以用作杀虫剂，可以用来防治包括农业环境等环境中的昆虫群体。通过体表接触(topical application)或者通过昆虫摄食多肽组合物，制剂可以用来杀死昆虫。有时，可以将本发明的多肽应用到土壤中，应用到植物、树、灌木等上或其周围，应用到活体植物、家畜、住所、农场设备、建筑等的周围。

本发明也提供转化寄主细胞、多能植物细胞群(pluripotent plantcell population)、植物胚性组织(embryonic plant tissue)、植物愈伤组织(plant callus)、小植株以及转基因植物，它们包括编码杀虫多肽的选择序列。这些细胞优选原核细胞或真核细胞，如细菌细胞、真菌细胞或植物细胞，其中可以使用的细菌细胞包括苏云金芽孢杆菌细胞、枯草芽孢杆菌细胞(B.subtilis)、B.megaterium细胞、B.cereus细胞、埃希氏杆菌属(Escherichia)细胞、沙门氏菌属(Salmonella)细胞、农杆菌属(Agrobacterium)细胞和假单胞菌属(Pseudomonas)细胞。

植物和植物寄主细胞优选单子叶植物细胞或双子叶植物细胞，如玉米、小麦、大豆、燕麦、棉花、水稻、黑麦、高粱、甘蔗、番茄、烟草、木棉、亚麻、马铃薯、大麦、草坪草、牧草、浆果、水果、荚豆、蔬菜、修饰性植物(ornamental plant)、灌木、仙人掌、肉质植物(succulent)及树的细胞。

本发明中说明的转基因植物优选将所选多核苷酸(或“转基因”)整合到其基因组中，所选核苷酸(或“转基因”)包括的第一个序列编码一种或多种本文公开的杀虫多肽。

同样，任何一代这样的转基因植物的后代(子代、后代等等)也代表本发明的一个重要方面。优选的是，这样的后代包括所选转基因，并遗传了亲本植物显示出来的抗虫性表型性状。所有这些转基因植物任何一代的种子也是本发明的一个重要方面。优选的是，种子中也包括所选基因，并赋予从种子长成的植物抗虫性表型。

包括一种或多种能编码一种或多种本文公开多肽的转基因的抗虫杂交可育转基因植物的制备方法主要包括：获得染色体上整合了编码杀虫多肽转基因的可育转基因植物，所转基因与在植物中有活性的启动子有效相连；将可育转基因植物与没有该转基因的第二种植物杂交，得到第三种包括该转基因的植物；将第三种植物回交，得到回交可育植物。以上情况中，转基因可以通过父本遗传也可通过母本遗传。第二种植物可以是自交植物，而第三种植物可以是杂交种。

同样，抗虫杂交转基因植物的制备方法主要涉及使第一种自交植物和第二种自交植物杂交，其中，第一种植物和第二种植物中的其中之一或两者均包括插入染色体上的转基因，插入的转基因编码所选多肽，该转基因与能使转基因表达的的植物表达启动子有效相连。在作为解释说明的实施方案中，第一种自交植物和第二种自交植物可以选自于以下单子叶植物：玉米、小麦、水稻、大麦、燕麦、黑麦、高粱、草坪草和甘蔗。

在相关的实施方案中，本发明同时提供一种制备抗虫转基因植物的方法。该方法主要涉及：在允许吸收DNA组分的条件下，将受体植物细胞与包括至少编码杀虫多肽的第一种转基因的DNA组分接触；选择包含有插入染色体的编码多肽的转基因的受体细胞；从所选细胞再生出植物；鉴定出相对于对应未转化植物来说抗虫性有增强的可育转基因植物。

转基因种子的产生方法主要涉及：获得其染色体上整合有转基因的可育转基因植物，所整合的转基因编码的多肽中包括本文公开的一种或多种氨基酸序列，转基因可行地连接到能使转基因在植物中表达的启动子上；在合适的条件下种植植物，产生出转基因种子。

本发明中同时提供任何一代抗虫性增强的可育转基因植物后代的产生方法。该方法主要涉及：收集来自于包括在其染色体上整合有转基因的转基因植物的转基因种子，编码所说多肽的转基因与能在植物中表达转基因的启动子有效连接；种植所收集的转基因种子；从转基因种子长成后代转基因植物。

转基因植物、转基因后代以及转基因种子的创造方法可以涉及使用熟知的植物细胞转化过程如微粒轰击(microprojectilebombardment)、电穿孔(electroporation)或农杆菌介导的转化(Agrobacterium-mediated transformation)中的其中之一，使植物细胞与DNA组分接触。从以下有本文所述益处的实施例和可以看出，本发明的这些实施方案以及其它实施方案对于那些本领域的技术人员来说是不难理解的。2.1多核苷酸区段

本发明所提供的核酸区段从任何来源中分离，该核酸区段游离于总基因组DNA之外，且编码本文公开的新的杀虫多肽以及其肽片段。编码这些肽和多肽的多核苷酸可以编码有杀虫活性的蛋白质或肽片段、多肽亚基、功能域，或者CryET84、CryET80、CryET76、CryET71、CryET69CryET7 5、CryET39、CryET79、CryET74以及与本文公开多肽相关的晶体蛋白中的一种或多种类似物。此外，本发明包括可以通过本领域技术人员熟知的方法体外完全合成的那些编码本文公开的新的多肽、肽、肽片段、亚基或功能域的核酸区段。

本文所用的术语“核酸区段”或“多核苷酸”是指从特定物种的总基因组DNA中分离出来的核酸分子。因此，编码内毒素多肽的核酸区段或多核苷酸是指包括至少第一种编码晶体蛋白的序列核酸分子。编码晶体蛋白的核酸序列是从某些物种的总基因组DNA中分离或纯化来的。本文中的总基因组DNA是革兰氏阳性细菌菌属芽孢杆菌的基因组，特定的芽孢杆菌品种是苏云金芽孢杆菌。包括在术语“核酸区段”中的有多核苷酸区段和这些区段中较小的片段，以及重组载体，例如，包括质粒、粘粒(cosmid)、噬菌粒(phagemid)、噬菌体(phage)、毒粒(viron)、杆状病毒(baculovirus)、人工染色体(artificialchromosome)、病毒(virus)等等。因此，与多核苷酸序列SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：18的核酸序列或功能等同物相似性在大约70％与大约80％之间或更优选在大约81％与大约90％之间或甚至更优选在大约91％与大约99％之间的多核苷酸序列，即为“基本为SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：18中所列”序列。特别优选的序列是与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：18中的核苷酸序列有优选为大约91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或大约100％相同或功能相当的序列。编码相关多肽序列的其它优选序列是那些与下文所列的一种序列或多种序列有大约81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％或90％相同或功能相当的序列。同样，我们认为那些与本文以下所列这些序列有大约71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％或80％相同或功能相当的序列在本发明的实践中同样有用。

同样，包括分离的、纯化的或所选基因或序列区段的多核苷酸指的是包括除了编码多肽的序列外某些其它元件，如调控序列，它们基本是从其它天然存在的基因或编码蛋白质的序列中分离出来的。此处的术语“基因”单纯是指编码功能蛋白质的单位或编码功能多肽的单位。正如那些本领域人员所能理解的那样，这一功能术语既包括基因组序列、操纵基因序列，又包括人工改造的较小的基因区段，这些序列或区段能够表达或能够适用于表达蛋白质、多肽或肽。在某些实施方案中，核酸区段将包括至少编码本文公开的一种或多种多肽的第一个基因。

为使基因能够表达，并使mRNA能够翻译成成熟多肽(maturepolypeptide)，核酸区段还优选包括与基因可行连接的至少第一个启动子，启动子能在用该核酸区段转化的寄主细胞中表达基因产物。启动子可以是内源启动子，或者可以选择能在一种或多种特定细胞类型中启动基因表达的异源启动子。例如，在创造包括所选基因的转基因植物和多能植物细胞过程中，可以选择在植物中表达的异源启动子，而且许多情况下，所选异源启动子优选的是组织特异性或细胞周期特异性。植物转化领域中的技术人员熟知植物表达启动子的选择，本文对可以效仿的合适启动子进行了描述。某些实施方案中，植物中表达的启动子可以选自于：玉米蔗糖合成酶1、玉米乙醇脱氢酶1(cornalcobol dehydrogenase 1)、玉米集光复合体(corn light harvestingcomplex)、玉米热激蛋白质、豌豆小亚基RuBP羧化酶、Ti质粒甘露碱合酶、Ti质粒胭脂碱合酶、矮牵牛查尔酮异构酶(petunia chalconeisomerase)、菜豆富甘氨酸蛋白质1(bean glycine rich protein 1)、马铃薯Patatin、凝集素(lectin)、CaMV 35S以及S-E9小亚基RuBP羧化酶的启动子。

“基本上从其它编码序列中分离来的”的意思是说：本文所关心的基因——编码细菌晶体蛋白的基因——是DNA区段中编码区的重要部分；DNA区段并不包含大部分天然存在的编码DNA，如大的染色体片段或功能基因或操纵子编码区。当然，这指的是原来分离的DNA区段，而并不排除后来由人工加到区段上的基因、重组基因、合成接头或编码区。

特定的实施方案中，本发明涉及分离的多核苷酸(如DNA、RNA、反义DNA、反义RNA、核酶以及PNAs)以及重组载体，包括编码本文公开的一种或多种多肽的多核苷酸序列。

术语“基本上如在SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：1O、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQID NO：16或SEQ ID NO：19中所列的序列”是指基本上对应于SEQ IDNO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：19序列部分的序列，与这些序列中的任何一种只是有非常少的几个氨基酸不同，或与这些序列中的任何一种的生物功能相当，或者就是这些序列中的任何一种。术语“生物功能相当”一词的意思在本领域中是容易理解的，本文中还要进一步作详细的定义(如，参照作为例释的实施方案部分)。因此，与氨基酸序列SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：19的氨基酸序列相似性或功能等值在大约70％与大约80％之间或更优选在大约81％与大约90％之间或甚至更优选在大约91％与大约99％之间的序列，即为“基本为SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ IDNO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：19中所列”序列。特别优选的序列是与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：19中的氨基酸序列有优选为大约91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或大约100％相同或功能相当的序列。其它优选序列是那些与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQID NO：14、SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：19中的氨基酸序列有大约81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％或90％相同或功能相当的序列。同样，我们认为那些与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQID NO：14、SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：19中多肽序列有大约71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％或80％相同或功能相当的序列在本发明的实践中同样有用。

可以理解的是，氨基酸序列和核酸序列可以包括额外的残基，如N-末端氨基酸或C-末端氨基酸或者5’或3’序列，而且只要这些序列符合上文所列原则，这些序列基本上仍是下文所列本文公开序列中的其中之一，所列原则包括谈到蛋白质表达时蛋白质生物活性的保持。添加的末端序列尤其适用于核酸序列，如可以包括位于编码区5’或3’部分之侧的多种非编码序列，也可以包括多种内部序列(internalsequence)，即大家熟知的位于基因内部的内含子。

本发明中的核酸区段，不论其编码序列的长度如何，都可以与其它核酸序列如启动子、多腺苷酸化信号、额外的限制酶位点、多克隆位点、其它编码区段等等相连接，因此它们的总长度变化相当大。因此我们认为几乎可以使用任意长度的核酸片段，其总长度优选容易制备。例如，可以制备出包括编码在SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ IDNO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：19中所公开肽序列的连续短片段在内的核酸片段，或者可以制备出与编码在SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：19中公开肽的核酸序列相同或互补的序列，或者可以特别制备出在SEQ ID NO：1、3、13、15或18中公开的核酸区段。例如，包括来自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQID NO：13、SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：18中连续核苷酸序列的核酸序列或者编码SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ IDNO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：19中连续氨基酸序列的核酸序列如大约23个核苷酸长度及最长大约10000、5000、3000、2000、1000、500、200、100、50个以及大约23个碱基对长度，尤其认为有用。

容易理解的是，在谈到多核苷酸序列或核酸序列或所公开基因所特异的引物(primer)或探针(probe)时提及的“中等长度”就是指在所引述范围内的长度，如：大约24、25、26、27、28、29等；30、31、32、33、34、35、36、37、38、39等；40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、65、70、75、80、85、90、95等；100、101、102、103、104等；110、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、180、190等；包括所有在大约200-500、500-1000、1000-2000、2000-3000、3000-5000范围内的所有整数；以及一直到并包括大约10000个或12000个核苷酸长度，等等。

同样容易理解的是，在谈到多肽或肽时所提及的“中等长度”就是指在所引述连续氨基酸范围内的任何长度。例如，在考虑公开的杀虫多肽时，我们认为所有在大约7个到大约300个连续氨基酸序列之间的长度在本文所公开的特定实施方案中是有用的。例如，包括的连续氨基酸序列约为7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、65等，70、75等，80、85等；90、95等的肽，以及那些包括SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ IDNO：14、SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：19中至少大约96、97、98、99、100、101、102、103和104个或更多个连续氨基酸的多肽，毫无疑问都认为在本发明的范围之内。

另外，本领域的技术人员也容易理解的是，在谈到有杀虫活性的更大的多肽时所提及的“中等长度”指的是在所引述的包括此多肽的连续氨基酸范围之间的任何长度。例如，在考虑本发明多肽时，我们认为在本文所公开的特定方案中所有大约100个到1000个连续氨基酸序列之间的长度都是有用的。例如，包括的连续氨基酸序列约为100、约101、约102、103、104、105、106、107、108、109、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195等，200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、220、230、240、250、260、270、280、290等，300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400等；410、430、450、470、490等，500、525、550、575、600、650、675、700等，750等的肽，以及那些包括至少大约775个或更多个氨基酸的多肽，毫无疑问都认为在本发明的范围之内。特别是有关包括SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：19中全部或部分氨基酸序列的融合蛋白质(fusion protein)，更长一点儿的多肽序列可能是优选的，包括那些包括长度在大约760、770、780、790或800、或900个或更多个氨基酸的序列。

同样可以理解的是，本发明并不局限于编码本发明肽的特定核酸序列或者编码SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：19中氨基酸序列的特定核酸序列，其包括在SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：18所特定公开的DNA序列。所以，重组载体和分离的DNA区段可分别包括编码这些多肽的区段、在基本编码区中有选择性的变动或修饰的编码区。这些重组载体和分离的DNA区段或者可以编码包括这些肽编码区在内的更大一点儿的多肽，或者可以编码氨基酸序列变体的有相当生物功能的蛋白质或多肽。

本发明中的DNA区段包含有相当生物功能的肽。这些序列的出现是因为密码子的简并性以及功能上的相当，已知这些情况天然发生在核酸序列及其所编码蛋白质中。另外，可以通过使用重组DNA技术创造出功能相当的蛋白质或肽，在考虑所改变氨基酸的特性的基础上可以对蛋白质结构的变化进行人工改造。可以应用定点诱变技术引入人为设计的变动，例如可以提高蛋白质的抗原性或者检验突变体以便在分子水平上检测蛋白质的活性。此外，那些未知或未鉴定的天然多肽和/或者与本文公开序列结构相关和/或功能相关的多肽，也都认为在本发明的范围之内。这些多核苷酸编码的多肽与本文中具有编码晶体蛋白特征的多核苷酸所确定的多肽在结构上类似和/或功能上类似或相同。因为选择“CryET39”、“CryET69”、“CryET71”、“CryET74”、“CryET76”、“CryET79”、“CryET80”、“CryET84”和“CryET75”这些任意名称来随意鉴定包括本文公开氨基酸序列的多肽，所以可以鉴定与这些序列高度同源(或者相同)的许多其它序列，但是从异种生物或来源或其它来源中分离的多肽可以完全从头合成或部分从头合成。因此，不论天然存在或人工创造的与本文所述一级氨基酸序列在结构上同源的所有多肽序列以及对本文公开的靶昆虫有相似杀虫活性的多肽序列，都认为在本公开内容的范围之内。同样，不论天然存在或人工创造的与本文公开的核酸序列在结构上同源的所有多核酸序列，或者编码与本文公开氨基酸序列同源和有相当生物功能的多肽的核酸序列，也认为在本公开内容的范围之内。

根据需要，也可制备出融合蛋白质和融合多肽，例如有时将编码肽的区段和其它有想要功能如为了纯化或免疫检测等目的的蛋白质或肽(如可以分别通过亲和层析以及编码酶标记的区段来纯化的蛋白质)放在在同一个表达单位中。

重组载体也是本发明的一些方面。我们认为尤其有用的载体中，DNA区段的编码区无论其编码全长的杀虫蛋白质或较小一点儿的肽，放在启动子的调控之下。启动子的形式可以是与本发明中编码肽的基因天然相连接的启动子，这可以通过诸如使用重组克隆技术(recombinantcloning technology)和/或PCR^TM技术，分离与本发明公开的组合物相关的位于编码区段或外显子(exon)上游的5’非编码序列。多数情况下，启动子可以是天然的启动子，或者可以是异源启动子，如细菌来源的启动子(包括来自其它晶体蛋白的启动子)、真菌来源、病毒、噬菌体或噬菌粒来源的启动子(包括象CaMV 35S这样的启动子及其衍生物、T3、T7、λ以及φ启动子等等)，或者植物来源的启动子(包括组成型、诱导型和/或组织特异性启动子，等等)。2.1.1从EG4851中分离出来的CryET76、CryET80、CryET84的特性

本发明所提供的新多肽阐明的是苏云金芽孢杆菌CryET76、CryET84或CryET80晶体蛋白中的全部或一部分。

优选实施方案中，本发明公开并申请专利的是所分离和纯化的CryET76蛋白质。CryET76蛋白质是从EG4851中分离来的，它包括一个387个氨基酸的序列，计算其分子量大约为43800Da。计算出CryET76的等电常数等于5.39。

优选实施方案中，本发明公开并申请专利的是所分离和纯化的CryET80蛋白质。CryET80蛋白质是从EG4851中分离来的，它包括一个132个氨基酸的序列，计算其分子量大约为14800Da。计算出CryET80的等电常数等于6.03。

优选实施方案中，本发明公开并申请专利的是所分离和纯化的CryET84蛋白质。CryET84蛋白质是从EG4851中分离来的，它包括一个341个氨基酸的序列，计算其分子量大约为37884Da。计算出CryET84的等电常数等于5.5。

在菌株EG4851中，cryET80基因和cryET76基因优选定位在一段DNA区段上，并且由大约95个核苷酸分隔开来。CryET76的基因从SEQ ID NO：5中的第514个核苷酸一直延续到第1674个核苷酸，而编码CryET80的基因从SEQ ID NO：5中的第23个核苷酸一直延续到第418个核苷酸。本发明中的cryET80基因和cryET76基因优选定位在一段DNA区段上。

在菌株EG4851中，cryET84基因的定位紧靠cryET80基因和cryET76基因的5’端附近。cryET84基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：18所示，推断出CryET84蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO：19所示。本发明中的cryET80基因、cryET84基因以及cryET76基因可能优选定位在同一个DNA区段上(如SEQ ID NO：17)。2.2用作杂交探针和模板的核酸区段

本文所述核酸序列除了能用于指导本发明中晶体蛋白或晶体多肽的表达外，还有其它多种用途。例如，在核酸杂交实施方案中它们有探针或引物的作用。本发明提供了检测编码δ-内毒素多肽的核酸序列的方法。该方法主要涉及：获得怀疑有编码δ-内毒素多肽的样品核酸；在使基本上互补的核酸能有效杂交的条件下，样品核酸与包括本文公开序列之一在内的分离核酸区段相混合接触；检测所形成的杂交互补核酸。

本文也提供了核酸检测试剂盒，核酸检测试剂盒中包括在合适容器中至少包括SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：18中至少23个连续核苷酸的至少第一种核酸区段，以及至少一种第一种检测试剂。这些核酸探针能够与编码晶体蛋白的序列特异杂交，这就使得它们在检测指定样品中是否存在互补序列方面非常有用。当然，也可以设想出其它用途，包括使用序列信息制备突变引物或者使用引物制备其它遗传构建体。

序列区段由大约23个到50个或直至并包括大约100-200个与本文DNA序列相同或互补的连续核苷酸区段组成的核酸分子，将尤其作为诸如DNA印迹(DNA blotting)和RNA印迹(RNA blotting)中所用的杂交探针。中等大小的片段在杂交实施方案中通常也有用处，其中，连续互补区段的长度可能变化很大，如在大约25-30，或在大约30-40之间的核苷酸，但也可能用到长度更大的连续互补片段，如也可能用到那些长度从大约200-300，或长度从300-400或500个的核苷酸，这要根据想要检测的互补序列的长度而定。也可能用到更加长一点儿的连续序列区段，包括那些包括本文公开序列之一中至少大约600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500个或更多个连续核苷酸的序列。

当然，也可以通过其它技术如机械剪切或限制酶消化等制得片段。小的核酸区段或片段极易通过诸如直接用化学方法合成片段的方式制备，通常使用用自动化寡核苷酸合成仪来实现这一目的。片段的获得方法可以使用核酸增殖技术如美国专利4683195和4683202中的PCR^TM技术(各个专利的内容在此引入作为参考)，也可以通过将所选序列引入到重组载体中进行重组增殖，也可以通过分子生物学领域中技术人员所熟知的其它重组DNA技术产生出所需片段。

因此，使用本发明中的核苷酸序列是因为它们能与DNA片段的互补区段选择性地形成双链分子。依据所能想到的不同应用，我们可以使用不同杂交条件得到针对靶序列的选择性不同的探针。对于应用时需要高度选择性的，我们将通常使用能形成杂种分子的相对严紧的条件。例如，“高度严紧性”的杂交条件通常使用相对低的盐和/或高温条件，如可以由在大约50℃～大约70℃时大约0.02M～大约0.15M的NaCl提供此条件。这样的选择条件只能忍受探针与模板或靶链存在非常低程度的错配(当然，如果有的话)，这对于分离编码晶体蛋白的DNA区段将尤其有用。对于本领域的熟练技术人员来说，通过杂交检测DNA区段的方法是众所周知的，美国专利4965188和5176995中的内容(两个专利的内容在此引入作为参考)均是可以效仿的杂交分析方法。诸如Maloy等(1990)、Maloy(1994)、Segal(1976)、Prokop和Bajpai(1991)以及Kuby(1994)的文章内容是特别相关的内容。

当然，对于有些应用，如在想要通过使用突变引物链与既定的(underlying)模板进行杂交时或在从相关品种中分离编码晶体蛋白序列的等功能体等时，为使异源双链形成通常将需要较低严紧性的杂交条件。此时，我们就想使用“低严紧性”或“严紧性降低的”的杂交条件，如在从大约20℃～50℃温度范围内波动的温度条件下使用从0.15M～0.9M的盐。因此，谈到控制杂交时，我们将交叉杂交视作正杂交信号。无论如何，我们通常认为通过加入逐渐增高量的甲酰胺能使杂交条件变得更为严紧。甲酰胺以与升高温度相同的方式达到使杂种双链去稳定的效果。所以，杂交的条件是容易调控的，而且通常这就是依赖于想要的结果时所选择的方法。不管在盐(如NaCl或柠檬酸钠等)、有机缓冲液(如，包括甲酰胺等)以及温育或漂洗的温度之间如何组合使用，熟练的技术人员会轻松地使用“高”、“中”或“低”严紧性的杂交条件，而且将能够使用这些条件去解释杂交分析结果，以便决定靶核酸序列与从SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：18中使用的特定新的多核苷酸探针序列之间的相对同源性。

某些实施方案中，在控制杂交时联合使用本发明的核酸序列和适当方法如标记将非常有利。在本领域中已知多种适当指示剂方法，包括荧光配体、放射性配体、酶促配体或其它配体，如抗生物素蛋白/生物素能够提供可检测到的信号。优选实施方案中，我们可能喜欢使用荧光标记或酶标物，如脲酶、碱性磷酸酶或过氧化物酶，而不是放射性或其它对环境不利的试剂。在酶标物中，已知的显色指示底物可以用于给人眼或分光光度提供可见方法，这样就能鉴定出与包含互补核酸的样品进行的特定杂交。

我们通常认为本文所述杂交探针既可以在溶液杂交中作为试剂，又可以在使用固相的实施方案中作为试剂使用。在涉及固相的实施方案中，待测DNA(或RNA)吸附到或固定到所选介质或表面上。随后，在预定条件下，固定的单链核酸与所选探针进行特定杂交。在所需特定标准的基础上，所选条件决定于特定的环境(如取决于G+C含量、靶核酸的类型、核酸来源、杂交探针的大小，等等)。漂洗杂交表面以便去除非特异结合的探针分子之后，使用标记对特异的杂交进行检测甚或进行定量。2.3重组表达Cry相关多肽的载体和方法

我们认为，其它实施方案中将编码DNA的区段放在重组启动子或异源启动子的控制之下将有某些优点。正如本文所用的重组启动子或异源启动子一样，重组启动子或异源启动子用来指在天然环境下一般并不与编码晶体蛋白或多肽的DNA区段相连接的启动子。这些启动子中包括通常与其它基因相连接的启动子和/或从任何细菌细胞、病毒细胞、真核细胞或植物细胞中分离的启动子。当然，在选择用于表达的细胞类型、生物甚或生物中使用能有效指导DNA区段表达的启动子是非常重要的。对于分子生物学领域中的技术人员来说，一般都知道如何联合使用启动子和细胞类型来表达蛋白质，如可以参照Sambrook等(1989)。所用启动子可以是组成型或诱导型的，在适当条件下可用于指导所导入DNA区段高水平的表达，这在产生大量重组蛋白质或肽时是有利的。我们认为用于高水平表达的合适启动子系统包括但并不局限于Pichia表达载体系统(Pharmacia LKB Biotechnology)。

关于用于制备重组蛋白质和重组肽的表达实施方案，我们认为更长的DNA区段使用的最多，其中编码完整肽序列的DNA区段最优选。但是，我们认为使用更短的DNA区段指导晶体蛋白或表位核心区如可以用于产生抗-晶体蛋白抗体，也在本发明的范围之内。我们认为编码从大约8个到大约50个氨基酸长度、或更优选从大约8个到大约20个氨基酸长度肽抗原的DNA区段尤其有用。这些肽的表位可以是包括本文公开的连续氨基酸序列的氨基酸序列。2.4表达CryET多肽的转基因植物

另一方面，本发明提供能表达所选核酸区段的转基因植物的产生方法，其中所选核酸区段中包括编码本发明中新的内毒素多肽的序列区段。在本领域中，转基因植物的产生方法是众所周知的。该方法一般包括用包含启动子的DNA区段转化合适的植物寄主细胞，其中的启动子与编码一个或多个所公开多肽的编码区可行地连接。编码区一般与至少第一个转录终止区相连接，这样启动子才能驱动编码区在细胞中的转录并因此提供细胞在体内产生多肽的能力。此外，在想要调控、调节或降低特定转基因细胞中特定重组晶体蛋白的量时，本发明也提供了表达晶体蛋白反义mRNA的方法。使用反义mRNA作为控制或降低细胞中指定蛋白质的量的方法在本领域中是熟知的。

本发明的另一个方面包括能表达编码本文所公开一种或多种新多肽组分的基因、基因区段或序列区段的转基因植物。正如本文所用的，术语“转基因植物”指的是整合有DNA序列的植物，所整合的DNA序列中，包括但并不局限于通常不存在的基因、通常并不转录成RNA或并不翻译(“表达”)成蛋白质的DNA序列，或者人们想要引入非转基因植物的任何其它基因或DNA序列，如那些通常在非转基因植物中存在的基因，人们想要将其进行遗传改造或使其表达发生改变。

我们认为，有时通过将一种或多种或天然存在或人工修饰或人工突变的编码与本文所公开多肽同一或高度同源杀虫多肽的转基因稳定引入，将使本发明中转基因植物的基因组得到改善。有时，要将不止一个转基因整合到所转化寄主植物细胞的基因组中。例如可以将不止一个编码晶体蛋白的DNA区段整合到植物基因组中。这时，可能想要使一个、两个、三个、四个或更多个苏云金芽孢杆菌晶体蛋白(要么是天然存在的要么是重组改造的)在所转化转基因植物中整合并进行稳定表达。此外，可以将第二个转基因导入植物细胞，赋予植物其它表型形状。这些转基因可赋予植物对一种或多种昆虫、细菌、真菌、病毒、线虫或其它病原体的抗性。

例如，可以导入的优选基因包括来源于细菌编码晶体蛋白的DNA区段以及特别是本文所述从Bacillus spp中所得的一个或多个DNA区段。高度优选的核酸序列是从苏云金芽孢杆菌中所得的序列，或者是通过遗传改造来降低或提高晶体蛋白在所转化寄主细胞中的杀虫活性的序列。

转化植物细胞的方法和制备多能植物细胞的方法以及从转化的细胞、细胞培养物、胚或愈伤组织再生出转基因细胞系的方法，在本领域中是熟知的，并且将在本文中进行讨论。当然，在转化这些细胞时所用的包括编码杀虫多肽的至少第一个核酸区段的载体(包括质粒、粘粒、噬菌体、噬菌粒、杆状病毒、病毒、毒粒、BACs[细菌人工染色体]、YACs[酵母人工染色体])一般包括操纵子、基因或本发明中来自于基因的天然存在或者来自于合成的序列，以及编码所公开晶体蛋白的序列。这些核酸构建体中还可以包括的结构有启动子、增强子(enhancer)、多位点接头、内含子、终止子(terminator)甚或对所述克隆δ-内毒素基因有正调节作用或负调节作用的基因序列。DNA区段或基因可以编码天然存在的晶体蛋白或修饰的晶体蛋白，它们将在所得重组细胞中表达并/或将赋予包含该区段的转基因植物以增强的表现型(此处是指植物对昆虫攻击、侵袭或集群的抗性增强)。

为了提高或增强植物对靶昆虫攻击的抗性而进行制备包括至少一种编码杀虫多肽的序列的转基因植物，代表本发明的一个重要方面。本发明尤其对抗虫单子叶植物或抗虫双子叶植物的制备方法进行了描述，方法是将编码对鞘翅目昆虫或鳞翅目昆虫有毒性的一种或多种杀虫多肽的转基因DNA区段导入到植物中。

本发明的有关方面也包括转基因植物产生的种子、由这些种子所得的后代以及由最初的转基因植物的后代所产生的种子，产生方法与以上过程一致。在这些后代及种子中，编码晶体蛋白的转基因稳定整合到基因组中，而且这些后代植物将以孟德尔方式遗传由稳定的转基因所给与的性状。所有那些在其基因组中整合了编码一种或多种晶体蛋白或多肽的转基因DNA区段的转基因植物都是本发明的内容。正如本领域中的技术人员所熟知，植物后代的意思就是来自于植物的任何子代或者后代。2.5筛选晶体蛋白和检测晶体蛋白的试剂盒

本发明涉及筛选那些怀疑包含晶体蛋白多肽或晶体蛋白相关多肽的样品的方法和试剂盒，或者筛选产生这些多肽的细胞的方法和试剂盒。试剂盒中可能包含一种或多种对所公开氨基酸序列特异的抗体、或者一种或多种对衍生自所公开序列的肽所特异的抗体，试剂盒中还可能包含检测样品与本发明中的抗体之间相互作用的试剂。所提供试剂可能是放射性标记、荧光标记或者是酶促标记。试剂盒中可能包括一种已知的放射性标记物，它能与本发明中的核酸或抗体结合或与之发生作用。

试剂盒中的试剂可能以液体溶液的方式提供，也可能与固相支持物相连，或者以干粉形式提供。当试剂以液体溶液提供时，液体溶液优选为水溶液。当提供的试剂与固相支持物相连时，固相支持物可优选为层析介质、多孔检测板或者显微镜载玻片。当提供的试剂是干粉时，加入适当溶剂可使干粉还原(reconstiture)，该溶剂也可能同时提供。

另一个实施方案中，本发明涉及免疫检测方法和与之相伴的试剂盒。一般认为，本发明中的晶体蛋白或肽可用于检测与之有反应性的抗体，此外，根据本发明制备的抗体可用于检测晶体蛋白或包含晶体蛋白相关表位的肽。一般而言，这些方法中将包括：首先获得怀疑含有该蛋白质、肽或抗体的样品，在能使免疫复合物形成的有效条件下使样品与与本发明一致的抗体或肽接触，然后检测免疫复合物(immunocomplex)的存在。

一般而言，本领域中有关免疫复合物形成的检测方法是熟知的，而且可以通过使用多种方法完成检测过程。例如，本发明就涉及到使用ELISA、RIA、免疫印迹(如斑点印迹)、间接免疫荧光技术(indirectimmunofluorescence techniques)等。检测免疫复合物的形成通常要使用标记，如放射性标记或酶标物(如碱性磷酸梅、辣根过氧化物酶等)。当然，通过使用第二种结合配体如二抗(second antibody)或生物素/抗生物素蛋白质，我们会发现其它优点，在本领域中这一点是熟知的。

以鉴定为目的，我们认为实际上任何要检测的怀疑含有晶体蛋白或晶体多肽或晶体蛋白相关肽或抗体，都可以使用，正如本文所述。我们认为这些实施方案可能在测定抗原或抗体效价方面、在选择杂交瘤等方面有应用。在相关实施方案中，本发明涉及试剂盒的制备方法，这些试剂盒可用于检测样品中晶体蛋白或相关肽以及/或抗体的存在。样品可以包括怀疑含有晶体蛋白或晶体肽的细胞、细胞上清液、细胞悬液、细胞抽提物、酶组分、蛋白质抽提物或者其它无细胞组分。一般而言，与本发明一致的试剂盒中将包括合适的晶体蛋白、晶体肽或针对这样蛋白质或肽的抗体，还有免疫检测试剂以及盛放抗体或抗原以及试剂的装置。免疫检测试剂中总是包括一种与抗体或抗原结合的标记，或者是与第二种结合配体结合的标记。典型的配体可能包括针对第一种抗体的二抗或抗原或生物素或抗生物素蛋白质(或链霉抗生物素蛋白质)配体，它们都与标记连接。当然，正如上面注意到的，许多典型的标记在本领域中是熟知的，与本发明相关的所有这些标记均可使用。

容器通常包括小管，抗体、抗原或检测试剂可放在小管儿中，并且优选进行合适的等份分装。本发明中的试剂盒也总是包括盛放抗体、抗原以及试剂容器的装置，要求严格以便商售。容器中包括注射器(injection)或吹制模具的塑料容器(blow-molded plasticcontainer)，其中所需小管置于其中。2.6杀虫组合物及其使用方法

本发明认为，本文所公开的多肽组分有特定用处，可用作杀虫剂用于大田作物、草、水果及蔬菜、草坪、树，和/或装饰性植物进行局部使用和/或系统使用。此外，本文所公开的多肽可以制成喷雾、粉剂或水状、喷雾状或烟雾剂杀灭昆虫或防治昆虫种群。本文所公开的多肽组分可作预防用，或者可以施给环境，因为靶昆虫如WCRW在特定环境中需要进行处理。多肽组合物可能包括一种单一的Cry多肽，也可能包含本文所公开多肽的多种组合。

不管其使用方法如何，有效多肽组分的量用的是杀虫有效量，这取决于的因素有：所防治的特定靶昆虫、特定的环境、位置、植物、作物或所处理的农业位点、环境条件，以及使用有杀虫活性多肽组分的方法、效率、浓度、稳定性。制剂可能也会随着气候条件、环境因素和/或使用频率和/或昆虫侵袭的严重程度而有所不同。

所述杀虫组合物的制作方法可以是将细菌细胞、晶体悬液和/或芽孢悬液或者分离的蛋白质组分与想要的农业上可接受的载体制成制剂。在施用之前组合物可以用适当方法进行处理，如低压冻干、冷冻干燥、脱水，或者制备在水溶性载体、培养基或适当稀释液中，如盐或其它缓冲液。所制成的组合物可以以粉剂或颗粒，或悬浮在油(植物油或矿物油)、水或油/水乳浊液中，或制成可湿性粉，或者与适合农业使用的其它载体一起使用。合适的农业载体可以是固体或液体，它们在本领域中是熟知的。术语“农业上可接受的载体”包含所有在杀虫制剂技术中通常使用的佐剂、惰性组分(inert component)、分散剂、表面活性剂、胶粘剂(tackifier)、粘合剂等；杀虫制剂领域中的熟练人员对这些是熟知的。制剂可以与一种或多种固体佐剂或液体佐剂混合，制备方法有多种，如可使用常规制剂技术(conventionalformulation techniques)将杀虫组分与合适的佐剂进行均匀混合、混合和/或研磨。2.6.1流动油悬液(oil flowable suspensions)

在优选实施方案中，生物杀虫剂组合物中包括表达本文所公开的新晶体蛋白的细菌细胞的流动油悬液。典型的细菌包括，如苏云金芽孢杆菌(B.thuringeiensis)、B.megaterium、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、B.cereus、大肠杆菌(E.coli)、沙门氏菌(Salmonellaspp.)、土壤农杆菌(Agrobacterium spp.)、假单胞杆菌(Pseudomonasspp.)。2.6.2水分散微粒

在另一个重要实施方案中，生物杀虫剂组合物包括水分散颗粒。这些颗粒包括表达本文所公开新的晶体蛋白的细菌细胞。优选的细菌细胞包括，如B.megaterium、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、B.cereus、大肠杆菌(E.coli)、沙门氏菌(Salmonella spp.)、土壤农杆菌(Agrobacterium spp.)、假单胞杆菌(Pseudomonas spp.)，这些细菌细胞均用本文所公开的DNA区段进行了转化，而且我们表达晶体蛋白也是有用的。2.6.3粉末制剂(powders formulations)、粉剂(dusts formulations)和芽孢制剂(spore formulations)

在第三个重要的实施方案中，生物杀虫剂组合物包括可湿性粉、粉剂、芽孢晶体制剂、细胞沉淀或胶态浓缩物。粉剂中包括表达本文所公开的新晶体蛋白的细菌细胞。优选的细菌细胞包括苏云金芽孢杆菌细胞(B.thuringeiensis)、或者B.megaterium、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、B.cereus、大肠杆菌(E.coli)、沙门氏杆菌(Salmonellaspp.)、土壤农杆菌(Agrobacterium spp.)、假单胞杆菌(Pseudomonasspp.)等菌株的细胞，也可能用一种或多种本文所公开的区段进行了转化。可以将这些干粉形式的杀虫组合物设计成：即湿即溶，或者是以控释方式(controlled-release manner)、持续释放的方式(sustained-release manner)或其它依赖于时间的方式(time-dependent manner)溶解。这些组合物可以用于靶昆虫或由靶昆虫摄食，这样就可以在指定环境中防治昆虫数目或防治这些昆虫的扩散。2.6.4水悬液和细菌细胞滤液和细菌细胞裂解液

在第四个重要的实施方案中，生物杀虫剂组合物包括细菌细胞的水悬液或伴孢晶体的水悬液，或细菌细胞裂解液或细菌细胞滤液的水悬液等，如上文所述表达晶体蛋白的细菌。这些水悬液可以由浓缩的贮存液提供，在使用前进行稀释，或者也可以由现成稀释好的溶液提供。

对于这些涉及到使用细菌细胞的方法，包含晶体蛋白基因的细胞寄主可以生长在任何方便的营养培养基上，其中的DNA构建体提供了选择优势，所提供的选择培养基使得所有细胞均保留了苏云金芽孢杆菌基因。然后，用与常规方法一致的方法收获细胞。另外，在收获之前可以对细胞进行处理。

当杀虫组合物包括完整的表达所感兴趣蛋白质的苏云金芽孢杆菌细胞时，对于这些细菌的制剂可以有多个方式。通过与各种不同惰性物质如无机矿质(叶硅酸、碳酸、硫酸、磷酸，等等)或者植物原料(玉米芯粉、水稻外壳、核桃壳，等等)混合，细菌细胞可以用作可湿性粉、颗粒或粉剂。制剂中可以包括展布剂-粘着剂佐剂(spreader-sticker adjuvants)、稳定剂或杀虫添加剂，或者表面活性剂(surfactants)。液体制剂可以是水基或非水基，并用作泡沫、悬液、乳化的浓缩物等。配料中可能包括流变剂(rheological agents)、表面活性剂、乳化剂、分散剂或高聚物(ploymers)。

此外，制备新的杀虫多肽可以用天然细菌表达系统或体外重组细菌表达系统，分离后由于以后的大田。这些蛋白质在制作成活性杀虫剂制剂之前，或者以粗制细胞裂解液、悬浮液、胶体等形式存在，或者也可以经过纯化、提炼、缓冲并且/或进一步加工。同样，有时我们想要从表达晶体蛋白的细菌培养物中分离晶体和/或芽孢，然后用这些晶体和/或芽孢的溶液制剂、悬浮液制剂或者胶体制剂作为有效的生物杀虫剂组合物。2.6.5多功能制剂(multifunctional formulations)

某些实施方案中，想要防治多种昆虫时，本文所述杀虫制剂也可能包括一种或多种化学杀虫剂，(如化学杀虫剂、杀线虫剂、杀真菌剂、杀病毒剂、杀微生物剂、杀变形虫剂、杀虫剂等)，以及/或一种或多种有相同或不同杀虫活性或杀虫特异性的δ-内毒素多肽，正如本文所鉴定的杀虫多肽一样。也可以将杀虫多肽与其它处理方法如肥料(fertilizers)、除莠剂(weed killer)、抗冻剂(cryoprotectant)、表面活性剂(surfactant)、去污剂(detergent)、杀虫肥皂(insecticidal soap)、休眠喷洒油(dormant oil)、聚合物和/或时间释放制剂(time-release formulation)或生物降解载体制剂(biodegradble carrier)一起使用，时间释放制剂或生物降解载体制剂能使目标区域使用一次制剂后长期有剂量。同样可以将制剂制备成可食性“诱饵”，或者将制剂做成昆虫“陷阱”，能使靶昆虫进食或摄食杀虫制剂。

本发明中的杀虫组合物也可以单独地连续或同时用于环境位点，或者与一种或多种附加杀虫剂、农药、化学药品、肥料或其它化合物一起使用。2.6.6应用方法及其有效率

本发明中的杀虫组合物应用于靶昆虫环境时，向来都是施到所保护植物或作物的叶上，所用方法为常规方法，优选喷洒方式。依照对特定害虫的特异条件、所要处理的作物以及特定的环境条件去设置杀虫应用的强度和延续时间。有效成分与载体之间相应的比例取决于杀虫组合物的化学本质、溶解性和稳定性，以及所要采用的特定制剂。

其它应用技术，包括撒粉、喷洒、浸泡土壤、土壤灌注、种子包被、幼苗包被、叶面喷洒、通气、nisting、喷雾(atomizing)、薰烟aerosolizing等，也是可行的，可以要求在某些情况下使用，如当昆虫导致根或茎的侵袭时，或者应用于娇弱的植被或者修饰性植物时。对于本领域中的熟练技术人员来说，这些应用程序也是熟知的。

也可以将本发明中的杀虫组合物规划设计预防性或防治性地应用于某一地区，有时可以用于宠物、家畜、动物的寝具或者用于农场设备、谷仓、住所或农业设施或工业设施之中或周围，等等。

用于环境应用、系统应用、局部应用或叶面应用时，杀虫组合物的浓度将大大不同，这将取决于特定制剂、使用方法、环境条件以及杀虫活性的程度。生物杀虫剂组合物在所用制剂中的浓度一般是至少大约1％(按重量计)，最高并包括大约99％(按重量计)。多肽组合物的干制剂(dry formulation)中蛋白质组分的重量百分比可能从大约1％到大约99％或更高，而液体制剂(liquid formulation)中一般将包括有效成分从大约1％到大约99％或更高(按重量计)。因此，可以制备出多种多样的制剂，包括其杀虫多肽的重量百分比从大约5％到大约95％或更高的制剂，包括其杀虫多肽的重量百分比从大约10％到到约90％或更高的制剂。当然，包括杀虫多肽的重量百分比从大约15％到大约85％或更高的制剂、包括杀虫多肽的重量百分比从大约20％到大约80％或更高的制剂，也都考虑在本公开内容的范围之内。

就其中包括了包含杀虫多肽的完整细菌细胞的组合物而言，虽然某些实施方案中可能会用到包含大约从10²～10⁴细胞/毫克的制剂，或者当想要更浓的制剂时也有可能用到包含大约从10⁸至10¹⁰或10¹¹细胞/毫克的制剂，但是制剂中一般将包含大约从10⁴～10⁸细胞/毫克。此外，可以制备有效多肽相当于从10¹²～10¹³细胞/毫克的细胞团(cellpaste)、芽孢浓缩液(spore concentrate)或晶体蛋白悬浮液浓缩液，在应用之前可将这些浓缩液稀释。

以上所述杀虫制剂可以以所需一种或多种应用方式施给特定植物或目标区域，典型的每公顷大田应用率是其有效成分从大约50克/公顷～大约500克/公顷，或者可能使用从大约500克/公顷～大约1000克/公顷。有时，更想给目标区域施的杀虫制剂其施用率是有效成分从大约1000克/公顷～大约5000克/公顷。实际上，在使用这些杀虫制剂管理、防治并杀灭目标害虫时，所用在从每公顷大约50克有效多肽到大约10000克/公顷之间范围内的施用率都认为是有用的。因此，有效多肽大约100克/公顷、大约200克/公顷、大约300克/公顷、大约400克/公顷、大约500克/公顷、大约600克/公顷、大约700克/公顷、大约800克/公顷、大约900克/公顷、大约1千克/公顷、大约1.1千克/公顷、大约1.2千克/公顷、大约1.3千克/公顷、大约1.4千克/公顷、大约1.5千克/公顷、大约1.6千克/公顷、大约1.7千克/公顷、大约1.8千克/公顷、大约1.9千克/公顷、大约2.0千克/公顷、大约2.5千克/公顷、大约3.0千克/公顷、大约3.5千克/公顷、大约4.0千克/公顷、大约4.5千克/公顷大约6.0千克/公顷、大约7.0千克/公顷、大约8.0千克/公顷、大约8.5千克/公顷、大约9.0千克/公顷甚至最高并包括大约10.0千克/公顷或更高的应用率，可能会在本文以上所述杀虫制剂的某些农业应用、工业应用、以及家庭应用上使用。2.7表位核心序列(epitopic core sequences)

本发明也涉及不含总细胞及其它肽的蛋白质组合物或肽组合物，所包括的纯化肽中参入的表位，能与所公开多肽序列特异的一种或多种抗体发生免疫交叉反应。本发明尤其涉及来自于一种或多种本文所公开多肽的表位核心序列。

本文所用术语“参入能与公开多肽序列特异的一种或多种抗体发生免疫交叉反应的表位”指的是一种肽抗原或蛋白质抗原，它包括与位于所公开多肽中的表位相似的一级结构(primary structure)、二级结构(secondary structure)或三级结构(tertiary structure)。相似性水平的程度为：晶体蛋白或晶体多肽的单克隆抗体(monoclonalantibodies)或多克隆抗体(polyclonal antibodies)也与发生交叉反应的肽抗原或蛋白质抗原相结合、反应，或者识别。多种免疫测定方法可以与这些抗体一起使用，如蛋白质印迹法(Western blotting)、ELISA、RIA等，本领域中的熟练技术人员对所有这些方法是熟知的。

适用于疫苗使用的鉴定免疫显性表位(immunodominant epitopes)及/或其功能相当体的方法，是件非常简单的事情。例如，可以使用美国专利4554101中所教的Hopp方法(在此引入作为参考)，该方法教我们在亲水性基础上从氨基酸序列确定并制备表位。其它几篇论文中所述该方法，以及在此基础上的软件程序，也都可以用来鉴定表位核心序列(如，可参考：Jameson和Wolf，1988；Wolf等，1988；美国专利4554101)。通过使用肽合成技术或重组技术，就可以很容易地将这些“表位核心序列”的氨基酸合并到肽中。

本发明的优选肽在使用时一般其长度在大约8个到大约20个氨基酸，更优选的长度为大约8个到大约15个氨基酸。我们认为，来自抗原晶体蛋白的较短肽有时会提供优点，如在免疫检测分析时。典型的优点包括易于制备和纯化、相对低的成本和生产的重复性提高，以及有利的生物分配(biodistribution)。

我们认为，通过制备包括修饰的和/或增长的表位/免疫原性核心序列的合成肽，就可以认识到本发明的特定优点，修饰的和/或增长的表位/免疫原性核心序列将产生出针对晶体蛋白和相关序列的“通用”表位肽。本文对这些表位核心序列的特定方面如特定多肽抗原的亲水区(hydrophilic region)进行了鉴定。我们认为，这些区域所代表的区域很可能启动T-细胞激活(T-cell stimulaion)或B-细胞激活(B-cell stimulation)，所以就能刺激特异抗体的产生。

本文所用的表位核心序列是相当短的一段氨基酸，这段氨基酸与本文所公开晶体蛋白抗体上的抗原结合位点“互补”，并因此之结合。此外或除此之外，表位核心序列将刺激能与针对本发明多肽组分发生交叉反应的抗体的产生。不难理解的是，本公开内容中的术语“互补的”是指氨基酸或肽之间彼此有吸引力。所以，本发明中的某些表位核心序列在谈到其与对应蛋白质的抗血清竞争结合想要蛋白质抗原或可能替代想要蛋白质抗原时，就能进行很好地定义了。

一般而言，并不认为多肽抗原的大小有多关键，只要其至少足够大携带了鉴定的核心序列或序列即可。本公开内容所期望的最小的有用核心序列其长度一般为8个氨基酸，序列更优选的长度是10到20个。因此，此大小与本发明所制备最小的肽抗原大致上相当。然而，如果需要的话，抗原的大小可以更大些，只要其包含基本的表位核心序列即可。

表位核心序列的鉴定方法对于本领域中的熟练技术人员来说是熟知的，例如，正如美国专利4554101(在此引入作为参考)所述，该专利教给我们如何在亲水性基础上从氨基酸序列确定表位并制备表位。此外，可以使用许多计算机程序去预测蛋白质的抗原部分(参照：Jameson和Wolf，1998；Wolf等，1988)。计算机化肽序列分析程序(如DNAStar软件，DNAStar公司，Madison，WI)也可能在设计与本公开内容一致的合成肽时是有用的。

使用常规合成技术(conventional synthetic techniques)如固相方法(solid phase method)(例如，可以使用可商购的肽合成仪如Applied Biosystems Model 430A肽合成仪)，很容易完成表位序列或者序列中包括抗原表位的肽的合成工作。随后可以将用此方式合成出来的肽抗原按预定量进行等份分装，并以常规方式储存，如以水溶液储存，甚或更优选以粉末或以低压冻干状态储存直到使用时为止。

一般而言，考虑到肽的相对稳定性，可以将它们在水溶液中储存上相当长的时间，如，在实际任何水溶液中储存6个月或更长时间并不会有什么降解或抗原活性有所丧失。然而，当需要更长时间在水中储存时，包括试剂如包括缓冲液如Tris缓冲液或磷酸缓冲液以保持约pH7.0～7.5将为可取。此外，可取的是包括能抑制微生物生长的试剂，如叠氮化钠或硫柳汞。为长时间以水的状态储存，可取的是大约4℃储存溶液或更优选冷冻。当然，当肽以低压冻干状态或干粉状态储存时，它们实际上可以无限期地储存，例如可以以等份分装形式储存，使用之前可以用预定量的水(优选蒸馏水)或缓冲液重新水化。2.8定义

下面词语及短语有以下所列意思。

表达(expression)：胞内过程的组合，包括由编码DNA分子如结构基因经过转录和翻译产生多肽。

多能的(pluripotent)：该术语用于描述发育的可塑性(developmental plasticity)。一个多能细胞能够分化成许多不同细胞类型及谱系。例如，骨髓中的干细胞能产生出许多不同循环血细胞系。这和已分化的细胞不同，分化的细胞一般归属于特定的分化途径。

启动子：DNA序列上的识别位点或一组DNA序列，为结构基因提供表达调控元件，RNA聚合酶特异地与之结合并起始该基因的RNA合成(转录)。

再生：从植物细胞(如植物原生质体或外植体)长成植物的过程。

结构基因：能表达产生多肽的基因。

转化：将外源DNA序列(如载体、重组DNA分子)导入到细胞或原生质体中的过程，在细胞或原生质体中外源DNA能整合到染色体中或能够进行自主复制(autonomous replication)。

转化细胞：由于外源DNA分子的导入细胞，DNA发生改变了后的细胞。

转基因细胞：任何来自或再生自转化细胞的细胞或者来自转基因细胞的细胞。典型的转基因细胞包括来自转化植物细胞的植物愈伤组织，以及来自转基因植物的特定细胞，如叶细胞、根细胞、茎细胞，如体细胞或生殖细胞。

转基因植物：任何一代来自于转化植物细胞或转化原生质体的植物的植物或后代，其中植物核酸包括在原来同一品系中天然非转基因植物中并不存在的外源选定的核酸序列区段。本领域中有时用术语“转基因植物”和“转化植物”作为定义其DNA中包括外源DNA分子的植物的同义词。但是，更为科学正确的想法是，转基因植物是指从转基因植物细胞或转基因原生质体或从转化多能植物细胞等到的再生植物或愈伤组织。本发明中的转基因植物优选包括的植物中包括编码杀虫多肽的至少第一种选定的多核苷酸。所选定的多核苷酸优选为至少与第一个启动子相连的δ-内毒素编码区(或基因)，在转基因植物中启动子表达编码区产生杀虫多肽。本发明中产生所编码多肽的转基因植物优选展示对靶害虫抗性增强的表型。这些转基因植物和它们的后代、子代以及任何一代的种子优选为抗虫植物。

载体：能在寄主细胞中复制的核酸分子和/或其它核酸区段能与之进行可操作性连接能使连接上的片段进行复制。质粒、噬菌体、噬菌粒和粘粒都是典型的载体。许多实施方案中，使用载体作为媒介物将一种或多种所选定的多核苷酸导入到寄主细胞中去，以此产生“转化”寄主细胞或“重组”寄主细胞。

3.0附图简述

图画是本详述的一部分内容，并用于进一步说明本发明的某些方面。同时参考一个或多个图画和本文中特定实施方案的详述部分，就能对本发明有更好的理解。

图1 pEG1337的限制性酶切图谱

图2 pEG1921的限制性酶切图谱

图3 来自EG11658、EG12156和EG1215的C2培养物芽孢-晶体悬浮液的SDS-PAGE分析。用75μl无菌水稀释25微升(μl)悬液，并为如实施例11中所述的电泳做准备。在15％丙烯酰胺凝胶上每个泳道上样10微升。其中包括牛血清白蛋白质(BSA)的系列稀释液作为标准物。泳道1-3，为EG11658；泳道4-6，为EG12156；泳道7-8，为EG12158。M＝分子量标准(Sigma M-0671)，单位为千道尔顿。对应于CryET76、CryET80和CryET84的条带由箭头标示出来。

4.0实施方案的解释说明4.1本发明的一些优点

本发明提供对昆虫如WCRW、SCRW和CPB有高度毒杀作用的新的δ-内毒素。这些蛋白质的氨基酸序列与对双翅目或鞘翅目有毒杀作用的其它δ-内毒素的关系遥远。在在苏云金芽孢杆菌晶体蛋白命名法(Crickmore等，1998)所建立的指导方针的基础上，这些多肽中的其中两个，称为CryET76和CryET80，代表一个亚类对鞘翅目有效的杀虫晶体蛋白。4.2害虫

几乎所有的大田作物、植物以及商业耕作区对一种或多种害虫的攻击都很敏感。表1中所鉴定的鳞翅目害虫和鞘翅目害虫问题尤为严重。例如，蔬菜作物和凉菜作物如菊芋、球茎甘蓝、芝麻菜、韭菜、芦笋、扁豆、菜豆、莴苣(如头、叶、romaine)、甜菜、bok choy、暗绿叶黄体芋、嫩茎花椰菜、甜瓜(如香瓜、西瓜、crenshaw、甜味烟草、甜瓜)、球子甘蓝、甘蓝、cardoni、胡萝卜、萝卜、花椰菜、秋葵、洋葱、芹菜、荷兰芹、鸡豆、防风草、菊苣、豌豆、中国甘蓝、辣椒、羽衣甘蓝、马铃薯、黄瓜、西葫芦、葫芦、小萝卜、干球洋葱、芜菁甘蓝、茄子、波罗门参、escarole、青葱、菊莴苣、大豆、大蒜、菠菜、绿葱、瓜类、青菜、甜菜、红薯、萝卜、莙荙菜、马萝卜、番茄、甘蓝、芜菁以及其它许多品种，对一种或多种下面的害虫的侵袭是敏感的：alfalfa looper、粘虫、甜菜粘虫、artichoke plume moth、cabbage budworm、粉纹夜蛾、玉米穗虫、芹菜叶虫、cross-stripedcabbageworm、欧洲玉米螟、diamondback moth、三叶草绿虫、importedcabbageworm、melonworm、omnivorous leafroller、pickleworm、rindworm complex、saltmarsh caterpillar、大豆夜蛾、tobaccobudworm、tomato fruitworm、tomato hornworm、tomato pinworm、藜豆认蛾以及yellowstriped armyworm。

同样，牧场作物和干草作物如苜蓿、牧草和青贮饲料经常受到害虫如粘虫、beef armyworm、alfalfa caterpillar、European skipper、多种looper和结网毛虫以及yellowstriped armyworm的进攻。

水果和藤类作物如苹果、杏、樱桃、油桃、桃子、梨、梅、李脯、杏仁、栗子、榛子、薄壳山胡桃、开心果、核桃、柑橘、黑莓、葡萄、鳄梨、香蕉、kiwi、柿子、石榴、菠萝、热带水果，通常对achema aphinxmoth、amorbia、粘虫、citrus cutworm、banana skipper、blackheadedfireworm、bluebberry leafroller、尺蠖幼虫、cherry fruitworm、filbert leafroller、filbert webworm、fruit tree leafroller、grapeberry moth、grape leaffolder、grapeleaf skeletonizer、greenfruitworm、gummosos-batrachedra commosae、gypsy moth、hickoryshuckworm、hornworms、loopers、navel orangeworm、obliquebandedleafrooler、omnivorous leafroller、omnivorous looper、orangetortrix、orangedog、oriental fruit moth、pandemis leafroller、peach twig borer、pecan nut casebearer、redbanded leafroller、红疣天社蛾、roughskinned cutworm、盐沼毛虫、尺蠖、帐篷毛虫、thecla-thecla baillides、烟草蚜虫、tortrix moth、tufted applebudworm、variegated leafrooler、胡桃木毛虫、western tentcaterpillar以及yellowstripped armyworm的进攻和脱叶是敏感的。

大田作物如油菜籽、月见草、meadow foam、玉米(大田里的、甜的、爆米花)、棉花、蛇麻草、jojoba、花生、水稻、红花、谷物(大麦、燕麦、黑麦、小麦等)、高粱、大豆、向日葵以及烟草通常是昆虫包括粘虫、亚洲玉米螟和其它玉米螟、banded sunflower moth、甜菜粘虫、棉铃虫、cabbage looper、玉米根虫(包括南方变种和西方变种)、cotton leaf perforator、diamondback moth、欧洲玉米螟、greenclverworm、headmoth、headworm、imported cabbageworm、loopers(包括Anacamptodes spp.)、obilquebanded leafrooler、omnivorousleaftier、podworm、saltmarsh caterpillar、南方玉米螟、soybeanlooper、spotted cutworm、向日葵蛾、tobacco budworm、烟草天蛾幼虫、藜豆认蛾等侵袭的目标。

寝具植物(bedding plant)、花、修饰性植物、蔬菜和容器原种经常被害虫寄主如粘虫、杜鹃花蛾、beet armyworm、diamondback moth、ello moth(hornworm)、佛罗里达蕨毛虫、Io moth、loopers、夹竹桃蛾、omnivorous leafroller、omnivorous looper和烟草蚜虫等食用。

森林、水果、修饰性树木及结实树木，以及其它苗木通常对多种昆虫如避债虫、blackheaded budworm、browntail moth、加里弗尼亚橡树虫、douglas fir tussock moth、elm spanworm、fall webworm、fruittree leafroller、greenstripped mapleworm、gypsy moth、jackpine budworm、mimosa webworm、pine butterfly、红疣天社蛾、saddleback caterpillar、saddle prominent caterpillar、spring andfall cankerworm、云松蚜虫、tent caterpillar、卷叶蛾及westerntussock moth的攻击敏感。同样，草坪草经常受到害虫如粘虫、sodwebworm及tropical sod webworm的攻击。

表1

原鞘亚目和多食亚目鞘翅目害虫的分类下目总科科亚科族属种

Cupedidae Priacma P.serrata

(reticulated beetles)

皮蠹科毛皮蠹属二星毛皮蠹Bostrichiformia Dermestidae (skin Attagenus A.pelllo

and larder beetles)

天牛科(长角甲虫)Chrysomeliformia Cerambycidae(long- Agapanthia Agapanthia sp.

horned beetles)

花天牛亚科

Lepturinae Leptura Leptura sp.(flower long-horned

beetle)

Rhagium Rhagium sp.

缢虎天牛属刺槐天牛

Megacyllene M.robiniae

锯天牛亚科

Prioninae Derobrachus D.geminatus

Tetraopes T.tropthalmus

叶甲科

Chrysomelidae(leaf Chlamisinae Exema E.neglecta

beetles)

叶甲科

Chrysomelinae Chrysomelini Chrysomela C.tremula， Chrysomela sp.下目总科科亚科族属种

Oreina O.cacaliae

Doryphorini Chrysoline Chrysolina sp.

Leptinotarsa L.decemlineata (Cotorado

potato beetle)

Gonioctenini Gonioctena G.fornicata，G.holdausi，G.

intermedia，G.interposita.G

kamikawai，G.linnaeana，G.

nigroplagiata，G.occidentalis，

G.olivacea，G.pallida，G.

quin-quepunctata，G.

rubripennis，G.rufipes，G.

tredecim-maculata，G.

variabilis，G.viminalis

Timarchini Timarcha Timarcha sp.

Criocerinae Oulema Oulema sp.

Galerucinae Galerucini Monoxia M.inornata，Monoxia sp.

Ophraella O.arctica，O.artemisiae，O.

bilineata，O.communa，O.

conferta，O.cribrata，O.notata，

O.notulata，O.nuda，O.pilosa，

O.sexvittata，O.slobodkini

Luperini Cerotoma C.trifurcata下目总科科亚科族属种

Diabrotica D.barberi(northern corn

rootworm)，D.

undecimpunctata，(southem

corn rootworm)，D.virgifera

(western corn rootworm)

未分类 Lachnaia Lachnaia sp.

Chrysomelidae

Epitrix E.cucumeris(Harris)(potato

flea

beetle)，E.fuscala(eggplant

flea beetle)

象虫科象虫亚科花象属墨西哥棉玲象

Curculionidae Curculioninae Anthonomus A.grandis(boll weevil)

(weevils)

Entiminae Naupactini Aramigus A.conirostris，A.globoculus，A.

intermedius，A.planioculus，A.

tesselatus

Otiorhynchus Otiorhynchus sp.

Phyllobiini Diaprepes D.abbreviata

Phyllobius Phyllobius sp.

Galapaganus G.galapagoensis下目总科科亚科族属种

叶象属

Hyperinae Hypera H.brunneipennis(Egyptian

alfalfa weevil)，H.postica

(alfalfa weevil)，H.punctata

(clover leaf weevil)

木蠹象属

Molytinae Pissodes P.affinis，P.nemorensis，P.

schwarzi，P.strobi，P.

terminalis

未象属

Rhynchophorinae Sitophilini Sitophilus S.granarius(granary weevil)，

S.zeamais(maize weevil)

Nemonychidae Lebanorhinus L.succinus

Scolytidae Ips I.acuminatus，I.amitinus，I.

cembrae，I.duplicatus，I.

mannsfeldi，I.sexdentatus，I.

typographus

瘤小蠹属

Orthotomicus O.erosus

Tomicus T.minorCucujiformia Coccinellidae Epilachna E.borealis(squash ladybird

(ladybird beetles) beetle)，E.varivstis(Mexican

bean beetle)

扁谷盗属

Cucujidae(flat bark Cryptolestes C.ferrugineus

beetles)下目总科科亚科族属种

Oryzaephilus O.surinamensis(saw-toothed

(grain beetles) grain beetle)

Lagriidae (long- Lagria Lagria sp.

joined beetles)

豆芫菁属

Meloidae (blister Epicauta E.funebris

beetles)

Meloe M.proscarabaeus

Rhipiphoridae Rhipiphorus R.fasciatus

粉虫属

Tenebrionidae Alphitobius A.diaperinus

(darkling ground

beetles) (lesser mealworm)

Hegeter H.amaroides，H.brevicollis，H.

costipennis，H.fernandezi，H.

glaber，H.gomerensis，H.gran-

canariensis，H.impressus，H.

intercedens，H.lateralis，H.

plicifrons，H.politus，H.

subrotundatus，H.tenui-

punctatus，H.transversus，

H.webbianus

Misolampus M.goudoti下目总科科亚科族属种

Palorus P.ficicola，P.ratzeburgi

粉盗属 (small-eyed flour beetle)，P.

subdepressus(depressed flour

beetle)

Pimelia P.baetica，P.canariensis，P.

criba，P.elevata，P.estevezi.P.

fernan-dezlopezi，P.grandis，P.

granulicollis，P.integra，P.

interjecta，P.laevigata，P.

lutaria，P.radula，P.sparsa，P.

variolosa

粉虫属

Tenebrio T.molitor(yellow mealworm)，

T.obscurus(dark mealworm)

Tentyria T.schaumi

拟谷盗属

Tribolium T.brevicornis，T.castaneum

(red flour beetle)，T.confusum

(confused flour beetle)，T.

freemani，T.madens

Zophobas Z.atratus

Z.rugipesElateriformia Elateroi Octinodes Octinodes sp.

dea下目总科科亚科族属种

Pyrophorus P.plagio-phthalamusScarabaeiformia Lucanidae (Stag Dorcus D.parallelo-pipedus

beetles)

Lucanus L.cervus

独角仙属独角仙

Scarabaeidae Allomyrina A.dichotoma

(lamellicorn beetles)

Cetoniinae(flower Pachnoda P.marginata

beetle)

Dynastinae Xyloryctes X.faunus

Geotrupinae Geotrupes G.stercorosus

(earth-boring dung

beetles)

Melonlonthinae Costelytra C.ealandica

(chafers)

Holotrichia H.diomphalia

鳃金龟属五月金龟子

Melolontha M.melolontha(cockchafer)

Odontria O.striata

O.variegata下目总科科亚科族属种

Prodontria P.bicolorata，P.capito.P.

lewisi，P.tarsis，P.modesta，P.

pinguis，P.praelatella，P.

truncata，Prodontria sp.

Scythrodes S.squalidus

Rutelinae(shining Popillia P.japonica(Japanese beetle)

leaf chafers)

Scarabaeinae Copris C.lunaris(black dung beetle)

Scarabaeus Scarabaeus sp.(scarab)Staphyliniformia Hydrophilidae Cercyon Cercyon sp.

Silphidae Nicrophorus N.americanus，N.marginatus，

N.orbicollis，N.tomentosus

Staphylinidae(rove Carpelimus Carpelimus sp.

beetles)

Quedius Q.mesomelinus

Tachyporus Tachyporus sp.

Xantholinus Xantholinus sp.4.3苏云金芽孢杆菌δ-内毒素的命名方法

表2包含的是已知δ-内毒素的传统命名法和目前认定命名法的一览表。表中同时给出已测序多肽和多核苷酸的GenBank登录号。

表2

已知苏云金芽孢杆菌δ-内毒素的命名A

现在过去 GenBank登录号

Cry1Aa1 CryIA(a) M11250

Cry1Aa2 CryIA(a) M10917

Cry1Aa3 CryIA(a) D00348

Cry1Aa4 CryIA(a) X13535

Cry1Aa5 CryIA(a) D175182

Cry1Aa6 CryIA(a) U43605

Cry1Aa7 AF081790

Cry1Aa8 I26149

Cry1Aa9 AB026261

Cry1Ab1 CryIA(b) M13898

Cry1Ab2 CryIA(b) M12661

Cry1Ab3 CryIA(b) M15271

Cry1Ab4 CryIA(b) D00117

Cry1Ab5 CryIA(b) X04698

Cry1Ab6 CryIA(b) M37263

Cry1Ab7 CryIA(b) X13233

Cry1Ab8 CryIA(b) M16463

Cry1Ab9 CryIA(b) X54939

Cry1Ab10 CryIA(b) A29125

Cry1Ab11 I12419

Cry1Ab12 AF057670

Cy1Ac1 CryIA(c) M11068 现在过去 GenBank登录号Cry1Ac2 CryIA(c) M35524Cry1Ac3 CryIA(c) X54159Cry1Ac4 CryIA(c) M73249Cry1Ac5 CryIA(c) M73248Cry1Ac6 CryIA(c) U43606Cry1Ac7 CryIA(c) U87793Cry1Ac8 CryIA(c) U87397Cry1Ac9 CryIA(c) U89872Cry1Ac10 CryIA(c) AJ002514Cry1Ac11 AJ130970Cry1Ac12 I12418Cry1Ad1 CryIA(d) M73250Cry1Ad2 A27531Cry1Ae1 CryIA(e) M65252Cry1Af1 U82003Cry1Ag1 AF081248Cry1Ba1 CryIB X06711Cry1Ba2 X95704Cry1Bb1 ET5 L32020Cry1Bc1 CryIb(c) Z46442Cry1Bd1 CryE1 U70726Cry1Ca1 CryIC X07518Cry1Ca2 CryIC X13620Cry1Ca3 CryIC M73251Cry1Ca4 CryIC A27642Cry1Ca5 CryIC X96682Cry1Ca6 CryIC X96683Cry1Ca7 CryIC X96684现在过去 GenBank登录号Cry1Cb1 CryIC(b) M97880Cry1Da1 CryID X54160Cry1Da2 I76415Cry1Db1 PrtB Z22511Cry1Ea1 CryIE X53985Cry1Ea2 CryIE X56144Cry1Ea3 CryIE M73252Cry1Ea4 U94323Cry1Ea5 A15535Cry1Eb1 CryIE(b) M73253Cry1Fa1 CryIF M63897Cry1Fa2 CryIF M63897Cry1Fb1 PrtD Z22512Cry1Fb2 Z22512Cry1Fb3 AF062350Cry1Fb4 I73895Cry1Ga1 PrtA Z22510Cry1Ga2 CryIM Y09326Cry1Gb1 CryH2 U70725Cry1Ha1 PrtC Z22513Cry1Hb1 U35780Cry1Ia1 CryV X62821Cry1Ia2 CryV M98544Cry1Ia3 CryV L36338Cry1Ia4 CryV L49391Cry1Ia5 CryV Y08920Cry1Ia6 AF076953Cry1Ib1 CryV U07642 现在过去 GenBank登录号Cry1Ic1 AF056933Cry1Ja1 ET4 L32019Cry1Jb1 ET1 U31527Cry1Jc1 AF056933Cry1Ka1 U28801Cry2Aa1 CryIIA M31738Cry2Aa2 CryIIA M23723Cry2Aa3 D86084Cry2Aa4 AF047038Cry2Aa5 AJ132464Cry2Aa6 AJ1324635Cry2Aa7 AJ132463Cry2Ab1 CryIIB M23724Cry2Ab2 CryIIB X55416Cry2Ac1 CryIIC X57252Cry3Aa1 CryIIIA M22472Cry3Aa2 CryIIIA J02978Cry3Aa3 CryIIIA Y00420Cry3Aa4 CryIIIA M30503Cry3Aa5 CryIIIA M37207Cry3Aa6 CryIIIA U10985Cry3Aa7 AJ237900Cry3Ba1 CryIIIB X17123Cry3Ba2 CryIIIB A07234Cry3Bb1 CryIIIB2 M89794Cry3Bb2 CryIIIC(b) U31633Cry3Bb3 I15475Cry3Ca1 CryIIID X59797现在过去 GenBank登录号Cry4Aa1 CryIVA Y00423Cry4Aa2 CryIVA D00248Cry4Ba1 CryIVB X07423Cry4Ba2 CryIVB X07082Cry4Ba3 CryIVB M20242Cry4Ba4 CryIVB D00247Cry5Aa1 CryVA(a) L07025Cry5Ab1 CryVA(b) L07026Cry5Ac1 I34543Cry5Ba1 PS86Q3 U19725Cry6Aa1 CryVIA L07022Cry6Ba1 CryVIB L07024Cry7Aa1 CryIIIC M64478Cry7Ab1 CryIIICb U04367Cry7Ab2 U04368Cry8Aa1 CryIIIE U04364Cry8Ba1 U04365Cry8Cal U04366Cry8Ba1 CryIIIG U04365Cry8Ca1 CryIIF U04366Cry9Aa1 CryIG X58120Cry9Aa2 CryIG X58534Cry9Ba1 CryIX X75019Cry9Ca1 CryIH Z37527Cry9Da1 N141 D85560Cry9Da2 AF042733Cry9Ea1Cry10Aa1 CryIVC M12662现在过去 GenBank登录号Cry10Aa2 E00614Cry11Aa1 CryIVD M31737Cry11Aa2 CryIVD M22860Cry11Ba1 Jeg80 X86902Cry11Bb1 AF017416Cry12Aa1 CryVB L07027Cry13Aa1 CryVC L07023Cry14Aal CryVD U13955Cry15Aal 34kDa M76442Cry16Aa1 cbm71 X94146Cry17Aa1 cbm71 X99478Cry18Aa1 CryBP1 X99049Cry19Aal Jeg65 Y08920Cry20Aa1 U82518Cry21Aa1 I32932Cry22Aa1 I34547Cry23Aa1 AF03048Cry24Aa1 U88188Cry25Aa1 U88189Cry26Aa1 AF122897Cry27Aa1 AB023293Cry28Aa1 AF132928Cyt1Aa1 Cyry X03182Cyt1Aa2 CytA X04338Cyt1Aa3 Cyry Y00135Cyt1Aa4 CytA M35968Cyt1Ab1 CytM X98793Cyt1Ba1 U37196现在过去 GenBank登录号Cyt2Aa1 CytB Z14147Cyt2Ba1 “CytB” U52043Cyt2Ba2 “CytB” AF020789Cyt2Ba3 “CytB” AF022884Cyt2Ba4 “CytB” AF022885Cyt2Ba5 “CytB” AF022886Cyt2Ba6 AF034926Cyt2Bb1 U82519Cyt2Bb1 U82519^a摘自：http：//epunix.biols.susx.ac.uk/Home/Neil-Crickmore/Bt/toxins.html(1999年4月27日的)4.4探针和模板

另一方面，本发明所提供的DNA序列信息考虑到相当短的DNA(或RNA)序列的制备方法，这些序列能与本文所公开的选择序列的基因序列特异杂交。在这些方面，适当长度的核酸探针是在考虑所选编码晶体蛋白的基因序列如本文所公开的某一序列的基础上制备的。这些DNA和核酸探针能够与编码晶体蛋白的基因序列特异杂交，使得它们在多个实施方案中有特定的应用。最为重要的是，这些探针可以用在用于检测指定样品中是否存在互补序列的多种分析方法当中。

在某些实施方案中使用寡核苷酸引物是有利的。用本发明中的多核苷酸涉及这些引物序列，使用PCR^TM技术从苏云金芽孢杆菌中检测、扩增或突变晶体蛋白基因的已知区段。使用这些引物通过PCR^TM也可以扩增出其它种中相关晶体蛋白基因的区段。

提供与本发明一致的某些优点，用于杂交研究或鉴定的优选核酸序列中包括那些与至少大约23到大约40个核苷酸长度的晶体编码序列互补的序列，如本文所示。大小至少大约为14个或15个核苷酸长度的序列可以确保是能形成既稳定又有选择性的双链分子的足够长度的片段。虽然有时为了增强杂交体的稳定性和选择性需要提高所得杂交分子的质量和程度，但是互补序列长度大于约23个碱基的分子通常优选。我们通常喜欢设计基因互补片段大约为14个到大约20个核苷酸的核酸分子，有时需要的互补片段更长。可以轻而易举地制备出这些片段，例如可以通过化学方式应用核酸扩增技术如美国专利4683195和4683202(在此特别引入作为参考)中的PCR^TM技术直接合成，或者可以从包含合适插入片段和合适限制位点的重组质粒中将所选DNA片段切除下来。4.5表达载体

本发明涉及包括在一个或多个表达载体中本发明中的多核苷酸。因此，在一个实施方案中表达载体包括的核酸区段包括与表达该基因的启动子可操作性连接的晶体蛋白编码基因。此外，编码区也可能与转录终止区(transcription-terminating region)可操作性地相连接，由此启动子驱动编码区的转录而转录终止区在编码区的某一3’点处终止转录。

本文所用术语“可操作性连接”意思是，启动子与编码区以这样一种方式向连，编码区的转录受到启动子的控制和调节。在本领域中将启动子与编码区进行可操作性连接的方法是熟知的。

在优选实施方案中，编码本发明中晶体蛋白的DNA的重组表达较适合在芽孢杆菌(Bacillis)寄主细胞中进行。优选的寄主细胞包括苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensis)、B.megaterium、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)及相关杆菌，其中苏云金芽孢杆菌高度优选。在细菌中有功能的启动子在本领域中是众所周知的。来自芽孢杆菌的晶体蛋白的典型并优选的启动子包括任何已知晶体蛋白基因的启动子，包括cry基因的启动子。此外，可以通过人工方法改造出诱变处理启动子或重组启动子，用于启动本文所公开的新基因区段的表达。

在某一实施方案中，用转化的革兰氏阴性细菌如大肠杆菌(E.coli)寄主细胞或假单胞杆菌(Pseudomonas spp.)寄主细胞重组表达编码本发明晶体蛋白的DNA。在大肠杆菌寄主细胞或其它革兰氏阴性寄主细胞中能行使功能高水平表达目标蛋白质的启动子在本领域中是众所周知的。

在用本发明中的表达载体转化植物时，选择能在植物中驱动表达的启动子。植物中有功能的启动子在本领域中使众所周知的。在植物中表达多肽的启动子中有用的是所述可诱导的、病毒的、组成型的启动子(Poszkowski等，1989；Odell等，1985)，以及受温度调节的、受空间调节的和受时空调节的启动子(Chau等，1989)。

选择启动子是因为它能够给编码区指导转化的植物细胞或转基因植物的转录活性。在植物组织中结构基因可以由多种启动子驱动。启动子可以是近组成型的(near-constitutive)如CaMV 35S启动子，或者是影响双子叶植物或单子叶植物的组织特异性启动子(tissue-specific promoter)或发育特异性启动子(developmentally specificpromoter)。

谈到近组成型的启动子如CaMV 35S时，在多种转化植物组织(如，愈伤组织、叶片、种子和根)中发现其增强了多肽的表达。此外，通过使用包含组织特异性启动子的植物整合载体，可以将转化效果指向特定的植物组织。

典型的组织特异性启动子是凝集素启动子，为种子组织特异性的。大豆种子中凝集素蛋白质由单基因(Le1)编码，该基因只有在种子成熟过程中表达，占种子总mRNA的大约2％到大约5％。凝集素基因和种子特异性启动子的特性都已完全分析清楚，在转基因烟草植物中用它们指导了种子特异性表达(Vodkin等，1983；Lindstrom等，1990)。

将包含编码感兴趣多肽的编码区的表达载体改造后使之位于凝集素启动子控制之下，用例如原生质体转化方法(protoplasttransformation method)(Dhir等，1991a)将该载体导入到植物中。在转基因植物的种子中特异指导多肽的表达。

将从用组织特异性启动子转化的植物细胞产生出的本发明中的转基因植物，与从用不同组织特异性启动子转化的植物细胞发育出的第二种转基因植物杂交，产生出的转基因植物显示出在多于一种特定组织中有表达结果。

典型的组织特异性启动子为玉米蔗糖合成酶1启动子(Yang等，1990)、玉米乙醇脱氢酶1启动子(Vogel等，1989)、玉米集光复合体启动子(Simpson等，1986)、玉米热激蛋白质启动子(Odell等，1985)、豌豆小亚基RuBP羧化酶启动子(Poulsen等，1986；Cashmore等，1983)、Ti质粒甘露氨酸合酶启动子(Langridge等，1989)、Ti质粒胭脂碱合酶启动子(Langridge等，1989)、矮牵牛查尔酮异构酶启动子(Van Tunen等，1988)、菜豆富甘氨酸蛋白质1启动子(Keller等，1989)、CaMV 35S转录本启动子(Odell等，1985)以及马铃薯patatin的启动子(Wenzler等，1989)。优选的启动子为花椰菜花叶病毒(CaMV 35S)启动子以及S-E9小亚基RuBP羧化酶启动子。

选择哪一个表达载体以及最终选择哪一个启动子与多肽编码区进行可操作性连接直接取决于所想要的功能特性如蛋白质表达的定位和定时以及所要转化的寄主细胞。这些在构建重组DNA分子领域中均是熟知的固有限制因素。然而，在实践本发明中有用的载体能够指导与之进行可操作性连接的多肽编码区的表达。

在高等植物中进行基因表达时有用的典型载体在本领域中是熟知的，包括来自于所述根癌农杆菌根癌诱导(Ti)质粒的载体(Rogers等，1987)。但是，已知其它几个植物整合载体能在植物中行使功能包括所述的pCaMVCN转移控制载体(Fromm等，1985)。PCaMVCN(可以从Pharmacia，Piscataway，NJ得到)包括花椰菜花叶病毒CaMV 35S启动子。

在优选实施方案中，用于表达多肽的载体包括在植物细胞中有效的选择标记，优选为抗药性选择标记(drug resistance selectionmarker)。其中一个优选的抗药性标记是其基因的表达能产生卡那霉素抗性的基因，即包括所述胭脂碱合酶启动子、Tn5新霉素磷酸转移酶II(nptII)以及胭脂碱合酶3’端非翻译区(Rogers等，1988)在内的嵌合基因。

RNA聚合酶转录编码DNA序列将通过存在聚腺苷酸化的位点。通常情况下，位于聚腺苷酸化位点下游几百碱基对处的DNA序列负责终止转录。这些DNA序列在本文中指的是转录终止区。转录出的信使RNA(mRNA)进行高效的聚腺苷酸化需要这些区段。

在本领域中表达载体的制备方法是众所周知的。在美国专利号4971908、4940835、4769061和4757011中对用于转化植物的表达(转化载体)以及这些载体的制作方法进行了描述，这些专利的公开内容在此特别引入作为参考。将这些载体进行修饰后可以包括与本发明一致的编码区。

已经发展出种种方法可以通过互补粘性末端或平头末端将DNA区段可操作性地插入到载体中。例如，可以将互补同聚物序列加入到将要插入的DNA区段中以及载体DNA中。随后通过同聚核苷酸尾之间的氢键将载体区段和DNA区段结合在一起，形成重组DNA分子。

编码有能力赋予细胞抗虫活性的多肽的编码区优选为苏云金芽孢杆菌晶体蛋白编码基因。在优选的实施方案中，此多肽有本文所公开序列之一的氨基酸残基序列或者为其功能相当体。与这些实施方案一致，包括这样序列的DNA序列的编码区同样优选。4.8新蛋白质的命名方法

发明者给本发明中的新的蛋白质随意指派了名称。同样，也给编码这些多肽的新的核酸序列指派了任意的基因名称。在晶体蛋白内毒素修正后的命名基础上将由苏云金芽孢杆菌命名委员会给基因和蛋白质名称指派正式名称，以便对苏云金芽孢杆菌晶体蛋白进行系统分类。发明者认为，本发明中任意指派的名称将由指派给这些序列的正式命名所取代。4.9转化寄主细胞和转基因植物

用一种或多种包括晶体蛋白编码基因的表达载体转化细菌、酵母细胞、植物细胞或完整植物的方法和组成，也是本公开内容的方面。由这些转化过程所得的转基因细菌、转基因酵母细胞、转基因植物细胞以及转基因植物或来自这样的转基因植物的后代和种子，也是本发明的实施方案。

在本领域中，转化细菌细胞和酵母细胞的方法是众所周知的。转化方法一般与用于转化其它细菌或酵母如大肠杆菌(E.coli)或Saccharomyces cerevisiae的已知方法相类似。用DNA转化植物细胞的方法包括农杆菌介导的植物转化方法(Agrobacterium-mediatedplant transformation)、原生质体转化方法(protoplasttransformation)、基因向花粉中的转移(gene transfer into pollen)、基因向生殖器官中的注射(injection into reproductive organs)、基因向未成熟胚中的注射(injection into immature embryos)以及粒子轰击(particle bombardment)。这些方法中的每一种方法各有优缺点。因此，向某一特定植物品系中导入基因的特定方法对于另一种植物品系来说并不是最为有效的，但是我们已经指导对于某一特定植物品系那些方法是有用的。

将转化的DNA区段导入细胞中有许多方法，但并不是所用方法都适合于向植物细胞中送递DNA。我们认为合适的方法实际上包括可以将DNA导入到细胞中的任何方法，如通过农杆菌侵染，DNA的直接送递如，例如通过PEG介导的原生质体转化(Omirulleh等，1993)、通过脱水/抑制介导的DNA吸收法、通过电穿孔、通过silicon carbide fiber的搅拌、通过包被了DNA的颗粒的加速作用等。在某些实施方案中，加速方法是优选的，包括如微粒轰击(microprojectile bombardment)等。

将DNA导入到细胞中的技术对于本领域中的熟练技术人员来说是众所周知的。四种将基因送递到细胞中的一般方法已经作过描述：(1)化学方法(Graham和van der Eb，1973；Zatloukal等，1992)；(2)物理方法如微注射(Capecchi，1980)、电穿孔(Wong和Neumann，1982；Fromm等，1985；美国专利5384253)以及基因枪(Johnston和Tang，1994；Fynan等，1993)；(3)病毒载体(Clapp，1993；Lu等，1993；Eglitis和Anderson，1988a；Eglitis等，1988)；(4)受体介导的机制(Curiel等，1991；1992；Wagner等，1992)。4.9.1电穿孔(electroporation)

给多种动物细胞和植物细胞使用瞬间高压电脉冲，在质膜上形成纳米大小的孔洞。DNA通过这些孔洞直接进入细胞胞质中或者是因为伴随着孔洞的关闭膜组分进行了重分配DNA直接进入了细胞胞质中。电穿孔的效率非常高，既可用于克隆基因的瞬时表达，又可用于携带所感兴趣基因插入拷贝的细胞系的建立。电穿孔与磷酸钙介导的转染(calcium phosphate-mediated transfection)及原生质体融合(protoplast fusion)相反，经常产生携带一个或最多数个外源DNA插入拷贝的细胞系。

用电穿孔导入DNA的方法对于本领域中的熟练技术人员来说是众所周知的。在该方法中，使用某些降解细胞壁的酶(cell wall-degradingenzyme)如降解果胶的酶可以使目标受体细胞比未处理细胞对电穿孔转化更敏感。此外，通过机械创伤(mechanical wounding)可以使受体细胞对转化更为敏感。为了实现电穿孔转化，我们要么可以使用易碎组织如细胞悬浮培养物或胚性愈伤组织(embryogenic callus)，要么也可以直接转化未成熟胚或其它活体组织。我们可以通过将所选细胞暴露在降解果胶的酶中(果胶酶)或以调控方式对之机械创伤，从而使所选细胞的细胞壁部分降解。这些细胞随后将作为用电穿孔进行DNA转移的受体，在该阶段可以进行电穿孔DNA转移，然后用适当的选择程序或筛选程序对转化后的细胞进行鉴定，选择何种程序取决于最新掺入DNA的特性。4.9.2微粒轰击(microprojectile bombardment)

将转化DNA区段送递到植物细胞中去的另一种有利方法是微粒轰击。在该方法中，颗粒可以用核酸包裹，通过推进力将其送递到细胞中。典型的颗粒包括由钨、金、铂等组成的颗粒。

除了作为能重复稳定转化单子叶植物的有效方法之外，微粒轰击的另一个优点是，既不需要分离原生质体(Cristou等，1988)也不需要农杆菌侵染的敏感性。用加速作用将DNA送递到玉米细胞中的方法的说明性实施方案为Biolistics Particle Delivery System，使用此系统可以推进用DNA或细胞包被的颗粒通过阻拦网如不锈钢阻拦网或Nytex阻拦网到达覆盖有悬浮液中培养的玉米细胞的滤纸表面。阻拦网能使颗粒分散，以使颗粒不会以聚集物形式送递到受体细胞。我们认为，位于发射装置和要轰击的细胞之间的阻拦网能减小微粒聚集物的大小，并能通过降低太大的微粒对受体细胞造成损伤有助于更为高效的转化。

对轰击来说，悬浮液中的细胞优选浓缩到滤纸上或固体培养基上。此外，可以将未成熟胚或其它靶细胞排列在固体培养基上。将要轰击的细胞放置在颗粒阻挡盘之下适当距离处。愿意的话，也可以将一个或多个阻拦网放置在加速装置和要轰击的细胞之间。通过使用本文所列技术我们可以获得最多1000或更多个表达标记基因的转化细胞。每轰击一次，轰击48小时之后表达外源基因产物的细胞数目通常从1个变化到10个，平均1个到3个。

在轰击转化中，我们可以优化轰击前的培养条件和轰击参数，就能产生出最大数量的稳定转化体。在该技术中，轰击的物理参数和生物参数都很重要。物理因素为涉及操作DNA/微粒沉淀的因素，或者影响大颗粒或微粒飞行和速度的因素。生物因素包括所有轰击前和轰击随后涉及的细胞操作，为帮助减轻伴随轰击产生出的创伤而对靶细胞进行的渗透调节，以及所转化DNA的特性如线形化DNA或完整的超螺旋质粒。我们认为，轰击前的操作过程对于幼胚的成功转化尤其重要。

因此，我们认为，我们可以在小量研究中调整各种轰击参数以便使条件完全优化。我们可能特别希望调整物理参数如间距(gapdistanceO、飞行距离(flight distance)、组织距离(tissue distance)以及氦气压力(helium pressure)。我们可以通过对影响受体细胞生理状态并因此影响转化效率和整合效率的条件进行修饰，以便也将使创伤减小因子(trauma reduction factors，TRFs)降低到最小。例如，可以调整受体细胞的渗透状态、组织水合以及继代培养状态或细胞周期到最适合转化的状态。就本公开内容来看，其它常规调整的完成对于本领域中的熟练技术人员来说是熟知的。4.9.3农杆菌介导的转移(Agrobacterium-mediated transfer)

对于将基因导入植物细胞来说，农杆菌介导的转移为广泛应用的系统，这是因为，DNA可以导入到完整的植物组织中，因此避免了从原生质体再生完整植物的需要。本领域中对于使用农杆菌介导的植物整合载体将DNA导入到植物细胞中是众所周知的。参照，如所述方法(Fraley等，1985；Rogers等，1987)。另外，Ti-DNA的整合是了解相对清楚的过程，很少产生重排(rearrangement)。要转移的DNA区由边界序列(border sequences)定义，间插DNA(intervening DNA)通常插入到植物基因组中(Spielmann等，1986；Jorgensen等，1987)。

现在的农杆菌转化载体能在大肠杆菌中复制也能在农杆菌中复制，便于操作(Klee等，1985)。此外，在农杆菌介导的基因转移有关载体方面的新的技术进展，增加了载体中基因和限制位点的排列，使得能表达各种多肽编码基因的载体易于构建。所述载体(Rogers等，1987)中在启动子和聚腺苷酸化位点两侧有方便的多接头区，可以直接表达所插入的多肽编码基因，适合本目的。另外，包含带甲Ti基因(armed Ti gene)以及卸甲Ti基因(disarmed Ti geng)的农杆菌均可以用于转化。对于农杆菌介导的转化有效的植物品系来说，选择该方法是因为改基因转移容易操作和容易获得的特性。

农杆菌介导的叶盘转化以及其它组织如子叶(cotyledon)和下胚轴(hypocotyl)的转化似乎局限于农杆菌天然侵染的植物。农杆菌介导的转化在双子叶植物中非常有效。只有个别单子叶植物似乎是农杆菌的天然寄主，虽然用农杆菌载体在芦笋中产生出转基因植物(Bytebier等，1987)。因此，有商业价值的重要谷物如水稻、玉米以及小麦通常需要用其它方法转化。然而，正如上文所提及的，也可以用农杆菌完成芦笋的转化(参考，如Bytebier等，1987)。

用农杆菌转化方法所得的转基因植物一般在其中一条染色体上包含单个基因。转基因植物对所加基因来说可以是杂合的。但是，由于“杂合”一词通常含义是在一对染色体的第二条染色体的同一基因座上存在互补基因且包含这样一个附加基因的植物中没有此基因，所以一般认为对于这样植物更为精确的名字是独立分离子，因为附加的外源基因在有丝分裂和减数分裂过程中独立分离。

更为优选的是对于附加结构基因来说纯合的转基因植物，也就是在转基因植物中包含2个附加基因，在染色体对儿的每条染色体的同一基因座上各有一个基因。获得纯合转基因植物的方法可以是：将包含单个附加基因的独立分离子转基因植物(independent segreganttransgenic plant)进行有性交配(自交)，使产生出的一些种子萌发，并分析所得植物相对于对照(天然的、非转基因的)植物或独立分离子转基因植物羧化酶活性的增强情况。

我们知道，也可以将两种不同的转基因植物交配，产生出包含两个对立分离的附加外源基因的后代。合适的后代自交后能产生出对于编码感兴趣多肽的两个附加外源基因均纯合的植物。同时可以考虑与亲本植物回交以及与非转基因植物远源杂交(out-crossing)。4.9.4其它转化方法

使用磷酸钙沉淀(calcium phosphate precipitation)、聚乙二醇处理(polyethylene glycol treatment)、电穿孔(electroporation)以及这些处理方法一起处理(参照，如Potrykus等，1985；Lorz等，1985；Fromm等，1986；Uchimiya等，1986；Callis等，1987；Marcotte等，1988)的基础上的方法可以完成植物原生质体的转化。

将这些系统应用到不同植物品系中，取决于从原生质体再生特定植物品系的能力。有人对从原生质体再生壳类植物的典型方法进行了描述(Fujimura等，1985；Toriyama等，1986；Yamada等，1986；Abdullah等，1986)。

对于不能从原生质体成功再生的植物品系，可以使用将DNA导入完整细胞或组织的其它方法转化这些植物。例如，可以象所述那样(Vasil，1988)从未成熟胚或外植体再生出谷类作物。此外，可以使用“基因枪”(particle gun)或高速微粒技术(high-velocitymicroprojectile technology)(Vasil等，1992)。

使用后一种技术时，正如所述那样(Klein等，1987；Klein等，1988；McCabe等，1988)，在微小金属颗粒表面上的DNA通过细胞壁进入细胞质。金属颗粒可以穿过数层细胞，所以可以转化组织外植体中的细胞。4.9.5基因在植物中的表达

尽管近年来在有关能表达细菌蛋白质如苏云金芽孢杆菌晶体蛋白的植物制备方面已经取得了很大进展，但是天然细菌基因在植物中的表达结果总是令人失望。与微生物遗传学不同，早期的植物遗传学家对影响外源基因在植物中进行异源表达的因素知之甚少。然而，近年来，已经发现几种潜在因素负责不同程度地从特定编码序列表达蛋白质。例如，科学家们现在知道，维持细胞中特定mRNA在相当水平才是真正的关键因素。不幸的是，导致编码外源蛋白质的mRNA低稳定态的原因有多个。首先，全长RNA的合成可能并不以高频率发生。这可能，例如，是由于在转录过程中RNA提前终止所致(prematuretermination)，或者由于转录过程中mRNA发生了预想不到的加工。第二，植物细胞中可能产生出全长RNA，但是随后在核中发生加工(剪接、polyA的加入)产生出非功能性的mRNA。如果RNA非恰当地合成、终止以及聚腺苷酸化，它就不能移到胞质中进行翻录。同样，如果胞质中的mRNA半寿期(由一级序列或二级序列决定)降低，则将产生非充足的蛋白质产物。此外，翻译效率对mRNA半寿期的影响，其大小难以确定。另外，每个RNA分子折叠成特定结构或可能是结构家族，这由其序列决定。任何RNA的特定结构在胞质中的稳定性增强或降低。结构本身也可能是核中mRNA加工的决定因素。不幸的是，不可能预测或几乎不可能确定体外或体内任一种RNA(除tRNA外)的结构。但是，有可能的是，明显改变RNA的序列将对其折叠结构有相当大的影响。结构本身或特定结构特征在决定RNA的稳定性方面也有作用。

为了克服在外源基因表达中的这些限制条件，研究人员已经鉴定出RNA中有可能对RNA稳定性有特定影响的特定序列以及信号。因此，在本发明中的某些实施方案中，我们想优化所公开核酸序列在植物中的表达。其中一个特定方法是，改变细菌基因，去除掉能降低转化的植物细胞表达的序列或基序(motif)。通常将改造编码序列优化其在植物中表达的过程称为“植物化”DNA序列(”plantizing”a DNAsequence)。

尤其麻烦的是A+T富含序列。不幸的是，因为苏云金芽孢杆菌的基因组富含A+T，所以天然的晶体蛋白基因序列通常必须经过修饰以便在植物中最优化表达。已经确定序列基序ATTTA(或在RNA以AUUUA形式出现)在哺乳动物细胞mRNA中为去稳定序列(destabilizingsequence)(Shaw和Kamen等，1986)。许多短暂mRNA的3’非翻译区富含A+T，这些区段中经常有A+T序列，有时以多拷贝或多聚体形式(如，ATTTATTTA……)出现。Shaw和Kamen证明，将不稳定mRNA的3’末端移植到稳定RNA(球蛋白质或VAl)中，将明显降低稳定RNA的半寿期。他们还证明，ATTTA五聚体对稳定信使有极强的去稳定效果(destabilizing effect)，无论该信号位于3’末端或者位于编码序列中它都能行使其作用。然而，ATTTA序列的数目及/或它们左右附近的序列在决定是否作为去稳定序列行使功能方面似乎也起重要作用。Shaw和Kamen证明，ATTTA三聚体比五聚体对mRNA稳定性的影响小，而二聚体或单体对稳定性没有影响(Shaw和Kamen等，1987)。我们注意到，ATTTA多聚体如五聚体必定产生A+T富含区。研究表明该过程为胞质影响，而在核中没有影响。其它的不稳定mRNA中ATTTA序列可能以单拷贝形式出现，但通常包含在A+T富含区中。从目前收集的动物细胞的数据来看，ATTTA似乎至少在某些左右附近中对稳定性有重要作用，但是还不可能预测哪些出现的ATTTA是去稳定元件或不可能预测能在植物中看到哪些影响。

对动物细胞中mRNA降解进行的一些研究也表明，有些情况下RNA降解可能开始于对A+T富含区的核溶解攻击(nucleolytic attack)。还不清楚裂解是否发生在ATTTA序列。也有些mRNA例子，它们的稳定性取决于表达它们的细胞类型或取决于在那一阶段它们进行表达。例如，组蛋白质mRNA在DNA合成过程中是稳定的，但是当DNA合成被搅乱时它们就不稳定了。有些组蛋白质mRNA的3’末端似乎负责该效果(Pander和Marzluff，1987)。既不似乎是ATTTA介导该效果，又不清楚是什么控制这些mRNA不同的稳定性。另一个例子是在B细胞成熟过程中B淋巴细胞中IgG mRNA的差别稳定性(Genovese和Milcarek，1988)。这些例子提供的证据都说明，mRNA稳定性可能由细胞类型或细胞周期特异因子介导。另外，还没有将这种去稳定性与特定序列相联系。出于这些不确定性，我们还不能预测指定细胞中哪些RNA可能不稳定。此外，即使是ATTTA基序作用也可能不同，取决于RNA所在细胞的本质。Shaw和Kamen(1987)报道，蛋白质激酶C的激活能够阻断由ATTTA介导的降解。

对于大多数真核生物mRNA，包括植物和动物，3’加入聚腺苷酸化链是常见的。当前接受的polyA附加的观点是，新生转录本延伸超过成熟的3’末端。包含在转录本中的是聚腺苷酸化信号以及适当3’末端形成的信号。3’末端的加工涉及mRNA的裂解和成熟3’末端polyA的附加。通过在植物和动物的mRNA中polyA尾附近寻找共有序列(consensus sequence)，可能鉴定出明显参与polyA附加和3’末端裂解的共有序列。同一共有序列好像对于这两个过程都很重要。这些序列通常是序列AATAAA的变体。在动物细胞中已经鉴定出有功能的该序列的一些变体；在植物细胞中似乎有更广范围的功能序列(Wickens和Stephenson，1984；Dean等，1986)。因为这些共有序列是AATAAA的变体，所以它们都是A+T富含序列。研究发现此序列在成熟mRNA中polyA尾之前15到20个bp处。动物细胞中的研究表明，该序列既参与polyA的附加又参与3’端成熟过程。该序列中的定点突变能破坏这些功能(Conway和Wickens，1988；Wickens等，1987)。然而，已经观察到同时还需要假定的polyA信号3’端50到100个bp；也就是说，有正常的AATAAA但下游发生取代或破坏的基因不能进行正常的聚腺苷酸化(Gil和Proudfoot，1984；Sadofsky和Alwine，1984；McDevitt等，1984)。也就是说，要进行彻底和正确的加工，仅有polyA信号本身是不够的。我们还不知道除了polyA信号外还需要哪些特定下游序列，或是否有具有此功能的特异序列。因此，只有通过序列分析才能鉴定出潜在的polyA信号。

我们观察到在发生正常聚腺苷酸化的天然存在的mRNA中，要么通过改变polyA信号要么通过改变mRNA中的其它序列可以破坏此过程，这时可以极大地影响功能性mRNA的水平。已经在数种天然存在的mRNA中观察到此结果，且结果是基因特异性的。

研究表明，在天然mRNA中，正确的聚腺苷酸化对于mRNA的积累是重要的，而破坏该过程能显著影响mRNA水平。然而，要在正常基因中预测变化后的结果还并没有足够的知识。在异源基因中推测结果就更难了。虽然如此，但是可能的情况是鉴定出的假定位点是无功能的。也就是说，这些位点并不是适当的polyA位点，而是作为异常位点(aberrant site)行使功能产生不稳定的mRNA。

AATAAA是动物细胞系统中在polyA的mRNA上游中鉴定出的最为常见的信号，但是也已经发现至少4种变体(Wickens和Stephenson，1984)。在植物中还没有做过如此多的分析，但清楚的是，可以使用类似于AATAAA的多个序列。表3中的称作主要或次要的植物位点仅仅是指Dean等(1986)的研究，该研究中只对三种植物基因进行了分析。将聚腺苷酸化位点称为主要或次要位点仅仅是指在分析过的天然存在基因中它们作为功能性位点出现的频率。就植物而言，这写只是非常有限的数据。很难肯定地预测称为主要或次要的位点可能或很少可能在异源基因如编码本发明中晶体蛋白的基因中能否部分行使功能或完全行使功能。

表3

植物基因中的聚腺苷酸化位点

PA AATAAA 主要共有位点

P1A AATAAT 主要植物位点

P2A AACCAA 主要植物位点

P3A ATATAA ＂

P4A AATCAA ＂

P5A ATACTA ＂

P6A ATAAAA ＂

P7A ATGAAA ＂

P8A AAGCAT ＂

P9A ATTAAT ＂

P10A ATACAT ＂

P11A AAAATA ＂

P12A ATTAAA 次要动物位点

P13A AATTAA ＂

P14A AATACA ＂

P15A CATAAA ＂

本发明提供制备合成植物基因的方法，这些基因表达它们蛋白质产物的水平比野生型基因的明显升高，在此之前通常使用这些野生型基因。另一方面，本发明也提供编码非植物蛋白质的新合成的植物基因。

正如上文所述，在植物中表达天然苏云金芽孢杆菌基因通常很难。苏云金芽孢杆菌基因编码区本质使它们与植物基因以及在植物中表达的外源基因区别开来。尤其是苏云金芽孢杆菌基因非常富含腺嘌呤(A)和胸腺嘧啶(T)而植物基因以及在植物中表达的大多数其它细菌基因等级为45-55％A+T。

由于遗传密码的兼并性以及对于任一氨基酸可供选择的数目有限，发现在有些芽孢杆菌的结构编码区中在密码子的第三位有许多“多余”的A+T。也就是说，有些芽孢杆菌基因中多个密码子中第三位的核苷酸为A或T。所以，A+T含量部分决定密码子选择的偏爱性(codon usagebias)。此外，清楚的是，基因在其进化的生物中进化产生出最大功能。这就意味着，一种生物的基因中特定的核苷酸除编码特定氨基酸区段外可能不再有作用，在另一种生物中可能是基因调控元件(如转录启动子或终止子、polyA附加位点、内含子剪接位点或特异的mRNA降解信号)。可能令人吃惊的是这些密码错读信号并不是异源基因表达的常见特征，但这可以由许多生物中相对均一的A+T含量(50％)进行部分解释。A+T含量加上遗传密码的本质使得有可能产生任何特定的寡核苷酸序列。所以，来自大肠杆菌有50％A+T含量的基因，很少有可能比来自苏云金芽孢杆菌的基因包含更多某一特定A+T富含区段。

通常情况下，为了在植物中获得δ-内毒基因的高水平表达，将编码δ-内毒的结构编码序列(“结构基因”)作如下修饰：通过定点突变包括结构基因的DNA将ATTTA序列以及假定的聚腺苷酸化信号去除掉。最为优选的是，虽然仅仅部分去除以上鉴定序列时观察到表达水平有所增强但是基本上要将所有聚腺苷酸化信号和ATTTA序列去除掉。此外，制备编码想要蛋白质的合成基因时，选择密码子避开ATTTA序列以及假定的聚腺苷酸化信号。本发明中假定的聚腺苷酸化信号包括但并不局限于

AATAAA，

AATAAT，AACCAA，ATATAA，AATCAA，ATACTA，ATAAAA，ATGAAA，

AAG(AT，ATTAAT，ATACAT，AAAATA，ATTAAA，AATTAA，AATACA以及CATAAA。在取代ATTTA序列以及假定的聚腺苷酸化信号时，优选使用的密码子是避开在植物中罕见的密码子。

扫描所选DNA序列确认那些多过四个连续腺嘌呤(A)核苷酸或胸腺嘧啶(T)核苷酸的区段。扫描A+T区段，寻找假定的聚腺苷酸化信号。虽然不存在5个或更多个连续A或T核苷酸时可排除掉许多植物聚腺苷酸化信号，但是，如果在10个核苷酸中确认出有不止一个次要聚腺苷酸化信号，那么该区段核苷酸序列优选改变，在保持原始编码氨基酸序列的情况下去除掉这些信号。

第二步是考虑在第一步中确认的A+T富含区周围大约15到大约30个核苷酸残基。如果周围区段A+T含量低于80％，就要对该区检查有无聚腺苷酸化信号。在聚腺苷酸化信号基础上对该区进行的变更取决于(1)聚腺苷酸化信号的数目，以及(2)主要聚腺苷酸化信号的存在。

检查延伸区植物聚腺苷酸化信号的存在。通过DNA序列的定点突变去除聚腺苷酸化信号。也要在延伸区检查多拷贝的ATTTA序列，也要通过突变去除掉。

同时优选的是，破坏包括多个连续A+T或G+C碱基的区段，因为推测这些区段很可能由于自身的互补性而形成发夹结构。因此，不均一碱基对的插入将降低形成自身互补二级结构的可能性，而已知自身互补二级结构的存在在某些生物中可以抑制转录和/或翻译。许多情况下，使用不包含多于5个连续A+T或G+C的序列可以将不利效果降低到最小。4.9.6以突变为目的而合成的寡核苷酸

在突变中使用寡核苷酸时，值得做的是在修饰基因中不引入常见限制位点如Bgl II、Hind III、Sac I、Kpn I、EcoR I、Nco I、Pst I和Sal I的情况下保持正确的氨基酸序列和阅读框。在许多克隆载体的多位点接头中有这些限制位点。当然，同时应该避免引入新的聚腺苷酸化信号、ATTTA序列或多于5个A+T或G+C的连续区段。寡核苷酸的优选大小为大约40个到大约50个碱基，但是有人使用过从大约18个到大约100个碱基的片段。许多情况下，与模板DNA合成片段两端同源最低需要大约5个到大约8个碱基，以使引物与模板能进行适当杂交。寡核苷酸应该避免长度超过5个碱基对的A+T或G+C。可能的话，在野生型密码子的替换中所用的密码子应该优选避开TA或CG双联体。从植物偏爱密码子表(如下面的表4)中选择密码子，避免使用植物基因组中罕见的密码子，应该尽量选择密码子以便将G+C含量优选调整到大约50％。

表4

植物优选使用的密码子

氨基酸密码子植物使用的百分比

ARG CGA 7

CGC 11

CGG 5

CGU 25

AGA 29

AGG 23

LEU CUA 8

CUC 20

CUG 10

CUU 28

UUA 5

UUG 30

SER UCA 14

UCC 26

UCG 3

UCU 21

AGC 21

AGU 15

氨基酸密码子植物使用的百分比

THR ACA 21

ACC 41

ACG 7

ACU 31

PRO CCA 45

CCC 19

CCG 9

CCU 26

ALA GCA 23

GCC 32

GCG 3

GCU 41

GLY GGA 32

GGC 20

GGG 11

GGU 37

ILE AUA 12

AUC 45

AUU 43

VAL GUA 9

GUC 20

GUG 28

GUU 43

LYS AAA 36

AAG 64

ASN AAC 72

AAU 28

氨基酸密码子植物使用的百分比

GLN CAA 64

CAG 36

HIS CAC 65

CAU 35

GLU GAA 48

GAG 52

ASP GAC 48

GAU 52

TYR UAC 68

UAU 32

CYS UGC 78

UGU 22

PHE UUC 56

UUU 44

MET AUG 100

TRP UGG 100

推测有许多连续A+T碱基或G+C碱基的区段很有可能由于自身互补性(self-complementarity)而形成发夹结构(hairpin structure)。通过插入均一碱基对破坏这些区段是优选的，应该降低形成自身互补二级结构如发夹的可能性，因为已知这些结构在某些生物中可以抑制转录(转录终止子)和翻译(衰减子)。

此外，可以制备指定氨基酸序列的完全合成的基因，避开有5个或更多个连续A+T或G+C核苷酸的区段。在选择密码子时密码子中应尽可能避开TA和CG双联体。可以按照植物优选密码子使用表(如表4)使密码子使用标准化，优选将G+C含量调整到大约50％。检查所得序列，应确保有最少的植物聚腺苷酸化信号和ATTTA序列。在通常使用的克隆载体中发现的限制位点同时优选避开。然而，在整个基因中放入数个单一限制位点在分析基因表达或构建基因变体时是有用的。4.10抗虫转基因植物的产生方法

用包含cry基因的重组区段转化合适的寄主细胞如植物细胞，表达编码的晶体蛋白(即对鞘翅目昆虫有杀虫活性的细菌晶体蛋白或多肽)即形成抗虫植物。

作为实施例，我们可以使用如粒子轰击方法(Maddock等，1991；Vasil等，1992)用包含苏云金芽孢杆菌晶体蛋白编码区和合适选择性标记基因的表达载体转化胚性植物细胞悬液如小麦细胞或玉米细胞，将包被在微粒上的DNA送递到受体细胞中。随后从表达杀虫蛋白质的转化胚性愈伤组织再生转基因植物。

也可以使用本领域中熟知的其它细胞转化方法如农杆菌介导的DNA转移(Fraley等，1983)形成转基因植物。此外，通过将DNA直接转移到花粉中(Zhou等，1983；Hess，1987；Luo等，1988)、通过将DNA注射到植物生殖器官(Pena等，1987)或通过将DNA直接注射到未成熟胚细胞中随后使干燥的胚发生水合作用(Neuhaus等，1987；Benbrook等，1986)，可以将DNA导入到植物中。

本领域中对于从单个植物原生质体转化体或各种转化外植体再生、发育及培养植物是熟知的(Weissoach和Weissbach，1988)。再生过程和生长过程通常包括的步骤是转化细胞的选择、培养细胞经过通常的胚胎发育阶段到小植株生根阶段。同样再生出转基因胚和转基因种子。此后将所得转基因生根幼苗种植在合适的植物生长培养基如土壤中。

通过农杆菌将编码感兴趣多肽的外源基因导入到叶片外植体中，包含该外源基因的植物的发育方法和再生方法在如所述的本领域中(Horsch等，1985)是熟知的。该方法中，在存在选择剂的能诱导所述转化植物品系再生出苗的培养基中培养转化体(Fraley等，1983)。

用该方法通常在2到4个月中产生出苗，随后将这些苗转移到包含选择剂和能抑制细菌生长的抗生素的合适生根诱导培养基上。然后将在存在选择剂情况下形成的小植株移栽到土壤或其它培养基中使根能够形成。这些流程依赖于所使用的特定植物品系而有所不同，本领域中对那些变动是熟知的。

正如前面所讨论的一样，再生植物优选自花授粉以提供纯合转基因植物。另外，将来自再生植物的花粉与农艺重要的优选自交系结实植物杂交。反之，用来自那些重要品系植物的花粉给再生植物授粉。使用本领域中熟练技术人员所熟知的方法耕种本发明中包含想要的多肽的转基因植物。

本发明中的转基因植物中编码本文所公开多肽的编码区(如基因)的量有所升高。优选的转基因植物是独立分离子(independentsegregant)，能够将此基因及其活性传递给后代。更优选的转基因植物对该基因是纯合的，有性交配时将该基因传递给所有后代。来自转基因植物的种子可以生长在大田或温室中，所得性成熟转基因植物自花传粉产生出真正的育种植物。这些转基因植物的后代形成真正的育种品系，以实施例方式对多种环境条件优选大田中对鞘翅目昆虫的杀虫能力的提高进行评估。发明者认为本发明在创造有商业利益转基因植物方面将有特定应用，包括各种草坪草和牧草、黑麦、小麦、玉米、木棉、亚麻、水稻、大麦、燕麦、甘蔗、棉花、番茄、马铃薯、大豆及其它豆科植物、烟草、高粱及多种修饰性植物包括仙人掌和肉质植物、水果、浆果、蔬菜及多种结坚果和结水果的树木及植物。

包括编码本文所述多肽的一种或多种转基因的转基因植物优选显示出的表型为对本文所述目标鞘翅目昆虫和鳞翅目昆虫的抗虫性提高或增强。这些植物优选年提供转基因种子，可用所得种子创造转基因植物家系(即原始转基因植物的后代)，可以用转基因植物家系产生种子或者用作动物或人类的食物，或者可用于生产纤维、油、水果、谷物或其它商业上重要的植物产品或植物成分。其中，转基因植物任何一代的后代或种子将包含整合于染色体上的编码本发明中δ-内毒素的所选转基因。可以将本发明中的转基因植物与带有目的性状的一种或多种植物杂交形成杂交系或自交系。有时，我们想要创造出包含除编码本发明多肽的转基因外的一种或多种整合到基因组中的其它转基因的转基因植物、种子及后代。例如，转基因植物中可以包含编码相同或不同抗虫多肽的第二个基因，或者植物中可以包含一种或多种附加转基因，例如能赋予植物除草剂抗性、真菌抗性、细菌抗性、胁迫耐受性、耐盐性或干旱耐受性、提高茎或根抗倒伏能力、提高淀粉、谷粒、油、碳水化合物、氨基酸、蛋白质产量等的转基因。4.11同源基因和同源基因片段的分离

与本发明相关的基因和δ-内毒素不但包括本文公开的全长序列，而且包括这些序列的片段或融合蛋白(fusion protein)，这些融合蛋白保留本文特别列举序列的典型杀虫活性。

对本领域中的熟练技术人员来说显而易见的是，可以通过数种方法确定δ-内毒素和获得δ-内毒素。特定基因或其部分可以从培养物保藏者处获得，或者用合成方式构建，例如使用基因合成仪(genemachine)。使用标准点突变技术可以毫不费力地构建出这些基因的变体。同样，可以使用可商购的外切核酸酶或内切核酸酶根据标准方法制备这些基因片段。例如，使用酶如Bal31或定点突变技术可以从这些基因的末端彻底切除核苷酸。同样，使用其它各种限制酶可以获得编码活性片段的基因。使用蛋白酶可以直接得到这些δ-内毒素的活性片段。

使用本文提供的技术可以从芽孢杆菌菌株及/或DNA文库中分离等效δ-内毒素和/或编码这些等效δ-内毒素的基因。例如，可以使用本文公开和声明的δ-内毒素的抗体从蛋白质混合物中鉴定分离其它δ-内毒素。可以特异产生几乎恒定并与其它苏云金芽孢杆菌δ-内毒素几乎截然不同的δ-内毒素部分的抗体。然后，使用这些抗体通过免疫沉淀法(immunoprecipitation)、酶联免疫测定(ELISA)或蛋白质印迹法(Western blotting)特异鉴定出有特定杀虫活性的等效δ-内毒素。

鉴定本发明中δ-内毒素和基因的另一个方法是通过使用寡核苷酸探针(oligonucleotide probe)。探针核苷酸序列上有可以检测的标记。正如本领域中众所周知的一样，如果探针分子和核酸样品通过在两个分子间形成强键而发生杂交，我们就可以合理假定探针和样品基本相同。探针上的检测标记提供决定杂交是否发生的方法。这样的探针分析法提供了快速鉴定本发明中δ-内毒素基因的方法。

用作本发明探针的核苷酸区段可以使用DNA合成仪(DNAsynthesizer)用标准方法合成。使用核苷酸区段作为探针时，用本领域中熟练技术人员熟知的合适标记标记特定探针，包括放射性标记以及非放射性标记。典型的放射性标记包括³²P、¹²⁵I、³⁵S等。用放射性同位素标记的探针可以使用Dnase和DNA聚合酶通过常规的切口平移反应(nick translation reaction)从与DNA样品互补的核苷酸序列构建。随后在杂交缓冲溶液中混合探针和样品，保持适当温度直至退火。此后，将其它物质从膜上漂洗掉，通常通过放射自显影(autoradiography)及/或液体闪烁计数(liquid scintllationcounting)对样品和结合态探针分子检测并定量。

非放射性标记包括，例如，配体如生物素或甲状腺素，以及酶如水解酶(hydrolase)或过氧化物酶(peroxidase)，或各种化学发光物质如萤光素(luciferin)或荧光化合物如荧光素(fluorescein)及其衍生物。为易于分离，可以在探针的两个末端用不同类型的标记进行标记，如在上文所提及的末端用同位素标记而在另一端使用生物素标记。

双链分子的形成及稳定性取决于杂交体两条链之间的大致互补性，而正如上文中注意到的，可以忍受一定程度的错配(mismatch)。因此，本发明中的探针包括所述序列的突变(既有单位点突变又有多位点突变)、缺失、插入及其组合，其中所说的突变、插入和缺失可以与目标多核苷酸形成稳定杂交分子。在指定多核苷酸中产生突变、插入以及缺失可以有许多方式，如可以通过当前普通技工熟知的方法以及将来可能变得熟知的其它方法产生。

所列探针中潜在的变体的产生，部分是由于遗传密码的冗余性(redundancy)。由于遗传密码的冗余性，即用于制造蛋白质的氨基酸中大部分都可以使用不止一个编码核苷酸三联体(密码子)。因此，不同的核苷酸序列可以编码一种特定氨基酸序列。所以，苏云金芽孢杆菌δ-内毒素和肽的氨基酸序列可以由编码相同蛋白质或肽氨基酸的等效核苷酸序列制备。因此，本发明包括这些等效核苷酸序列。反向序列和互补序列也是本发明的一个方面，本领域中的熟练技术人员可以轻而易举地使用这些序列。此外，研究表明，如果氨基酸序列的改变并未使蛋白质二级结构发生改变，那么确定结构和功能的蛋白质可以通过改变氨基酸序列构建(Kaiser和Kezdy，1984)。所以，本发明包括本文所示氨基酸序列的突变体，这些突变体并不改变蛋白质的二级结构，或者如果结构发生改变，但大体保留了其生物活性。另外，本发明还包括带有本发明基因编码的所有或部分δ-内毒素的生物突变体。通过本领域中熟练技术人员熟知的技术可以制得这些突变体。例如，可以使用UV辐射(UV irradiation)制备寄主生物的突变体。同样，突变体中可能包括无孢子寄主细胞(asporogenous host cell)，通过本领域中熟知的方法可以制备这些无孢子寄主细胞。4.13重组寄主细胞

可以将本发明中的核苷酸序列导入到多种微生物寄主和真核生物寄主中。重组表达Cry多肽的寄主中尤其引人注目的是原核生物和低等真核生物，如真菌。典型的原核生物，既有革兰氏阴性又有革兰氏阳性，包括肠细菌(Enterobacteriaceae)，如大肠杆菌(Escherichia)、欧氏杆菌(Erwinia)、志贺菌属(Shigella)、沙门氏菌属(Salmonella)及变形杆菌属(Proteus)、芽孢杆菌属(Bacillaceae)；根瘤菌属(Rhizobiceae)，如根瘤菌(Rhizobium)；螺旋菌属(Spirillaceae)，如发光细菌(photobacterium)，发酵单胞菌属(Zymomonas)、Serratia、气单胞菌属(Aeromonas)、弧菌(Vibrio)、Desulfovibro、螺旋菌属(Spirillum)；乳酸菌属(Lactobacillaceae)；假单胞菌(Pseudomonadaceae)，如假单胞杆菌属(Pseudomonas)和醋酸杆菌属(Acetobacter)；固氮细菌(Azotobacteraceae)、放线菌(Actinomycetales)和硝化细菌属(Nitrobacteraceae)。其中的真核生物有真菌(fungi)，如藻状菌属(Phycomycetes)和子囊菌(Ascomycetes)，包括酵母如酵母菌属(Saccharomyces)和裂殖酵母(Schizosaccharomyces)，以及担子菌纲(Basidiomycetes)酵母如Rhodotorula、金白蘑菇(Aureobasidium)、Sporobolomyces等。

选择寄主细胞时特别感兴趣的特性包括：易于将本发明中的遗传构建体导入到寄主细胞中，表达系统的有效性，表达效率，目的基因在寄主中的稳定性以及辅助遗传能力的存在。

已知居住在多种重要作物叶面(植物叶子的表面)及/或根际(植物根周围的土壤)的大量微生物也可能是所公开遗传构建体操作、繁殖、储存、送递和/或突变的寄主细胞。这些微生物中包括细菌、藻类及真菌。特别引人注目的有微生物，如细菌如芽孢杆菌属(包括

B.thuringiensis kurstaki HD-1，B.thuringiensis kurstaki HD-73，B.thuringiensis sotto，B.thuringiensis berliner，B.thuringiensis thuringiensis，B.thuringiensis tolworthi，B.thuringiensis dendrolimus，B.thuringiensis alesti，B.thuringiensis galleriae，B.thuringiensis aizawai，B.thuringiensis subtoxicus，B.thuringiensis entomocidus，B.thuringiensis tenebrionis及B.thuringiensis sandiego的种和亚种)、假单胞杆菌属、欧氏杆菌、Settatia、克雷伯氏杆菌属、Zanthomonas、链霉菌属、根癌菌属、红假单胞菌、Methylophilius、土壤杆菌属、醋酸杆菌属、乳酸杆菌属、节杆菌属、固氮菌属、嗜柠檬酸明串球菌属和Alcaligenes，如真菌尤其是酵母如酵母菌属、隐球酵母菌属、克鲁维酵母菌属、Sporobolomyees、Rhodotorula及金白蘑菇菌属。尤其引人注目的是植物圈细菌如Pseudomonas syringae、荧光假单胞杆菌、Serratiamarcescens、Acetobacter xylinum、根癌农杆菌、Rhodobactersphaeroides、Xanthomonas campestris、Rhizobium melioti、Alcaligenes eutrophus及Azotobacter vinlandii，以及植物圈酵母如Rhodotorula rubra、R.glutinis、R.marina、R.aurantiaca、Cryptococcus albidus、C.diffluens、C.laurentii、Saccharomycesrosei、S.pretoriensis、啤酒酵母、Sporobolomyces roseus、S.odorus、Kluyveromyces veronae及Aureobasidium pollulans。

选择寄主细胞时特别感兴趣的特性包括：易于将所选遗传构建体导入到寄主中，表达系统的有效性，表达效率，多核苷酸在寄主中的稳定性以及辅助遗传能力的存在。其它考虑因素包括易于制作和处理、经济、储存稳定性等。4.14多核苷酸序列

在向受体植物细胞中送递过程中、多能植物细胞的世代中以及最终产生抗虫转基因植物过程中特别优选的是编码本发明中杀虫活性多肽的DNA组分。例如，可以使用的DNA区段以载体和质粒的形式使用或以线性DNA片段形式使用，有时仅包含要在植物细胞中表达的DNA元件等等。

当然，在用编码δ-内毒素的多核苷酸转化细胞时使用的载体、质粒、噬菌粒、粘粒、病毒载体、穿梭载体、杆状病毒载体、BACs(细菌人工染色体)、YACs(酵母人工染色体)及DNA区段，通常包括编码SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ IDNO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：19的多肽的至少第一个基因，或者包括的基因所编码的多肽与在SEQ IDNO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：19中公开的氨基酸序列的同一性至少为大约80％或85％或90％或95％。这些核酸构建体可以包括一个或多个想要导入受体细胞中去的基因。DNA构建体中可以包括诸如启动子、增强子、多位点接头或调节基因等想要的结构。导入细胞时选择的DNA区段或基因通常编码的多肽在所得重组细胞中表达，可以产生可以筛选的性状或可以选择的性状，以及/或可以赋予转化寄主细胞增强的表型。另外，核酸构建体可以包含反义构建体或核酶编码区。4.15突变多核苷酸的制备方法

有时，为了改变或变更编码多肽的杀虫活性或杀虫特异性，我们可能想要修饰或改变本文公开的一个或多个多核苷酸序列中的一个或多个核苷酸。然后扩增突变序列。突变DNA区段及扩增DNA区段的方法对本领域中的熟练技术人员来说是熟知的。通过随机突变方法或位点特异性突变方法可以制备出突变DNA区段。通过在编码杀虫活性多肽的序列中进行一个或多个核苷酸的附加、缺失或取代可以对多核苷酸进行修饰。

在本发明的实践中有用的特定突变方法和扩增方法由Tomic等、Upender等、Kwoh等、Frohman等、0hara等、Wu等、Walker等、美国专利4683195、4683202、4800159、4883750及EP320308、EP329822、GB2202328、PCT/US87/00880、PCT/US89/01025、WO88/10315、WO89/06700等进行了描述，各文内容在此完整引入作为参考。4.16影响植物中转基因表达的转录后事件

许多情况下，指定寄主细胞中特定转基因的转录水平并不总表示转化寄主细胞中产生蛋白质的量。这通常是由于转录后过程的缘故，如剪接、聚腺苷酸化、翻译的适当起始及RNA稳定性，影响转录本产生蛋白质的能力。这些因素也可能影响指定转基因产生的mRNA的稳定性和量。因此，我们通常通过特定分子生物学技术改变翻译后事件。发明者认为，某些情况下，我们可以通过改变本发明中编码多肽的核酸构建体的转录及/或表达，来增强、降低或调节或调控在特定寄主细胞和/或转基因植物中的构建体。4.16.1蛋白质翻译的有效起始

真核生物mRNA的5’前导区(5’-UTL)在翻译效率中发挥重要作用。许多早期的嵌合转基因使用的是病毒启动子，将转录起始位点后任意长度的病毒序列与编码区AUG融合。近来的研究表明，5’-UTL序列及AUG周围的序列对寄主细胞和特别是某些植物品种中的翻译效率影响很大，影响大小依赖于表达信使的特定细胞或组织而有所不同。

在许多真核生物mRNA中，翻译起始点发生在紧邻转录本5’帽子的AUG密码子处。对植物mRNA序列进行比较及定点诱变实验证明在植物起始密码子周围存在共有序列，5’-UAAACA AUGGCU-3’(Joshi，1987；Lutcket等，1987)。然而，共有序列在不同植物品种中是明显的。例如，从85个玉米基因中发现起始密码子周围的一套序列为5’-(C/G)AUGGCG-3’(Luehrsen等，1994)。在烟草原生质体中，当将基因的天然序列变成编码5’-ACCAUGG-3’时，编码β-葡糖醛酸酶(GUS)和细菌几丁质酶的转基因表达水平分别增强4倍和8倍(Gallie等，1987；Jones等，1988)。

产生嵌合转基因(即包括连接在一起的不同来源DNA区段)时通常使用植物病毒5’-UTL。研究表明，苜蓿花叶病毒(AMV)外壳蛋白和雀麦草花叶病毒(BMV)外壳蛋白的5’-UTL能使mRNA电击后的烟草原生质体中增强8倍(Gallie等，1987a；1987b)。研究表明，将烟草花叶病毒RNA(TMV)5’-UTL的67核苷酸衍生物(Ω)与氯霉素乙酰转移酶(CAT)基因和GUS基因融合后使报告基因体外翻译增强(Gallie等，1987a；1987b；Sleat等，1987；Sleat等，1988)。用包含与报告基因CAT、GUS和LUC融合的TMV前导序列的转录体电击烟草叶肉原生质体，使表达水平分别增强33倍、21倍和36倍(Gallie等，1987a；1987b；Gallie等，1991)。同样也是在烟草中的研究表明，马铃薯病毒X RNA的83-nt 5’-UTL能使新霉素磷酸转移酶II(Npt II)的表达增强4倍(Poogin和Skryabin，1992)。

5’-UTL的影响依赖于植物尤其是双子叶植物和单子叶植物而有所不同。研究表明，TMV 5’-UTL在烟草原生质体中(Gallie等，1989)比在玉米原生质体中(Gallie和Young，1994)更为有效。同样，来自TMV Ω(Gallie等，1988)、AMV外壳(Gehrke等，1983；Jobling和Gehrke，1987)、TMV外壳(Goelet等，1982)以及BMV外壳(French等，1986)的5’-UTL在玉米中的作用很小，相对于萤光素酶基因的天然前导序列来说能抑制萤光素酶基因在玉米中的表达(Koziel等，1996)。但是，来自花椰菜花叶病毒(CaMV)35S转录体和玉米基因谷蛋白(Boronat等，1986)、PEP羧化酶(Hudspeth和Grula，1989)以及核酮糖二磷酸羧化酶中的5’-UTL相对于萤光素酶基因的天然前导序列来说使萤光素酶基因的表达有相当大的增强(Koziel等，1996)。

这些5’-UTL在烟草中的效果不同。与在玉米中的相反，TMV Ω 5’-UTL和AMV外壳蛋白5’-UTL在烟草中能增强表达，而谷蛋白5’-UTL、玉米PEP羧化酶5’-UTL和玉米核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶5’-UTL相对于萤光素酶5’-UTL并未增强(Koziel等，1996)。只有CaMV 35S5’-UTL既能在玉米中增强萤光素酶的表达又能在烟草中增强萤光素酶的表达(Koziel等，1996)。另外，TMV外壳蛋白5’-UTL和BMV外壳蛋白5’-UTL既在玉米原生质体又在烟草原生质体中有抑制作用(Koziel等，1996)。4.16.2使用内含子增强表达

虽然并不是所有的内含子都有刺激效果而且刺激程度千差万别，但是已经发现在基因的转录部分中包括一个或多个内含子，能增强多种植物系统中异源基因的表达(Callis等，1987；Maas等，1991；Mascerenhas等，1990；McElroy等，1990；Vasil等，1989)。内含子的增强效果似乎在单子叶植物中比在双子叶植物中更为明显。Tanaka等(1990)研究表明，使用从蓖麻子中分离的过氧化氢酶内含子1能增强基因在水稻中的表达。同样，研究表明，乙醇脱氢酶1(Adh1)的第一个内含子能增强包括内源启动子的基因组克隆在转化玉米细胞中的表达(Callis等，1987；Dennis等，1984)。能增强包括内含子的转基因表达的其它内含子，包括Adh1的内含子2和6(Luehrsen和Walbot，1991)、过氧化氢酶内含子(Tanaka等，1990)、玉米bronze 1基因的内含子1(Callis等，1987)、玉米蔗糖合成酶内含子1(Vasil等，1989)、水稻肌动蛋白基因的内含子3(Luehrsen和Walbot，1991)、水稻肌动蛋白内含子1(McElroy等，1990)以及玉米泛素外显子1(Christensen等，1992)。

通常情况下，为使得优化表达，考虑到剪接点序列所选内含子应该以正确方向放在5’转录单元中(Cailis等，1987；Maas等，1991；Mascerenhas等，1990；Oard等，1989；Tanaka等，1990；Vasil等，1989)。研究表明，当将Adh1的内含子9放在目的基因的3’端(或下游)时能增强外源基因的表达(Cailis等，1987)。4.16.3使用合成基因增强植物中异源基因的表达

当将原核生物基因导入到真核生物寄主中或在非天然寄主中表达真核生物基因时，必须对基因序列进行改变或变更才能使来自该基因的转录本进行有效翻译。我们已经在植物中表达苏云金芽孢杆菌基因时获得了用合成基因增强目的蛋白表达的大量经验。天然苏云金芽孢杆菌基因在双子叶植物中有时在几乎所有许多单子叶植物中通常只有低水平的表达(Koziel等，1996)。天然基因中密码子使用与典型植物基因中密码子使用有相当大的不同，而植物基因G+C含量更为高些。增强这些基因在植物中表达的策略通常就是改变基因总的G+C含量。例如，合成编码苏云金芽孢杆菌晶体蛋白质的基因，显著提高了这些基因在多种作物包括棉花(Perlak等，1900；Wilson等，1992)、番茄(Perlak等，1991)、马铃薯(Perlak等，1993)、水稻(Cheng等，1998)和玉米(Koziel等，1993)中的表达。

同样，发明者认为，由于本发明中的遗传构建体包含细菌来源的一个或多个基因，所以有时可以改变这些遗传构建体，以增强来自原核生物的这些基因在包含这些构建体的特定真核寄主细胞及/或转基因植物中的表达。使用本领域中熟练技术人员熟知的分子生物学技术，我们可以改变特定Cry编码基因序列的编码序列或非编码序列，以适用于预防或降低这些转基因植物对昆虫侵袭或攻击的水平优化或促进其在转化植物细胞中的表达。4.16.4叶绿体汇集(chloroplast sequestering)和叶绿体导向(chloroplast targeting)

增强A+T富含基因在植物中表达的另一个方法已经在烟草叶绿体转化中作过说明。McBride等(1995)已经报道过在烟草中高水平表达非修饰性苏云金芽孢杆菌晶体蛋白编码基因。

.此外，已经发展出将蛋白质导向叶绿体的方法。该技术使用豌豆叶绿体转运肽，将聚羟基丁酸合成途径中的酶导向叶绿体(Nawrath等，1994)。同时，该技术除需要加入合适的导向序列外，去除掉修饰编码区的必要性。

美国专利5576198(在此特别引入作为参考)公开了植物细胞遗传工程中有用的组合物和方法，提供一种方法控制插入在植物质体基因组中的外源DNA序列表达的定时性或组织方式。构建体包括用于核转化的构建体，给病毒单亚基RNA聚合酶提供植物组织中的表达，并能将表达出的聚合酶蛋白导向植物细胞的质体中。同时包括质体表达构建体，在该构建体中包括RNA聚合酶特异的启动子区，而RNA聚合酶是从上文所述核表达构建体中表达出来的，质体表达构建体中还包括要在转化的质体细胞中表达的异源目的基因。另外，基因可以转化/定位到叶绿体/质体基因组中并用本领域中熟知的启动子从该处表达。4.16.5 3’区对转基因表达的影响

研究发现，转基因的3’末端区对植物中转基因的表达有很大影响(Ingelbrecht等，1989)。在该研究中，将不同的3’末端连接到新霉素磷酸转移酶II(Npt II)报告基因上，并在转基因烟草中表达。所用不同的3’末端分别来自于章鱼碱合酶基因、来自拟南芥的2S种子蛋白、来自拟南芥的rbcS小亚基、来自胡萝卜的伸展蛋白以及来自矮牵牛的查尔酮合成酶。在稳定的烟草转化体中，表达最好的构建体(小亚基rbcS 3’末端)与表达最差的构建体(查尔酮合成酶3’末端)之间的差别大约为60倍。

表5

植物启动子启动子参考文献a病毒玄参花叶病毒(FMV) 美国专利5378619花椰菜花叶病毒(CaMV) 美国专利5530196

美国专利5097025

美国专利5110732植物延长因子美国专利5177011番茄聚半乳糖醛酸酶美国专利5442052拟南芥组蛋白H4 美国专利5491288菜豆蛋白美国专利5504200组分2 美国专利5608144泛素美国专利5614399P119 美国专利5633440α-淀粉酶美国专利5712112病毒增强子/植物启动子CaMV 35S增强子/甘露碱美国专利5106739合成酶启动子^a各参考文献在此特别完整引入作为参考

表6

组织特异性植物启动子组织特异性启动子组织参考文献aBlec 表皮美国专利5646333苹果酸合酶种子、幼苗美国专利5689040异柠檬酸裂合酶种子、幼苗美国专利5689040patatin 块茎美国专利5436393ZRP2 根美国专利5633363ZRP2(2.0) 根美国专利5633363ZRP2(1.0) 根美国专利5633363RB7 根美国专利5459252

根美国专利5401836

果实美国专利4943674

分生组织美国专利5589583

保卫细胞美国专利5538879

雄蕊美国专利5589610SodA1 花粉、药壁中层、花药裂口 Van Camp等，1996SodA2 维管束、气孔、腋芽、中柱鞘、 Van Camp等，1996

花药裂口、花粉CHS15 花、根尖 Faktor等，1996Psam-1 韧皮组织、皮层、根尖 Vander等，1996ACT11 正在伸长的组织和器官、花粉、 Huang等，1997

胚珠zmGBS 花粉、胚乳 Russell和Fromm，1997zmZ27 胚乳 Russell和Fromm，1997osAGP 胚乳 Russell和Fromm，1997osGT1 胚乳 Russell和Fromm，1997RolC 韧皮组织、维管束鞘、维管薄 Graham等，1997

壁组织Sh 韧皮组织 Graham等，1997CMd 胚乳 Grosset等，1997Bnml 花粉 Treacy等，1997水稻tungro杆状病毒韧皮部 Yin等，1997a；1997bS2-Rnase 花粉 Ficker等，1998LeB4 种子 Baumlein等，1991Gf-2.8 种子、幼苗 Berna和Bernier，1997^a各参考文献在此特别完整引入作为参考

在植物中以组织特异性方式表达基因的能力导致雄性不育植物和雌性不育植物的产生。雄性不育植物的产生通常涉及到使用花药特异性启动子，而该启动子与能破坏花粉形成的基因相连接(美国专利5689051、5689049、5659124，各专利在此引入作为参考)。美国专利5633441(特别在此引入作为参考)公开产生雌性遗传不育性植物的方法。该方法包括使用使用花柱细胞、柱头细胞或花柱细胞及柱头细胞特异性启动子表达多肽，多肽在植物细胞中表达后，能杀死或明显破坏细胞的代谢、功能性或发育。

表7

诱导型植物启动子启动子参考文献a热激启动子美国专利5447858Em 美国专利5139954Adh1 Kyozoka等，1991HMG2 美国专利5689056肉桂乙醇脱氢酶美国专利5633439天冬酰胺合成酶美国专利5595896GST-H-27 美国专利5589614^a各参考文献在此特别完整引入作为参考4.18抗体组合物及其制备方法

特定的实施方案中，发明者考虑到抗体的用途，这些单克隆抗体(monoclonal antibodies)或多克隆抗体(polyclonal antibodies)与本文公开的一种或多种多肽结合。制备抗体的方法以及鉴定抗体特性的方法在本领域中是众所周知的(如可以参考Harlow和Lane，1988；在此引入作为参考)。单克隆抗体(mAbs)的产生方法通常开始的流程与制备多克隆抗体的相同。简言之，多克隆抗体的制备方法是，用本发明中的免疫原性组分免疫接种动物，然后从免疫动物中收集抗血清。多种动物可以用于抗血清的产生。通常用于产生抗血清的动物为兔子、小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠或山羊。由于兔子的血液体积相对较大，所以产生多克隆抗体时兔子为优选选择。

通过使用已知技术可以轻而易举地制备出mAbs，如美国专利4196265中列举的技术，其内容在此引入作为参考。该技术通常涉及到用所选免疫原组分如纯化或部分纯化的晶体蛋白、多肽或肽免疫接种合适动物。免疫组分以能有效刺激抗体生成细胞的方式给药。啮齿类动物如小鼠和大鼠为优选动物，当然也有可能使用兔子、绵羊或青蛙细胞。使用大鼠可以提供某些优点(Goding，1986，pp.60-61)，但优选小鼠，而BALB/c鼠最优选，因为惯例使用最多并且一般都能产生更高程度的稳定融合。4.19 ELISAs和免疫沉淀法(immunoprecipitation)

可以将mAbs与本发明一起使用。ELISAs或使用ELISAs的试剂盒的产生和用途对于本领域中的熟练技术人员是众所周知的。4.20蛋白质印迹

本发明中的组合物在免疫印迹或蛋白质印迹分析中有非常大的用途。抗肽抗体可以作为高亲和性的初级试剂(primary reagent)，用于鉴定固定在固相支持物如硝酸纤维素、尼龙(nylon)或二者结合起来上的蛋白质。凝胶电泳后结合免疫沉淀法，这些组合物可以作为单步骤试剂(single step reagent)，用于检测抗原，而用于检测抗原的第二种试剂会导致不利背景。当所研究抗原为免疫球蛋白时(避免在使用免疫球蛋白时结合细菌细胞壁组分)、所研究抗原与检测试剂发生交叉反应时或它们以与交叉反应信号相同的相同分子量迁移时，这就变得尤其有用了。

我们认为，结合包括酶标记、放射性标记或荧光标记的内毒素部分的二抗使用以免疫为基础的检测方法在这方面尤其有用。4.21生物功能等效体(biological functional equivalents)

在本发明中的多肽以及编码多肽的DNA区段结构中可以修饰和改变，这样就能得到编码想要特定蛋白质或肽的功能性分子。以下讨论内容的基础是，改变蛋白质的氨基酸产生出等效甚或增强的第二代分子。我们认为，在本发明的特定实施方案中，突变晶体蛋白在增强蛋白质的杀虫活性方面并因此增强重组转基因在植物细胞中的杀虫活性及/或表达水平方面是有用的。根据表8中给出的密码子，可以通过改变DNA序列中的密码子完成氨基酸的变动。

表8氨基酸密码子丙氨酸 Ala A GCA GCC GCG GCU半胱氨酸 Cys C UGC UGU天冬氨酸 Asp D GAC GAU谷氨酸 Glu E GAA GAG苯丙氨酸 Phe F UUC UUU甘氨酸 Gly G GGA GGC GGG GGU组氨酸 His H CAC CAU异亮氨酸 Ile I AUA AUC AUU赖氨酸 Lys K AAA AAG亮氨酸 Leu L UUA UUG CUA CUC CUG CUU甲硫氨酸 Met M AUG天冬酰胺 Asn N AAC AAU脯氨酸 Pro P CCA CCC CCG CCU谷氨酰胺 Gln Q CAA CAG精氨酸 Arg R AGA AGG CGA CGC CGG CGU丝氨酸 Ser S AGC AGU UCA UCC UCG UCU苏氨酸 Thr T ACA ACC ACG ACU缬氨酸 Val V GUA GUC GUG GUU色氨酸 Trp W UGG酪氨酸 Tyr Y UAC UAU

例如，当与诸如抗体中抗原结合区或底物结合位点等结构相互结合能力没有明显丧失的情况下，可以将蛋白质结构中的某些氨基酸替换成其它氨基酸。因为蛋白质的相互作用能力和本质决定蛋白质的生物功能活性，所以蛋白质序列中可以进行某些氨基酸序列的替换，当然其DNA编码序列中也将进行某些替换，从而得到有类似特性的蛋白质。所以，发明者认为，在不丧失其生物功效或活性的情况下，在所公开组分的肽序列或对应的编码所说肽的DNA序列中可以有各种变动。

作以上变动时，可以考虑氨基酸的亲水指数(hydropathic index)。本领域通常对氨基酸亲水指数赋予蛋白质生物功能方面的重要性是了解的(Kyte和Doolittle，1982，在此引入作为参考)。一般认为，氨基酸的相对亲水特性促使所得蛋白质形成二级结构，而蛋白质的二级结构决定蛋白质与其它分子如酶、底物、受体、DNA、抗体、抗原等之间的相互作用。

各个氨基酸在其疏水性和电荷特性的基础上均指定了亲水指数(Kyte和Doolittle，1982)，分别为：异亮氨酸(+4.5)；缬氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)；甲硫氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)；苏氨酸(-0.7)；丝氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；组氨酸(-3.2)；谷氨酸(-3.5)；谷氨酰胺(-3.5)；天冬氨酸(-3.5)；天冬酰胺(-3.5)；赖氨酸(-3.9)；精氨酸(-4.5)。

在本领域中已知某些氨基酸可以由有相近亲水指数或分数的其它氨基酸取代，仍可以得到有相似生物活性的蛋白质，即能得到生物功能等效蛋白质。在作这些变动时，取代亲水指数在±2内的氨基酸是优选的，在±1内的尤其优选，在±0.5内的甚至更尤其优选。

本领域中同时可以理解的是，可以在亲水性(hydrophilicity)基础上有效取代相似氨基酸。在此将美国专利4554101引入作为参考，该专利认为，蛋白质的最大局部平均亲水性由其相邻氨基酸的亲水性决定，与蛋白质的生物特性相关。

正如美国专利4554101所详述的那样，分别给氨基酸残基指定了以下亲水性值：精氨酸(+3.0)；赖氨酸(+3.0)；天冬氨酸(+3.0±1)；谷氨酸(+3.0±1)；丝氨酸(+3.0)；天冬酰胺(+2.0)；谷氨酰胺(+2.0)；甘氨酸(0)；苏氨酸(-0.4)；脯氨酸(-0.5±1)；丙氨酸(-0.5)；组氨酸(-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；甲硫氨酸(-1.3)；缬氨酸(-1.5)；亮氨酸(-1.8)；异亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙氨酸(-2.5)；色氨酸(-3.4)。

一般认为，氨基酸可以替换成有相近亲水性值的另一个氨基酸，这样仍可以得到生物等效体尤其是免疫等效蛋白质。在这些变动中，取代亲水性指数在±2内的氨基酸是优选的，在±1内的尤其优选，在±0.5内的甚至更尤其优选。

正如上文略述，氨基酸取代的基础通常是氨基酸侧链取代的相对相似性如疏水性、亲水性、电荷、大小等。考虑到前面所述内容，典型的取代对本领域中的熟练技术人员是熟知的，包括：精氨酸和赖氨酸；谷氨酸和天冬氨酸；丝氨酸和苏氨酸；谷氨酰胺和天冬酰胺；以及缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。5.0实施例

以下实施例展示的是本发明的优选实施方案。本领域中的熟练技术人员应该了解，以下实施例中所公开的技术代表的是发明者发现的能在本发明实践中有作用的技术，考虑其可以组成本发明实践的优选方法。但是，就本公开内容来说，本领域中的熟练技术人员应该知道，在此公开的特定实施方案中可以有多种变动，在不违反本发明精神和范围的情况下也能获得类似或相似结果。5.1实施例1——苏云金芽孢杆菌EG4550菌株和EG5899菌株的分离

作物尘土样品取自从美国到国外的多种不同来源，通常取自谷物储藏设施。将作物尘土样品处理后分散在琼脂平板上，按照美国专利5187091所述分离单个芽孢杆菌菌落如苏云金芽孢杆菌，该专利内容在此特别完整引入作为参考。使用相差显微技术用视觉认定在处理后长出的菌落中鉴定有晶体内含体的细胞。用Gonzalez等(1982)所述改动过的Eckhardt琼脂糖凝胶电泳对产晶体的菌株进行鉴定。使用该方法可以将苏云金芽孢杆菌菌株中天然质粒的阵列显示出来。将质粒阵列与苏云金芽孢杆菌已知血清型比较，可以帮助鉴定野生型菌株(Carlton和Gonzalez，1985)。

产晶体苏云金芽孢杆菌菌株EG4550是从纽约作物尘土样品中分离出来的。形成芽孢的EG4550中的晶体内含体有截然不同的形态学，呈棒状。EG4550的质粒阵列与苏云金芽孢杆菌的任何已知血清型(serovar)均无相似性。

产晶体苏云金芽孢杆菌菌株EG5899是从加里弗尼亚作物尘土样品中分离出来的。形成芽孢的EG5899的晶体内含体是不同寻常的，因为这些晶体内含体好象以不规则形态形成的多附着晶体。EG5899的质粒阵列与苏云金芽孢杆菌的任何已知血清型均无相似性。

对苏云金芽孢杆菌菌株EG4550和EG5899进行的昆虫生物测定(insect bioassay)表明，这些菌株对包括SCRW在内的鞘翅目昆虫幼虫有毒杀作用，这说明在这些菌株的晶体中包含新的杀虫蛋白。用ARSPatent Culture Collection沉淀EG4550和EG5899，其NRRL号分别指定为B-21784和B-21783。表9中所列是本发明中的这些菌株及其它菌株。

表9

野生型细菌菌株和重组细菌菌株a菌株 NRRL NRRL 生物质粒克隆片段载体已知cry 质粒

索取号保藏日期基因抗生素标记EG4550 B-21784 5-30-97 苏云金芽孢杆菌 - - - cryET39，74，75 -EG5899 B-21783 5-30-97 苏云金芽孢杆菌 - - - cryET39，74，75 -EG11582 - - 大肠杆菌 pEG1337 8.4-kb HindIII pUC18 cryET39，74，75 AmpEG11525 - - 大肠杆菌 pEG1321 8.4-kb HindIII pEG597 cryET39，74，75 AmpEG11529 B-21917 2-12-98 苏云金芽孢杆菌 pEG1321 8.4-kb HindIII pEG597 cryET39，74，75 CmEG11521 - - 大肠杆菌 pEG1319 8.4-kb HindIII pBluescript cryET39，74，75 AmpEG11934 - - 苏云金芽孢杆菌 pEG1918 4.5-kb HindIII pHT315 cryET75 ErythEG11935 - - 苏云金芽孢杆菌 pEG1919 3.2-kb HindIII-EcoRI pHT315 cryET74 ErythEG11936 - - 苏云金芽孢杆菌 pEG1920 3.7-kb HindIII pHT315 cryET39，74 ErythEG11937 - - 苏云金芽孢杆菌 pEG1921 1.4-kb HindIII pEG1915 cryET39 ErythEG4100 B-21786 5-30-97 苏云金芽孢杆菌 - - - cryET69 -EG11647 B-21787 5-30-97 苏云金芽孢杆菌 pEG1820 Mbol partial pHT315 cryET69 ErythEG9444 B-21785 5-30-97 苏云金芽孢杆菌 - - - cryET7l，79 -EG11648 B-21788 5-30-97 苏云金芽孢杆菌 pEG1821 Mbol partial pHT315 cryET71，79 ErythEG4851 B-21915 2-12-98 苏云金芽孢杆菌 - - - cryET76，80，84 -EG11658 B-21916 2-12-98 苏云金芽孢杆菌 pEG1823 Mbol partial pHT315 cryET76，80，84 Eryth^a以上所列构建体详细内容见下面的实施例。

^b实验培养物，在保证在本专利未决期间，对于由专利及商标委员会按照37 C.F.R.1.14和35 U.S.C.122给予此权利的主体可以获得培养物的条件下保藏。在本申请的相应申请，或其子代已提交的国家，按外国专利法请求本储藏物也是可以得到的。然而，应当理解，获得此保藏物并不构成许可实施本发明以损害由政府行为授予的专利权。按照布达佩斯微生物保藏条约，本培养物保藏物将被储存并可为公众所得。即，将尽谨慎保持其在最近一次请求提供保藏样品五年内，并在任何情况下，在保藏之日，或任何公开了该培养物的专利的有效期起至少30年存活且不被污染。储存者明白置换保藏物的责任使得当请求时，由于保藏条件的原因，保藏机构不能提供样品。当公开此保藏的专利被授权时，所有对于公众获得此培养物保藏物的限制将被不可逆撤消。

表3所示的培养物按照布达佩斯条约被保藏在AgriculturalReseach Service Culture Collection，Northern Regional ResearchLaboratory(NRRL)，1815 N.University Street，Peoria，IL 61604。5.2实施例2——对EG4550和EG5899的晶体蛋白的评定

于30℃在C2芽孢形成培养基(Donovan等，J.Biol.Chem.，263：561-567，1988)中培养菌株EG4550和EG5899 3天，培养物在该过程中生长到稳定期(stationary phase)，随后形成芽孢，培养物裂解后将蛋白质内含物释放到培养基中。培养物经离心收集包含芽孢和晶体的细胞沉淀。将沉淀悬浮在0.005％Triton X-100溶液中进行漂洗，随后离心。将漂洗后的沉淀重新悬浮在1/10体积原体积的0.005％TritonX-100中。

通过将芽孢-晶体悬液于100℃温育在增溶缓冲液[0.14M Tris-HClpH8.0，2％(wt./vol.)十二烷基硫酸纳(SDS)，5％(vol./vol.)2-巯基乙醇，10％(vol./vol.)，1％溴酚蓝]中5分钟使晶体蛋白增溶。用12.5％丙烯酰胺凝胶通过SDS-PAGE将溶解后的晶体蛋白按大小进行分离。

蛋白质按大小进行分离后，通过用考马斯亮蓝R-250染色显色。菌株EG4550显示出的蛋白质的分子量大约为45kDa和15kDa。菌株EG5899显示出的蛋白质的分子量大约为160kDa、45kDa、35kDa和15kDa。5.3实施例3——EG4550的CryET39晶体蛋白的特性

将EG4550约45kDa的蛋白质氨基末端序列称为CryET39，并确定了该序列。EG4550的芽孢培养物经过漂洗并重新悬浮。悬液中的晶体蛋白溶解后按照SDS-PAGE分析法在10％丙烯酰胺凝胶上跑电泳。电泳之后，使用标准蛋白质印迹方法将蛋白质转移到BioRad PVDF膜上。转移后，蒸馏水中漂洗膜3次后使用酰胺黑1013(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)染色1分钟。滤膜在5％乙酸中脱色1分钟后用蒸馏水漂洗3次。用剃须刀片将包含约45kDa CryET39条带的滤膜部分切掉。使用该方法得到纯化的CryET39，该蛋白质条带印迹在PVDF膜上(BioRad，Hercules，CA)。

在Tufts Medical Schoo(Boston，MA)的生理系中，使用艾德曼降解方法(Edman degradation procedures)确定固定在膜上的纯化CryET39蛋白质氨基末端的氨基酸序列。其氨基酸序列确定为：

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

Met Leu Asp Thr Asn Lys Val Tyr Glu Ile Ser Asn His Ala Asn

(SEQ ID NO：20)

使用计算机算法(Korn和Queen，1984)将CryET39蛋白质氨基末端序列与发明者所知的所有苏云金芽孢杆菌晶体蛋白氨基酸比较，包括科技文献、国际专利申请或发行专利中公开的所有苏云金芽孢杆菌晶体蛋白序列。序列公开并给予基因/蛋白质命名的晶体蛋白一览表如表2所示。5.4实施例4——分离包括cryET39基因的DNA片段

为了鉴定编码CryET39的基因，设计蛋白质氨基末端氨基酸序列特异的寡核苷酸探针。使用通常在苏云金芽孢杆菌内毒素基因中发现的密码子，通过Integrated DNA Technologies，Inc.(Coraville，IA)合成出41核苷酸的寡核苷酸并称为wd271。 wd271的序列为：

5′-ATGTTAGATACAAATAAAGTATATGAAATTTCAAATCATGC-3′

(SEQ ID NO：21)

按照下文所述在Southern杂交实验中使用放射性标记的wd271为探针，确定包含cryET39基因的限制片段。通过以下步骤从菌株EG4550和EG5899中提取总DNA。将营养细胞重新悬浮在裂解缓冲液中，缓冲液中包含50mM葡萄糖、25mM Tris-HCl(pH8.0)、10mM EDTA和4mg/ml溶菌酶。将悬浮液在37℃温育1小时。温育后，悬浮液用等体积的苯酚抽提1次，然后用等体积的苯酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)抽提1次，再用等体积的氯仿∶异戊醇(24∶1)抽提1次。加入1/10体积的3M乙酸钠及2倍体积100％乙醇，从水相中沉淀DNA。通过离心收集沉淀的DNA，沉淀DNA用70％乙醇漂洗并重新悬浮在蒸馏水中。

然后使用制造商建议的条件在不同反应体系中用各种限制性内切酶(restriction endonuclease)包括EcoR I和Hind III(Promega Corp.，Madison，WI)消化提取出的DNA。通过1×TBE(0.089M Tris-硼酸，0.089M硼酸，0.002M EDTA)中的0.8％琼脂糖凝胶按2伏/厘米胶长电泳过夜，按大小分离消化后的DNA。然后，根据Southern(1975)的方法将分离后的DNA片段转移到Millipore Immobilon-NC硝酸纤维素滤膜(Millipore Corp.，Bedford，MA)上。在真空烘箱中80℃烘烤滤膜，将DNA片段固定到硝酸纤维素滤膜上。

使用寡核苷酸wd271作杂交探针完成对包含编码CryET39蛋白质氨基末端的序列(参照实施例3)的DNA片段的确认。放射性标记探针时，在包含[γ-³²P]ATP(3μl 3000 Ci/mmol，20μl反应体系中为10mCi/ml)、10×反应缓冲液(700mM Tris-HCl(pH7.8)、100mM MgCl₂、50mM DTT)及10个单位的T4多核苷酸激酶(Promega Corp.)的反应中加入1～5pmol wd271。在37℃温育反应20分钟，使放射性磷酸转移到寡核苷酸的5’末端，得到有用的杂交探针。

标记好的探针在3×SSC、0.1％SDS、10×Denhardt’s试剂(0.2％BSA、0.2％聚乙烯吡咯烷酮、0.2％Ficoll)、0.2mg/ml肝素中与硝酸纤维素滤膜于45℃温育过夜。温育后，于45℃用3×SSC、0.1％SDS漂洗滤膜数次。吸干滤膜，于-70℃在有DuPont Cronex增感屏的情况下将滤膜过夜暴光于Kodak X-OMAT AR X-射线胶片(Eastman KodakCompany，Rochester，NY)，得到放射自显影图。

放射自显影图确认出菌株EG4550 DNA中有大约2.5kb wd271杂交EcoR I片段。菌株EG5899中有大约8.4kb的Hind III片段，该片段与标记的wd271特异杂交。结果表明，EG4550和EG5899均包含与cryET39基因相关甚或相同的拷贝。5.5实施例5——cryET39基因的克隆

首次克隆研究包括EG4550的2.5kb EcoR I片段的分离，以便表达并鉴定EG4550的CryET39蛋白质。然而，当在苏云金芽孢杆菌重组菌株中克隆并表达该片段时，仅仅产生出15kDa的蛋白质，这表明在2.5kb EcoR I片段中并不包含完整且有功能的cryET39基因。该结果也表明，15kDa晶体蛋白和CryET39的基因相当接近。产生15kDa蛋白质的重组苏云金芽孢杆菌菌株称作EG11467，对SCRW幼虫无毒杀作用。

按照5.4部分中所述从总基因组DNA中分离包含EG5899 cryET39基因的大约8.4kb Hind III限制片段。用Hind III消化DNA后，通过0.8％琼脂糖、1×TBE凝胶在2伏/厘米胶长的情况下电泳。凝胶用溴化乙锭染色，这样消化后的DNA在暴露于长波UV光时就变得可见了。然后，使用Geneclean流程(Bio 101，Vista，CA)从凝胶切片中纯化DNA片段。

将分离的DNA片段连接到噬菌粒pBluescriptII SK+(Stratagene，LaJolla，CA)中，得到的大肠杆菌文库中的有按大小进行选择的Hind III限制片段。噬菌粒DNA载体pBluescriptII SK+能在大肠杆菌中以高拷贝数进行复制，携带有抗生素氨苄青霉素抗性基因，可以用作选择标记。将片段与用Hind III消化的pBluescriptIISK+混合，而后者预先用细菌碱性磷酸酶(GibcoBRL，Gaithersburg，MD)处理以从消化的质粒中去除5’磷酸，这样处理可以抑制载体本身的自连。在包含消化质粒与按大小进行选择的Hind III片段的反应中加入T4连接酶和连接缓冲液(Promega Corp.)。反应混合物于室温条件下温育1小时，使Hind III片段插入并连接到pBluescriptII SK+载体中。

按照制造商所述流程将连接混合物导入到转化感受态大肠杆菌DH5α^TM细胞(GibcoBRL)中。将转化后的大肠杆菌细胞铺板到包含50μl/ml氨苄青霉素的LB琼脂平板上，并于37℃温育过夜。在每个平板上长出数百个氨苄青霉素抗性菌落，说明在每一个这些菌落中的细胞中都有重组质粒的存在。

为了分离带有包含cryET39基因的克隆8.4kb Hind III片段的菌落，首先将菌落转移到硝酸纤维素滤膜上。将圆形滤纸(Millipore HATF 08525，Millipore Corp.，Bedford，MA)直接放到包含转化菌落的LB-氨苄青霉素琼脂糖平板上，即可完成该过程。当从平板上慢慢揭下滤膜时菌落粘附到滤膜上，即正确产生出原来平板上菌落排列方式的影印。平板上每个菌落都留下充足的细胞，37℃培养5-6个小时后即能恢复菌落。然后将平板保存在4℃备用。随后将带有转移菌落的硝酸纤维素滤膜按菌落面向上的方式，放置到LB-氨苄青霉素琼脂糖平板上，37℃培养直到菌落长到直径约为1毫米为止。

为使DNA从重组大肠杆菌细胞中释放出来，将硝酸纤维素滤膜按菌落面向上的方式放置到用0.5N NaOH、1.5M NaCl浸泡过的2片Whatman 3MM层析纸(Whatman International Ltd.，Maidstone，England)上15分钟。此处理能裂解细胞并能变性释放出的DNA，将DNA固定到硝酸纤维素滤膜上。随后将滤膜中和：将滤膜菌落面向上放置到用1M乙酸铵、0.02M NaOH浸泡过的2片Whatman纸上10分钟。然后用3×SSC漂洗滤膜，空气中干燥后在真空烘箱中于80℃烘烤1小时，以备杂交使用。

cryET39基因特异的氨基末端寡核苷酸wd271，按如上所述用γ-³²P和T4多核苷酸激酶标记其5’末端。滤膜放在3×SSC、0.1％SDS、10×Denhardt’s试剂(0.2％BSA、0.2％聚乙烯吡咯烷酮、0.2％Ficoll)、0.2mg/ml肝素中，加入标记探针后于40℃温育过夜。选择这些条件，是因为这些条件可以使标记的寡核苷酸与转化大肠杆菌菌落的硝酸纤维素印迹上的相关序列进行杂交。温育之后，滤膜于45℃用3×SSC、0.1％SDS漂洗数次。吸干滤膜，于-70℃在有DuPont Cronex增感屏的情况下将滤膜过夜暴光于Kodak X-OMAT AR X-射线胶片(EastmanKodak)。

该转化中有数个菌落与wd271杂交。确认这些菌落：将放射自显影图上的信号与原始转化平板上的菌落排列比较。随后，分离出的菌落在LB-氨苄青霉素液体培养基中培养，培养基中的细胞收获后可以用标准碱裂解小量制备方法(Maniatis等，1982)制备重组质粒。分离出的质粒用限制性酶Hind III消化，表明EG5899 DNA中的克隆片段为预计大小，即8.4kb。6个杂交菌落中的Hind III消化质粒DNA通过琼脂糖凝胶电泳后，按如上所述转移到硝酸纤维素上。随后，印迹与寡核苷酸wd271杂交，而后者在此之前其5’末端已经用γ-³²P和T4多核苷酸激酶进行放射性标记。所有这6个消化质粒中的大约8.4kb的插入片段均与wd271杂交，证明存在cryET39基因。其中一个质粒中8.4kb插入片段包含cryET39基因，将该质粒称为pEG1319。包含pEG1319的大肠杆菌菌株称作EG11521。5.6实施例6——来自EG11529的重组蛋白的表达

为了了解CryET39蛋白质的特性，有必要在不产生晶体蛋白的苏云金芽孢杆菌细胞(Cry-)中表达克隆的cryET39基因。为此，将来自pEG1319中的克隆的8.4kb Hind III片段插入到能在苏云金芽孢杆菌中复制的质粒中，这样就能表达cryET39基因并产生出编码的蛋白质。

用Hind III消化pEG1319，切除克隆的8.4kb片段。消化后的质粒在琼脂糖凝胶上进行分离，并切除包含8.4kb片段的凝胶切片。使用GeneClean方法(Bio101)从凝胶切片中纯化8.4kb Hind III片段。将该片段连接到苏云金芽孢杆菌/大肠杆菌穿梭载体中，而穿梭载体在此之前已经用Hind III消化并用细菌碱性磷酸酶处理。Baum等(1990)对称为pEG597的穿梭载体进行了描述。pEG597既能在大肠杆菌中复制又能在苏云金芽孢杆菌中复制，赋予大肠杆菌以氨苄青霉素抗性，赋予苏云金芽孢杆菌以氯霉素抗性。使用制造商所述转化方法(GibcoBRL)将连接混合物引入到大肠杆菌DH5α^TM细胞中。从Amp^R转化体中制备质粒DNA，用限制性酶分析法证实构建正确。将包含插入到pEG597中的8.4kb Hind III片段的质粒命名为pEG1321。将带有pEG1321的大肠杆菌菌株命名为EG11525。

通过电穿孔(Macaluso和Mettus，1991)将pEG1321引入到Cry-苏云金芽孢杆菌菌株EG10368中。通过在包含3μg/ml氯霉素的LB琼脂平板上温育过夜，选择出转化了氯霉素抗性的细胞。从数个苏云金芽孢杆菌转化体中分离质粒DNA。分离出的质粒用Hind III消化并通过琼脂糖凝胶电泳。所有转化体都有对应于8.4kb cryET39基因片段和pEG597载体的限制片段。为了证实质粒构建的正确，将限制片段印迹到硝酸纤维素滤膜上后，按上文所述滤膜与cryET39特异的寡核苷酸wd271杂交。wd271探针与克隆的8.4kb Hind III片段杂交，证实pEG1321包含cryET39基因且已经成功引入到苏云金芽孢杆菌中。将包含pEG1321的苏云金芽孢杆菌重组菌株命名为EG11529。用NRRL沉淀EG11529，指定保藏号为B-21917。

EG11529在包含5μg/ml氯霉素的DSM+葡萄糖芽孢形成培养基培养[0.8％(wt./vol.)Difco营养肉汤、0.5％(wt./vol.)葡萄糖、10mMK₂HPO₄、10mM KH₂PO₄、1mM Ca(NO₃)₂、0.5mM MgSO4、10μMnCl2、10μM FeSO₄]上于30℃培养3天，培养过程中培养物生长到稳定期，形成芽孢后细胞裂解，将蛋白质内含体释放到培养基中。通过离心收获培养物。包含芽孢和蛋白质晶体的沉淀用0.005％Triton X-100、2mM EDTA溶液漂洗后离心。将漂洗后的沉淀重新悬浮在1/10原体积的0.005％Triton X-100、2mM EDTA中。

通过将悬浮液在溶解缓冲液[0.14M Tris-HCl(pH8.0)、2％(wt./vol.)十二烷基硫酸钠(SDS)、5％(wt./vol.)2-巯基乙醇、10％(wt./vol.)甘油及0.1％溴酚蓝]中于100℃温育5分钟使晶体蛋白从芽孢-晶体悬浮液中溶解出来。溶解后的晶体蛋白通过SDS-PAGE按大小进行分离。按大小分离后，通过用考马斯亮蓝R-250染色的方法使蛋白质显色。分析表明，在菌株EG11529中产生了3中截然不同的晶体蛋白。除产生44kDa的CryET39外，还产生了大约15kDa和35kDa的多肽。

通过用如5.12部分中所述蔗糖分级梯度(分级：55％、68％、72％、79％)离心法，可以将苏云金芽孢杆菌中表达的35kDa晶体蛋白与44kDa(CryET39)和15kDa蛋白质分离开来。使用5.3部分中所述方法完成对分离的35kDa蛋白质氨基末端氨基酸序列的确定工作。35kDa蛋白质氨基末端氨基酸序列如下所示：

SILNLQDLSQKYMTAALNKI(SEQ ID NO：22)

将35kDa蛋白质氨基末端与推断出的CryET39氨基酸序列进行比较，证实35kDa蛋白质并不是CryET39蛋白质的加工形式。将大约为35kDa的蛋白质命名为CryET75，将编码该蛋白质的基因(该基因位于EG5899的8.4kb片段上)命名为cryET75。

含有CryET39蔗糖梯度级分也含有大约15-kDa蛋白，称为CryET74。按照5.3的关于CryET39的方法确定CryET74的氨基末端序列。分离的CryET74蛋白的氨基末端序列是：

SARQVHIQINNKTRH(SEQ ID NO：23)

该序列与CryET39 CryET75的序列比较表明CryET74是由第3个基因，称之为CryET74，编码的，它存在于EG5899的8.4kb的Hind III片段上。5.7实施例7——cryET39基因的序列测定及其所编码多肽氨基酸序列的确定

为了测定cryET39、cryET74和cryET75基因的序列，将pEG1319中的8.4kb Hind III片段亚克隆到Hind III消化后的pUC18(Yanisch-Perron等，1985)中。将该质粒命名为pEG1337，如图1所示。

使用标准碱裂解法或Qiagen质粒试剂盒(Qiagen Inc.，Chatworth，CA)完成对pEG1337双链质粒模板DNA的制备工作。按照制造商指定程序使用Sequenase^TM Version 2.0 DNA测序试剂盒(UnitedStates Biochemical/Amersham Life Science Inc.，Cleveland，OH)并使用³⁵S-[dATP]标记同位素(DuPont NEN Research Products，Boston，MA)进行测序反应。反应在6％(wt./vol.)丙烯酰胺、42％(wt./vol.)尿素测序胶上进行变性凝胶电泳。在室温下将干胶过夜暴光于Kodak X-OMAT AR X射线胶片(Eastman Kodak)。

将氨基末端特异的寡核苷酸wd271作为测序起始引物。使用如上所述流程确定cryET39基因的全序列。从前套反应的测序参数中设计出用于引发测序反应的连续寡核苷酸。这样，DNA序列测定将同时沿着cryET39基因的上链和底链分段进行。

在CryET75蛋白质氨基末端氨基酸序列基础上设计寡核苷酸引物，用于cryET75基因的序列测定。将寡核苷酸命名为MR51，其序列为：

5′-TCACAAAAATATATGAACAGC-3′(SEQ ID NO：24)

使用如上所述DNA测序程序，确定cryET75基因的部分核苷酸序列时使用自动测序完成序列的测定工作。根据制造商指定流程使用ABIPRISMDyeDeoxy测序试剂(Applied Biosystems，Inc.，CA)测定DNA样品的序列。反应结束后在ABI 377自动DNA测序仪上电泳。使用Sequencher v3.0 DNA分析软件(Gene Codes Corporation，Ann Arbor，MI)对DNA序列资料进行分析。然后通过翻译cryET75的开放阅读框推断出CryET75蛋白质的氨基酸序列。所确定的CryET75的氨基末端序列，与由核苷酸序列得出的氨基末端氨基酸序列相同。

如5.11部分中所述，将来自EG44529的8.4kb Hind III片段进一步消化后将片段亚克隆，分别单独或一同表达晶体蛋白。CryET39蛋白质的表达取决于将cryET74基因克隆在同一限制片段上。这表明，cryET74基因位于cryET39基因的上游，cryET74基因的启动子也能指导cryET39基因的表达。设计cryET39基因5’端DNA序列特异寡核苷酸作为自动测序的引物。在各套测序反应数据的基础上设计连续引物。这样，cryET39的上游区段可以分段进行测序。DNA序列的翻译找出编码CryET74蛋白质的开放阅读框。确定出在推断出的氨基酸序列中有一个区段与CryET74氨基末端氨基酸序列相同，证明此开放阅读框是cryET74基因。5.7.1 CryET39

CryET39基因的DNA序列如SEQ ID NO：7所示，编码CryET39多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示。5.7.1.3从EG5899分离的CryET39多肽的特性

CryET39多肽包括有385个氨基酸的序列，其分子量计算值为44246Da，其PI计算值为5.47。表11中给出CryET39多肽的氨基酸组成。

表11

CryET39的氨基酸组成氨基酸残基个数占总数的％氨基酸残基个数占总数的％

Ala 6 1.5 Leu 33 8.5

Arg 3 0.7 Lys 39 10.1

Asn 31 8.0 Met 8 2.0

Asp 23 5.9 Phe 6 1.5

Cys 2 0.5 Pro 16 4.1

Gln 17 4.4 Ser 30 7.7

Glu 27 7.0 Thr 36 9.3

Gly 19 4.9 Trp 7 1.8

His 8 2.0 Tyr 24 6.2

Ile 32 8.3 Val 18 4.6酸性氨基酸 (Asp+Glu) 50碱性氨基酸 (Arg+Lys) 42芳香族氨基酸 (Phe+Trp+Tyr) 37疏水性氨基酸 (芳香氨基酸+Ile+Leu+Met+Val) 1265.7.2 CryET74

CryET74基因的DNA序列如SEQ ID NO：5所示，编码CryET74多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示。5.7.2.3 CryET74多肽的特性

CryET74多肽包括有119个氨基酸的序列，其分子量计算值为13221Da，其PI计算值为6.21。表12中给出CryET74多肽的氨基酸组成。

表12

CryET74的氨基酸组成氨基酸残基个数占总数的％氨基酸残基个数占总数的％Ala 4 3.3 Leu 6 5.0Arg 6 5.0 Lys 7 5.8Asn 6 5.0 Met 2 1.6 氨基酸残基个数占总数的％氨基酸残基个数占总数的％

Asp 7 5.8 Phe 4 3.3

Cys 1 0.8 Pro 3 2.5

Gln 3 2.5 Ser 13 10.9

Glu 8 6.7 Thr 12 10.0

Gly 10 8.4 Trp 1 0.8

His 5 4.2 Tyr 4 3.3

Ile 9 7.5 Val 8 6.7酸性氨基酸 (Asp+Glu) 15碱性氨基酸 (Arg+Lys) 13芳香族氨基酸 (Phe+Trp+Tyr) 9疏水性氨基酸 (芳香氨基酸+Ile+Leu+Met+Val) 345.7.3 CryET75

CryET75基因的DNA序列如SEQ ID NO：15所示，编码CryET75多肽的氨基酸序列，如SEQ ID NO：16所示。5.7.3.3 CryET75多肽的特性

SEQ ID NO：15多肽包括有310个氨基酸的序列，其分子量计算值为34259Da，其PI计算值为5.67。表13中给出GryET75多肽的氨基酸组成。

表13

CryET75的氨基酸组成氨基酸残基个数占总数的％氨基酸残基个数占总数的％Ala 15 4.8 Leu 24 7.7Arg 5 1.6 Lys 29 9.3Asn 15 4.8 Met 7 2.2Asp 17 5.4 Phe 11 3.5Cys 2 0.6 Pro 9 2.9Gln 11 3.5 Ser 34 10.9Glu 22 7.0 Thr 33 10.6Gly 17 5.4 Trp 1 0.3 氨基酸残基个数占总数的％氨基酸残基个数占总数的％

His 6 1.9 Tyr 11 3.5

Ile 22 7.0 Val 19 6.1酸性氨基酸 (Asp+Glu) 39碱性氨基酸 (Arg+Lys) 34芳香族氨基酸 (Phe+Trp+Tyr) 23疏水性氨基酸 (芳香氨基酸+Ile+Leu+Met+Val) 955.8实施例8——CryET39的同源性分析

用推断出的CryET39蛋白质的氨基酸序列查询相关蛋白质同源性的电子序列数据。使用FASTA3.15版本(Pear和Lipman，1988)在欧洲生物信息协会FASTA服务器上以以下参数(matrix＝pam150，ktup＝2，gapcost＝-12，gapxcost＝-2)查询SWISS-PROT ALL(swall)数据。数据查询结果显示，CryET39与来自B.sphaericus的42kDa杀蚊晶体蛋白322个氨基酸区有～25％氨基酸序列相似性。CryET39与来自B.sphaericus的51kDa晶体蛋白343个氨基酸区有～20％氨基酸序列相似性。数据中再没有其它蛋白质序列与CryET39序列有明显的序列相似性。使用BLASTP2.0版本(Altschul等，1997)运用以下参数：matrix＝blosum62、gapped alignment、other parameters＝defaultsettings，再用CryET39的氨基酸序列查询国家中心生物技术信息(NCBI)的冗余(nr)数据。nr数据包括来自于GenBank的PDS、SWISS-PROT、PIR及CDS转换的序列结果。查询结果与使用FASTA查询所得结果一致。5.9实施例9——CryET74相关蛋白质的数据查询

同样，利用5.8中所述的FASTA和BLASTP，用推断的CryET74的氨基酸序列查询SWISS-PROT ALL数据和nr数据。没有发现与CryET74有明显序列相似性的蛋白质。5.10实施例10——CryET75相关蛋白质的数据查询

同样，利用5.8中所述的FASTA和BLASTP，用推断的CryET75的氨基酸序列查询SWISS-PROT ALL数据和nr数据。FASTA查询结果显示，CryET75与Cry15Aa(GenBank登陆号M76442)在121个氨基酸的序列上有28.1％的序列同一性。BLASTP分析表明，在231个氨基酸的区域上有23％的序列同一性。5.11实施例11——cryET39基因和cryET74基因的亚克隆和表达

从EG11529裂解培养物中获得的伴胞晶体蔗糖梯度组分中，既包括CryET39多肽又包括CryE74多肽。对CryET39和CryE74制剂进行生物鉴定，表明该制剂与由EG11529制备的总晶体蛋白一样，对WCRW有毒杀作用。为单独确定CryET39蛋白质的杀虫活性，有必要从另一个启动子下游克隆cryET39基因。正如下文所述，该过程是通过使用PCR^TM来完成的，扩增苏云金芽孢杆菌晶体蛋白Cry2Ac(Wu et al.，1991)的启动子区，并放置在穿梭载体中PCR^TM扩增的cryET39基因的上游，仅使CryET39蛋白质在重组苏云金芽孢杆菌菌株中表达。

设计寡核苷酸作为PCR^TM扩增及随后cry2Ac基因调控区克隆的引物；包括开放阅读框ORF1和ORF2、核糖体结合位点以及Cry2Ac的起始密码子。寡聚物mr47包括cry2Ac编码区起始密码子上游2124个碱基对处的EcoR I限制位点。mr47的序列为：

5′-ATATCTATA GAATTCGCAATTCGTCCATGTG-3′(SEQ ID NO：25)

EcoRI

互补的寡核苷酸引物，mr43，由cry2Ac基因核糖体结合位点和起始密码子(Met)的倒转互补序列组成。在RBS与Met密码子之间插入了一个Hind III位点，可以插入cryET39基因序列的读框。mr43的序列为：

5′-CAGTATT CATAT AAGCTTCCTCCTTTAATA-3′(SEQ ID NO：26)

Met Hind III RBS

扩增cryET39基因的PCR^TM反应由以下组成：四种脱氧核苷三磷酸——dATP、dTTP、dCTP、dGTP，最终浓度200μM；5μL 10×Taq Extend^TMBuffer(Stratagene Cloning System)，终浓度为1×；10ng pEG1273，cry2Ac基因克隆到pUC18后构成pEG1273；寡核苷酸引物mr47和mr43的终浓度各为2.5μM；2.5个单位的Taq Extend^TM(Stratagene CloningSystem)；2.5个单位的Taq Polymerase(Promega Corp)；加dH₂O至最终反应体系50μl。反应在PowerBlock^TM EasyCycler^TM Series温度循环仪(Ericomp，Inc.，San Diego，CA)中进行。循环条件由94℃2min变性步骤组成，变性步骤之后为30个循环的94℃1min、50℃退火1min及72℃延伸10min。循环之后取5μl反应产物在0.8％琼脂糖凝胶上电泳，证实由PCR^TM产生出一条大约2-kb的产物条带。在制造商的指导下(QIAGEN，Inc.)使用QIAquick^TM spin柱将剩下的反应产物纯化。

随后将PCR^TM扩增出的cry2Ac启动子克隆到E.coli/B.thuringiensis穿梭载体pHT315(Arantes和Lereclus，1991)中。该过程是通过将pHT315和PCR^TM产物在分开的反应中用限制性酶EcoRI和Hind III消化来完成的。这些酶在pHT315的多克隆区中及PCR^TM产物末端附近切割，在由寡核苷酸mr47和mr43限定的序列中切割。通过琼脂糖凝胶分离消化过的PCR^TM产物，然后使用Geneclean方法(Bio101)将大约2kb的片段纯化。用类似方法纯化消化了的pHT315。然后，在包含T4 DNA连接酶和连接缓冲液的反应中(Promega Corp)将片段连接到消化了的pHT315之中。

参照制造商所述的方法将连接混合物导入到转化-感受态E.coliDH5α^TM细胞(GibcoBRL)中。E.coli细胞在包含50μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂平板上铺板，37℃培育过夜。pHT315包含能赋予已经成功转化该质粒的重组细胞氨苄青霉素抗性的基因。从数个抗氨苄青霉素的克隆中制备质粒DNA，用EcoR I和Hind III消化来证实2kb插入片段的存在。使用其中的一个命名为pEG1915的质粒进行cryET39基因的克隆和表达。

使用PCR^TM从pEG1337中的克隆8.4kb片段中扩增cryET39。设计寡核苷酸引物使cryET39插入到pEG1915中，以便基因能够从cry2Ac启动子表达。cryET39特异的寡核苷酸，mr44，包括cryET39的起始密码子(Met)，同时将Hind III位点人工改造到起始密码子中。mr44的序列为：

5′-AAGGTG AAGCTTTT ATGTTAGATACTAATAAAGTTTATG-3′(SEQ ID NO：27)

Hind III Met

设计第二种引物，称为mr45。设计该引物与cryET39编码区3’末端212个碱基对互补。将Hind III位点引入到mr45的序列之中。

5′-CCGGAATAG AAGCTTTGCATATGG-3′(SEQ ID NO：28)

Hind III

用mr44和mr45作为引物所产生的cryET39 PCR^TM产物用Hind III切割并插入到质粒pEG1915中由mr43确定的Hind III位点之中。这就取代了克隆cry2Ac启动子核糖体结合位点下游7碱基处的cryET39基因中的Met密码子。预想这样的构型可以使重组CryET39蛋白质有效表达。用将cryET39基因插入到pEG1915中去的连接反应转化E.coli DH5α^TM细胞产生氨苄青霉素抗性。制备质粒DNA，用限制性酶分析鉴定出一个克隆cryET39基因已经以适当方向插入到了pEG1915中。为使有效转录发生，cryET39的有意义链有必要以与cry2Ac启动子调控区相同的方向定向。用图2中所示酶进行酶切消化后，鉴定出其中一个质粒中以合适方向包含cryET39。将该质粒命名为pEG1921。

导入pEG1921将苏云金芽孢杆菌的一个Cry-菌株转化成红霉素抗性。重组菌株命名为EG11937，生长在C2芽孢形成培养基中直到形成芽孢、形成晶体。用相差显微镜明显鉴定出培养基中晶体包含体的形状为伸长的长方形或针形。通过离心收集芽孢、晶体以及未裂解的孢子囊。沉淀中的物质用0.005％Triton X-100、10mM Tris-HCl pH7.5溶液漂洗2次，然后悬浮在1/2体积的原漂洗溶液中。

用SDS-PAGE显示晶体中的蛋白质。在100μl样品中加入25μl 0.5NNaOH抑制蛋白质水解作用，因为在晶体溶解后蛋白质水解作用将破坏蛋白质。室温中2.5min后，在样品中加入65μl 3×Laemmli samplebuffer(30％甘油、15％2-巯基乙醇、3％SDS、0.1875M Tris、0.01％溴酚蓝)。样品加热到100℃ 5min，短暂离心后去除掉不溶物质，在丙烯酰胺凝胶上上样。用考马斯亮蓝R-250染色使蛋白质条带显色。分析结果表明，EG11937表达的是44kDa CryET39蛋白质，而并不是如重组菌株EG11529所产生的13kDa(CryET74)蛋白质或34kDa(CryET75)蛋白质。对由PCR^TM产生的pEG1921中cryET39基因的拷贝进行序列测定，证实与来自pEG1377的野生型拷贝相同。培养菌株EG11937，并准备对WCRW幼虫的生物鉴定。未曾料到的是，来自EG11937的晶体蛋白对昆虫没有活性。该结果表明，要么CryET39蛋白质的毒杀作用需要CryET74的存在，要么CryET74为有效毒素蛋白质。

用限制性内切酶Hind III和EcoR I消化pEG1377，释放出大约3.2kb的片段中包含cryET74基因以及一小部分的cryET39基因。在琼脂糖凝胶上分离该片段并纯化，然后使用上文中所述方法将该片段克隆到用Hind III和EcoR I消化过的穿梭载体pHT315中。将所得质粒称作pEG11935，通过电穿孔导入到Cry-苏云金芽孢杆菌菌株EG10650中，转化重组细胞成红霉素抗性。将命名为EG11935的转化体培养在C2芽孢形成培养基中，以确定所克隆的cryET74基因是否能够指导晶体蛋白的表达。收集培养物，通过如上所述的SDS-PAGE分析晶体蛋白。EG11935只产生CryET74，且对WCRW幼虫没有活性。

观察到单独的CryET39与CryET74对WCRW幼虫都没有活性，这表明这两种蛋白质相互作用相成毒素蛋白质组分。使用PCR^TM产生出包含CryET39基因和CryET74基因的DNA片段，但是在8.4kb pEG1377片段(参照pEG1377的图谱)上并没有CryET75基因。使用m13/pUC正向测序引物(GibcoBRL)和mr45扩增出大约为3.7kb包含cryET74和cryET39的产物。用pEG1377作为模板，使用如上所述条件进行PCR^TM。PCR^TM产物用凝胶纯化，用Hind III消化，然后克隆到用Hind III切割过并用细菌碱性磷酸酶处理过的pHT315中。将所得质粒称作pEG1920，用此质粒转化Cry^-苏云金芽孢杆菌菌株EG10650中产生红霉素抗性。培养命名为EG11936的重组体，估计晶体蛋白产量。EG11936既产生44kDa的CryET39多肽，又产生大约为13 kDa的CryET74多肽。与在重组菌株EG11529中所观察到的活性相比，EG11936产生的晶体蛋白对WCRW幼虫有活性。5.12 实施例12——晶体蛋白对昆虫的毒杀性5.12.1 EG11529晶体蛋白对SCRW幼虫的毒杀性

对表达CryET39多肽、CryET74多肽和CryET75多肽的重组菌株EG11529对SCRW(Diabrotica undecimpunctaia howardi)幼虫的毒性进行了检测。

EG11529于30℃在C2培养基中培养3天，直到芽孢形成、溶菌发生。离心收集培养物，在1×原体积的0.005％Triton X-100中漂洗2次，然后悬浮在1/10原体积的0.005％Triton X-100中。与EG11535比较，将表达鞘翅目毒性蛋白质Cry3B2(Donovan等，1992)的重组苏云金芽孢杆菌菌株培养后以相同方式收集。使用SDS-PAGE显示晶体中的蛋白质。在制造商的方法指导下，使用求积光密度计Model 300A(Molecular Dynamics，Sunnyvale，CA)通过与标准上样已知量的牛血清白蛋白质(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)比较对蛋白质定量。

通过与Marrone等(1992)类似的方法(无福尔马林)用表面污染人工饲喂方式生物测定SCRW幼虫。每个生物测定由8种连续水稀释液构成，在食物表面使用等分试样。稀释液(0.005％Triton X-100水溶液)凉干后，在食物上放置一龄幼虫并于28℃温浴。每一剂量检测32头幼虫。7天后计算死亡率。从重复的生物测定中收集数据进行概率值分析(Daum，1970)，死亡率用对照死亡校对，而对照仅为稀释液(Abbot，1925)。对导致LC₅₀的每孔晶体蛋白的量，即杀死50％待测昆虫所需的浓度，进行报道。同时报道置信区间。

表14 EG11529对SCRW幼虫的杀虫活性

样品 LC₅₀ 95％C.I.

(μg蛋白质/孔)EG11529 34.1 28-41EG11535(Cry3B2) 49.5 33-83

上表所示结果表明，EG11529晶体蛋白对SCRW幼虫有显著活性。EG11529的LC₅₀值比在Cry3B2对照蛋白质中所见的低，虽然95％置信区间的确重叠，这表明差异可能并不显著。5.12.2 CryET39和CryE74对WCRW幼虫的毒杀性

确定EG11529对WCRW幼虫(Diabrotica virgifera virgifera)的毒性，以及构建的产生单个EG11529晶体蛋白的重组菌株对WCRW幼虫的毒性。重组菌株及其产生的晶体蛋白如表15所示。

表15

Bt重组菌株表达的晶体蛋白 MW(kDa)^*

EG11529 CryET39 44kDa

CryET74 13kDa

CryET75 34kDa

EG11934 CryET75 34kDa

EG11935 CryET74 13kDa

EG11936 CryET39+CryET74 44kDa+13kDa

EG11937 CryET39 44kDa

*分子量是通过SDS-PAGE凝胶上蛋白质的迁移率以及与已知分子量标准比较估计出来的。

用基本上如所述SCRW分析方法进行一系列生物鉴定以确定晶体蛋白的活性，不同的是用的是新生幼虫而不是一龄幼虫。使用蔗糖分级梯度制备第一次分析的纯化晶体蛋白。于C2芽孢形成培养基中在30℃培养3天。形成芽孢且裂解的培养物通过离心收集，并用等体积漂洗缓冲液(10mM Tris-HCl，pH7.5，0.005％Triton X-100)漂洗2次，然后悬浮在1/10原体积漂洗溶液中。蔗糖分级梯度的制备方法是，于25×89mm Ultra-Clear离心管(Beckman Instruments，Inc.，PaloAlto，CA)中，在漂洗溶液中铺入浓度逐渐降低的蔗糖溶液。制作步骤由7.5ml每种以下浓度的蔗糖(从底部到顶部)构成：79％-72％-68％-55％。将5ml芽孢/晶体悬液铺到梯度的顶部。在L8-70M超速离心机(Beckman Instruments)中，于18000rpm 4℃过夜离心梯度。EG11529的晶体蛋白分离成2条明显不同的条带。一条条带位于68％-72％界面，仅包含CryET75蛋白质。第二条条带位于72％-79％界面，既包含CryET39又包含CryET74。用移液管将条带吸出，并在漂洗缓冲液中漂洗2次。随后蛋白质样品跑第二次梯度，确保CryET75与CryET39+CryET74完全分离。蛋白质样品在SDS-PAGE凝胶上跑样，以证实样品的完整性。随后按照制造商方法，使用标准蛋白质分析法(Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA)对样品定量。

CryET39+CryET74纯化晶体蛋白样品以及CryET75纯化晶体蛋白样品对WCRW幼虫的毒性与EG11529的毒性进行分析比较。将EG11529制备成芽孢/晶体悬液，通过SDS-PAGE以及光密度测定法确定蛋白质的量。从分析结果中收集数据进行概率值分析(Daum，1970)，死亡率用对照死亡校对，而对照仅为稀释液(Abbot，1925)。对导致LC₅₀的每孔晶体蛋白的量(175mm²食物表面)，即杀死50％待测昆虫所需的浓度，进行报道。同时在表16中报道95％置信区间。

表16

EG11529蛋白质对WCRW幼虫的杀虫活性

样品 LC₅₀ 95％C.I.

(μg蛋白质/孔)

CryET75 无活性*

EG11529 8.6 6.6-10.6CryET39+CryET74 9.7 7.2-12.7

*剂量为45μg/孔时的死亡率为6％

分析结果明显表明，纯化的CryET75蛋白质对WCRW幼虫没有毒杀作用。包含CryET39和CryET74混合物的样品与EG11529有相似的活性，这表明在EG11529对WCRW幼虫的毒性中CryET75没有协同作用。

为了确定CryET74是否是EG11529菌株的毒性组分，将仅产生CryET74的EG11935的芽孢/晶体悬液，与既产生CryET39又产生CryET74的EG11529和EG11936的芽孢/晶体悬液比较生物鉴定。从重复的生物测定中收集数据进行概率值分析(Daum，1970)，死亡率用对照死亡校对，而对照仅为稀释液(Abbot，1925)。对导致LC₅₀的每孔晶体蛋白的量(175mm²食物表面)，即杀死50％待测昆虫所需的浓度，进行报道同时在下面的表17中报道95％置信区间。

表17

苏云金芽孢杆菌蛋白质对WCRW幼虫的杀虫活性

样品 LC₅₀ 95％C.I.

(μg/孔)

EG11935 在80μg/孔时无活性*

EG11529 9.78 6.9-12.5

EG11936 14.5 9.7-19.5

EG11935产生的CryET74蛋白质对WCRW幼虫没有活性，表明CryET39蛋白质，或单独或与CryET74一起，负责如EG11529和EG11936中所见到的杀虫活性。

将仅产生CryET39晶体蛋白的EG11937的芽孢/晶体悬液与EG11936和EG11937的悬液进行分析比较。本分析方法中也包括50∶50 EG11935+EG11937的混合物，以观察CryET39与CryET74的混合物是否有与EG11936类似的活性。数据(表18)所表示的是百分数，为指定剂量校对了稀释液对照中对照死亡率后的死亡率。为了重复，制备了2个相同的EG11937样品。

表18

样品 Dose(μg/孔) 百分数

EG11935 80 0

EG11935 160 0

EG11936 80 100

EG11936 160 100

EG11937(1) 80 10.5

EG11937(1) 160 6.7

EG11937(2) 80 13.3

EG11937(2) 160 0

EG11935+EG11937(1) 80 100

EG11935+EG11937(1) 160 100

EG11935+EG111937(2) 80 100

EG11935+EG11937(2) 160 93.3

此测定结果清楚地表明，EG11937中表达的单独CryET39蛋白质本身并不能解释在EG11936或EG11529中所见到的活性。然而，将CryET74加入到CryET39蛋白质中后所得组合物对WCRW幼虫有毒杀作用。这些资料表明，CryET39和CryET74相互作用形成有毒组分——EG11529和EG11936。5.12.3 晶体蛋白EG11529对CPB幼虫的毒杀性

按如上所述收获形成芽孢的EG11529培养物并漂洗和重悬，并确定EG11529所产生的晶体蛋白对马铃薯甲虫(CPB)的幼虫是否有毒杀作用。使用与在SCRW测定中类似的技术对CPB幼虫进行测定实验，唯一的区别是将人工饲料替换成BioServe’s#9380昆虫食物(添加马铃薯片)。第3天时计算死亡率(而不是在第7天)。该测定中每140μg/孔的单一剂量中使用16只昆虫。在这种剂量下100％的幼虫被杀死，这说明EG11529对CPB幼虫有毒杀作用。5.13 实施例13——编码相关δ-内毒素多肽的基因的鉴定

形成芽孢的培养物中的伴胞晶体通过SDS-PAGE分析，证明苏云金芽孢杆菌产生的晶体蛋白大小为40-50kDa。按照如上所述流程提取总DNA，用限制性内切酶Hind III消化后通过琼脂糖凝胶电泳分离限制片段并印迹到硝酸纤维素滤膜上进行DNA印迹分析。使用PCR^TM技术扩增cryET39基因的区段，用此片段作为杂交探针从这些苏云金芽孢杆菌菌株中鉴定和克隆相关毒素基因。PCR^TM片段从cryET39编码区的第176个核苷酸一直延伸到距离基因3’末端200核苷酸处，该片段是使用反向引物mr13和mr24并以质粒pEG1337为模板产生的。

mr13：5’-TGACACAGCTATGGAGC-3’ (SEQ ID NO：33)

mr24：5’-ATGATTGCCGGAATAGAAGC-3’(SEQ ID NO：34)

使用α-³²P-ATP和随机引物标记试剂盒(Prime-a-GeneLabelingSystem；Promega Corporation，Madison，WI)对扩增出的DNA片段进行放射性标记。滤膜和cryET39特异杂交探针温育后在中等严格条件下(如在0.1X-1.0XSSC中于55℃漂洗)，用X胶片暴光得到鉴定包含cryET39相关序列的DNA片段的放射自显影图。数个菌株中产生出与EG5899不同的杂交模式。将这3个菌株分别命名为EG4100、EG4851和EG9444，并作进一步鉴定。

使用5.4部分、5.5部分及5.6部分中所述流程，完成对来自菌株EG4100、EG4851和EG9444的基因的克隆和表达。从菌株中制备DNA，用限制酶MboI部分消化后产生出基本随机分布的DNA片段。MboI片段在琼脂糖凝胶上分离后纯化大小在6-10kb之间的片段。随后将纯化出的MboI片段连接到苏云金芽孢杆菌/大肠杆菌穿梭载体pHT315中，而该穿梭载体预先用BamHI消化并用碱性磷酸酶处理。然后用连接混合物转化大肠杆菌产生氨苄青霉素抗性，这样就构建出了代表各个不同苏云金芽孢杆菌菌株基因组的克隆片段的文库。将大肠杆菌文库铺在含有50μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂平板上并将菌落转移到硝酸纤维素滤膜上。为了鉴定cryET39相关序列，滤膜要么用如5.4部分和5.5部分中所述的放射性标记寡核苷酸wd271杂交(EG9444文库)，要么按如上所述cryET39特异杂交探针杂交(EG4100和EG4851文库)。从杂交的大肠杆菌文库中分离质粒DNA，并转化acrystalliferous苏云金芽孢杆菌寄主菌株产生红霉素抗性。将重组苏云金芽孢杆菌克隆培养在C2培养基中形成芽孢，按如5.6部分中所述将晶体蛋白进行SDS-PAGE分析。

按如上所述方式从EG4100文库中鉴定出的克隆片段编码大约60kDa的晶体蛋白，将其命名为CryET69(SEQ ID NO：14)。DNA序列分析表明cryET39基因(SEQ ID NO：13)编码含有520个氨基酸残基的蛋白质。CryET69蛋白质与CryET39有～23％的序列相似性。将表达CryET69的重组苏云金芽孢杆菌菌株命名为EG11647，而将包含cryET39基因的重组质粒命名为pEG1820。用ARS Patent Culture Collection保藏EG4100和EG11647，指定其NRRL保藏号分别为B-21786和B-21787。

按如上所述从EG9444文库中分离的克隆片段编码大约为45 kDa的晶体蛋白，将该蛋白质命名为CryET71，与CryET39相关；克隆片段还编码大约为14 kDa的晶体蛋白，将该蛋白质命名为CryET79，与CryET74相关。DNA序列分析表明，cryET71基因(SEQ ID NO：11)编码含有397个氨基酸的蛋白质，而cryET79基因(SEQ ID NO：9)编码含有123个氨基酸的蛋白质。CryET71蛋白质(SEQ ID NO：12)与CryET39有78％的序列相似性，而CryET79蛋白质(SEQ ID NO：10)与CryET74有80％的序列相似性。将表达CryET71和CryET79的重组苏云金芽孢杆菌菌株命名为EG11648，同时将包含cryET71基因和cryET79基因的重组质粒命名为pEG1821(图9)。EG11648对WCRW幼虫有毒杀作用。通过它们与相关CryET39蛋白质和CryET74蛋白质的相似性，可以推断完全的WCRW毒杀性既需要CryET71又需要CryET79。于ARS Patent Culture Collection保藏EG9444和EG11648，指定其NRRL保藏号分别为B-21785和B-21788。

按如上所述从EG4851文库中分离的克隆片段编码大约为44kDa的晶体蛋白，将该蛋白质命名为CryET76，与CryET39相关；克隆片段还编码大约为15kDa的晶体蛋白，将该蛋白质命名为CryET80，与CryET74相关。DNA序列分析表明，cryET76基因(SEQ ID NO：1)编码含有387个氨基酸的蛋白质，而cryET80基因(SEQ ID NO：3)编码含有132个氨基酸的蛋白质。CryET76蛋白质(SEQ ID NO：2)与CryET39有61％的序列相似性，而CryET80蛋白质(SEQ ID NO：4)与CryET74有52％的序列相似性。将表达CryET76和CryET80的重组苏云金芽孢杆菌菌株命名为EG11658，同时将包含cryET76基因和cryET80基因的重组质粒命名为pEG1823(图9)。EG11658对WCRW幼虫有毒杀作用。通过它们与相关CryET39蛋白质和CryET74蛋白质的相似性，可以推断完全的WCRW毒杀性既需要CryET76又需要CryET80。于ARS PatentCulture Collection保藏EG4851和EG11658，指定其NRRL保藏号分别为B-21915和B-21916。

基于这些结果，发明者认为，使用与本文所述类似的流程可以发现并分离其它苏云金芽孢杆菌晶体蛋白毒素。可以从寡核苷酸、PCR^TM产物及限制片段制备出基于本文公开新序列的DNA探针，并用于鉴定与本文所述序列相关的其它基因。同时可以克隆得到这些新基因，并通过序列测定进行鉴定，而它们所编码的蛋白质可以利用本文所述方法对多种害虫进行生物测定的评估。反过来，正如上面的实施例中所见，新的基因也可以用于鉴定新的相关基因家族。5.14 实施例14——相关Cry基因的序列测定5.14.1 CryET71

利用寡核苷酸wd271作为测序引物并使用5.7部分中所述流程，得到cryET71基因的原始核苷酸序列。根据最初序列测定的结果设计出用于引发测序反应的连续寡核苷酸，以获得cryET71基因的全序列。

CryET71基因的DNA序列如SEQ ID NO：11所示，编码CryET71多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：12所示。5.14.1.4 CryET71多肽的特性

CryET71多肽包括有397个氨基酸的序列，其分子量计算值为45576Da，其PI计算值为4.75。表19中给出CryET71多肽的氨基酸组成。

表19

CryET71的氨基酸组成氨基酸残基个数占总数的％氨基酸残基个数占总数的％Ala 11 2.7 Leu 31 7.8Arg 8 2.0 Lys 30 7.5Asn 38 9.5 Met 8 2.0Asp 28 7.0 Phe 6 1.5Cys 2 0.5 Pro 16 4.0Gln 25 6.2 Ser 29 7.3Glu 22 5.5 Thr 33 8.3Gly 19 4.7 Trp 7 1.7His 5 1.2 Tyr 24 6.0Ile 41 10.3 Val 14 3.5酸性氨基酸 (Asp+Glu) 50碱性氨基酸 (Arg+Lys) 38芳香族氨基酸 (Phe+Trp+Tyr) 37疏水性氨基酸 (芳香氨基酸 +Ile+Leu+Met+Val) 1315.14.2 CryET79

从完成的cryET71序列设计寡核苷酸引物，利用该引物得到cryET79基因上游原始序列。根据制造商指定流程，使用ABI PRISM^TMDyeDeoxy序列测定化学试剂盒(Applied Biosystems)测定DNA样品序列。反应完成后，在ABI377自动化DNA测序仪上电泳。使用Sequencher v3.0 DNA分析软件(Gene Codes Corp.)分析DNA序列结果。根据最初序列测定的结果设计出用于引发测序反应的连续寡核苷酸，以获得cryET79基因的全序列。5.14.2.3 CryET79多肽的特性

CryET79多肽包括有123个氨基酸的序列，其分子量计算值为13609Da，其PI计算值为6.32。表20中给出CryET79多肽的氨基酸组成。

表20

CryET79的氨基酸组成氨基酸残基个数占总数的％氨暴酸残基个数占总数的％

Ala 5 4.0 Leu 4 3.2

Arg 4 3.2 Lys 6 4.8

Ash 12 9.7 Met 2 1.6

Asp 5 4.0 Phe 3 2.4

Cys 0 0 Pro 3 2.4

Gln 6 4.8 Ser 13 10.5

Glu 7 5.6 Thr 13 10.5

Gly 13 10.5 Trp 1 0.8

His 6 4.8 Tyr 8 6.5

Ile 6 4.8 Val 6 4.8酸性氨基酸 (Asp+Glu) 12碱性氨基酸 (Arg+Lys) 10芳香族氨基酸 (Phe+Trp+Tyr) 12疏水性氨基酸 (芳香氨基酸+Ile+Leu+Met+Val) 305.14.3 CryET69

使用5.3部分中所述流程确定所分离CryET69蛋白质氨基末端氨基酸序列。所分离蛋白质氨基末端序列为：

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

Met Asn Val Asn His Gly Met Ser Cys Gly Cys

(SEQ ID NO：29)

根据CryET69蛋白质氨基末端氨基酸序列设计寡核苷酸引物，用于cryET69的序列测定。将该寡核苷酸命名为crc12，其序列为：

5′-ATGAATGTAAATCATG-GGATGWSNTGT-3′(SEQ ID NO：30)其中，W＝A或T，S＝C或G。使用crc12作为测序引物并利用5.7部分中所述方法得到原始核苷酸序列。根据最初序列测定结果设计用于引发测序反应的连续寡核苷酸。使用自动化序列测定方法完成对序列的测定工作。根据制造商指定流程，使用ABI PRISM^TM DyeDeoxy序列测定化学试剂盒(Applied Biosystems)测定DNA样品序列。反应完成后，在ABI377自动化DNA测序仪上电泳。使用Sequencher v3.0 DNA分析软件(Gene Codes Corp.)分析DNA序列结果。5.14.3.3 CryET69多肽的特性

CryET69多肽包括有520个氨基酸的序列，其分子量计算值为58609Da，其PI计算值为5.84。表21中给出CryET69多肽的氨基酸组成。

表21

CryET69的氨基酸组成氨基酸残基个数占总数的％氨基酸残基个数占总数的％Ala 24 4.6 Leu 31 5.9Arg 30 5.7 Lys 15 2.8Asn 60 11.5 Met 10 1.9Asp 27 5.1 Phe 20 3.8Cys 9 1.7 Pro 24 4.6 氨基酸残基个数占总数的％氨基酸残基个数占总数的％

Gln 32 6.1 Ser 39 7.5

Glu 24 4.6 Thr 48 9.2

Gly 32 6.1 Trp 6 1.1

His 9 1.7 Tyr 22 4.2

Ile 24 4.6 Val 34 6.5酸性氨基酸 (Asp+Glu) 51碱性氨基酸 (Arg+Lys) 45芳香族氨基酸 (Phe+Trp+Tyr) 48疏水性氨基酸 (芳香氨基酸+Ile+Leu+Met+Val)1475.16实施例16——CryET69相关蛋白质的数据查询

使用如5.8部分中有关CryET39中所述的FASTA和BLASTP，用推断出的CryET69氨基酸序列查询SWISS-PROT ALL和nr数据库不同之处是以blosum 50比较矩阵作FASTA查询。FASTA查询结果表明CryET69在338个氨基酸的区段上与B.sphaericus 42kDa杀蚊晶体蛋白有～32％的序列相似性，而在其440个氨基酸的区段上与B.sphaericus 51kDa杀蚊晶体蛋白有～30％的序列相似性。5.17实施例17——CryET71相关蛋白质和CryET79相关蛋白质的数据查询

使用如5.8部分中有关CryET39中所述的FASTA和BLASTP，用推断出的CryET71和CryET79氨基酸序列查询SWISS-PROT ALL和nr数据库。FASTA查询结果表明CryET71在323个氨基酸的区段上与B.sphaericus 42kDa杀蚊晶体蛋白有～25％的序列相似性，而在其388个氨基酸的区段上与B.sphaericus 51kDa杀蚊晶体蛋白有～25％的序列相似性。FASTA和BLASTP查询结果没有找到与CryET79有明显序列相似性的蛋白质。5.18实施例18——cryET76基因和cryET80基因的序列测定

按照建立起的双脱氧链终止DNA序列测定程序(Sanger等，1977)确定克隆在pEG1823上的基因部分DNA序列。按照制造商指定流程使用WizardSV少量制备试剂盒(Promega Corp.)或者按照制造商指定程序使用Qiagen质粒试剂盒(Qiagen Inc.)完成双链质粒模板DNA的制备工作。随后用苯酚∶氯仿∶异戊醇(50∶48∶2)抽提一次，再用氯仿∶异戊醇(24∶1)抽提一次。按照制造商指定流程，使用Sequenase^TMVersion 2.0 DNA测序试剂盒(United States Biochemical/AmershamLife Science Inc.)并使用³⁵S-[dATP]作为标记同位素(DuPont NENResearch Products)进行测序反应。在6％(wt./vol.)丙烯酰胺、42％wt./vol.)尿素测序凝胶上或在CastAway^TM Precast 6％丙烯酰胺测序凝胶(Stratagene)上进行反应的变性凝胶电泳。干胶在室温下过夜暴光在Kodak X-OMAT AR X射线胶片(Eastman Kodak)，得到放射自显影图。

使用如上所述流程得到pEG1823上cryET76基因和cryET80基因的部分DNA序列。使用cryET39特异寡核苷酸mr18作为最初序列测定的引物。mr18的序列为：

5′-GTACCAGAAGTAGGAGG-3′(SEQ ID NO.31)

根据最初序列测定结果设计用于引发测序反应的连续寡核苷酸。使用自动化序列测定方法完成对序列的测定工作。根据制造商建议的流程，使用ABI PRISM^TM DyeDeoxy序列测定化学试剂盒(AppliedBiosystems)测定DNA样品序列。反应完成后，在ABI377自动化DNA测序仪上电泳。使用Sequencher v3.0 DNA分析软件(Gene Codes Corp.)分析DNA序列结果。CryET76(SEQ ID NO：1)和cryET80(SEQ ID NO：3)的DNA序列如下文所示。推断出CryET76蛋白质(SEQ ID NO：2)和CryET80蛋白质(SEQ ID NO：4)的氨基酸序列也如下文所示。完整测序区段如(SEQ ID NO：17)中所示。5.18.1 CryET76

CryET76基因的DNA序列如SEQ ID NO：1所示，编码CryET76多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。5.18.1.3 CryET76多肽的特性

CryET76多肽包括有387个氨基酸的序列，其分子量计算值为43812Da，其PI计算值为5.39。表22中给出CryET76多肽的氨基酸组成。

表22

CryET76的氨基酸组成氨基酸残基个数占总数的％氨基酸残基个数占总数的％

Ala 14 3.6 Leu 34 8.7

Arg 7 1.8 Lys 27 6.9

Asn 39 10.0 Met 5 1.2

Asp 17 4.3 Phe 8 2.0

Cys 1 0.2 Pro 10 2.5

Gln 17 4.3 Ser 30 7.7

Glu 22 5.6 Thr 47 12.1

Gly 22 5.6 Trp 8 2.0

His 4 1.0 Tyr 24 6.2

Ile 31 8.0 Val 20 5.1酸性氨基酸 (Asp+Glu) 39碱性氨基酸 (Arg+Lys) 34芳香族氨基酸 (Phe+Trp+Tyr) 40疏水性氨基酸 (芳香氨基酸+Ile+Leu+Met+Val) 1305.18.2 CryET80

CryET80基因的DNA序列如SEQ ID NO：3所示，编码CryET80多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。5.18.2.3 CryET80多肽的特性

CryET80多肽包括有132个氨基酸的序列，其分子量计算值为14839Da，其PI计算值为6.03。表23中给出CryET80多肽的氨基酸组成。

表23

CryET80的氨基酸组成氨基酸残基个数占总数的％氨基酸残基个数占总数的％Ala 7 5.3 Leu 6 4.5Arg 8 6.0 Lys 4 3.0Asn 13 9.8 Met 2 1.5 氨基酸残基个数占总数的％氨基酸残基个数占总数的％

Asp 8 6.0 Phe 2 1.5

Cys 1 0.7 Pro 3 2.2

Gln 3 2.2 Ser 11 8.3

Glu 8 6.0 Thr 11 8.3

Gly 9 6.8 Trp 1 0.7

His 8 6.0 Tyr 6 4.5

Ile 13 9.8 Val 8 6.0酸性氨基酸 (Asp+Glu) 16碱性氨基酸 (Arg+Lys) 12芳香族氨基酸 (Phe+Trp+Tyr) 9疏水性氨基酸 (芳香氨基酸+Ile+Leu+Met+Val) 385.18.3从EG4851(SEQ ID NO：17)中分离的CryET76基因、CryET80基因和CryET84基因的特性

包含CryET76、CryET80和CryET84编码区的完整三个基因操纵子的DNA序列如SEQ ID NO：17所示。

菌株EG4851中，cryET84基因的位置紧靠cryET80和cryET76基因的5’端。cryET84基因开始于核苷酸656，结束于核苷酸1678。cryET80基因开始于核苷酸1773，结束于核苷酸2168。CryET76基因开始于核苷酸2264，结束于核苷酸3424。5.19 实施例19——序列同源性分析5.19.1 CryET76相关蛋白质和CryET80相关蛋白质的数据查询

由核苷酸序列的翻译推断出CryET76蛋白质和CryET80蛋白质的氨基酸序列，并用推断出的序列查询相关蛋白质序列的序列数据库。用欧洲生物技术学会(http：//www.ebi.ac.uk)的FASTA服务器所提供的FASTA version 3.15(Pearson和Lipman，1988)查询SWISS-PROTALL数据库，使用参数如下：library＝swall，matrix＝pam150，ktup＝2，gapcost＝-12，gapxcost＝-2。同样使用BLASTP version 2.0(Altschul等，1997)用CryET76和CryET80的氨基酸序列查询国家生物技术信息学中心(NCBI)的non-redundant(nr)数据库，使用参数如下：matrix＝blosum62，gapped alignment、other parameters＝defaultsettings。

FASTA分析结果表明CryET76在320个氨基酸的区段上与B.Sphaericus的42kDa杀蚊晶体蛋白有～27％的序列相似性，而CryET80与SWISS-PROT ALL中的序列没有明显的序列相似性。BLASTP查询结果与FASTA查询结果大致一致。没有找到与CryET80有明显序列相似性的蛋白质。5.19.2 与Cry蛋白质的序列比较

将CryET39、CryET74、CryET75、CryET71、CryET79、CryET76、CryET80和CryET69序列，与最新发表的专利申请中的序列进行对比。对比时使用PC/GENE version 6.85序列分析软件包(IntelligeneticsCorp.Mountain View，CA)中的PALIGN。排列配对时使用如下参数：comparison matrix＝unitary、open gap cost＝3、unit gap cost＝1。5.19.2.1 CryET39

将CryET39序列与最新发表的专利申请中的序列进行排列比较，表明CryET39和用Intl.Pat.Appl.Publ.No.WO 97/40162中的11、38和43号鉴定序列之间有序列相似性。CryET39与11号序列有99.2％的序列相似性，与38号序列有78.6％的序列相似性，而与43号序列有79.9％的序列相似性。5.19.2.2 CryET74

将CryET74序列与最新发表的专利申请中的序列进行排列比较，表明CryET74和用Intl.Pat.Appl.Publ.No.WO 97/40162中的32、36和41号鉴定序列之间有序列相似性。CryET74与32号鉴定序列有100％的序列相似性，与36号鉴定序列有80.7％的序列相似性，而与申请中的41号序列有77.3％的序列相似性。5.19.2.3 CryET75

将CryET75序列与最新发表的专利申请中的序列进行排列比较，表明CryET75与Intl.Pat.Appl.Publ.No.WO 97/17600中公开的鞘翅目毒性蛋白质CryET33有26％的序列相似性。5.19.2.4 CryET71

将CryET71序列与最新发表的专利申请中的序列进行排列比较，表明CryET71和用Intl.Pat.Appl.Publ.No.WO 97/40162中的11、38和43号鉴定序列之间有序列相似性。CryET71与11号鉴定序列有78.4％的序列相似性，与38号鉴定序列有91.9％的序列相似性，而与申请中的43号序列有97.4％的序列相似性。5.19.2.5 CryET79

将CryET79序列与最新发表的专利申请中的序列进行排列比较，表明CryET79和用Intl.Pat.Appl.Publ.No.WO 97/40162中的32、36和41号鉴定序列之间有序列相似性。CryET74与32号鉴定序列有79.8％的序列相似性，与36号鉴定序列有95.9％的序列相似性，而与申请中的41号序列有91％的序列相似性。5.19.2.6 CryET76

将CryET76序列与最新发表的专利申请中的序列进行排列比较，表明CryET76和用Intl.Pat.Appl.Publ.No.WO 97/40162中的11、38和43号鉴定序列之间有序列相似性。CryET76与11号鉴定序列有60.8％的序列相似性，与38号鉴定序列有61.6％的序列相似性，而与申请中的43号序列有61.9％的序列相似性。5.19.2.7 CryET80

将CryET80序列与最新发表的专利申请中的序列进行排列比较，表明CryET80和用Intl.Pat.Appl.Publ.No.WO 97/40162中的32、36和41号鉴定序列之间有序列相似性。CryET80与32号鉴定序列有52.1％的序列相似性，与36号鉴定序列有56.1％的序列相似性，而与申请中的41号序列有54.5％的序列相似性。5.19.2.8 CryET69

将CryET69序列与最新发表的专利申请中的序列进行排列比较，表明CryET69和用Intl.Pat.Appl.Publ.No.WO 97/40162中的11、38和43号鉴定序列之间仅仅有23-25％的序列相似性。该晶体蛋白与B.Sphaericus的杀蚊晶体蛋白之间比与苏云金芽孢杆菌晶体蛋白之间有更高程度的同源性。5.19.3概述

以上分析结果表明，CryET69、CryET75、CryET76和CryET80的氨基酸序列与以前所述杀虫晶体蛋白之间明显不同。使用建立的有关苏云金芽孢杆菌晶体蛋白命名法(Crickmore等，1988)，CryET76和CryET80将被指定新的二次排列，而CryET69和CryET75将被指定新的初级排列。5.20 实施例20——重组CryET76多肽和重组CryET80多肽的表达

为了鉴定CryET76蛋白质和CryET80蛋白质的特性，有必要在并不产生其它晶体蛋白的苏云金芽孢杆菌菌株(即Cry-菌株)中表达克隆出的cryET76基因和cryET80基因。正如上文所述，在包含克隆的cryET76基因和克隆的cryET80基因的质粒pEG1823中，既包含苏云金芽孢杆菌复制起始位点又包含能在大肠杆菌中指导复制的起始位点。通过电穿孔(Macaluso和Mettis，1991)用pEG1823转化Cry-苏云金芽孢杆菌菌株EG10650，产生红霉素抗性(Em^R)。通过在含有25μg/ml红霉素的LB琼脂平板上培养过夜，从而筛选出转化有红霉素抗性的细胞。选择每次转化后的Em^R菌落，进行进一步分析。将其中分离出的一个菌落命名为EG11658。

于25℃下在含有25μg/ml红霉素的C2芽孢形成培养基中培养4天，此时芽孢形成，细胞开始裂解。对产生芽孢的培养物进行显微镜观察，结果表明重组菌株正在产生伴胞内含体。用离心法收获EG11658产生芽孢的培养物，漂洗后重悬在1/10原体积的水中。悬浮液中的晶体蛋白用SDS-PAGE分析鉴定，结果表明产生了大约44kDa和15kDa的蛋白质。5.21 实施例21——CryET76和CryET80对昆虫的毒杀性

确定CryET76和CryET80对WCRW的毒杀作用。

于25℃下在C2培养基中培养4天，直到芽孢形成，细胞开始裂解。通过离心收获培养物，用约2.5倍原体积的蒸馏水漂洗后重悬在1/10原体积的0.005％Triton X-100^中。为便于与EG11658进行比较，以相同方式培养并收获产生WCRW毒性蛋白质CryET39和CryET74的重组苏云金芽孢杆菌菌株EG11529以及产生WCRW毒性蛋白质CryET71和CryET79的重组苏云金芽孢杆菌菌株EG11648。按照所述方法(Brussock和Currier，1990)用SDS-PAGE对样品中的毒素蛋白质进行定量。对该流程的改动是：去除掉用3M HEPES的中和步骤。

通过在人工食物(每升中含20g琼脂、50g麦胚、39g蔗糖、32g酪蛋白、14g纤维、9g Wesson盐混合物、1g甲基对羟基苯甲酸酯、0.5g山梨酸、0.06g胆固醇、9g Vanderzant’s维生素混合物、0.5ml亚麻子油、2.5ml磷酸/丙酸)上进行表面培养的方式对WCRW幼虫进行生物测定。在对EG11658(CryET76和CryET80)、EG11529(CryET39和CryET74)以及EG11648(CryET71和CryET79)的每个生物测定实验中，都包括将8种连续水稀释液按等份试样加到食物的表面。当稀释液(含有0.005％Triton X-100^的水溶液)干后，将新生幼虫放到食物表面并在28℃下温育。每剂量处理中检测32只幼虫。7天后计算死亡率。收集重复生物测定中的数据进行概率分析(Daum，1970)，其中死亡率用对照死亡率校对而对照仅为稀释液(Abbott，1925)。结果按照每孔(食物表面为175mm²)中导致LC₅₀的晶体蛋白的量即杀死50％待测昆虫的浓度来报道。同时对于LC₅₀值报道95％置信区间(表24)。

表24

晶体蛋白对WCRW幼虫的杀虫活性样品晶体蛋白 LC₅₀ 95％C.I. LC₉₅

(μg蛋白质/孔) (μg蛋白质/孔)EG11658 CryET76 10.7 2.2-18.9 46

CryET80EG11648 CryET71 5.3 0.9-10.1 27

CryET79EG11936 CryET39 12.3 12.5-14.3 32

CryET74

表24中所示结果表明，CryET76蛋白质和CryET80蛋白质对WCRW有明显的杀虫活性。5.22 实施例22——CryET69对昆虫的毒杀性

使用5.21部分中所述流程确定CryET69对WCRW的毒杀性。结果按照每孔(食物表面为175mm²)中导致LC₅₀的晶体蛋白的量即杀死50％待测昆虫的浓度来报道。同时对于LC₅₀值报道95％置信区间(表25)。

表25

CryET69对WCRW幼虫的杀虫活性样品晶体蛋白 LC₅₀ 95％C.I. LC₉₅

(μg蛋白质/孔) (μg蛋白质/孔)EG112.4 Cry3B2 13.8 3.2-30.1 502EG11647 CryET69 147.3 73-1292 6190对照死亡率＝22％

这些结果表明，CryET69比Cry3B2对WCRW的活性明显要低。5.23 实施例23——菌株EG12156和菌株EG12158的构成

构建出产生CryET76或产生CryET80的重组苏云金芽孢杆菌菌株。将一个移码突变引入到pEG1823上的cryET76编码区中，产生的重组质粒仅仅能够指导CryET80的产生。通过计算机分析技术对确定出的cryET76核苷酸序列进行分析，在cryET76编码区中鉴定出一个独一无二的Age I限制位点。随后用Age I消化pEG1823证明该限制位点对于此质粒来说是独一无二的。为了在该位点产生一个移码突变，pEG1823用Age I消化后在有dNTPs存在下用T4聚合酶对其DNA末端进行平端化处理。随后通过在1％琼脂糖凝胶上电泳分离线性DNA片段，用剃须刀片切除DNA条带，再用Qiagen凝胶抽提试剂盒进行纯化。使用T4连接酶使纯化出的DNA自连，并用于转化大肠杆菌菌株DH5α，产生氨苄青霉素抗性。对从数个氨苄青霉素抗性菌落中所得DNA进行限制性酶分析，证明pEG1823上的Age I位点已被破坏掉。将从这样的一个克隆中所得重组质粒命名为pEG2206。随后，通过电穿孔用pEG2206转化acrystalliferous苏云金芽孢杆菌菌株EG10650，产生红霉素抗性。将含有pEG2206的重组Bt菌株命名为EG12156。

在pEG1823上的cryET80编码区中引入一个缺失突变，产生的重组质粒仅仅能够指导CryET80的产生。通过计算机分析技术对确定出的cryET80核苷酸序列进行分析，在cryET80编码区中鉴定出一个独一无二的Dra III限制位点。随后用Dra III消化pEG1823证明该限制位点对于此质粒来说是独一无二的。为了在该位点产生一个突变，pEG1823用Dra III消化后在有dNTPs存在下用T4聚合酶对其DNA末端进行平端化处理。随后通过在1％琼脂糖凝胶上电泳分离线性DNA片段，用剃须刀片切除DNA条带，再用Qiagen凝胶抽提试剂盒进行纯化。使用T4连接酶使纯化出的DNA自连，并用于转化大肠杆菌菌株DH5α，产生氨苄青霉素抗性。对从数个氨苄青霉素抗性菌落中所得DNA进行限制性酶分析，证明pEG1823上的Dra III位点已被破坏掉。将从这样的一个克隆中所得重组质粒命名为pEG2207。随后，通过电穿孔用pEG2207转化acrystalliferous苏云金芽孢杆菌菌株EG10650，产生红霉素抗性。将含有pEG2207的重组菌株命名为EG12158。

用菌株EG11658、EG12156以及EG12158接种含有10μg/ml红霉素的100ml C2肉汤培养基。在500ml带挡板摇瓶中于28-30℃下将肉汤培养基振荡培养3天，此时培养物完全形成芽孢，孢子囊裂解。在JA 14转头中于4℃条件下通过在8000 rpm(～9800×g)离心20分钟沉淀芽孢和晶体。将沉淀重悬在50ml的10mM Tris-HCl、50mMNaCl、1mM EDTA、0.005％Triton X-100(pH7.0)中。在Beckman GPR离心机中于4℃条件通过在3750rpm(～3200×g)离心1小时，再次沉淀芽孢和晶体。将沉淀重悬在10ml的10mM Tris-HCl、50mM NaCl、1mM EDTA、0.005％Triton X-100(pH7.0)中并保存在4-8℃。

这些培养物所产生的晶体蛋白通过SDS-PAGE电泳检测后随后按照5.11部分中所述用考马斯亮蓝R-250染色。分析结果证实，菌株EG12156产生CryET80而并不产生CryET76，而菌株EG12158产生CryET76而并不产生CryET80(图3)。因此，每种晶体蛋白都能独立于其它晶体蛋白单独产生。每种晶体蛋白在影响对WCRW毒杀性中的功能现在可以作更为细致的研究。

图3中所述SDS-PAGE分析结果表明，在EG12156及EG12158晶体制剂中都存在另外一种蛋白质。该蛋白质的表观分子量大约为35 kDa，将其命名为CryET84。

对pEG1823中克隆的插入片段作进一步的DNA序列分析后发现第三个开放阅读框，该阅读框编码～38kDa的蛋白质(SEQ ID NO：19)。此编码区位置紧靠cryET80基因5’端。因此，cryET84、cryET80和cryET76可能组成一个操纵子。从EG4851分离的CryET84蛋白质包括341个氨基酸组成的序列，计算其分子量大约为37884 Da。CryET84的等电常数(pI)计算值为5.5。

对如5.21部分所述WCRW生物测定中所用的EG11658晶体蛋白进行SDS-PAGE分析，没有检测到CryET84蛋白质条带。很显然，在菌株培养过程中或在收获及漂洗芽孢-晶体悬浮液过程中的微细差别都有可能丢失CryET84。

按照实施例8中所述，利用Blast 2.0和FASTA 3进行序列比较，结果表明在CryET84和所有已知苏云金芽孢杆菌晶体蛋白之间没有发现明显的序列相似性。5.24 实施例24——抗虫转基因植物的制备5.24.1 植物转基因构建

在以双链DNA形式存在的植物转基因表达过程中涉及在RNA聚合酶作用下，从一条DNA链转录出信使RNA(mRNA)，以及随后在核内进行的mRNA初级转录本的加工过程。该加工过程包括将聚腺苷酸核苷酸加入到RNA 3’末端形成3’非翻译区。DNA转录成mRNA的过程受通常称之为“启动子”的DNA区段的调节。启动子区包含的一段碱基序列提供RNA聚合酶与DNA结合的信号，并利用一条DNA链为模板起始mRNA的转录过程，形成RNA的互补链。

文献中已经描述过在植物细胞中有活性的多个启动子。可以从植物或植物病毒中得到这些启动子，启动子中包括但不局限于胭脂碱合酶(NOS)和章鱼碱合酶(OCS)的启动子(由根癌农杆菌致瘤质粒携带)、花椰菜花叶病毒(CaMV)19S启动子和35S启动子、来自核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶小亚基(ssRUBISCO，一种非常丰富的植物多肽)的光诱导启动子及玄参花叶病毒(FMV)35S启动子。所有这些启动子都已用于产生各种类型DNA构建体，这些构建体已在植物中进行表达(如可参照美国专利5463175，在此特别引入作为参考)。

所选特定启动子应该能够使酶编码区充分表达，产生出有效量的蛋白质。有一套优选启动子为组成型启动子如CaMV 35S启动子或FMV 35S启动子能在许多植物器官中产生高水平表达(美国专利5378619，在此特别引入作为参考)。还有一套优选启动子为根增强或特异的启动子如CaMV衍生出的4 as-1启动子或小麦POX1启动子(美国专利5023179，在此特别引入作为参考；Hertig等，1991)。在用转基因玉米防治玉米根虫(Diabroticus spp.)时，根增强或根特异启动子将尤其优选。

本发明DNA构建体中所用的启动子在需要时可以修饰，修饰后能影响它们的调控特性。例如，在没有光时ssRUBISCO基因部分抑制ssRUBISCO的表达，可以将CaMV 35S启动子与ssRUBISCO基因部分相连接，所得启动子在叶片中而不是在根中有活性。可以按照本文所述使用所得启动子。为此，短语“CaMV 35S”启动子包括CaMV 35S启动子变体，例如通过与操纵子区连接的方式或随机突变或控制性突变所得启动子。另外，启动子改变后可以包含多个“增强子序列”，可以促进基因的表达。

本发明DNA构建体产生出的RNA也包含5’非翻译前导序列。该序列可以来自选择用于表达基因的启动子，可以经过特定修饰以增强mRNA的转录。5’非翻译区也可以来自于病毒RNA，可以来自于合适的真核基因或来自于合成基因序列。本发明并不局限于以下构建体：该构建体中非翻译区来自于与启动子相伴的5’非翻译区。

为了在单子叶植物如玉米中进行优化表达，DNA表达构建体中可以同时包括内含子。内含子通常放在mRNA 5’附近的非翻译区中。内含子可以来自但不局限于以下一套内含子，包括玉米hsp 70内含子(美国专利5424412，在此特别引入作为参考)或水稻Actin1启动子(McElroy等，1990)。

正如上文所注意到的一样，本发明中植物嵌合基因的3’非翻译区包含聚腺苷酸化信号，此信号在植物中能使腺苷酸核苷酸加入到RNA 3’末端。优选的3’非翻译区为：(1)包含土壤农杆菌致瘤(Ti)质粒基因如胭脂碱合成酶(NOS)的聚腺苷酸化信号的3’转录非翻译区及(2)植物基因如豌豆ssRUBISCO E9基因(Wong等，1992)。5.24.2植物转化和表达

可以通过适当方法如本文详述方法，将包含本发明δ-内毒素编码区的转基因插入到植物基因组中。合适的植物转化载体包括来自于根癌农杆菌Ti质粒的质粒，同时包括由Herrera-Estrella(1983)、Bevan等(1983)、Klee(1985)及Eur.Pat.Appl.Publ.No.EP0120516公开的载体。除了来自于根癌农杆菌的Ti质粒或毛根诱导(Ri)质粒的植物转化载体外，可以使用其它将本发明DNA构建体插入到植物细胞中。这些方法可能涉及，例如使用脂质体、电穿孔、增强DNA吸收的化学物质，通过微粒轰击的游离DNA的送递以及利用载体或花粉的转化方法(Fromm等，1986；Fromm等，1990)。在4.0部分中对这些方法进行了详细介绍。5.24.3植物表达载体的构建

为使本文公开多肽在转基因植物中有效表达，所选编码杀虫多肽的序列区段必须有合适的序列组成(Diehn等，1996)。

例如，为了将一个或多个本文所述cry基因放置到适合在单子叶植物中表达的载体中(例如，在增强型花椰菜花叶病毒35S启动子的控制之下，并连接到hsp 70内含子后连接美国专利5424412中的胭脂碱合酶聚腺苷酸化位点，该专利在此特别引入作为参考)，可以用合适酶如Nco I和EcoR I消化载体。随后，将大约4.6 kb的载体大片段电泳后纯化，并用T4 DNA连接酶将载体片段与包含植物化cry基因的合适限制片段连接。然后将连接混合物转化到大肠杆菌中，羧苄青霉素抗性菌落长出后通过DNA小量制备程序提取质粒DNA。然后用诸如NcoI和EcoR I(一起)、Not I和Pst I的酶对DNA进行限制性内切酶分析，鉴定出包含在增强型CaMV 35S启动子控制下与hsp 70内含子融合的cry基因编码区的克隆。

为了将δ-内毒素基因放置在适合于稳定转化并适合于产生抗虫植物的载体中，可以通过电泳和纯化过程分离得到pMON33708限制片段，该片段中包含在增强型CaMV 35S启动子控制下与hsp 70内含子融合的赖氨酸氧化酶编码区。然后将该片段与诸如pMON30460的载体连接，而后者预先用Not I和小牛小肠碱性磷酸酶处理过(pMON30460包含在CaMV 35S启动子控制下的新霉素磷酸转移酶编码区)。然后，通过将连接混合物转化到大肠杆菌中得到卡那霉素抗性菌落，用限制性内切酶消化小量制备的质粒DNA，对所得质粒进行鉴定。可以使用诸如Not I、EcoR V、Hind III、Nco I、EcoR I和Bgl II的限制酶，鉴定出包含正确插入到pMON30460对应位点中的限制片段的适当克隆，插入方向为两个基因串联排列(换句话说，cry基因表达盒的3’末端与npt II表达盒的5’末端连接)。然后，通过电穿孔将载体引入到植物原生质体中并通过蛋白质印迹和ELISA分析，证实所得载体在植物原生质体中的表达出Cry蛋白质。通过微粒枪轰击随后用巴龙霉素筛选的方法可以将该载体引入到植物胚如玉米的基因组DNA中，得到表达基本上如美国专利5424412(特别将该专利引入作为参考)中所述cry基因的玉米植株。本实施例中，载体引入的方法是，载体与赋予潮霉素抗性的质粒通过共轰击方法进入到玉米未成熟胚的盾片(scutella)中，接着用潮霉素筛选，然后再生。然后，通过ELISA分析法对表达所选Cry蛋白质的转基因植物系进行鉴定。随后，检测所得后代种子能否防止易感昆虫的进食。5.25 实施例25——为在植物中表达对细菌基因进行修饰5.25 实施例25——为在植物中表达对细菌基因进行修饰

已知许多编码细菌晶体蛋白的野生型基因在植物中以全长基因或截短基因形式表达时表达都很差。通常情况下，cry基因的G+C含量低(37％)，经常包含许多个A+T富含区、潜在的聚腺苷酸化位点及多个ATTTA序列。表26显示的是当制备“植物化”基因构建体时应该避免的潜在聚腺苷酸化序列一览表。

表26

潜在的聚腺苷酸化信号序列一览表

AATAAA^* AAGCAT

AATAAT^* ATTAAT

AACCAA ATACAT

ATATAA AAAATA

AATCAA ATTAAA**

ATACTA AATTAA**

ATAAAA AATACA**

ATGAAA CATAAA***显示的是潜在的植物主要聚腺苷酸化位点**显示的是潜在的植物次要聚腺苷酸化位点

其它均为潜在的植物次要聚腺苷酸化位点。可以按照下面所述方式选择用于突变的区段。在cry基因DNA序列中寻找包含5个或更多个连续A或T碱基对的所有区段。多于20-30个碱基对区段上的周围序列按A+T的最高百分比和长度进行排名。在DNA中分析可能包含聚腺苷酸化位点或ATTTA序列的区段。然后设计寡核苷酸，其中最大限度地减少包含一个或多个聚腺苷酸化位点或ATTTA序列的A+T连续区。在已发表的研究报告中，发现2个潜在的植物聚腺苷酸化位点比较关键。选择能提高G+C含量但并不产生克隆和装配修饰基因时用到的限制酶位点(例如BamH I、Bgl II、Sac I、Nco I、EcoRV等)的密码子。同样避免使用包含双联体TA或GC的密码子，因为研究报道这样的密码子在植物中出现的频率很低。

虽然CaMV 35S启动子在多种植物组织中通常为高水平组成型启动子，但是在花组织中由CaMV 35S启动子驱动的基因表达水平比在叶组织中所见水平相对要低。因为受某些昆虫破坏的经济重要目标是花部分或来自花的部分(如棉花的蕾和棉桃、烟草的芽、番茄的芽和果实)，所以在这些组织中用CaMV 35S启动子获得高水平表达的晶体蛋白通常是有利的。

玄参花叶病毒(FMV)的35S启动子与CaMV 35S启动子类似。已经将该启动子分离并人工改造到植物转化载体中。FMV 35S启动子相对于CaMV启动子来说能在花组织中高水平表达，同时在其它组织如叶片中仍能提供类似高水平的基因表达。可以构建出其中的一个或多个全长天然δ-内毒素编码基因或植物化δ-内毒素编码基因由FMV 35S启动子驱动的植物转化载体。例如，可以用这样的载体转化烟草植株，并通过蛋白质印迹或ELISA免疫测定法比较叶组织和/或花组织中晶体蛋白的表达情况。已经用FMV启动子在花组织中产生出比CaMV相对高水平的晶体蛋白。5.26 实施例26——带有ssRUBISCO启动子及叶绿体转运肽的天然cry基因或植物化cry基因的表达

植物中编码RUBISCO小亚基(SSU)的基因通常进行高水平表达，并受光照调节，而且有时为组织特异性。这些表达特性主要归因于这些基因的启动子序列。有可能通过SSU启动子的使用在植物中表达异源基因。植物通常包含多个SSU基因，而且不同SSU基因的表达水平和组织特异性有所不同。SSU蛋白质由核编码，在胞质中以前体形式合成，在蛋白质前体中包含氨基末端延伸部分即叶绿体转运肽(CTP)。CTP使前体指向叶绿体并促使SSU蛋白质进入叶绿体中。在该过程中，CTP从SSU蛋白质上裂解下来。已经使用这些CTP序列将异源蛋白质指导进入到转化植物的叶绿体中。

在植物中表达异源基因时SSU启动子可能有多个优点。有些SSU启动子进行非常高水平的表达，可能产生出与用CaMV 35S启动子观察到的一样高水平或更高水平的表达。SSU启动子表达的组织分布与CaMV35S启动子的不同，所以为了防治有些害虫，将晶体蛋白的表达指向SSU高效表达的细胞中可以能有利的。例如，虽然CaMV 35S启动子相对为组成型，但是叶中CaMV 35S启动子在维管组织中比在叶的其它一些部位中更能高效表达，而大多数SSU启动子在叶的叶肉细胞中能够高效表达。有些SSU启动子是高度组织特异性的，所以如果发现在某些细胞中表达蛋白质后对这些细胞产生有害作用，就可以利用特定SSU启动子在植物组织的某些亚型中表达本发明中的蛋白质。例如，为了防治马铃薯中的马铃薯甲虫，用SSU启动子将晶体蛋白的表达指向叶片而不是可以食用的块茎可能是有利的。

利用SSU CTP序列将晶体蛋白定位到叶绿体中同样可能有利。将苏云金芽孢杆菌晶体蛋白定位到叶绿体中，就可以保护这些蛋白质不受胞质中发现的蛋白酶的影响。这样就可以使蛋白质变得稳定起来，并可以更高水平地积累活性毒素。包含CTP的cry基因可以与SSU启动子或诸如CaMV 35S的其它启动子联合使用。5.27 实施例27——使用信号肽向胞外空间或液泡引入δ-内毒素多肽

可以将本文所述苏云金芽孢杆菌δ-内毒素多肽定位在转化植物细胞的胞质中，胞质定位后可能产生出抗虫植物。然而，在某些实施方案中，将苏云金芽孢杆菌多肽的定位或产生指向植物的某一区室或多个区室中或指向特定植物细胞类型中可能是有利的。将苏云金芽孢杆菌蛋白质定位于区室而不是胞质中，就可以使苏云金芽孢杆菌蛋白质少些暴露于胞质蛋白酶，使蛋白质进行更多的积累，从而产生强的杀虫活性。细胞外定位可以使某些昆虫更有效地暴露于苏云金芽孢杆菌蛋白质，从而产生更高的效能。如果发现某种苏云金芽孢杆菌蛋白质对植物细胞功能有害，那么将蛋白质定位于非胞质区室就能够保护这些细胞免受蛋白质的毒性作用。

在植物及其它真核生物中，定位于细胞外或定位于特定区室中的蛋白质在合成时通常带有氨基末端氨基酸延伸部分即信号肽。信号肽指引蛋白质进入区室化途径，通常从成熟蛋白质上裂解下来作为区室化中的早期步骤。对于细胞外蛋白质，分泌途径一般涉及共翻译插入进入内质网，信号肽的裂解就发生在此阶段。随后成熟蛋白质通过高尔基体进入小泡中，小泡与质膜融合后将蛋白质释放到胞外空间。安排到其它区室中的蛋白质遵循类似途径。例如，安排到内质网或高尔基体中的蛋白质即遵循此方案，但是它们特定滞留在适当的区室中。植物中的某些蛋白质同样定向到液泡中。液泡是许多植物细胞的胞质中存在的另一种膜结合区室。定向于液泡的蛋白质在高尔基体中与上述途径不同，在高尔基体中蛋白质进入小泡中后小泡与液泡融合。

蛋白质定向的共同特征是起始区室化过程的信号肽。许多情况下，将信号肽与蛋白质融合后将使蛋白质定向到内质网中。该步骤的效率可能同时取决于成熟蛋白质的序列。我们对将蛋白质指向特定区室而不是胞外空间中的信号了解的还不太清楚。看起来许多将蛋白质指向特定区室的信号包含在成熟蛋白质的氨基酸序列中。对于某些定向液泡的蛋白质的确如此，但是还不可能对这些序列进行精确定义。看起来对于包含信号序列而不包含其它区室化信号的蛋白质来说，分泌到胞外空间是一“错误”途径。因此，将苏云金芽孢杆菌蛋白质指向胞质外的策略是，将合成的苏云金芽孢杆菌基因与编码已知植物信号肽的DNA序列融合。这些融合基因将产生进入分泌途径的苏云金芽孢杆菌蛋白质，使蛋白质胞外分泌或胞外定向到液泡或其它区室中。

已经对多个植物基因的信号肽进行了描述。其中的一个序列是烟草致病相关蛋白PR1b的信号肽，已经有人对此信号肽进行了描述(Cornelissen等，1986)。PR1b蛋白质通常定位于胞外空间。其它类型的信号肽包含在豆科植物种子储藏蛋白中。这些蛋白质定位于种子的蛋白体中，所谓的蛋白体是种子中发现的类似于液泡的区室。有人对普通菜豆(Phaseolus vulgaris)7S储藏蛋白β亚基PvuB的信号肽DNA序列进行了描述(Doyle等，1986)。在已公开的序列基础上，可以使用编码PR1b和PvuB信号肽的寡核苷酸化学合成基因。有时为了完成异源蛋白质的分泌或区室化，除了包括信号肽正常裂解位点外可能有必要包括某些氨基酸序列。保证信号肽的正确裂解可能是必要的。

6.0参考文献

以下参考文献中提供本文所列方法外值得模仿的方法或其它详细内容，在此特别引入作为参考：

U.S.Patent 4,196,265，issued Apr.1，1980.

U.S.Patent 4,237,224，issued Dec.2，1980.

U.S.Patent 4,554,101，issued Nov.19，1985.

U.S.Patent 4,683,195，issued Jul.28，1987.

U.S.Patent 4,683,202，issued Jul.28，1987.

U.S.Patent 4,757,011，issued Jul.12，1988.

U.S.Patent 4,766,203，issued Aug.23，1988.

U.S.Patent 4,769,061，issued Sep.6，1988.

U.S.Patent 4,800,1 59，issued Jan.24，1989.

U.S.Patent 4,883,750，issued Nov.28，1989.

U.S.Patent 4,940,835，issued Feb.23，1990.

U.S.Patent 4,943,674，issued Jul 24，1990.

U.S.Patent 4,965,188，issued Oct.23，1990.

U.S.Patent 4,971,908，issued Nov.20，1990.

U.S.Patent 4,987,071，issued Jan.22，1991.

U.S.Patent 5,023,179，issued Jun 11，1991.

U.S.Patent 5,097,025，issued Mar 17，1992.

U.S.patent 5,106,739，issued Apr 21，1992.

U.S.Patent 5,110,732，issued May 5，1992.

U.S.Patent 5,139,954，issued Aug 19，1992

U.S.Patent 5,176,995，issued Oct. 15，1991.

U.S.Patent 5,177,011，issued Jan 5，1993.

U.S.Patent 5,187,091，issued Oct. 15，1991.

U.S.Patent 5,334,711，issued Aug. 2，1994.

U.S.Patent 5,378,619，issued Jan 3，1995.

U.S.Patent 5,384,253，issued Jan.24，1995.

U.S.Patent 5,401,836，issued Mar.28，1995.

U.S.Patent 5,424,412，issued Jun 13，1995.

U.S.Patent 5,436,002，issued Jul 25，1995.

U.S.Patent 5,436,393，issued Jul 25，1995.

U.S.Patent 5,442,052，issued Aug 15，1995.

U.S.Patent 5,447,858，issued Sept 5，1995.

U.S.Patent 5,459,252，issued Oct 17，1995.

U.S.Patent 5,463,175，issued Oct 31，1995.

U.S.Patent 5,491,288，issued Feb 13，1996.

U.S.Patent 5,504,200，issued Apr 2，1996.

U.S.Patent 5,530,196，issued Jun 25，1996.

U.S.Patent 5,538,879，issued Jul 23，1996.

U.S.Patent 5,576,198，issued Nov 19，1996.

U.S.Patent 5,589,583，issued Dec 31，1996.

U.S.Patent 5,589,610，issued Dec 31，1996.

U.S.Patent 5,589,614，issued Dec 31，1996

U.S.Patent 5,595,896，issued Jan 21，1997.

U.S.Patent 5,608,144，issued Mar 4，1997.

U.S.Patent 5,614,399，issued Mar 25，1997.

U.S.Patent 5,631,359，issued May 20，1997.

U.S.Patent 5,633,363，issued May 27，1997.

U.S.Patent 5,633,439，issued May 27，1997.

U.S.Patent 5,633,440，issued May 27，1997.

U.S.Patent 5,633,441，issued May 27，1997.

U.S.Patent 5,646,333，issued Jul 8，1997.

U.S.Patent 5,659,124，issued Aug 19，1997.

U.S.Patent 5,689,040，issued Nov 18，1997.

U.S.Patent 5,689,049，issued Nov 18，1997.

U.S.Patent 5,689,051，issued Nov 18，1997.

U.S.Patent 5,689,056，issued Nov 18，1997.

U.S.Patent 5,700,922，issued Dec.23，1997.

U.S.Patent 5,712,112，issued Jan 27，1998.

Int.Pat.Appl.Publ.No.PCT/US87/00880.

Int.Pat.Appl.Publ.No.PCT/US89/01025.

Int.Pat.Appl.Publ.No.WO 88/10315.

Int.Pat.Appl.Publ.No.WO 89/06700.

Int.Pat.Appl.Publ.No.WO 90/13651.

Int.Pat.Appl.Publ.No.WO 91/03162.

Int.Pat.Appl.Publ.No.WO 92/07065.

Int.Pat.Appl.Publ.No.WO 93/15187.

Int.Pat.Appl.Publ.No.WO 93/23569.

Int.Pat.Appl.Pub1.No.WO 94/02595.

Int.Pat.Appl.Publ.No.WO 94/13688.

Int.Pat.Appl.Publ.No.WO 96/10083.

Int.Pat.Appl.Publ.No.WO 97/17507.

Int.Pat.Appl.Publ.No.WO 97/17600.

Int.Pat.Appl.Publ.No.WO 97/40162.

Eur.Pat.Appl.Publ.No.EP0120516.

Eur.Pat.Appl.Publ.No.EP0360257.

Eur.Pat.Appl.Publ.No.EP 320,308.

Eur.Pat.Appl.Publ.No.EP 329,822.

Eur.Pat.Appl.Publ.No.92110298.4

Great Britain Pat.Appl.Publ.No.GB 2,202,328.

Abdullah et al.，Biotechnology，4：1087，1986.

Abbott，＂A method for computing the effectiveness of an insecticide，＂J.Econ.Entomol.，

18：265-267，1925.

Altschul，Stephen F.et al.，“Gapped BLAST and PSI-BLAST： a new generation of protein

database search programs”， Nucl.Acids Res.25：3389-3402，1997.Arantes and Lereclus，Gene，108：115-119，1991.Armitage et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，94(23)：12320-12325，1997.Baumlein，Boerjan，Nagy，Panitz，Inze，Wobus，“Upstream sequences regulating legumin gene

expression in heterologous transgenic plants，”Mol.Gen.Genet.，225(1)：121-128，1991.Baum，et al.，Appl.Envior.Biol.56：3420-3428，1990.Baumann et al.，J.Bacteriol.，170：2045-2050，1988.Benbrook et al.，In：Proceedings Bio Expo 1986，Butterworth，Stoneham，MA，pp.27-54，1986.Berna and Bernier，“Regulated expression of a wheat germin gene in tobacco：oxalate oxidase

activity and apoplastic localization of the heterologous protein，”Plant Mol.Biol.，

33(3)：417-429，1997.Bevan et al.，Nucleic Acids Res.，11(2)：369-85，1983.Boffa，Carpaneto，Allfrey，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，92：1901-1905，1995.Boffa，Morris，Carpaneto，Louissaint，Allfrey，J.Biol.Chem.， 271：13228-13233，1996.Boronat，Martinez，Reina，Puigdomenech，Palau，＂Isolation and sequencing of a 28 kd

gluteline-2 gene from maize：Common elements in the 5′flanking regions among zein

and glutelin genes，＂Plant Sci.，47：95-102，1986.Brussock and Currier，＂Use of sodium dodecyl sulfate-polacryamide gel electrophoresis to

quantify Bacillus thuringiensis.δ-endotoxins，＂In：Analytical Chemistry of Bacillus

thuringiensis，L.A.Hickle and W.L.Fitch，(Eds)，American Chemical Society，

Washington DC，pp.78-87，1990.Bytebier et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，84：5345，1987.Callis et al.，Genes and Development，1：1183，1987.Callis，Fromm，Walbot，＂Introns increase gene expression in cultured maize cells，＂Genes Devel.，

1：1183-1200，1987.Campbell，＂Monoclonal Antibody Technology，Laboratory Techniques in Biochemistry and

Molecular Biology，＂Vol.13，Burden and Von Knippenberg，Eds.pp.75-83，Elsevier，

Amsterdam，1984.Capecchi，＂High efficiency transformation by direct microinjection of DNA into cultured

mammalian cells，＂Cell，22(2)：479-488，1980.Carlsson et al.，Nature，380：207，1996.Carlton and Gonzalez，Molecular Biology of Microbial Differnetiation， Ninth International

Spore Conference，Asilomar，Calif.，USA Sept.3-6，1984.IX+280P.American Society

for Microbiology，246-252，1985.Cashmore et al.，Gen.Eng.of Plants，Plenum Press，New York，29-38，1983.Charles et al.，Zent.Bakteriol.Suppl.，28(0)：99-100，1996a.Charles et al.，Annual Review of Entomology，41：451-472，1996b.Chau et al.，Science，244：174-181，1989.Chen et al.，Nucl.Acids Res.，20：4581-9，1992.Cheng，Sardana，Kaplan，Altosaar，＂Agrobacterium-transformed rice plants expressing synthetic

cryIA(b) and cryIA(c) genes are highly toxic to striped stem borer and yellow stem

borer，＂Proc.Natl.Acad.Sci.USA，95(6)：2767-2772，1998.Chowrira and Burke，Nucl.Acids Res.，20：2835-2840，1992.Christensen et al.，J.Pept.Sci.，1(3)：175-183，1995.Christensen，Sharrock，Quail，＂Maize polyubiquitin genes：Structure，thermal perturbation of

expression and transcript splicing，and promoter activity following transfer to protoplasts

by electroporation，＂Plant Mol.Biol.，18：675-689，1992.Clapp，＂Somatic gene therapy into hematopoietic cells.Current status and future implications，＂

Clin.Perinatol.，20(1)：155-168，1993.Collins and Olive，Biochem.，32：2795-2799，1993.Conway and Wickens，In：RNA Processing，p.40，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring

Harbor，NY，1988.Corey，Trends Biotechnol.，15(6)：224-229，1997.Cornelissen et al.，Nature，321(6069)：531-2，1986.Crickmore et al.，“Revision of the nomenclature for the Bacillus thuringiensis pesticidal crystal

proteins，”Proc.Natl.Acad.Sci USA 62：807-813，1998Cristou et al.，Plant Physiol.，87：671-674，1988.Curiel，Agarwal，Wagner，Cotten，＂Adenovirus enhancement of transferrin-polylysine-mediated

gene delivery，＂ Proc.Natl.Acad.Sci.USA，88(19)：8850-8854，1991.Curiel，Wagner，Cotten，Birnstiel，Agarwal，Li，Loechel，and Hu，＂High-efficiency gene transfer

mediated by adenovirus coupled to DNA-polylysine complexes，＂ Hum. Gen. Ther.，

3(2)：147-154，1992.Daum，＂Revision of two computer programs for probit analysis，＂Bull.Entomol.Soc.Amer.，

16：10-15，1970.Dean et al.，Nucl.Acids Res.，14(5)：2229，1986.Dennis，Gerlach，Pryor，Bennetzen，Inglis，Llewellyn，Sachs，Ferl，Peackocock，＂Molecular

analysis of the alcohol dehydrogenase (Adhl) gene of maize，＂Nucl.Acids Res.，12：3983-

4000，1984.Diehn et al.，Genet. Eng. (N.Y.)，18：83-99，1996.Dhir，Dhir，Hepburn，Widholm，“Factors affecting transient gene expression in electroporated

Glycine-max protoplasts，” Plant Cell Rep.，10(2)：106-110，1991a.Donovan et al.， Appl.Environ.Microbiol.，58：3921-3927，1992.Doyle et al.，J.Biol.Chem.，261(20)：9228-38，1986.Dropulic et al.，J.Virol.，66：1432-41，1992.Dueholm et al.，J.Org.Chem.，59：5767-5773，1994.Egholm et al.，Nature，365：566-568，1993.Eglitis and Anderson，＂Retroviral vectors for introduction of genes into mammalian cells，＂

Biotechniques，6(7)：608-614，1988.Eglitis，Kantoff，Kohn，Karson，Moen，Lothrop，Blaese，Anderson，＂Retroviral-mediated gene

transfer into hemopoietic cells，＂Avd.Exp.Med.Biol.，241：19-27，1988.Elroy-Stein and Moss，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，87：6743-7，1990.English and Slatin，Insect Biochem.Mol.Biol.，22：1-7，1992.Faktor，Kooter，Dixon，Lamb，“Functional dissection of a bean chalcone synthase gene promoter

in transgenic tobacco plants reveals sequence motifs essential for floral expression，”

Plant Mol.Biol.，32(5)：849-859，1996.Ficker，Kirch，Eijlander，Jacobsen，Thompson，“Multiple elements of the S2-RNase promoter

from potato (Solanum tuberosum L.) are required for cell type-specific expression in

transgenic potato and tobacco，”Mol.Gen.Genet.，257(2)：132-142，1998.Footer，Engholm，Kron，Coull，Matsudaira，Biochemistry，35：10673-10679，1996.Fraley et al.，Biotechnology，3：629，1985.Fraley et al.， Proc.Natl.Acad. Sci.USA，80：4803，1983.French，Janda，Ahlquist，＂Bacterial gene inserted in an engineered RNA virus：efficient

expression in monocotyledonous plant cells，＂Science，231：1294-1297，1986.Frohman，In：PCR^TM Protocols：A Guide to Methods and Applications，Academic Press，New

York，1990.Fromm et al.，Biotechnology (N.Y.)，8(9)：833-9，1990.Fromm，Taylor，Walbot，＂Expression of genes transferred into monocot and dicot plant cells by

electroporation，＂Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82(17)：5824-5828，1985.Fromm et al.，Nature，319：791-793，1986.Fujimura et al.，Plant Tiss.Cult.Lett.，2：74，1985.Fynan，Webster，Fuller，Haynes，Santoro，Robinson，＂DNA vaccines：protective immunizations

by parenteral，mucosal，and gene gun inoculations，＂Proc.Natl.Acad.Sci.USA，

90(24)：11478-11482，1993.Gallie and Young，＂The regulation of expression in transformed maize aleurone and endosperm

protoplasts，＂Plant Physiol.，106：929-939，1994.Gallie，Feder，Schimke，Walbot，＂Post-transcriptional regulation in higher eukaryotes：the role of

the reporter gene in controlling expression，＂Mol.Gen. Genet.，228：258-264，1991.Gallie，Lucas，Walbot，＂Visualizing mRNA expression in plant protoplasts：factors influencing

efficient mRNA uptake and translation，＂Plant Cell，1：301-311，1989.Gallie，Sleat，Turner，Wilson，＂Mutational analysis of the tobacco mosaic virus 5′-leader for

altered ability to enhance translation，＂Nucl.Acids Res.，16：883-893，1988.Gallie，Sleat，Watts，Turner，Wilson，＂A comparison of eukaryotic viral 5′-leader sequences as

enhancers of mRNA expression in vivo，＂Nucl.Acids Res.，15：8693-8711，1987b.Gallie，Sleat，Watts，Turner，Wilson，＂The5′-leader sequence of tobacco mosaic virus RNA

enhances the expression of foreign gene transcripts in vitro and in vivo，＂Nucl. Acids Res.，

15：3257-3273，1987a.Gambacorti-Passerini et al.，Blood，88：1411-1417，1996.Gao and Huang，Nucl.Acids Res.，21：2867-72，1993.Gefter et al.，Somat.Cell Genet.，3：231-236，1977.Gehrke，Auron，Quigley，Rich，Sonenberg，＂5′-Conformation of capped alfalfa mosaic virus

ribonucleic acid 4 may reflect its independence of the cap structure or of cap-binding

protein for efficient translation，＂Biochemistry，22：5157-5164，1983.Genovese and Milcarek，In：RNA Processing，p.62，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold

Spring Harbor，NY，1988.Gil and Proudfoot，Nature，312：473，1984.Goding，＂Monoclonal Antibodies：Principles and Practice，＂pp. 60-74. 2nd Edition，Academic

Press，Orlando，FL，1986.Goelet，Lomonossoff，Butler，Akam，Gait，Karn，＂Nucleotide sequence of tobacco mosaic virus

RNA，＂Proc.Natl.Acad Sci.USA，79：5818-5822，1982.Gonzalez Jr.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci USA，79：6951-6955，1982.Good and Nielsen，Antisense Nucleic Acid Drug Dev.，7(4)：431-437，1997.Graham，Craig，Waterhouse，“Expression patterns of vascular-specific promoters ROIC and Sh

in transgenic potatoes and their use in engineering PLRV-resistant plants，”Plant Mol.

Biol.，33(4)：729-735，1997.Graham，F.L.，and van der Eb，A.J.，＂Transformation of rat cells by DNA of human adenovirus

5，＂Virology，54(2)：536-539，1973.Griffith et al.，J.Am.Chem.Soc.，117：831-832，1995.Grosset，Alary，Gautier，Menossi，Martinez-Izquierdo，Joudrier，“Characterization of a barley

gene coding for an alpha-amylase inhibitor subunit (Cmd protein) and analysis of its

promoter in transgenic tobacco plants and in maize kernels by microprojectile

bombardment，” Plant Mol.Biol.，34(2)：331-338，1997.Guerrier-Takada et al.，Cell，35：849，1983.Haaima，Lohse，Buchardt，Nielsen，Angew.Chem.，Int.Ed.Engl.，35：1939-1942，1996.Hampel and Tritz，Biochem.，28：4929，1989.Hampel et al.，Nucl.Acids Res.，18：299，1990.Hanvey et al.，Science，258：1481-1485，1992.Harlow and Lane，＂Antibodies：A Laboratory Manual，＂Cold Spring Harbor Laboratory，Cold

Spring Harbor，NY，1988.Herrera-Estrella et al.，Embo.J.，2(6)：987-996，1983.Hertig et al.，Plant Mol.Biol.，16(1)：171-4，1991.Hess，Intern Rev.Cytol.，107：367，1987.Hfte and Whiteley，Microbiol. Rev.，53：242-255，1989.Horsch，Fry，Hoffmann，Eichholtz，Rogers，Fraley，“A simple and general method for

transferring genes into plants，”Science，227(4691)：1229-1231，1985.Huang，An，McDowell，McKinney，Meagher，“The Arabidopsis ACT11 action gene is strongly

expressed in tissues of the emerging inflorescence，pollen and developing ovules，”Plant

Mol.Biol.，33(1)：125-139，1997.Hudspeth and Grula，＂Structure and expression of the maize gene encoding the

phosphoenolpyruvate carboxylase isozyme involved in C4 photosynthesis，＂Plant Mol.

Biol.，12：579-589，1989.Hyrup and Nielsen，Bioorg.Med.Chem.，1996.Ingelbrecht，Herman，Dekeyser，Van Montagu，Depicker，＂Different 3′ end regions strongly

influence the level of gene expression in plant cells，＂Plant Cell，1：671-680，1989.Jameson and Wolf，＂The Antigenic Index： A Novel Algorithm for Predicting Antigenic

Determinants，＂Compu.Appl.Biosci.，4(1)：181-6，1988.Jensen et al.，Biochemistry，36(16)：5072-5077，1997.Jobling and Gehrke，＂Enhanced translation of chimaeric messenger RNAs containing a plant

viral untranslated leader sequence，＂Nature，325：622-625，1987.Johnston and Tang，＂Gene gun transfection of animal cells and genetic immunization，＂Methods

Cell.Biol.，43(A)：353-365，1994.Jones，Dean，Gidoni，Gilbert，Bond-Nutter，Lee，Bedbrook，Dunsmuir，＂Expression of bacterial

chitinase protein in tobacco leaves using two photosynthetic gene promoters，＂Mol.Gen.

Genet.，212：536-542，1988.Jorgensen et al.，Mol.Gen.Genet.，207：471，1987.Joshi，＂An inspection of the domain between putative TATA box and translation start site in 79

plant genes，＂Nucl.Acids Res.，15：6643-6653，1987.Kaiser and Kezdy，Science，223：249-255，1984.Kashani-Sabet et al.，Antisense Res.Dev.，2：3-15，1992.Keller et al.，EMBO J.，8：1309-14，1989.Klee，Yanofsky，Nester，“Vectors for transformation of higher plants，”Bio-Technology，

3(7)：637-642，1985.Klein et al.，Nature，327：70，1987.Klein et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，85：8502-8505，1988.Koch et al.，Tetrahedron Lett.，36：6933-6936，1995.Kohler and Milstein，Eur.J.Immunol.，6：511-519，1976.Kohler and Milstein，Nature，256：495-497，1975.Koppelhus，Nucleic Acids Res，25(11)：2167-2173，1997.Korn and Queen，DNA，3：421-436，1984.Kozicl，Beland，Bowman，Carozzi，Crenshaw，Crossland，Dawson，Desai，Hill，Kadwell，Launis，

Lewis，Maddox，McPherson，Meghji，Merlin，Rhodes，Warren，Wright，Evola，＂Field

performance of elite transgenic maize plants expressing an insecticidal protein derived

from Bacillus thuringiensis，Bio/technology，11：194-200，1993.Koziel，Carozzi，Desai，＂Optimizing expression of transgenes with an emphasis on post-

transcriptional events，＂Plant Mol.Biol.，32(102)：393-405，1996.Kremsky et al.，Tetrahedron Lett.，37：4313-4316，1996.Krieg et al.，In：Zangew.Ent.，96：500-508，1983.Kuby，＂Immunology＂ 2nd Edition.W.H.Freeman & Company，New York，1994.Kunkel，Roberts，Zakour，＂Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic

selection，＂Methods Enzymol.，154：367-382，1987.Kwoh，Davis，Whitfield，Chappelle，DiMichele，Gingeras，＂Transcription-based amplification

system and detection of amplified human immunodeficiency virus type 1 with a bead-

based sandwich hybridization format，＂Proc.Natl.Acad.Sci.USA，86(4)：1173-1177，

1989.Kyozuka，Fujimoto，Izawa，Shimamoto，＂Anaerobic induction and tissue-specific expression of

maize Adhl promoter in transgenic rice plants and their progeny，＂ Mol.Gen.Genet.，

228(1-2)：40-48，1991.Kyte and Doolittle，＂A simple method for displaying the hydropathic character of a protein，＂J.

Mol.Biol.，157(1)：105-132，1982.L′Huillier et al.，EMBO J.，11：4411-8，1992.Lambert et al.，Appl.Environ.Microbiol.，58：2536-2642，1992b.Lambert et al.，Gene，110：131-132，1992a.Landsdorp et al.，Hum.Mol.Genet.，5：685-691，1996.Langridge et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，86：3219-3223，1989.Lieber et al.，Methods Enzymol.，217：47-66，1993.Lindstrom et al.，Developmental Genetics，11：160，1990.Lisziewicz et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，90：8000-4，1993.Lorz et al.，Mol.Gen.Genet.，199：178，1985.Lu，Xiao，Clapp，Li，Broxmeyer，＂High efficiency retroviral mediated gene transduction into

single isolated immature and replatable CD34(3+) hematopoietic stem/progenitor cells

from human umbilical cord blood，＂J.Exp.Med.，178(6)：2089-2096，1993.Luehrsen et al.，Prog.Nucleic Acid Res.Mol.Biol.，47：149-93，1994.Luehrsen and Walbot，＂Intron enhancement of gene expression and the splicing efficiency of

introns in maize cells，＂Mol.Gen.Genet.，225：81-93，1991.Luo et al.，Plant Mol.Biol.Reporter，6：165，1988.Lutcke，Chow，Mickel，Moss，Kern，Scheele，＂Selection of AUG initiation codons differs in

plants and animals，＂EMBO J.，6：43-48，1987.Maas，Laufs，Grant，Korfhage，Werr，＂The combination of a novel stimulatory element in the

first exon of the maize shrunken-l gene with the following intron enhances reporter gene

expression 1000-fold，＂Plant Mol.Biol.，16：199-207，1991.Macaluso and Menus，J.Bacteriol.，173：1353-1356，1991.Maddock et al.，Third International Congress of Plant Molecular Biology，Abstract 372，1991.Maloy，＂Experimental Techniques in Bacterial Genetics＂Jones and Bartlett Publishers，Boston，

MA，1990.Maloy et al.，＂Microbial Genetics＂ 2nd Edition.Jones and Barlett Publishers，Boston，MA，1994.Maniatis et al.，”Molecular Cloning：a Laboratory Manual，＂Cold Spring Harbor Laboratory，

Cold Spring Harbor，NY.，1982.Marcotte et al.，Nature，335：454，1988.Marrone，“Influence of artificial diet on southern corn rootworm life history and susceptibility to

insecticidal compounds，” Westview Studies in Insect Biology；Advances in insect rearing

for research and pest management，229-235，1992.Mascerenhas，Mettler，Pierce，Lowe，＂Intron mediated enhancement of heterologous gene

expression in maize，＂Plant Mol.Biol.，15：913-920，1990.McBride，Svab，Schaaf，Hogan，Stalker，Maliga，＂Amplification of a chimeric Bacillus gene in

chloroplasts leads to an extraordinary level of an insecticidal protein in tobacco，＂

Bio/technology，13：362-365，1995.McCabe et al.，Biotechnology，6：923，1988.McDevitt et al.，Cell，37：993-999，1984.McElroy，Zhang，Wu，＂Isolation of an efficient promoter for use in rice transformation，＂Plant

Cell，2：163-171，1990.Michael，Biotechniques，16：410-412，1994.Mollegaard，Buchardt，Egholm，Nielsen，Proc.Natl.Acad Sci.USA，91：3892-3895，1994.Nawrath，Poirier，Somerville，＂Targeting of the polyhydroxybutyrate biosynthetic pathway to the

plastids of Arabidopsis thaliana results in high levels of polymer accumulation，＂Proc.

Natl.Acad.Sci.USA，91：12760-12764，1994.Neilsen，In.：Perspectives in Drug Discovery and Design 4，Escom Science Publishers，pp.76-84，

1996.Nielsen et al.，Anticancer Drug Des.，8(1)：53-63，1993b.Nielsen，Egholm，Berg，Buchardt，Science，254：1497-1500，1991.Norton，Piatyszek，Wright，Shay，Corey，Nat.Biotechnol.，14：615-620，1996.Norton，Waggenspack，Varnum，Corey，Bioorg.Mead.Chem.，3：437-445，1995.Oard，Paige，Dvorak，＂Chimeric gene expression using maize intron in cultured cells of

breadwheat，＂Plant Cell. Rep.，8：156-160，1989.Odell et al.，Nature，313：810，1985.Ohara et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，86(15)：5673-7，1989.Ohkawa，Yuyama，Taira，＂Activities of HIV-RNA targeted ribozymes transcribed from a ′shot-

gun′ type ribozyme-trimming plasmid，＂Nucl.Acids Symp.Ser.，27：15-6，1992.Ojwang et al.，Proc.Natl.Acad Sci.USA，89：10802-6，1992.Omirulleh et al.，Plant Mol.Biol.，21：415-428，1993.Orum，Nielsen，Egholm，Berg，Buchardt，Stanley，Nucl Acids Res.，21：5332-5336，1993.Orum，Nielsen，Jorgensen，Larsson，Stanley，Koch，BioTechniques，19：472-480，1995.Pandey and Marzluff，In ＂RNA Processing，＂p.133，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold

Spring Harbor，NY，1987.Pardridge，Boado，Kang，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，92：5592-5596，1995.Pearson and Lipman，Proc.Natl.Acad.Sci USA，85(8)：2444-8，1988.Pena et al.，Nature，325：274，1987.Perlak，Deaton，Armstrong，Fuchs，Sims，Greenplate，Fischhoff，＂Insect resistant cotton plants，＂

Bio/Technology，8：939-943，1990.Perlak，Fuchs，Dean，McPherson，Fischhoff，＂Modification of the coding sequence enhances

plant expression of insect control protein genes，＂Proc.Natl.Acad.Sci USA，88：3324-

3328，1991.Perlak，Stone，Muskopf，Peterson，Parker，McPherson，Wyman，Love，Reed，Biever，Fischhoff，

＂Genetically improved potatoes：protection from damage by Colorado potato beetles，＂

Plant Mol.Biol.，22：313-321，1993.Pertault et al，Nature，344：565，1990.Perrotta and Been，Biochem.，31：16，1992.Perry-O′Keefe，Yao，Coull，Fuchs，Egholm，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，93：14670-14675，1996.Petersen，Jensen，Egholm，Nielsen，Buchardt，Bioorg.Med.Chem.Lett.，5：1119-1124，1995.Pieken et al.，Science，253：314，1991.Poogin and Skryabin，＂The 5′untranslated leader sequence of potato virus X RNA enhances the

expression of the heterologous gene in vivo，”Mol.Gen.Genet.，234：329-331，1992.Poszkowski et al.，EMBO J.，3：2719，1989.Potrykus et al.，Mol.Gen.Genet.，199：183，1985.Poulsen et al.，Mol.Gen.Genet.，205：193-200，1986.Prokop and Bajpai，Ann.N.Y.Acad.Sci.，646，1991.Rogers et al.，In：Methods For Plant Molecular Biology，Weissbach and Weissbach，eds.，

Academic Press Inc.，San Diego，CA 1988.Rogers et al.，Methods Enzymol.，153：253-277，1987.Rose，Anal.Chem.，65(24)：3545-3549，1993.Rossi et al.，Aids Res.Hum.Retrovir.，8：183，1992.Ruskowski et al.，Cancer，80(12 Suppl)：2699-2705，1997.Russell and Fromm，“Tissue-specific expression in transgenic maize for four endosperm

promoters from maize and rice，”Transgenic Res.，6(2)：157-168，1997.Sadofsky and Alwine，Mol.Cell.Biol.，4(8)：1460-1468，1984.Sambrook et al.，＂Antibodies：A Laboratory Manual，＂Cold Spring Harbor Laboratory，Cold

spring Harbor，NY，1989a.Sambrook et al.，＂Molecular Cloning：A Laboratory Manual，＂Cold Spring Harbor Laboratory，

Cold Spring Harbor，NY，1989b.Sanger et al.，＂DNA sequencing with chain-terminating inhibitors，＂Proc.Natl.Acad Sci.U S A，

74(12)：5463-5467，1977.Sarver et al.，Science，247(4947)：1222-5，1990.Saville and Collins，Cell，61：685-696，1990.Saville and Collins，Proc.Natl.Acad Sci.USA，88：8826-8830，1991.Scanlon et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，88：10591-5，1991.Scaringe et al.，Nucl.Acids Res.，18：5433-5441，1990.Seeger et al.，Biotechniques，23(3)：512-517，1997.Segal，＂Biochemical Calculations＂2nd Edition.John Wiley & Sons，New York，1976.Shaw and Kamen，Cell，46：659-667，1986.Shaw and Kamen，In：“RNA Processing”，p.220，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring

Harbor，NY，1987.Simpson，Science，233：34，1986.Sleat，Gallie，Jefferson Bevan，Turner，Wilson，＂Characterization of the 5′-leader sequence of

tobacco mosaic virus RNA as a general enhancer of translation in vitro，＂Gene，217：217-

225，1987.Sleat，Hull，Turner，Wilson，＂Studies on the mechanism of translational enhancement by the 5′-

leader sequence of tobacco mosaic virus RNA，＂Eur.J.Biochem.，175：75-86，1988.Southern，J.Mol.Biol.，98：503-517，1975.Spielmann et al.，Mol.Gen.Genet.，205：34，1986.Stetsenko，Lubyako，Potapov，Azhikina，Sverdlov，Tetrahedron Lett.，37：3571-3574，1996.Taira et al.，Nucl.Acids Res.，19：5125-30，1991.Tanaka，Mira，Ohta，Kyozuka，Shimamoto，Nakamura，＂Enhancement of foreign gene expression

by a dicot intron in rice but not in tobacco is correlated with an increased level of mRNA

and an efficient splicing of the intron，＂Nucl.Acids Res.，18：6767-6770，1990.Thanabalu et al.，Appl.Environ. Microbiol.，61(11)：4031-6，1995.Thanabalu et al.，J.Bacteriol.，173(9)：2776-85，1991.Thiede，Bayerdorffer，Blasczyk，Wittig，Neubauer，Nucleic Acids Res.，24：983-984，1996.Thisted，Just，Petersen，Hyldig-Nielsen，Godtfredsen，Cell Vision，3：358-363，1996.Thomson et al.，Tetrahedron，51：6179-6194，1995.Tomic，Sunjevaric，Savtchenko，Blumenberg，＂A rapid and simple method for introducing

specific mutations into any position of DNA leaving all other positions unaltered，＂Nucl.

Acids Res.，18(6)：1656，1990.Toriyama et al.，Theor Appl. Genet.，73：16，1986.Treacy，Hattori，Prud’homme，Barbour，Boutilier，Baszczynski，Huang，Johnson，Miki，“Bnml，a

Brassica pollen-specific gene，”Plant Mol.Biol.，34(4)：603-611，1997.Uchimiya et al.，Mol.Gen.Genet.，204：204，1986.Ulmann，Will，Breipohl，Langner，Ryte，Angew.Chem.，Int.Ed.Engl.，35：2632-2635，1996.Upender，Raj，Weir，＂Megaprimer method for in vitro mutagenesis using parallel templates，＂

Biotechniques，18：29-31，1995.Ulmann el al.，J.Am.Chem.Soc.，109：7845-7854，1987.Usman and Cedergren，TIBS，17：34，1992.Van Camp，Herouart，Willekens，Takahashi，Saito，Van Montagu，Inze，“Tissue-specific activity

of two manganese superoxide dismutase promoters in transgenic tobacco，”Plant

Physiol.，112(2)：525-535，1996.Van Tunen et al.，EMBO J.，7：1257，1988.Vander，Van Montagu，Inze，Boerjan，“Tissue-specific expression conferred by the S-adenosyl-

L-methionine synthetase promoter of Arabidopsis thaliana in transgenic poplar，”Plant

Cell Physiol.，37(8)：1108-1115，1996.Vasil et al.，＂Herbicide-resistant fertile transgenic wheat plants obtained by microprojectile

bombardment of regenerable embryogenic callus，＂ Biotechnology，10：667-674，1992.Vasil，Biotechnology，6：397，1988.Vasil，Clancy，Ferl，Vasil，Hannah，＂Increased gene expression by the first intron of maize

shrunken-l locus in grass species，＂Plant Physiol.，91：1575-1579，1989.Ventura et al.，Nucl.Acids Res.，21：3249-55，1993.Veselkov，Demidov，Nielsen，Frank-Kamenetskii，Nucl.Acids Res.，24：2483-2487，1996.Vickers，Griffith，Ramasamy，Risen，Freier，Nucl.Acids Res.，23：3003-3008，1995.Vodkin et al.，Cell，34：1023，1983.Vogel，Dawe，Freeling，“Regulation of the cell type-specific expression of maize Adhl and Shl

electroporation-directed gene transfer into protoplasts of several maize tissues，”J.Cell.

Biochem.，(Suppl.0) 13：Part D，1989.Wagner et al.，＂Coupling of adenovirus to transfenin-polylysine/DNA complexes greatly

enhances receptor-mediated gene delivery and expression of transfected genes，＂Proc.

Natl.Acad.Sci.USA，89(13)：6099-6103，1992.Walker，Little，Nadeau，Shank，＂Isothermal in vitro amplification of DNA by a restriction

enzyme/DNA polymerase system，＂Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89(1)：392-396，1992.Wang et al.，J.Am.Chem.Soc.，118：7667-7670，1996.Watson，＂Fluid and electrolyte disorders in cardiovascular patients，＂Nurs.Clin.North Am.，

22(4)：797-803，1987.Webb and Harskainen，J.Biomol.Screen.，1：119-121，1996.Weerasinghe et al.，J.Virol.，65：5531-4，1991.Weissbach and Weissbach，Methods for Plant Molecular Biology，(eds.)，Academic Press，Inc.，

San Diego，CA，1988.Wenzler et al.，Plant Mol.Biol.，12：41-50，1989.Wickens and Stephenson，Science，226：1045，1984.Wickens et al.，In：“RNA Processing，”p.9，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring

Harbor，NY，1987.Wilson，Flint，Deaton，Fischhoff，Perlak，Armstrong，Fuchs，Berberich，Parks，Stapp，＂Resistance

of cotton lines containing a Bacillus thuringiensis toxin to pink bollworm (Lepidopteran：

Gelechiidae) and other insects，＂J.Econ.Entomol.，4：1516-1521，1992.Wolf et al.，Compu.Appl.Biosci.，4(1)：187-91 1988.Wong et al.，Plant Mol.Biol.20(1)：81-93，1992.Wong and Neumann，＂Electric field mediated gene transfer，＂Biochim.Biophys. Res. Commun.，

107(2)：584-587，1982.Woolf et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89：7305-7309，1992.Wu et al.，FEMS Microbiol.Lett.，81，31-36，1991.Wu and Dean，＂Functional significance of loops in the receptor binding domain of Bacillus

thuringiensis CryIIIA delta-endotoxin，＂J.Mol.Biol.，255(4)：628-640，1996.Yamada et al.，Plant Cell Rep.，4：85，1986.Yang et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，87：4144-48，1990.Yanisch-Perron et al.，Gene，33(1)：103-19，1985.Yin，Chen，Beachy，“Promoter elements required for phloem-specific gene expression from the

RTBV promoter in rice，”Plant J.，12(5)：1179-1188，1997b.Yin，Zhu，Dai，Lamb，Beachy，“RF2a，a bZIP transcriptional activator of the phloem-specific rice

tungro bacilliform virus promoter，functions in vascular development，” EMBO J.，

16(17)：5247-5259，1997a.Yu et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：6340-4，1993.Zatloukal，Wagner，Cotten，Phillips，Plank，Steinlein，Curiel，Birnstiel，＂Transferrinfection：a

highly efficient way to express gene constructs in eukaryotic cells，＂Ann.N.Y.Acad.Sci.，

660：136-153，1992.Zhou et al.，Methods Enzymnol.，101：433，1983.Zhou et al.，Mol.Cell Biol.，10：4529-37，1990.

本文公开和声明的所有组合物和方法，在有关本公开内容方面没有进行不适当实验时可以产生并使用。在谈到优选实施方案时描述的本发明的组合物和方法时，对于本领域中的熟练技术人员来说，在不违反本发明的概念、精神和范围的情况下本文所述组合物、方法及方法的步骤或步骤的次序中可以有所变动。更特别的是，可以理解的是某些化学相关或生理相关的试剂在能获得相同结果或相似结果时可以替代本文所述试剂。对于本领域中的熟练技术人员来说，所有这些类似的替换和修饰都可以视作在由附加的权利要求中阐述的本发明精神、范围和概念中。因此，为申请专利而作的专用权利请参见在下面权利要求所描述的内容。

序列一览表<110>RUPAR，MARK J.

DONOVAN，WILLIAM P.

CHU，CHIH-REI

PEASE，ELIZABETH

TAN，YUPING

SLANEY，ANNETTE C.

BAUM，JAMES A.

MALVAR，THOMAS M.<120>鞘翅目毒性多肽组合物和抗虫转基因植物<130>MECO164<140><141><160>34<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>1161<212>DNA<213>苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)<400>1atgatagaaa ctaataagat atatgaaata agcaataaag ctaatggatt atatgcaact 60acttatttaa gttttgataa ttcaggtgtt agtttattaa ataaaaatga atctgatatt 120aatgattata atttgaaatg gtttttattt cctattgata ataatcagta tattattaca 180agttatggag taaataaaaa taaggtttgg actgctaatg gtaataaaat aaatgttaca 240acatattccg cagaaaattc agcacaacaa tggcaaataa gaaacagttc ttctggatat 300ataatagaaa ataataatgg gaaaatttta acggcaggaa caggccaatc attaggttta 360ttatatttaa ctgatgaaat acctgaagat tctaatcaac aatggaattt aacttcaata 420caaacaattt cacttccttc acaaccaata attgatacaa cattagtaga ttaccctaaa 480tattcaacga ccggtagtat aaattataat ggtacagcac ttcaattaat gggatggaca 540ctcataccat gtattatggt atacgataaa acgatagctt ctacacacac tcaaattaca 600acaacccctt attatatttt gaaaaaatat caacgttggg tacttgcaac aggaagtggt 660ctatctgtac ctgcacatgt caaatcaact ttcgaatacg aatggggaac agacacagat 720caaaaaacca gtgtaataaa tacattaggt tttcaaatta atacagatac aaaattaaaa 780gctactgtac cagaagtagg tggaggtaca acagatataa gaacacaaat cactgaagaa 840cttaaagtag aatatagtag tgaaaataaa gaaatgcgaa aatataaaca aagctttgac 900gtagacaact taaattatga tgaagcacta aatgctgtag gatttattgt tgaaacttca 960ttcgaattat atcgaatgaa tggaaatgtc cttataacaa gtataaaaac tacaaataaa 1020gacacctata atacagttac ttatccaaat cataaagaag ttttattact tcttacaaat 1080cattcttatg aagaagtaac agcactaact ggcatttcca aagaaagact tcaaaatctt 1140aaaaacaatt ggaaaaaaag a 1161<210>2<211>387<212>蛋白质<213>苏云金芽孢杆菌<400>2Met Ile Glu Thr Asn Lys Ile Tyr Glu Ile Ser Asn Lys Ala Asn Gly1 5 10 15Leu Tyr Ala Thr Thr Tyr Leu Ser Phe Asp Asn Ser Gly Val Ser Leu

20 25 30Leu Asn Lys Asn Glu Ser Asp Ile Asn Asp Tyr Asn Leu Lys Trp Phe

35 40 45Leu Phe Pro Ile Asp Asn Asn Gln Tyr Ile Ile Thr Ser Tyr Gly Val

50 55 60Asn Lys Asn Lys Val Trp Thr Ala Asn Gly Asn Lys Ile Asn Val Thr65 70 75 80Thr Tyr Ser Ala Glu Asn Ser Ala Gln Gln Trp Gln Ile Arg Asn Ser

85 90 95Ser Ser Gly Tyr Ile Ile Glu Asn Asn Asn Gly Lys Ile Leu Thr Ala

100 105 110Gly Thr Gly Gln Ser Leu Gly Leu Leu Tyr Leu Thr Asp Glu Ile Pro

115 120 125Glu Asp Ser Asn Gln Gln Trp Asn Leu Thr Ser Ile Gln Thr Ile Ser

130 135 140Leu Pro Ser Gln Pro Ile Ile Asp Thr Thr Leu Val Asp Tyr Pro Lys145 150 155 160Tyr Ser Thr Thr Gly Ser Ile Asn Tyr Asn Gly Thr Ala Leu Gln Leu

165 170 175Met Gly Trp Thr Leu Ile Pro Cys Ile Met Val Tyr Asp Lys Thr Ile

180 185 190Ala Ser Thr His Thr Gln Ile Thr Thr Thr Pro Tyr Tyr Ile Leu Lys

195 200 205Lys Tyr Gln Arg Trp Val Leu Ala Thr Gly Ser Gly Leu Ser Val Pro

210 215 220Ala His Val Lys Ser Thr Phe Glu Tyr Glu Trp Gly Thr Asp Thr Asp225 230 235 240Gln Lys Thr Ser Val Ile Asn Thr Leu Gly Phe Gln Ile Asn Thr Asp

245 250 255Thr Lys Leu Lys Ala Thr Val Pro Glu Val Gly Gly Gly Thr Thr Asp

260 265 270Ile Arg Thr Gln Ile Thr Glu Glu Leu Lys Val Glu Tyr Ser Ser Glu

275 280 285Asn Lys Glu Met Arg Lys Tyr Lys Gln Ser Phe Asp Val Asp Asn Leu

290 295 300Asn Tyr Asp Glu Ala Leu Asn Ala Val Gly Phe Ile Val Glu Thr Ser305 310 315 320Phe Glu Leu Tyr Arg Met Asn Gly Asn Val Leu Ile Thr Ser Ile Lys

325 330 335Thr Thr Asn Lys Asp Thr Tyr Asn Thr Val Thr Tyr Pro Asn His Lys

340 345 350Glu Val Leu Leu Leu Leu Thr Asn His Ser Tyr Glu Glu Val Thr Ala

355 360 365Leu Thr Gly Ile Ser Lys Glu Arg Leu Gln Asn Leu Lys Asn Asn Trp

370 375 380Lys Lys Arg385<210>3<2ll>396<212>DNA<213>苏云金芽孢杆菌<400>3atgtcagcac gtgaagtaca cattgaaata ataaatcata caggtcatac cttacaaatg 60gataaaagaa ctagacttgc acatggtgaa tggattatta cacccgtgaa tgttccaaat 120aattcttctg atttatttca agcaggttct gatggagttt tgacaggagt agaaggaata 180ataatttata ctataaatgg agaaatagaa attaccttac attttgacaa tccttatgca 240ggttctaata aatattctgg acgttctagt gatgatgatt ataaagttat aactgaagca 300agagcagaac atagagctaa taatcatgat catgtaacat atacagttca aagaaacata 360tcacgatata ccaataaatt atgttctaat aactcc 396<210>4<211>132<212>蛋白质<213>苏云金芽孢杆菌<400>4Met Ser Ala Arg Glu Val His Ile Glu Ile Ile Asn His Thr Gly His1 5 10 15Thr Leu Gln Met Asp Lys Arg Thr Arg Leu Ala His Gly Glu Trp Ile

20 25 30Ile Thr Pro Val Asn Val Pro Asn Asn Ser Ser Asp Leu Phe Gln Ala

35 40 45Gly Ser Asp Gly Val Leu Thr Gly Val Glu Gly Ile Ile Ile Tyr Thr

50 55 60Ile Asn Gly Glu Ile Glu Ile Thr Leu His Phe Asp Asn Pro Tyr Ala65 70 75 80Gly Ser Asn Lys Tyr Ser Gly Arg Ser Ser Asp Asp Asp Tyr Lys Val

85 90 95Ile Thr Glu Ala Arg Ala Glu His Arg Ala Asn Asn His Asp His Val

100 105 110Thr Tyr Thr Val Gln Arg Asn Ile Ser Arg Tyr Thr Asn Lys Leu Cys

115 120 125Ser Asn Asn Ser

130<210>5<211>402<212>DNA<213>苏云金芽孢杆菌<400>5aaggaacata catataaaaa ggggaaacct accgaaaaat attatcattt ttttaagtta 60aatacataca ttaatttagt atctgtaaaa acattaattt tatggaggtt gatatttatg 120tcagctcgcg aagtacacat tgaaataaac aataaaacac gtcatacatt acaattagag 180gataaaacta aacttagcgg aggtagatgg cgaacatcac ctacaaatgt tgctcgtgat 240acaattaaaa catttgtagc agaatcacat ggttttatga caggagtaga aggtattata 300tattttagtg taaacggaga cgcagaaatt agtttacatt ttgacaatcc ttatatagtt 360ctaataaatg tgatggttct tctgatagac ctgaatatga ag 402<210>6<211>119<212>蛋白质<213>苏云金芽孢杆菌<400>6Met Ser Ala Arg Glu Val His Ile Glu Ile Asn Asn Lys Thr Arg His1 5 10 15Thr Leu Gln Leu Glu Asp Lys Thr Lys Leu Ser Gly Gly Arg Trp Arg

20 25 30Thr Ser Pro Thr Asn Val Ala Arg Asp Thr Ile Lys Thr Phe Val Ala

35 40 45Glu Ser His Gly Phe Met Thr Gly Val Glu Gly Ile Ile Tyr Phe Ser

50 55 60Val Asn Gly Asp Ala Glu Ile Ser Leu His Phe Asp Asn Pro Tyr Ile65 70 75 80Gly Ser Asn Lys Cys Asp Gly Ser Ser Asp Lys Pro Glu Tyr Glu Val

85 90 95Ile Thr Gln Ser Gly Ser Gly Asp Lys Ser His Val Thr Tyr Thr Ile

100 105 110Gln Thr Val Ser Leu Arg Leu

115<210>7<211>1155<212>DNA<213>苏云金芽孢杆菌<400>7atgttagata ctaataaagt ttatgaaata agcaatcttg ctaatggatt atatacatca 60acttatttaa gtcttgatga ttcaggtgtt agtttaatga gtaaaaagga tgaagatatt 120gatgattaca atttaaaatg gtttttattt cctattgata ataatcaata tattattaca 180agctatggag ctaataattg taaagtttgg aatgttaaaa atgataaaat aaatgtttca 240acttattctt caacaaactc tgtacaaaaa tggcaaataa aagctaaaga ttcttcatat 300ataatacaaa gtgataatgg aaaggtctta acagcaggag taggtgaatc tcttggaata 360gtacgcctaa ctgatgaatt tccagagaat tctaaccaac aatggaattt aactcctgta 420caaacaattc aactcccaca aaaacctaaa atagatgaaa aattaaaaga tcatcctgaa 480tattcagaaa ccggaaatat aaatcctaaa acaactcctc aattaatggg atggacatta 540gtaccttgta ttatggtaaa tgattcagga atagataaaa acactcaaat taaaactact 600ccatattata tttttaaaaa atataaatac tggaatctag caaaaggaag taatgtatct 660ttacttccac atcaaaaaag atcatatgat tatgaatggg gtacagaaaa aaatcaaaaa 720acatctatta ttaatacagt aggattgcaa attaatatag attcaggaat gaaatttgaa 780gtaccagaag taggaggagg tacagaagac ataaaaacac aattaactga agaattaaaa 840gttgaatata gcactgaaac caaaataatg acgaaatatc aagaacactc agagatagat 900aatccaacta atcaaccaat gaattctata ggacttctta tttatacttc tttagaatta 960tatcgatata acggtacaga aattaagata atggacatag aaacttcaga tcatgatact 1020tacactctta cttcttatcc aaatcataaa gaagcattat tacttctcac aaaccattcg 1080tatgaagaag tagaagaaat aacaaaaata cctaagcata cacttataaa attgaaaaaa 1140cattatttta aaaaa 1155<210>8<211>385<212>蛋白质<213>苏云金芽孢杆菌<400>8Met Leu Asp Thr Asn Lys Val Tyr Glu Ile Ser Asn Leu Ala Asn Gly1 5 10 15Leu Tyr Thr Ser Thr Tyr Leu Ser Leu Asp Asp Ser Gly Val Ser Leu

20 25 30Met Ser Lys Lys Asp Glu Asp Ile Asp Asp Tyr Asn Leu Lys Trp Phe

35 40 45Leu Phe Pro Ile Asp Asn Asn Gln Tyr Ile Ile Thr Ser Tyr Gly Ala

50 55 60Asn Asn Cys Lys Val Trp Asn Val Lys Asn Asp Lys Ile Asn Val Ser65 70 75 80Thr Tyr Ser Ser Thr Asn Ser Val Gln Lys Trp Gln Ile Lys Ala Lys

85 90 95Asp Ser Ser Tyr Ile Ile Gln Ser Asp Asn Gly Lys Val Leu Thr Ala

100 105 I10Gly Val Gly Glu Ser Leu Gly Ile Val Arg Leu Thr Asp Glu Phe Pro

115 120 125Glu Asn Ser Asn Gln Gln Trp Asn Leu Thr Pro Val Gln Thr Ile Gln

130 135 140Leu Pro Gln Lys Pro Lys Ile Asp Glu Lys Leu Lys Asp His Pro Glu145 150 155 160Tyr Ser Glu Thr Gly Asn Ile Asn Pro Lys Thr Thr Pro Gln Leu Met

165 170 175Gly Trp Thr Leu Val Pro Cys Ile Met Val Asn Asp Ser Gly Ile Asp

180 185 190Lys Asn Thr Gln Ile Lys Thr Thr Pro Tyr Tyr Ile Phe Lys Lys Tyr

195 200 205Lys Tyr Trp Asn Leu Ala Lys Gly Ser Asn Val Ser Leu Leu Pro His

210 215 220Gln Lys Arg Ser Tyr Asp Tyr Glu Trp Gly Thr Glu Lys Asn Gln Lys225 230 235 240Thr Ser Ile Ile Asn Thr Val Gly Leu Gln Ile Asn Ile Asp Ser Gly

245 250 255Met Lys Phe Glu Val Pro Glu Val Gly Gly Gly Thr Glu Asp Ile Lys

260 265 270Thr Gln Leu Thr Glu Glu Leu Lys Val Glu Tyr Ser Thr Glu Thr Lys

275 280 285Ile Met Thr Lys Tyr Gln Glu His Ser Glu Ile Asp Asn Pro Thr Asn

290 295 300Gln Pro Met Asn Ser Ile Gly Leu Leu Ile Tyr Thr Ser Leu Glu Leu305 310 315 320Tyr Arg Tyr Asn Gly Thr Glu Ile Lys Ile Met Asp Ile Glu Thr Ser

325 330 335Asp His Asp Thr Tyr Thr Leu Thr Ser Tyr Pro Asn His Lys Glu Ala

340 345 350Leu Leu Leu Leu Thr Asn His Ser Tyr Glu Glu Val Glu Glu Ile Thr

355 360 365Lys Ile Pro Lys His Thr Leu Ile Lys Leu Lys Lys His Tyr Phe Lys

370 375 380Lys385<210>9<211>372<212>DNA<213>苏云金芽孢杆菌<400>9atgtcagcac gtgaagtaca cattaatgta aataataaga caggtcatac attacaatta 60gaagataaaa caaaacttga tggtggtaga tggcgaacat cacctacaaa tgttgctaat 120gatcaaatta aaacatttgt agcagaatca catggtttta tgacaggtac agaaggtcat 180atatattata gtataaatgg agaagcagaa attagtttat attttgataa tccttattca 240ggttctaata aatatgatgg gcattccaat aaacctcaat atgaagttac tacccaagga 300ggatcaggaa atcaatctca tgttacgtat actattcaaa ctgcatcttc acgatatggg 360aataactcat aa 372<210>10<211>123<212>蛋白质<213>苏云金芽孢杆菌<400>10Met Ser Ala Arg Glu Val His Ile Asn Val Asn Asn Lys Thr Gly Hisl 5 10 15Thr Leu Gln Leu Glu Asp Lys Thr Lys Leu Asp Gly Gly Arg Trp Arg

20 25 30Thr Ser Pro Thr Asn Val Ala Asn Asp Gln Ile Lys Thr Phe Val Ala

35 40 45Glu Ser His Gly Phe Met Thr Gly Thr Glu Gly His Ile Tyr Tyr Ser

50 55 60Ile Asn Gly Glu Ala Glu Ile Ser Leu Tyr Phe Asp Asn Pro Tyr Ser65 70 75 80Gly Ser Asn Lys Tyr Asp Gly His Ser Asn Lys Pro Gln Tyr Glu Val

85 90 95Thr Thr Gln Gly Gly Ser Gly Asn Gln Ser His Val Thr Tyr Thr Ile

100 105 110Gln Thr Ala Ser Ser Arg Tyr Gly Asn Asn Ser

115 120<210>11<211>1152<212>DNA<213>苏云金芽孢杆菌<400>11atgttagata ctaataaagt ttatgaaata agtaatcatg ctaatggact atatgcagca 60acttatttaa gtttagatga ttcaggtgtt agtttaatga ataaaaatga tgatgatatt 120gatgattata acttaaaatg gtttttattt cctattgatg atgatcaata tattattaca 180agctatgcag caaataattg taaagtttgg aatgttaata atgataaaat aaatgtttcg 240acttattctt caacaaattc aatacaaaaa tggcaaataa aagctaatgg ttcttcatat 300gtaatacaaa gtgataatgg aaaagtctta acagcaggaa ccggtcaagc tcttggattg 360atacgtttaa ctgatgaatc ctcaaataat cccaatcaac aatggaattt aacttctgta 420caaacaattc aacttccaca aaaacctata atagatacaa aattaaaaga ttatcccaaa 480tattcaccaa ctggaaatat agataatgga acatctcctc aattaatggg atggacatta 540gtaccttgta ttatggtaaa tgatccaaat atagataaaa atactcaaat taaaactact 600ccatattata ttttaaaaaa atatcaatat tggcaacgag cagtaggaag taatgtagct 660ttacgtccac atgaaaaaaa atcatatact tatgaatggg gaacagaaat agatcaaaaa 720acaacaatca taaatacatt aggatttcaa atcaatatag attcaggaat gaaatttgat 780ataccagaag taggtggagg tacagatgaa ataaaaacac aactaaatga agaattaaaa 840atagaatata gtcgtgaaac taaaataatg gaaaaatatc aagaacaatc tgaaatagat 900aatccaactg atcaaccaat gaattctata ggatttctta ctattacttc tttagaatta 960tatagatata atggctcaga aattcgtata atgcaaattc aaacctcaga taatgatact 1020tataatgtta cttcttatcc agatcatcaa caagctttat tacttcttac aaatcattca 1080tatgaagaag tagaagaaat aacaaatatt cctaaaagta cactaaaaaa attaaaaaaa 1140tattattttt aa 1152<210>12<21l>383<212>蛋白质<213>苏云金芽孢杆菌<400>12Met Leu Asp Thr Asn Lys Val Tyr Glu Ile Ser Asn His Ala Asn Gly1 5 10 15Leu Tyr Ala Ala Thr Tyr Leu Ser Leu Asp Asp Ser Gly Val Ser Leu

20 25 30Met Asn Lys Asn Asp Asp Asp Ile Asp Asp Tyr Asn Leu Lys Trp Phe

35 40 45Leu Phe Pro Ile Asp Asp Asp Gln Tyr Ile Ile Thr Ser Tyr Ala Ala

50 55 60Asn Asn Cys Lys Val Trp Asn Val Asn Asn Asp Lys Ile Asn Val Ser65 70 75 80Thr Tyr Ser Ser Thr Asn Ser Ile Gln Lys Trp Gln Ile Lys Ala Asn

85 90 95Gly Ser Ser Tyr Val Ile Gln Ser Asp Asn Gly Lys Val Leu Thr Ala

100 105 110Gly Thr Gly Gln Ala Leu Gly Leu Ile Arg Leu Thr Asp Glu Ser Ser

115 120 125Asn Asn Pro Asn Gln Gln Trp Asn Leu Thr Ser Val Gln Thr Ile Gln

130 135 140Leu Pro Gln Lys Pro Ile Ile Asp Thr Lys Leu Lys Asp Tyr Pro Lys145 150 155 160Tyr Ser Pro Thr Gly Asn Ile Asp Asn Gly Thr Ser Pro Gln Leu Met

165 170 175Gly Trp Thr Leu Va1 Pro Cys Ile Met Val Asn Asp Pro Asn Ile Asp

180 185 190Lys Ash Thr Gln Ile Lys Thr Thr Pro Tyr Tyr Ile Leu Lys Lys Tyr

195 200 205Gln Tyr Trp Gln Arg Ala Val Gly Ser Asn Val Ala Leu Arg Pro His

210 215 220Glu Lys Lys Ser Tyr Thr Tyr Glu Trp Gly Thr Glu Ile Asp Gln Lys225 230 235 240Thr Thr Ile Ile Asn Thr Leu Gly Phe Gln Ile Asn Ile Asp Ser Gly

245 250 255Met Lys Phe Asp Ile Pro Glu Val Gly Gly Gly Thr Asp Glu Ile Lys

260 265 270Thr Gln Leu Asn Glu Glu Leu Lys Ile Glu Tyr Ser Arg Glu Thr Lys

275 280 285Ile Met Glu Lys Tyr Gln Glu Gln Ser Glu Ile Asp Asn Pro Thr Asp

290 295 300Gln Pro Met Asn Ser Ile Gly Phe Leu Thr Ile Thr Ser Leu Glu Leu305 310 315 320Tyr Arg Tyr Asn Gly Ser Glu Ile Arg Ile Met Gln Ile Gln Thr Ser

325 330 335Asp Asn Asp Thr Tyr Asn Val Thr Ser Tyr Pro Asp His Gln Gln Ala

340 345 350Leu Leu Leu Leu Thr Asn His Ser Tyr Glu Glu Val Glu Glu Ile Thr

355 360 365Asn Ile Pro Lys Ser Thr Leu Lys Lys Leu Lys Lys Tyr Tyr Phe

370 375 380<210>13<211>1952<212>DNA<213>苏云金芽孢杆菌<400>13aaaatctttt acatatattt gttaggaagc atgaaaataa aaatagatta tatagaagga 60gtgaaataga tgaatgtaaa tcacggtatg tcttgtggat gtggttgcca gcaaggtaaa 120gaagaatata acgattatca tgtgtcaaat gaatataggg acgaaaatcc tagtacaact 180tgtaattctc aacaaggtaa ttatgagtac gaacaaagta aagaaacata taacaatgat 240tatcaatcat atgaatacaa tcaacaaaat tataatactt gcggaaggaa tcaaggaacg 300atggaacagg agtcgatgca aaaggatagg aattgggaga atgcaaatta tagtggatat 360gatggatgta gtccaaatca gttgaatgca ctaaatttac cagatgaaag tactaggttt 420caaaaaataa ctaatgtaaa tactcgtgat agtcatcgtg ttttagacat gatggacgtt 480cctagtggaa ctaggcttga tactcgtgta cctcctattt gtagtcaaac cgaatttaca 540aatacggtta gtaatgaatt agtttccacg aatcatgata cacaattttt aattttttat 600caaacagatg atagttcatt tattattggg aatcgaggaa atggtcgagt tttagatgtt 660tttcctagta atagaaatgg ttatacaata gtttcaaatg tgtatagtgg ttcaaggaat 720aatcagcgtt ttcgtatgaa taaagcatct aataatcaat ttagtttaca aaccattttt 780aaggacagag taaatatatg tggtcatatt cacaatttta acgcgataat tacagctact 840actttaggtg agaatgatag taatgcttta tttcaagtac aatcttccac aaatataaca 900ctacctacat taccacctag gacaacatta gaaccaccaa gagcattaac aaatataaat 960gatacaggtg attctccagc gcaagcacct cgagcggtag aaggaagtgt tcttatcccc 1020gcaatagcgg taaatgatgt cattccggta gcgcaaagaa tgcaagaaag tccgtattat 1080gtgttaacat ataatacata ttggcataga gttatttcag caatactacc aggtagtggg 1140caaactacaa ggttcgatgt aaacttacca ggtcctaatc aaagtacaat ggtagatgta 1200ttagatacag caattactgc agattttaga ttacaatttg ttggaagtgg acgaacaaat 1260gtatttcaac aacaaattag aaatggatta aatatattaa attctacaac gtctcatcgt 1320ttaggagatg aaacacgtaa ttgggatttt acaaatagag gtgctcaagg aagattagcg 1380ttttttgtaa aagcacatga gtttgtatta acacgtgcga atggaacacg agtaagtgat 1440ccatgggtgg cattagatcc gaatgttaca gctgctcaaa catttggagg agtattactt 1500acattagaaa aagaaaaaat agtatgtgca agtaatagtt ataatttatc agtatggaaa 1560acaccaatgg aaataaagaa tggaaaaatt tatacaaaaa atgaatggaa tacaaaacca 1620aactacaaat aaacaaaatg attctgttga caagtttgaa aaaacaaaaa ttggtttgca 1680aaatatggtt ccggtgcaaa aattccaaaa tgattgaaaa ggatttatca aacttgtcca 1740tactggtact actacttaaa aaaggtgtgt gattagtatg ggaccagaaa atttatttaa 1800gtggaaacat tatcaaccag atattatttt atcaacagta cgttggtacc tacggtacaa 1860cttaagtttt cgtgatttgg tagaaatgat ggaggaacga ggnttatctt tggctcatac 1920aaccattatg cngttgggtt catcaatatg gt 1952<210>14<211>520<212>蛋白质<213>苏云金芽孢杆菌<400>14Met Asn Val Asn His Gly Met Ser Cys Gly Cys Gly Cys Gln Gln Gly1 5 10 15Lys Glu Glu Tyr Asn Asp Tyr His Val Ser Asn Glu Tyr Arg Asp Glu

20 25 30Asn Pro Ser Thr Thr Cys Asn Ser Gln Gln Gly Asn Tyr Glu Tyr Glu

35 40 45Gln Ser Lys Glu Thr Tyr Asn Asn Asp Tyr Gln Ser Tyr Glu Tyr Asn

50 55 60Gln Gln Asn Tyr Asn Thr Cys Gly Arg Asn Gln Gly Thr Met Glu Gln65 70 75 80Glu Ser Met Gln Lys Asp Arg Asn Trp Glu Asn Ala Asn Tyr Ser Gly

85 90 95Tyr Asp Gly Cys Ser Pro Asn Gln Leu Asn Ala Leu Asn Leu Pro Asp

100 105 110Glu Ser Thr Arg Phe Gln Lys Ile Thr Asn Val Asn Thr Arg Asp Ser

115 120 125His Arg Val Leu Asp Met Met Asp Val Pro Ser Gly Thr Arg Leu Asp

130 135 140Thr Arg Val Pro Pro Ile Cys Ser Gln Thr Glu Phe Thr Asn Thr Val145 150 155 160Ser Asn Glu Leu Val Ser Thr Asn His Asp Thr Gln Phe Leu Ile Phe

165 170 175Tyr Gln Thr Asp Asp Ser Ser Phe Ile Ile Gly Asn Arg Gly Asn Gly

180 185 190Arg Val Leu Asp Val Phe Pro Ser Asn Arg Asn Gly Tyr Thr Ile Val

195 200 205Ser Asn Val Tyr Ser Gly Ser Arg Asn Asn Gln Arg Phe Arg Met Asn

210 215 220Lys Ala Ser Asn Asn Gln Phe Ser Leu Gln Thr Ile Phe Lys Asp Arg225 230 235 240Val Asn Ile Cys Gly His Ile His Asn Phe Asn Ala Ile Ile Thr Ala

245 250 255Thr Thr Leu Gly Glu Asn Asp Ser Asn Ala Leu Phe Gln Val Gln Ser

260 265 270Ser Thr Asn Ile Thr Leu Pro Thr Leu Pro Pro Arg Thr Thr Leu Glu

275 280 285Pro Pro Arg Ala Leu Thr Asn Ile Asn Asp Thr Gly Asp Ser Pro Ala

290 295 300Gln Ala Pro Arg Ala Val Glu Gly Ser Val Leu Ile Pro Ala Ile Ala305 310 315 320Val Asn Asp Val Ile Pro Val Ala Gln Arg Met Gln Glu Ser Pro Tyr

325 330 335Tyr Val Leu Thr Tyr Asn Thr Tyr Trp His Arg Val Ile Ser Ala Ile

340 345 350Leu Pro Gly Ser Gly Gln Thr Thr Arg Phe Asp Val Asn Leu Pro Gly

355 360 365Pro Asn Gln Ser Thr Met Val Asp Val Leu Asp Thr Ala Ile Thr Ala

370 375 380Asp Phe Arg Leu Gln Phe Val Gly Ser Gly Arg Thr Asn Val Phe Gln385 390 395 400Gln Gln Ile Arg Asn Gly Leu Asn Ile Leu Asn Ser Thr Thr Ser His

405 410 415Arg Leu Gly Asp Glu Thr Arg Asn Trp Asp Phe Thr Asn Arg Gly Ala

420 425 430Gln Gly Arg Leu Ala Phe Phe Val Lys Ala His Glu Phe Val Leu Thr

435 440 445Arg Ala Asn Gly Thr Arg Val Ser Asp Pro Trp Val Ala Leu Asp Pro

450 455 460Asn Val Thr Ala Ala Gln Thr Phe Gly Gly Val Leu Leu Thr Leu Glu465 470 475 480Lys Glu Lys Ile Val Cys Ala Ser Asn Ser Tyr Asn Leu Ser Val Trp

485 490 495Lys Thr Pro Met Glu Ile Lys Asn Gly Lys Ile Tyr Thr Lys Asn Glu

500 505 510Trp Asn Thr Lys Pro Asn Tyr Lys

515 520<210>15<211>1024<212>DNA<213>苏云金芽孢杆菌<400>15agtgcgagca tttattaata caatagaaat gctcacatat gtaacaacct ttagtatatt 60taaatataag gagttgtata acttgagtat cttaaatctt caagacttat cacaaaaata 120tatgactgca gctttaaata agataaatcc aaaaaaagta ggtactttcc attttgagga 180accaatagta ctttcagaat cttctactcc cacacgttct gaaattgatg cccctcttaa 240tgttatgttt cacgcttcac aagatcttga taatagaagg ggcactagtg atttaaaaca 300aactgtttct ttttctcaaa ctcaaataaa tactgttgaa accaaaacta ctgatggtgt 360taaaacaact aaagaacata catttagtgg tacattagaa ctaaagatta aatatgcaat 420gtttgattta gggggagtgt caggcacata tcaatataaa aaaagtactg aaaacgatat 480tagttcagaa aagagtaaat cgaagtcaga ttctcaaact tggtcaatat caagtgaata 540tacagttaaa cctggagtaa aagaaactct tcatttttat attgtaggaa taaaaaaccg 600aagtgccttt taaatatttt tgctgaattt caaggtacta aaactattga taatgtatcc 660aatgttatgg cttatcaaga gtttataagt caagatgatg aacatataag agcatgtatg 720aaagcaagta aattggctaa tcctgatcat ctttcaggat atacagctcc aaaggaatta 780aaagcaaata caagtaaagg atcagtagaa tttagaggta cagctatagc taaaataaat 840acaggagtaa aatgtcttgt tgtagttaat ggaaaaaatt caataactgg aaaaacttat 900tcttatatac atcctaaaac aatgttagct gatggaacca ttgaatattt agaaagtgag 960atagatcttt tagaaagtga gatagatctt ttaactacaa gtagtatttt agtttaaaca 1020atta 1024<210>16<211>3l0<212>蛋白质<213>苏云金芽孢杆菌<400>16Met Ser Ile Leu Asn Leu Gln Asp Leu Ser Gln Lys Tyr Met Thr Ala1 5 l0 15Ala Leu Asn Lys Ile Asn Pro Lys Lys Val Gly Thr Phe His Phe Glu

20 25 30Glu Pro Ile Val Leu Ser Glu Ser Ser Thr Pro Thr Arg Ser Glu Ile

35 40 45Asp Ala Pro Leu Asn Val Met Phe His Ala Ser Gln Asp Leu Asp Asn

50 55 60Arg Arg Gly Thr Ser Asp Leu Lys Gln Thr Val Ser Phe Ser Gln Thr65 70 75 80Gln Ile Asn Thr Val Glu Thr Lys Thr Thr Asp Gly Val Lys Thr Thr

85 90 95Lys Glu His Thr Phe Ser Gly Thr Leu Glu Leu Lys Ile Lys Tyr Ala

100 105 110Met Phe Asp Leu Gly Gly Val Ser Gly Thr Tyr Gln Tyr Lys Lys Ser

115 120 125Thr Glu Asn Asp Ile Ser Ser Glu Lys Ser Lys Ser Lys Ser Asp Ser

130 135 140Gln Thr Trp Ser Ile Ser Ser Glu Tyr Thr Val Lys Pro Gly Val Lys145 150 155 160Glu Thr Leu Asp Phe Tyr Ile Val Gly Ile Lys Thr Glu Val Pro Leu

165 170 175Asn Ile Phe Ala Glu Phe Gln Gly Thr Lys Thr Ile Asp Asn Val Ser

180 185 190Asn Val Met Ala Tyr Gln Glu Phe Ile Ser Gln Asp Asp Glu His Ile

195 200 205Arg Ala Cys Met Lys Ala Ser Lys Leu Ala Asn Pro Asp His Leu Ser

210 215 220Gly Tyr Thr Ala Pro Lys Glu Leu Lys Ala Asn Thr Ser Lys Gly Ser225 230 235 240Val Glu Phe Arg Gly Thr Ala Ile Ala Lys Ile Asn Thr Gly Val Lys

245 250 255Cys Leu Val Val Val Asn Gly Lys Asn Ser Ile Thr Gly Lys Thr Tyr

260 265 270Ser Tyr Ile His Pro Lys Thr Met Leu Ala Asp Gly Thr Ile Glu Tyr

275 280 285Leu Glu Ser Glu Ile Asp Leu Leu Glu Ser Glu Ile Asp Leu Leu Thr

290 295 300Thr Ser Ser Ile Leu Val305 310<210>17<211>3607<212>DNA<213>苏云金芽孢杆菌<400>17gaattcttaa aaaaaataag gttttttatg gaaaattgtc ggaaagctgt atgttttgtg 60aatagataag tatatttttt aaaattaatt tatataaaat atataatatc aacgagtgaa 120tatatagcat tgtctaatta tagataaaag agcttatttt tttcacatat aaactactta 180ttacgtatag tacagtgaga caatttttaa cagttgtttc atataaccct ccattcattt 240tataagagca aaaaaacaaa cacgcttatg aaaaggaata tttgtttttc atttattatt 300tatttcaaga aaattgaaat gtgtatatat gattaagcaa catttggagt tgtttttgat 360tctcctctta ttcaaattgc cggagtttaa aattcaaata aatttattga tgtatattac 420tcttctgaag atgataatct taaatattac caattgataa aagttgaatc tcattttgta 480caaactacct ttagcaaaca gttgatgaaa gagcgtggaa aaattaaaca atagtttagt 540catttcaaag ataaagggct ggaacagcca cgttgatatg gttaaaatcg ctatctattg 600catatatatt tttagtaaat aactttttat tattaaaaat ataattttat aaaggatgtg 660tttaagtttg actatcataa atatattaga ttatgcagat tcttatttaa gagctgctat 720taaaaaatat ggaggatacc caagttctag taaagctaga ttcttatcta ctccaaaaat 780ttcagaacca gagtggtatt accctgctaa agaatctgtt aatgcatatg aaattggtaa 840acaatctggt tcgtatccta atcattcttc tacatctcaa aattttaatg taccaattcg 900ttatcctgtt tccactacta gttcaacaaa aactataaat ggttttaaaa cagataaaag 960tatttctaaa aatttaaatc ttaacttagg gataaatgca aaaataccta atataaatat 1020tcctggtggc tttgaaattg aagttaaacc tggagctgag gtttcaagaa atgttaaaac 1080gaatcaaaca gtagacttta gtagtacttc tgaaaaaaca caaaatacaa atgacactcc 1140atctgacaca actcaatctt tctcttgtcc tcctaacaca aaagcaacat atatagttat 1200ttatttcggg ggagaaccta aagtagaagt tacagctgta acagatataa taggaaatgg 1260atctggaata ggaacagatc ctactactgg tcaagaaaaa tcgcaaagaa atgttttagc 1320aactttagat tacagtaaag aaggtcaagc tggtaaaaaa tatactatga tggtaactgc 1380agatcaatta gcaactaaaa tacctggata taatcctcca ccaagagtcg aacaagatcg 1440tagtcataat gcattaacta ttcatagtga ccttatagta aatttaaaag aagattttgc 1500atatgaaata attgtaaaat ttgaaaattt atcttattcg acacttttta atgaagatct 1560ctttatttat agattcgaca aaaatcataa tcttcttata gaaaaaacag ttggatcatt 1620atttgaaact aatctacatg cagatatttt ttatgaacat attgaaagtg aattagaata 1680aaaatatttt tttaaatatg ataactccac ttatttaaaa tcacaaaagt tttaaacaaa 1740attaacaaaa aaattaaatg gaggttgaaa atatgtcagc acgtgaagta cacattgaaa 1800taataaatca tacaggtcat accttacaaa tggataaaag aactagactt gcacatggtg 1860aatggattat tacacccgtg aatgttccaa ataattcttc tgatttattt caagcaggtt 1920ctgatggagt tttgacagga gtagaaggaa taataattta tactataaat ggagaaatag 1980aaattacctt acattttgac aatccttatg caggttctaa taaatattct ggacgttcta 2040gtgatgatga ttataaagtt ataactgaag caagagcaga acatagagct aataatcatg 2100atcatgtaac atatacagtt caaagaaaca tatcacgata taccaataaa ttatgttcta 2160ataactccta aaatttattt taattattaa aaacaaagtt ctataaattt gaataaagaa 2220ctttgttttt atttgaaaaa atcacaaaaa ggtgtgtgaa attatgatag aaactaataa 2280gatatatgaa ataagcaata aagctaatgg attatatgca actacttatt taagttttga 2340taattcaggt gttagtttat taaataaaaa tgaatctgat attaatgatt ataatttgaa 2400atggttttta tttcctattg ataataatca gtatattatt acaagttatg gagtaaataa 2460aaataaggtt tggactgcta atggtaataa aataaatgtt acaacatatt ccgcagaaaa 2520ttcagcacaa caatggcaaa taagaaacag ttcttctgga tatataatag aaaataataa 2580tgggaaaatt ttaacggcag gaacaggcca atcattaggt ttattatatt taactgatga 2640aatacctgaa gattctaatc aacaatggaa tttaacttca atacaaacaa tttcacttcc 2700ttcacaacca ataattgata caacattagt agattaccct aaatattcaa cgaccggtag 2760tataaattat aatggtacag cacttcaatt aatgggatgg acactcatac catgtattat 2820ggtatacgat aaaacgatag cttctacaca cactcaaatt acaacaaccc cttattatat 2880tttgaaaaaa tatcaacgtt gggtacttgc aacaggaagt ggtctatctg tacctgcaca 2940tgtcaaatca actttcgaat acgaatgggg aacagacaca gatcaaaaaa ccagtgtaat 3000aaatacatta ggttttcaaa ttaatacaga tacaaaatta aaagctactg taccagaagt 3060aggtggaggt acaacagata taagaacaca aatcactgaa gaacttaaag tagaatatag 3120tagtgaaaat aaagaaatgc gaaaatataa acaaagcttt gacgtagaca acttaaatta 3180tgatgaagca ctaaatgctg taggatttat tgttgaaact tcattcgaat tatatcgaat 3240gaatggaaat gtccttataa caagtataaa aactacaaat aaagacacct ataatacagt 3300tacttatcca aatcataaag aagttttatt acttcttaca aatcattctt atgaagaagt 3360aacagcacta actggcattt ccaaagaaag acttcaaaat cttaaaaaca attggaaaaa 3420aagataaaat atatatagag ttaaaagttc cgtaaggaac ggggagtgtt tttgagaaga 3480acactaaaaa agtcggtttt ttaattttca cctaaaggca aagacaatcc ctcagaagcg 3540tctagaagct tgtatagagc gtttaaaagt atgtttagat aaaatactag ggaaaagtag 3600tgaattc 3607<210>18<211>1026<212>DNA<213>苏云金芽孢杆菌<400>18atgtgtttaa gtttgactat cataaatata ttagattatg cagattctta tttaagagct 60gctattaaaa aatatggagg atacccaagt tctagtaaag ctagattctt atctactcca 120aaaatttcag aaccagagtg gtattaccct gctaaagaat ctgttaatgc atatgaaatt 180ggtaaacaat ctggttcgta tcctaatcat tcttctacat ctcaaaattt taatgtacca 240attcgttatc ctgtttccac tactagttca acaaaaacta taaatggttt taaaacagat 300aaaagtattt ctaaaaattt aaatcttaac ttagggataa atgcaaaaat acctaatata 360aatattcctg gtggctttga aattgaagtt aaacctggag ctgaggtttc aagaaatgtt 420aaaacgaatc aaacagtaga ctttagtagt acttctgaaa aaacacaaaa tacaaatgac 480actccatctg acacaactca atctttctct tgtcctccta acacaaaagc aacatatata 540gttatttatt tcgggggaga acctaaagta gaagttacag ctgtaacaga tataatagga 600aatggatctg gaataggaac agatcctact actggtcaag aaaaatcgca aagaaatgtt 660ttagcaactt tagattacag taaagaaggt caagctggta aaaaatatac tatgatggta 720actgcagatc aattagcaac taaaatacct ggatataatc ctccaccaag agtcgaacaa 780gatcgtagtc ataatgcatt aactattcat agtgacctta tagtaaattt aaaagaagat 840tttgcatatg aaataattgt aaaatttgaa aatttatctt attcgacact ttttaatgaa 900gatctcttta tttatagatt cgacaaaaat cataatcttc ttatagaaaa aacagttgga 960tcattatttg aaactaatct acatgcagat attttttatg aacatattga aagtgaatta 1020gaataa 1026<210>19<211>341<212>PRT<213>苏云金芽孢杆菌<400>19Met Cys Leu Ser Leu Thr Ile Ile Asn Ile Leu Asp Tyr Ala Asp Ser1 5 10 15Tyr Leu Arg Ala Ala Ile Lys Lys Tyr Gly Gly Tyr Pro Ser Ser Ser

20 25 30Lys Ala Arg Phe Leu Ser Thr Pro Lys Ile Ser Glu Pro Glu Trp Tyr

35 40 45Tyr Pro Ala Lys Glu Ser Val Asn Ala Tyr Glu Ile Gly Lys Gln Ser

50 55 60Gly Ser Tyr Pro Asn His Ser Ser Thr Ser Gln Asn Phe Asn Val Pro65 70 75 80Ile Arg Tyr Pro Val Ser Thr Thr Ser Ser Thr Lys Thr Ile Asn Gly

85 90 95Phe Lys Thr Asp Lys Ser Ile Ser Lys Asn Leu Asn Leu Asn Leu Gly

100 105 110Ile Asn Ala Lys Ile Pro Asn Ile Asn Ile Pro Gly Gly Phe Glu Ile

115 120 125Glu Val Lys Pro Gly Ala Glu Val Ser Arg Asn Val Lys Thr Asn Gln

130 135 140Thr Val Asp Phe Ser Ser Thr Ser Glu Lys Thr Gln Asn Thr Asn Asp145 150 155 160Thr Pro Ser Asp Thr Thr Gln Ser Phe Ser Cys Pro Pro Asn Thr Lys

165 170 175Ala Thr Tyr Ile Val Ile Tyr Phe Gly Gly Glu Pro Lys Val Glu Val

180 185 190Thr Ala Val Thr Asp Ile Ile Gly Asn Gly Ser Gly Ile Gly Thr Asp

195 200 205Pro Thr Thr Gly Gln Glu Lys Ser Gln Arg Asn Val Leu Ala Thr Leu

210 215 220Asp Tyr Ser Lys Glu Gly Gln Ala Gly Lys Lys Tyr Thr Met Met Val225 230 235 240Thr Ala Asp Gln Leu Ala Thr Lys Ile Pro Gly Tyr Asn Pro Pro Pro

245 250 255Arg Val Glu Gln Asp Arg Ser His Asn Ala Leu Thr Ile His Ser Asp

260 265 270Leu Ile Val Asn Leu Lys Glu Asp Phe Ala Tyr Glu Ile Ile Val Lys

275 280 285Phe Glu Asn Leu Ser Tyr Ser Thr Leu Phe Asn Glu Asp Leu Phe Ile

290 295 300Tyr Arg Phe Asp Lys Asn His Asn Leu Leu Ile Glu Lys Thr Val Gly305 310 315 320Ser Leu Phe Glu Thr Asn Leu His Ala Asp Ile Phe Tyr Glu His Ile

325 330 335Glu Ser Glu Leu Glu

340<210>20<211>15<212>蛋白质<213>苏云金芽孢杆菌<400>20Met Leu Asp Thr Asn Lys Val Tyr Glu Ile Ser Asn His Ala Asn1 5 10 15<210>21<211>41<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的特点：人工合成<400>21atgttagata caaataaagt atatgaaatt tcaaatcatg c<210>22<211>20<212>蛋白质<213>苏云金芽孢杆菌<400>22Ser Ile Leu Asn Leu Gln Asp Leu Ser Gln Lys Tyr Met Thr Ala Ala1 5 10 15Leu Asn Lys Ile

20<210>23<211>15<212>蛋白质<213>苏云金芽孢杆菌<400>23Ser Ala Arg Gln Val His Ile Gln Ile Asn Asn Lys Thr Arg His1 5 10 15<210>24<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的特点：人工合成<400>24tcacaaaaat atatgaacag c 21<210>25<211>31<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的特点：人工合成<400>25atatctatag aattcgcaat tcgtccatgt g 31<210>26<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的特点：人工合成<400>26cagtattcat ataagcttcc tcctttaata 30<210>27<211>39<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的特点：人工合成<400>27aaggtgaagc ttttatgtta gatactaata aagtttatg 39<210>28<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的特点：人工合成<400>28ccggaataga agctttgcat atgg 24<210>29<211>11<212>蛋白质<213>苏云金芽孢杆菌<400>29Met Asn Val Asn His Gly Met Ser Cys Gly Cys1 5 10<210>30<211>27<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<222>(22)<223>W＝A or T/U<220><221>misc_feature<222>(23)<223>S＝G or C<220><221>misc_feature<222>(24)<223>N＝A，C，G or T/U<220><223>人工序列的特点：人工合成<400>30atgaatgtaa atcatgggat gwsntgt 27<210>31<211>12<212>RNA<213>人工序列<220><223>人工序列的特点：人工合成<400>31uaaacaaugg cu 12<210>32<211>17<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的特点：人工合成<400>32gtaccagaag taggagg 17<210>33<211>17<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的特点：人工合成<400>33tgacacagct atggagc 17<210>34<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的特点：人工合成<400>34atgattgccg gaatagaagc 20

Claims

1.包括SEQ ID NO：2中至少15个连续氨基酸、SEQ ID NO：4中至少15个连续氨基酸、SEQ ID NO：14中至少15个连续氨基酸、SEQID NO：16中至少15个连续氨基酸或SEQ ID NO：19中至少15个连续氨基酸的分离多肽。

2.权利要求1中的多肽，包括SEQ ID NO：2中至少30个连续氨基酸、SEQ ID NO：4中至少30个连续氨基酸、SEQ ID NO：14中至少30个连续氨基酸、SEQ ID NO：16中至少30个连续氨基酸或SEQ IDNO：19中至少30个连续氨基酸。

3.权利要求1中的多肽，包括SEQ ID NO：2中至少50个连续氨基酸、SEQ ID NO：4中至少50个连续氨基酸、SEQ ID NO：14中至少50个连续氨基酸、SEQ ID NO：16中至少50个连续氨基酸或SEQ IDNO：19中至少50个连续氨基酸。

4.权利要求1中的多肽，包括SEQ ID NO：2中至少100个连续氨基酸、SEQ ID NO：4中至少100个连续氨基酸、SEQ ID NO：14中至少100个连续氨基酸、SEQ ID NO：16中至少100个连续氨基酸或SEQID NO：19中至少100个连续氨基酸。

5.权利要求1中的多肽，包括选自SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：19中的氨基酸序列。

6.权利要求1中的多肽，其中的多肽由SEQ ID NO：1中的至少45个连续核苷酸、SEQ ID NO：3中的至少45个连续核苷酸、SEQ ID NO：13中的至少45个连续核苷酸、SEQ ID NO：15中的至少45个连续核苷酸、SEQ ID NO：17中的至少45个连续核苷酸、SEQ ID NO：18中的至少45个连续核苷酸编码。

7.权利要求1中的多肽，其中的多肽由SEQ ID NO：1中的至少90个连续核苷酸、SEQ ID NO：3中的至少90个连续核苷酸、SEQ ID NO：13中的至少90个连续核苷酸、SEQ ID NO：15中的至少90个连续核苷酸、SEQ ID NO：17中的至少90个连续核苷酸、SEQ ID NO：18中的至少90个连续核苷酸编码。

8.权利要求1中的多肽，其中的多肽由SEQ ID NO：1中的至少150个连续核苷酸、SEQ ID NO：3中的至少150个连续核苷酸、SEQ IDNO：13中的至少150个连续核苷酸、SEQ ID NO：15中的至少150个连续核苷酸、SEQ ID NO：17中的至少150个连续核苷酸、SEQ ID NO：18中的至少150个连续核苷酸编码。

9.权利要求1中的多肽，其中的多肽由SEQ ID NO：1中的至少300个连续核苷酸、SEQ ID NO：3中的至少300个连续核苷酸、SEQ IDNO：13中的至少300个连续核苷酸、SEQ ID NO：15中的至少300个连续核苷酸、SEQ ID NO：17中的至少300个连续核苷酸、SEQ ID NO：18中的至少300个连续核苷酸编码。

10.权利要求1中的多肽，其中的多肽由SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：18编码。

11.包含至少一种多肽的组合物，其中的多肽包括SEQ ID NO：2中的至少30个连续氨基酸、SEQ ID NO：4中的至少30个连续氨基酸、SEQ ID NO：14中的至少30个连续氨基酸、SEQ ID NO：16中的至少30个连续氨基酸或SEQ ID NO：19中的至少30个连续氨基酸。

12.权利要求11中的组合物，其中的多肽包括选自SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：19的氨基酸序列。

13.权利要求11中的组合物，其中的组合物包括3种或更多种多肽，而这3种多肽是SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：19。

14.权利要求11中的组合物，其中的组合物包括2种或更多种多肽，而这2种多肽是SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：4。

15.权利要求11中的组合物，包括苏云金芽孢杆菌

EG4550，

EG5899，EG11529，NRRL B-21784，NRRL B-21783，NRRL B-21917，NRRL B-21786，

NRRL B-21787，NRRL B-21785，NRRL B-21788，NRRL B-21915或NRRL B-21916细胞的细胞抽提物、细胞悬浮液、细胞匀浆、细胞裂解物、细胞上清液、细胞滤液或细胞沉淀。

16.权利要求15中的组合物，其中所说的组合物为粉末、粉剂、片剂、颗粒、喷雾、乳剂、胶体或溶液。

17.权利要求15中的组合物，其中该组合物是由苏云金芽孢杆菌细胞的培养物经过干燥、冷冻干燥、匀浆、提取、过滤、离心、沉降或浓缩制备产生的。

18.权利要求15中的组合物，包括的多肽从大约1％～大约99％(按重量计)。

19.杀虫多肽，其制备过程包括以下步骤：

(a)在能有效产生杀虫多肽的条件下培养苏云金芽孢杆菌

EG4550，EG5899，EG11529，NRRL B-21784，

NRRL B-21783，NRRL B-21917，NRRL B-21786，NRRL B-21787，NRRL B-21785，

NRRL B-21788，NRRL B-21915或NRRL B-21916细胞；及

(b) 从所说的细胞中获得产生出的杀虫多肽。

20.权利要求19中的多肽，其中所说的多肽包括SEQ ID NO：2中至少30个连续氨基酸、SEQ ID NO：4中至少30个连续氨基酸、SEQ IDNO：14中至少30个连续氨基酸、SEQ ID NO：16中至少30个连续氨基酸或SEQ ID NO：19中至少30个连续氨基酸。

21.苏云金芽孢杆菌细胞的NRRL保藏号为

NRRL B-21784，

NRRL B-21783，NRRL B-21917，NRRL B-21786，NRRL B-21787，NRRL B-21785，

NRRL B-21788，NRRL B-21915或NRRL B-21916。

22.编码SEQ ID NO：2中至少15个连续氨基酸、SEQ ID NO：4中至少15个连续氨基酸、SEQ ID NO：14中至少15个连续氨基酸、SEQID NO：16中至少15个连续氨基酸或SEQ ID NO：19中至少15个连续氨基酸的分离多核苷酸。

23.权利要求22中的多核苷酸，其中所说的多核苷酸编码包括SEQID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：19中氨基酸序列的多肽。

24.权利要求22中的多核苷酸，其中的该多核苷酸编码包括SEQ IDNO：2、SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：19中氨基酸序列的多肽。

25.权利要求22中的多核苷酸，其中的多核苷酸编码包括SEQ IDNO：2、SEQ ID NO：4中氨基酸序列的多肽。

26.权利要求22中的多核苷酸，包括SEQ ID NO：1中至少45个连续核苷酸、SEQ ID NO：3中至少45个连续核苷酸、SEQ ID NO：13中至少45个连续核苷酸、SEQ ID NO：15中至少45个连续核苷酸、SEQID NO：17中至少45个连续核苷酸或SEQ ID NO：18中至少45个连续核苷酸。

27.权利要求22中的多核苷酸，包括SEQ ID NO：1中至少90个连续核苷酸、SEQ ID NO：3中至少90个连续核苷酸、SEQ ID NO：13中至少90个连续核苷酸、SEQ ID NO：15中至少90个连续核苷酸、SEQID NO：17中至少90个连续核苷酸或SEQ ID NO：18中至少90个连续核苷酸。

28.权利要求22中的多核苷酸，包括SEQ ID NO：1中至少150个连续核苷酸、SEQ ID NO：3中至少150个连续核苷酸、SEQ ID NO：13中至少150个连续核苷酸、SEQ ID NO：15中至少150个连续核苷酸、SEQ ID NO：17中至少150个连续核苷酸或SEQ ID NO：18中至少150个连续核苷酸。

29.权利要求22中的多核苷酸，包括SEQ ID NO：1中至少300个连续核苷酸、SEQ ID NO：3中至少300个连续核苷酸、SEQ ID NO：13中至少300个连续核苷酸、SEQ ID NO：15中至少300个连续核苷酸、SEQ ID NO：17中至少300个连续核苷酸或SEQ ID NO：18中至少300个连续核苷酸。

30.权利要求22中的多核苷酸，包括SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：18中的核苷酸序列。

31.权利要求22中的多核苷酸，包括SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：18中的核苷酸序列。

32.权利要求22中的多核苷酸，包括SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：3中的核苷酸序列。

33.权利要求22中的多核苷酸，进一步鉴定为RNA或DNA。

34.权利要求22中的多核苷酸，其中所说的分离核苷酸与第一个启动子可操作性地相连接。

35.权利要求34中的多核苷酸，其中所说的启动子为异源启动子。

36.权利要求34中的多核苷酸，其中所说的异源启动子为可在植物中表达的启动子。

37.权利要求36中的多核苷酸，其中所说的可在植物中表达的启动子选自于玉米(corn)蔗糖合成酶1启动子、玉米乙醇脱氢酶1启动子、玉米集光复合物启动子、玉米热激蛋白启动子、豌豆小亚基RuBP羧化酶启动子、Ti质粒甘露碱合酶启动子、Ti质粒胭脂碱合酶启动子、矮牵牛查尔酮异构酶启动子、菜豆甘氨酸富含蛋白1启动子、马铃薯patatin启动子、凝集素启动子、CaMV 35S启动子以及S-E9小亚基RuBP羧化酶启动子。

38.检测编码δ-内毒素多肽的核酸序列的方法，包括以下步骤：

a) 获得怀疑是编码δ-内毒素多肽的样品核酸；

b) 在能使基本互补的核酸有效发生杂交的条件下，使所说的样品核酸与权利要求35中的的多核苷酸相接触；及

c) 检测所形成的杂交互补核酸。

39.核酸检测试剂盒，在合适容器装置里，至少包括根据权利要求22的第一种核酸区段以及至少第一种检测试剂。

40.包括编码多肽的至少第一种序列区段的核酸载体，多肽中包括SEQ ID NO：2中至少30个连续氨基酸、SEQ ID NO：4中至少30个连续氨基酸、SEQ ID NO：14中至少30个连续氨基酸、SEQ ID NO：16中至少30个连续氨基酸或SEQ ID NO：19中至少30个连续氨基酸。

41.权利要求40中的载体，其中所说的第一种序列区段编码SEQ IDNO：2、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：19。

42.权利要求40中的载体，其中所说的第一种序列区段编码SEQ IDNO：2、SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：19。

43.权利要求40中的载体，其中的第一种序列区段编码SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：4。

44.权利要求40中的载体，进一步定义为质粒载体、杆状病毒载体、人工染色体载体、毒粒(virion)载体、粘粒载体噬菌粒载体、噬菌体载体或病毒载体。

45.包括编码SEQ ID NO：2中至少30个连续氨基酸、SEQ ID NO：4中至少30个连续氨基酸、SEQ ID NO：14中至少30个连续氨基酸、SEQ ID NO：16中至少30个连续氨基酸或SEQ ID NO：19中至少30个连续氨基酸的核酸的转化寄主细胞。

46.权利要求45中的转化寄主细胞，其中的核酸编码

SEQ ID NO：2，SEQ

ID NO：4，SEQ ID NO：14，SEQ ID NO：16，或SEQ ID NO：19。

47.权利要求45中的转化寄主细胞，其中的核酸编码SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：19。

48.权利要求45中的转化寄主细胞，其中的核酸编码SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：4。

49.权利要求45中的转化寄主细胞，进一步定义为原核寄主细胞或真核寄主细胞。

50.权利要求45中的转化寄主细胞，进一步定义为细菌细胞或植物细胞。

51.权利要求50中的转化寄主细胞，其中所说的细菌细胞是苏云金芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、Bacillus megaterium细胞、Bacilluscereus细胞、埃希氏菌、沙门氏菌、农杆菌或假单胞菌细胞。

52.权利要求50中的转化寄主细胞，其中该细菌细胞是苏云金芽孢杆菌

EG4550，EG5899，EG11529，NRRL B-21784，NRRL B-21783，NRRL B-21917，NRRL

B-21786，NRRL B-21787，NRRL B-21785，NRRL B-21788，NRRL B-21915或NRRL

B-21916细胞。

53.权利要求50中的转化寄主细胞，其中的细菌细胞是根癌农杆菌细胞。

54.权利要求50中的转化寄主细胞，进一步定义为单子叶植物细胞或双子叶植物细胞。

55.权利要求54中的转化寄主细胞，其中所说的植物细胞选自于玉米细胞、小麦细胞、大豆细胞、燕麦细胞、棉花细胞、水稻细胞、黑麦细胞、高粱细胞、甘蔗细胞、番茄细胞、烟草细胞、木棉细胞、亚麻细胞、马铃薯细胞、大麦细胞、草坪草细胞、牧草细胞、浆果细胞、水果细胞、荚果细胞、蔬菜细胞、装饰性植物细胞、灌木细胞、仙人掌细胞、肉质植物细胞和树木细胞。

56.权利要求54中的转化寄主细胞，其中该植物细胞为玉米细胞、小麦细胞、水稻细胞或甘蔗细胞。

57.权利要求54中的转化寄主细胞，其中的植物细胞为大豆细胞、棉花细胞、马铃薯细胞、番茄细胞或烟草细胞。

58.包括编码SEQ ID NO：2中至少30个连续氨基酸、SEQ ID NO：4中至少30个连续氨基酸、SEQ ID NO：14中至少30个连续氨基酸、SEQ ID NO：16中至少30个连续氨基酸或SEQ ID NO：19中至少30个连续氨基酸的多核苷酸的植物愈伤组织或植物胚。

59.权利要求58中的植物愈伤组织或植物胚，其中所说的多核苷酸编码SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：19。

60.权利要求58中的植物愈伤组织或植物胚，其中该多核苷酸编码SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：19。

61.权利要求58中的植物愈伤组织或植物胚，其中的多核苷酸编码SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：4。

62.基因组中整合了所选多核苷酸的转基因植物，多核苷酸中包括编码SEQ ID NO：2中至少30个连续氨基酸、SEQ ID NO：4中至少30个连续氨基酸、SEQ ID NO：14中至少30个连续氨基酸、SEQ ID NO：16中至少30个连续氨基酸或SEQ ID NO：19中至少30个连续氨基酸的第一种序列区段。

63.权利要求62中的转基因植物，其中所说的第一种序列区段编码SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：19。

64.权利要求62中的转基因植物，其中该第一种序列区段编码SEQID NO：2、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：19。

65.权利要求62中的转基因植物，其中的第一种序列区段编码SEQID NO：2和SEQ ID NO：4。

66.权利要求62中的转基因植物，其中的第一种序列区段包括SEQID NO：1中至少90个连续核苷酸、SEQ ID NO：3中至少90个连续核苷酸、SEQ ID NO：13中至少90个连续核苷酸、SEQ ID NO：15中至少90个连续核苷酸、SEQ ID NO：17中至少90个连续核苷酸或SEQ IDNO：18中至少90个连续核苷酸。

67.权利要求62中的转基因植物，其中的第一种序列区段包括SEQID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：18。

68.权利要求62中的转基因植物，其中的第一种序列区段包括SEQID NO：1、SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：18。

69.权利要求62中的转基因植物，其中的第一种序列区段包括SEQID NO：1和SEQ ID NO：3。

70.权利要求62中的转基因植物，进一步定义为单子叶植物。

71.权利要求62中的转基因植物，进一步定义为玉米、小麦、燕麦、水稻、大麦、草坪草或牧草。

72.权利要求62中的转基因植物，进一步定义为双子叶植物。

73.权利要求62中的转基因植物，进一步定义为荚果、大豆、烟草、番茄、马铃薯、棉花、水果、浆果、蔬菜或树木。

74.任何一代权利要求62中转基因植物的后代，其中所说的后代包括所说的第一种选择序列区段。

75.任何一代权利要求62中植物的种子，其中所说的种子包括所说的第一种序列区段。

76.任何一代权利要求74中后代的种子，其中该种子包括第一种序列区段。

77.任何一代权利要求75或76中种子的植物，其中所说的植物包括第一种序列区段。

78.制备抗虫植物的方法包括：

(a) 使植物细胞与至少包括编码权利要求1中多肽的第一种核酸序列的多核苷酸组合物接触；

(b) 选择包括第一种核酸序列的受体植物细胞；及

(c) 从选择出的细胞再生植物；

其中所说的植物相对于非转化植物抗虫性增强。