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CN1200765A - 糖核苷酸的制备方法 - Google Patents

糖核苷酸的制备方法 Download PDF

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CN1200765A
CN1200765A CN97191233A CN97191233A CN1200765A CN 1200765 A CN1200765 A CN 1200765A CN 97191233 A CN97191233 A CN 97191233A CN 97191233 A CN97191233 A CN 97191233A CN 1200765 A CN1200765 A CN 1200765A
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CN
China
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sugar
sugared
gdp
glucose
udp
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Application number
CN97191233A
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Inventor
竹之内健治
浜本智树
野口利忠
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Yamasa Corp
Original Assignee
YAMASA SOY-SAUSE Co Ltd
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    • C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
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Abstract

本发明是使用了酵母菌体,由核苷酸制备糖核苷酸的方法,其特征是使核苷二磷酸－糖焦磷酸化酶和糖1－磷酸共存于反应体系中。利用该方法能够有效地制备用以往的酵母菌体法产率较低的各种糖核苷酸。

Description

糖核苷酸的制备方法
技术领域
本发明涉及合成低聚糖的重要底物—糖核苷酸的制备方法。
背景技术
近年，对糖链的研究进展迅速，随着对其机能的明确了解，作为具有生理活性的低聚糖的医药品或功能性材料的用途开发正倍受瞩目。但是，目前市售的低聚糖仅限于几个种类，而且价格极高。此外，这些低聚糖仅能够达到试剂水平制备，还不能够进行大量制备。
以往，可通过天然物萃取法、化学合成法或酶合成法，或并用上述方法来制备低聚糖，一般认为其中的酶合成法为适于大量制备的方法。这是因为酶合成法在(1)不需要化学合成法中所谓的保护、脱保护等繁杂的步骤，能够快速地合成目的产物低聚糖；(2)利用酶的底物的特异性，能够合成结构特异性高的低聚糖等方面优于其他方法的缘故。而且，由于近年的重组DNA技术的发展，使合成酶能够以较低的成本大量生产，这样就更显示出酶合成法的优越性。
作为利用酶合成法制备低聚糖的方法，一般包括以下2种，利用低聚糖加水分解酶的逆反应的方法以及利用糖转移酶的方法。前一种方法由于使用的底物为单价便宜的单糖，所以在价格上占优，但反应本身利用的是分解反应的逆反应，所以，从合成收率和用于制备具有复杂结构的低聚糖方面考虑，就不一定是最佳的方法。
另一方面，后一种方法为使用糖转移酶的合成法，在合成收率和用于制备具有复杂结构的低聚糖方面比前一种方法有优势，此外，由于近年的重组DNA技术的进步，各种糖转移酶的量化也随着该技术的发展而发展。
但是，使用糖转移酶的合成法中所用的供糖体糖核苷酸除了一部分之外，其余的价格仍很高，仍然维持其量只能够达到试剂水平的供给量的现状。例如，报道了由尿苷酸(UMP)和葡萄糖1-磷酸(G-1-P)通过化学合成获得包含在大多数具有生理活性的糖链核心部分的葡萄糖供体尿核苷二磷酸葡萄糖(UDPG)的方法，或以UMP和葡萄糖为底物的酵母菌体法(T.Tochikura et al.，J.Ferment.Technol.，46，957(1968)，S.Shirota，et al.，Agric，Biol.Chem.，35，325(1971)，S.Watanabe and ITakeda，Agric，Biol.Chem.，36，2265(1972))等，但在用于工业生产上还存在继续探讨的余地。
本发明者们研究了通过以UMP和葡萄糖为底物的以往的酵母菌体法制得UDPG的方法，但UDPG的生成量极少，添加的60％以上的UMP都转变为了尿苷三磷酸(UTP)或尿苷二磷酸(UDP)，因此，还不能够成为真正的UDPG生产方法，彻底达到实用化目的。
所以，本发明的目的就是改善以往的酵母菌体法，提供能够有效地制备UDPG等糖核苷酸的方法。
发明的揭示
本发明者们为了达到上述目的而进行的研究的结果是利用酵母合成UDPG方法中最为重要的是由UMP合成UTP的反应体系；由葡萄糖合成G-1-P的反应体系和由UTP和G-1-P合成UDPG的反应体系这3个反应体系的有效的共同作用，相对于由UMP合成UTP的反应能够较顺利的进行，G-1-P的合成活性和由UTP与G-1-P获得UDPG的合成活性较小，而且，如果上述反应体系不能够有效地共同作用，其结果就是导致UDPG的产量降低。
为了解决上述问题进行了更进一步的研究，其结果是酵母中UDPG并不是合成的关键，关键在于UTP的合成，反应体系中使UDP葡萄糖焦磷酸化酶和G-1-P共存，能够使各自的酶反应有效地进行，而且，能够以高收率获得目的产物UDPG。此外，该方法不仅限于UDPG的合成，还适用于其他糖核苷酸的合成，从而完成了本发明。
即，在利用酵母菌体由核苷酸制备糖核苷酸的方法中，本发明是以反应体系中使核苷二磷酸-糖焦磷酸化酶和糖1-磷酸共存为特征的糖核苷酸的制备方法。
对图的简单说明
图1表示UDPG的经时生成量。
图2表示GDP甘露糖的经时生成量。
实施发明的最佳状态
本发明的糖核苷酸为公知的糖核苷酸，对其没有特别的限定。具体来讲包括UDPG、UDP半乳糖、UDP葡糖醛酸等UDP糖，GDP甘露糖、GDP岩藻糖、GDP葡萄糖等GDP糖，ADP葡萄糖等ADP糖，dTDP葡萄糖、dTDP半乳糖等dTDP糖，CDP葡萄糖等CDP糖等。
反应所用的酵母为以往制备核苷酸和糖核苷酸等时使用的酵母，对其没有特别的限定。具体来讲可使用属于接合酵母属(Zygosaccharomyces)、酵母属(saccharomyces)、假丝酵母属(Candida)、圆酵母属(Torulopsis)、汉逊酵母属(Hansenula)、德巴利酵母属(Debarylmyces)等属的酵母。这些酵母可以是鲜酵母，也可以是干酵母，从反应收率考虑较好的是使用干酵母。
对共存于反应体系的核苷二磷酸-糖焦磷酸化酶的来源没有特别的限定，可以来源于动物、植物和微生物等，可使用所有来源的物质，但从制备酶的简便性等方面考虑，较好的是使用来源于微生物的核苷二磷酸-糖焦磷酸化酶。而且，如果所用的核苷二磷酸-糖焦磷酸化酶基因被克隆时，使用该被克隆的核苷二磷酸-糖焦磷酸化酶基因，利用常用的方法以大肠菌为宿主可大量生产，由该重组菌可制备该酶。
这种核苷二磷酸-糖焦磷酸化酶只要具有相应的活性，可以任何一种形态存在。具体来讲可以是微生物的菌体、该菌体的处理物或由该处理物获得的酶制剂。
制备微生物的菌体是通过使用可培养出该微生物的培养基，利用常用的方法培养后，再用离心分离等集菌方法进行的。具体来讲，以属于杆菌属或大肠菌类的细菌为例进行说明，培养基可使用肉汤培养基、LB培养基(1％胰酶水解胨、0.5％酵母提取物、1％食盐)或2×YT培养基(1.6％胰酶水解胨、1％酵母提取物、0.5％食盐)等。将菌种接种在该培养基中后，如有必要可在约30～50℃的范围内，搅拌约10～50小时进行培养，然后，离心分离所得的培养液，通过微生物菌体的集菌制得具有核苷二磷酸-糖焦磷酸化酶活性的微生物菌体。
微生物菌体的处理物是指通过机械破坏(组织捣碎器、压榨机、匀浆机、乳钵等)、冷冻溶解、自身消化、干燥(冷冻干燥、风干等)、酶处理(使用溶菌酶等)、超声波处理、化学处理(酸、碱处理等)等常用方法处理上述微生物菌体后获得的菌体破坏物或菌体细胞壁或细胞膜的变性物。
酶制剂可使用通过通常的酶精制方法，例如，盐析处理、等电点沉淀处理、有机溶剂沉淀处理、透析处理、各种色谱法处理等处理由上述菌体处理物获得的具有核苷二磷酸-糖焦磷酸化酶活性的部分所得的粗酶或精制酶。
对应于作为目的产物的糖焦磷酸化酶，反应液中添加的糖1-磷酸及核苷酸(核苷单磷酸)可从已知的物质中选择，可使用市售品，也可使用利用公知的方法调制而成的物质。使用浓度较好的是约1～200mM，特别好的是约10～100mM。
合成糖核苷酸时使用的核苷二磷酸-糖焦磷酸化酶、核苷酸及糖1-磷酸组成的具体例子如表1所示。
                                    表1
    糖核苷酸 核苷酸     糖1-磷酸 核苷二磷酸-糖焦磷酸化酶
  1.UDP糖UDP葡萄糖UDP半乳糖UDP葡糖醛酸2.GDP糖GDP甘露糖GDP岩藻糖GDP葡萄糖3.ADP糖ADP葡萄糖4.dTDP糖dTDP葡萄糖dTDP半乳糖5.CDP糖CDP葡萄糖 UMPUMPUMPGMPGMPGMPAMPdTMPdTMPCMP 葡萄糖1-磷酸半乳糖1-磷酸葡糖醛酸1-磷酸甘露糖1-磷酸岩藻糖1-磷酸葡萄糖1-磷酸葡萄糖1-磷酸葡萄糖1-磷酸半乳糖1-磷酸葡萄糖1-磷酸 UDP葡萄糖焦磷酸化酶(E.C.2.7.7.9)UDP半乳糖焦磷酸化酶(E.C.2.7.7.10)UDP葡糖醛酸焦磷酸化酶(E.C.2.7.7.44)GDP甘露糖焦磷酸化酶(E.C.2.7.7.13)GDP岩藻糖焦磷酸化酶(E.C.2.7.7.30)GDP葡萄糖焦磷酸化酶(E.C.2.7.7.34)ADP葡萄糖焦磷酸化酶(E.C.2.7.7.27)dTDP葡萄糖焦磷酸化酶(E.C.2.7.7.24)dTDP半乳糖焦磷酸化酶(E.C.2.7.7.32)CDP葡萄糖焦磷酸化酶(E.C.2.7.7.33)
此外，用糖1-磷酸的生成系统代替糖1-磷酸共存于反应液中也可以。例如，可利用蔗糖和蔗糖磷酸化酶组合形成的G-1-P生成系统(E.J.Vandamme et al.，Appl.Microbiol.，32，163-201(1987))，糖原和糖原磷酸化酶组合形成的G-1-P生成系统(P.H. Strausbauch et al.，Methods in Enzymology，11，671-675)等。
除了上述酶及底物之外，较好的是还在反应系统中添加无机磷酸和能量源。
所用的无机磷酸可以是未加处理的磷酸钾等磷酸盐，但较好的是使用磷酸缓冲液。使用浓度较好的约为10～500mM，特别好的约为100～300mM。此外，磷酸缓冲液的pH可设定在约6.0～9.0的范围内。
所用的能量源包括葡萄糖、果糖、蔗糖等糖类，乙酸、柠檬酸等有机酸。
糖核苷酸的合成反应通过在磷酸缓冲液中添加酵母、核苷酸、糖1-磷酸、作为能源的糖类或有机酸，再添加核苷二磷酸-糖焦磷酸化酶，其添加量较好的约在0.001单位/ml以上，更好的约在0.01～100单位/ml的范围内，如有必要较好的是在约30℃以下，更好的是在约5～20℃的范围内搅拌约1～50小时，使反应进行。
此外，糖1-磷酸和核苷二磷酸-糖焦磷酸化酶可在反应开始前添加，但较好的是在反应开始后，对应于添加的核苷酸产生最大量核苷三磷酸时，在约60℃以上对反应液进行5分钟以上的热处理等使酶源失活的处理后，添加糖1-磷酸和核苷二磷酸-糖焦磷酸化酶，继续进行酶反应。
用糖核苷酸的常用分离精制方法(离子交换色谱法、吸附色谱法、盐析等)分离精制所得的糖核苷酸。
实施例
以下，通过实施例对本发明进行具体说明，但本发明并不仅限于此。
以下实施例中的DNA调制、通过限制酶的切断、通过T4DNA连接酶的连接，以及大肠菌的转化法都是根据《Molecular Cloning》(Maniatis等编，Cold springHarbor Laboratory，Cold Spring Harbor，New York(1982))进行的。而且，限制酶、AmpliTaqDNA聚合酶、T4DNA连接酶是宝酒造株式会社生产的。利用HPLC法进行反应液中糖核苷酸的定量。具体来讲，进行分离时采用YMC株式会社制造的ODS-AQ312柱，洗脱液为0.5M磷酸-钾溶液系统，或采用YMC株式会社制造的ODS-AM303柱，洗脱液为0.2M三乙胺-乙酸(pH8.0)系统。
实施例1：UDPG的合成1
(1)大肠菌UDP葡萄糖焦磷酸化酶基因的克隆
用齐藤和三浦的方法(Biochim.Biophys.Acta.，72，619(1963))调制大肠菌12株JM109菌(宝酒造株式会社生产)的染色体DNA。将该DNA作为模板，通过常用的方法合成以下所示的2种引物DNA，再通过PCR法扩增大肠菌UDP葡萄糖焦磷酸化酶(galU)基因(Weissborn et al.，J.Bacteriol.，176，2611 91994))。
引物(A)：5′-GCGAATTCTGATATACTGGGATGCGATAC-3′
引物(B)：5′-ACGTCGACACCGATACGGATGTATCTT-3′
通过PCR进行的galU基因的扩增是将50mM氯化钾、10mM Tris-盐酸(pH8.3)、1.5mM氯化镁、0.001％明胶和0.1μgDNA模板、引物DNA(A)(B)各0.2mM、2.5单位AmpliTaqDNA聚合酶组成的反应液100μl装入DNA热循环仪(Perkin-Elmer Cetus Instrument公司制)，以热变性(94℃，1分钟)、退火(55℃，1.5分钟)、聚合(72℃，1.5分钟)的顺序循环25次而进行的。
基因扩增后，用苯酚/氯仿(1∶1)混合液处理反应液，在水溶性部分中添加2倍容量的乙醇，使DNA沉淀。按照文献(Molecular Cloning，前述)所述方法通过琼脂糖凝胶电泳分离沉淀回收的DNA，精制相当于1.0kb的DNA片段。通过限制酶EcoRI及SalI切断该DNA，使用经过同样的限制酶EcoRI及SalI消化的质粒pTrc99A(Pharmacia Biotech.社制)和T4DNA连接酶进行连接。用连接反应液进行大肠菌JM109菌的转化，通过所得的氨苄青霉素耐性转化体分离质粒pTrc-galU。pTrc-galU是在pTrc99A的trc启动区下游的EcoRI-SalI切口部位插入含有大肠菌galU基因的EcoRI-SalIDNA片段而获得的。
(2)大肠菌UDP葡萄糖焦磷酸化酶的调制
将保持了质粒pTrc-galU的大肠菌JM109菌接种在300ml含有100mg/L氨苄青霉素的2×YT培养基中，于37℃振荡，培养。当达到4×108菌/ml的状态时，在培养液中添加IPTG，使其最终浓度达到1mM，然后，于37℃振荡2.5小时，继续培养。
悬浮在mM Tris-盐酸(pH7.5)、5mMEDTA、0.1％Triton X-100、0.2mg/ml溶菌酶组成的60ml缓冲液中。在37℃保温1小时后，进行超声波处理，破坏菌体，再次进行离心分离(20,000×g，10分钟)除去菌体残渣。将所得的上清部分作为酶标准品。酶标准品中的UDP葡萄糖焦磷酸化酶活性和对照菌(保持pTrc99A的大肠菌JM109菌)的活性如表2所示。
                                表2
    菌株     UDP葡萄糖焦磷酸化酶活性(单位/mg蛋白质)
JM  109/pTrc99A     ＜0.5
 JM 109/pTrc-galU     20.4
此外，UDP葡萄糖焦磷酸化酶活性单位(unit)可用以下所示方法测定，计算。即，在含有5mM的氯化镁、6mMUTP、6mMG-1-P的50mM Tris-盐酸缓冲液(pH8.0)中添加酶标准品，将温度保持在37℃进行反应，在100℃进行5分钟热处理使酶失活后，通过HPLC法对反应液中的UDPG进行定量，将37℃时1分钟内生成1μ摩尔UDPG的活性计为1个单位(unit)。
(3)使用了干面包酵母的UDPG-UTP液的调制
在容量为100ml的烧杯中调制由40mM UMP、100mM葡萄糖、200mM磷酸钠(pH8.0)、10mM氯化镁组成的反应液20ml，在其中悬浮2g干面包酵母(Oriental酵母工业株式会社)，于20℃搅拌9小时进行反应。反应结束后，于100℃对反应液处理5分钟，通过离心分离(2,000×g，10分钟)除去酵母菌体。用HPLC分析回收的上清部分后，可确认生成了7.9mM UDPG和21.9mM UTP。
(4)在UDPG-UTP液中添加UDP焦磷酸化酶及G-1-P合成UDP
在100ml上述UDPG-UTP液中添加G-1-P，使其最终浓度达到30mM，然后，再添加实施例2所述的酶标准品，使UDP葡萄糖焦磷酸化酶达到0.5单位/ml，于30℃反应30小时。用HPLC对反应液中的UDPG浓度进行分析后，可确认生成了30.9mM UDPG。
实施例2：UDPG的合成2
用与实施例1的(3)和(4)相同的方法合成UDPG。但是，添加的UDP葡萄糖焦磷酸化酶分别为酶单位为0单位、0.5单位或5单位的酶。
UDPG的经时生成量如图1所示。
实施例3：UDPG的合成3
(1)大肠菌麦芽糊精磷酸化酶基因的克隆
用齐藤和三浦的方法(Biochim.Biophys.Atca.，72，619(1963))调制大肠菌12株JM109菌(宝酒造株式会社生产)的染色体DNA。将该DNA作为模板，通过常用的方法合成以下所示的2种引物DNA，再用PCR法扩增大肠菌麦芽糊精磷酸化酶(malP)基因(Nature，313(6002)，500～502(1985))。
引物(C)：5′-TAGAATTCAACTCCTCCCTGCCTAATCCCCC-3′
引物(D)：5′-TTGGATCCCGGCATTATCCAGACGTTTGCTT-3′
通过PCR进行的malP基因的扩增是将50mM氯化钾、10mM Tris-盐酸(pH8.3)、1.5mM氯化镁、0.001％明胶和0.1μgDNA模板、引物DNA(C)(D)各0.2mM、2.5单位AmpliTaqDNA聚合酶组成的反应液10μl装入DNA热循环仪(Perkin-Elmer Cetus Instrument公司制)，以热变性(94℃，1分钟)、退火(60℃，1.5分钟)、聚合(72℃，3分钟)的顺序循环25次而进行的。
基因扩增后，用苯酚/氯仿(1∶1)混合液处理反应液，在水溶性部分中添加2倍容量的乙醇，使DNA沉淀。按照文献(Molecular Cloning，前述)所述方法通过琼脂糖凝胶电泳分离沉淀回收的DNA，精制相当于2.0kb的DNA片段。通过限制酶EcoRI及BamHI切断该DNA，使用经过同样的限制酶EcoRI及BamHI消化的质粒pTrc99A(Pharmacia Biotech.社制)和T4DNA连接酶进行连接。用连接反应液进行大肠菌JM109菌的转化，通过所得的氨苄青霉素耐性转化体分离质粒pTrc-malP。pTrc-malP是在pTrc99A的trc启动区下游的EcoRI-BamHI切口部位插入含有大肠菌malP基因的启动区和结构基因的EcoRI-BamHIDNA片段而获得的。
(2)大肠菌麦芽糊精磷酸化酶的调制
将保持了质粒pTrc-malP的大肠菌JM109菌接种在300ml含有100mg/L氨苄青霉素的2×YT培养基中，于37℃振荡8小时，进行培养。当达到4×108菌/ml的状态时，在培养液中添加IPTG，使其最终浓度达到1mM，然后，于37℃振荡5小时，继续培养。
培养结束后，通过离心分离(9,000×g，10分钟)回收菌体，将其悬浮在60ml由50mM Tris-盐酸(pH7.5)、5mMEDTA、0.1％Triton X-100、0.2mg/ml溶菌酶组成的缓冲液中。在37℃保温1小时后，进行超声波处理，破坏菌体，再次进行离心分离(9,000×g，10分钟)除去菌体残渣。将所得的上清部分作为酶标准品。酶标准品中的麦芽糊精磷酸化酶活性和对照菌(保持pTrc99A的大肠菌JM109菌)的活性如表3所示。
                             表3
    菌株 麦芽糊精磷酸化酶活性(单位/mg蛋白质)
 JM 109/pTrc99A     1.5
 JM 109/pTrc-malP     93.8
此外，本发明的麦芽糊精磷酸化酶活性单位(unit)可用以下所示方法测定，计算。即，在含有5mM的氯化镁、6mMUTP、0.5％糊精(W/V)、1U/ml底物UDPG焦磷酸化酶的50mM Tris-盐酸缓冲液(pH7.0)中添加麦芽糊精磷酸化酶标准品，将温度保持在30℃进行反应，添加与反应量等量的70％乙醇使酶失活，通过HPLC法对反应液中的UDPG进行定量，将30℃时1分钟内生成1μ摩尔UDPG的活性计为1个单位(unit)。
(3)在UDPG-UTP酵母反应液中添加UDP焦磷酸化酶、麦芽糊精磷酸化酶及糊精合成UDPG
在100ml实施例1的(3)调制的UDPG-UTP液中添加糊精(Difico公司制)使最终浓度达到2％(W/V)，然后，添加UDP葡萄糖焦磷酸化酶及麦芽糊精磷酸化酶标准品，使其浓度达到0.5单位/ml，于30℃反应30小时。用HPLC分析反应液中的UDPG浓度，可以确认生成了31.0mM UDPG。
实施例4：GDP甘露糖的合成
(1)大肠菌GDP甘露糖焦磷酸化酶基因的克隆
用齐藤和三浦的方法(Biochim.Biophys.Atca.，72，619(1963))调制大肠菌ATCC4157的染色体DNA。将该DNA作为模板，通过常用的方法合成以下所示的2种引物DNA，再用PCR法扩增大肠菌GDP甘露糖焦磷酸化酶(manC)基因(Gordon Stevenson et al.，J.Bacteriol.，178，4885(1996))。
引物(E)：  5′-ATGCCGAATTCCCGTCGAAACTGA-3′
引物(F)：  5′-GGAATTCCGTTGGGGAAATTGCCG-3′
通过PCR进行的manCP基因的扩增是将50mM氯化钾、10mM Tris-盐酸(pH8.3)、1.5mM氯化镁、0.001％明胶和0.1μgDNA模板、引物DNA(E)(F)各0.2mM、2.5单位AmpliTaqDNA聚合酶组成的反应液10μl装入DNA热循环仪(Perkin-Elmer Cetus Instrument公司制)，以热变性(94℃，1分钟)、退火(55℃，2分钟)、聚合(72℃，3分钟)的顺序循环25次而进行的。
基因扩增后，用苯酚/氯仿(1∶1)混合液处理反应液，在水溶性部分中添加2倍容量的乙醇，使DNA沉淀。按照文献(Molecular Cloning，前述)所述方法通过琼脂糖凝胶电泳分离沉淀回收的DNA，精制相当于1.8kb的DNA片段。通过限制酶EcoRI切断该DNA，使用经过同样的限制酶EcoRI消化的质粒pUC18(宝酒造株式会社制)和T4DNA连接酶进行连接。用连接反应液进行大肠菌JM109菌的转化，通过所得的氨苄青霉素耐性转化体分离质粒pUC18-manC。pUC18-manC是在pUC18的lac启动区下游的EcoRI切口部位插入含有大肠菌manC基因的EcoRI DNA片段而获得的。
(2)大肠菌GDP甘露糖焦磷酸化酶的调制
将保持了质粒pUC18-manC的大肠菌JM109菌接种在300ml含有100mg/L氨苄青霉素的2×YT培养基中，于37℃振荡培养。当达到4×108菌/ml的状态时，在培养液中添加IPTG，使其最终浓度达到1mM，然后，于37℃振荡5小时，继续培养。
培养结束后，通过离心分离(9,000×g，10分钟)回收菌体，将其悬浮在60ml由50mM Tris-盐酸(pH7.5)、5mM EDTA、0.1％Triton X-100、0.2mg/ml溶菌酶组成的缓冲液中。在37℃保温1小时后，进行超声波处理，破坏菌体，再次进行离心分离(20,000×g，10分钟)除去菌体残渣。将所得的上清部分作为酶标准品。酶标准品中的GDP甘露糖焦磷酸化酶活性和对照菌(保持pUC18的大肠菌JM109菌)的活性如表4所示。
                                        表4
    菌株 GDP甘露糖焦磷酸化酶活性(单位/mg蛋白质)
    JM109/pUC18     ＜0.01
 JM109/pUC 18-macC     0.23
此外，本发明的GDP甘露糖焦磷酸化酶活性单位(unit)可用以下所示方法测定，计算。即，在含有1mM的氯化镁、5mM GTP、5mM甘露糖-1-P的50mM Tris-盐酸缓冲液(pH7.6)中添加酶标准品，将温度保持在37℃进行反应，于100℃热处理5分钟使酶失活，通过HPLC法对反应液中的GDP甘露糖进行定量，将37℃时1分钟内生成1μ摩尔GDP甘露糖的活性计为1个单位(unit)。
(3)使用了干面包酵母的GDP甘露糖-GTP液的调制
在容量为100ml的烧杯中调制20ml由40mM GMP、200mM葡萄糖、200mM磷酸钾(pH8.0)、10mM氯化镁组成的反应液，在其中悬浮2g干面包酵母(Oriental酵母工业株式会社)，于20℃搅拌7小时进行反应。反应结束后，于100℃对反应液处理5分钟，通过离心分离(2,000×g，10分钟)除去酵母菌体。用HPLC分析回收的上清部分后，可确认生成了11.2mM GDP甘露糖和10.1mMGTP。
(4)在GDP甘露糖-GTP液中添加GDP甘露糖焦磷酸化酶及甘露糖-1-P合成GDP甘露糖
在200μl上述GDP甘露糖-GTP液中添加甘露糖-1-P，使其最终浓度达到20mM，然后，再添加上述酶标准品，使GDP甘露糖焦磷酸化酶达到0.1单位/ml，加水使总体积达到400μl，于37℃反应8小时。用HPLC对反应液中的GDP甘露糖浓度进行分析后，可确认生成了10.5mM GDP甘露糖。
实施例5
用与实施例4的(3)及(4)相同的方法合成GDP甘露糖。但是，添加的GDP甘露糖焦磷酸化酶分别为酶单位为0、0.025、0.05或0.1单位的酶。GDP甘露糖的经时生成量如图2所示。
产业上利用的可能性
利用本发明能够有效地制备用以往的酵母菌体法产率较低的各种糖核苷酸。

Claims (7)

1.一种糖核苷酸的制备方法，是使用了酵母菌体，由核苷酸制备糖核苷酸的方法，其特征在于，使核苷二磷酸-糖焦磷酸化酶和糖1-磷酸共存于反应体系中。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征还在于，糖核苷酸选自UDP糖、GDP糖、ADP糖、dTDP糖及CDP糖。
3.如权利要求2所述的制备方法，其特征还在于，糖核苷酸选自以下A群的(1)～(5)：
(1)UDP糖、UDP葡萄糖、UDP半乳糖及UDP葡糖醛酸
(2)GDP糖：GDP甘露糖、GDP岩藻糖及GDP葡萄糖
(3)ADP糖：ADP葡萄糖
(4)dTDP糖：dTDP葡萄糖及dTDP半乳糖
(5)CDP糖：CDP葡萄糖。
4.如权利要求1所述的制备方法，其特征还在于，用糖1-磷酸生成体系代替糖1-磷酸共存于反应体系中。
5.如权利要求4所述的制备方法，其特征还在于，糖1-磷酸生成体系使用了磷酸化酶。
6.如权利要求4所述的制备方法，其特征还在于，糖1-磷酸生成体系为葡萄糖-1-磷酸(G-1-P)的生成体系。
7.如权利要求4所述的制备方法，其特征还在于，糖1-磷酸生成体系为蔗糖和蔗糖磷酸化酶形成的G-1-P生成体系，糖原和糖原磷酸化酶形成的G-1-P生成体系或糊精和麦芽糊精磷酸化酶形成G-1-P生成体系。
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