CN100546997C

CN100546997C - 一种制备胞嘧啶核苷化合物的方法

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Publication number: CN100546997C
Application number: CNB021193029A
Authority: CN
Inventors: 安楽城正; 池田一郎; 的石薰; 阿部玲子; 及川利洋; 松叶泰子; 石桥大树; 长原清辉; 福入靖
Original assignee: Mitsui Chemical Industry Co Ltd
Current assignee: Mitsui Chemical Industry Co Ltd
Priority date: 2001-05-01
Filing date: 2002-05-08
Publication date: 2009-10-07
Anticipated expiration: 2022-05-08
Also published as: DE60227595D1; ATE401407T1; CN1392153A; US6858721B2; BR0203343A; KR100476294B1; EP1254959A2; US20030207405A1; EP1254959A3; US20050233420A1; CA2380804A1; EP1254959B1; KR20020085798A; US7629457B2

Abstract

本发明涉及一种以1-磷酸戊糖与胞嘧啶或其衍生物为底物，在一种对胞嘧啶具有活性的核苷磷酸化酶或酶活性的细胞的作用下，生成胞嘧啶核苷化合物的方法。本发明还涉及了一种方法，用以专门减小降解底物或产物的物质的活性，从而能够有效地获得胞嘧啶核苷化合物。根据本发明，只有很少量的副产物伴随着胞嘧啶核苷化合物而生成。

Description

一种制备胞嘧啶核苷化合物的方法

技术领域

本发明涉及一种制备胞嘧啶核苷化合物的方法，这些胞嘧啶核苷化合物可用作药用化合物等的合成前体。具体来说，本发明涉及一种在具有胞嘧啶-核苷磷酸酶活性的酶，或具有此酶活性的微生物细胞，或由微生物细胞或其培养基制得的酶制剂等的作用下，由1-磷酸戊糖与胞嘧啶或其衍生物，制备胞嘧啶核苷化合物的方法。

背景技术

核苷磷酸化酶通常是指在磷酸存在下，能使核苷的N-葡糖苷键磷酸化以及在核糖核苷存在时，能够催化以下方程式所表示的反应的酶。

核糖核苷+磷酸(或磷酸盐)→核酸的碱基+1-磷酸核糖

这些酶大致可分为嘌呤-核苷磷酸化酶和嘧啶-核苷磷酸化酶。它们都广泛地存在于各种生物有机体内，例如哺乳动物、鸟类或鱼类、酵母或细菌等的组织内。这些酶反应都是可逆的。现已知道的许多不同核苷化合物的合成就是利用了此可逆反应来完成的。例如，已知的用1-磷酸-2’-脱氧核糖与核酸的碱基(胸腺嘧啶，腺嘌呤，或鸟嘌呤)反应，分别制得了胸腺嘧啶脱氧核苷(日本公开特许01-104190号)，2’-脱氧腺嘌呤核苷(日本公开特许11-137290号)，或2’-脱氧鸟嘌呤核苷(日本公开特许11-137290号)。由于磷酸化酶可以使得反应在温和的条件下进行，并得到区域和立体选择性的核苷产物，因此关于各种核苷化合物的合成研究也不断兴起。

日本公开特许1-60396描述了一种使用细菌细胞本身作为催化剂，由1-磷酸脱氧核糖与胞嘧啶反应，制备脱氧胞嘧啶核苷的方法。这项应用尽管使用了细菌细胞本身作为反应的催化剂，但它不能确定其中是否含有胞嘧啶-核苷磷酸化酶。在反应过程中，可能会发生在细菌细胞体内积累的脱氧胞嘧啶核苷滤出细胞的情况，或者细胞体内的核苷脱氧核糖转移酶将加入的作为底物胞嘧啶转换为细胞中的脱氧核苷的碱基，从而导致检测到脱氧胞嘧啶核苷的情况。发明者获取了对上述申请实施例中的七种保藏菌株，并且对1-磷酸脱氧核糖与胞嘧啶反应的产物-脱氧胞嘧啶核苷进行了测定。结果表明，在使用了以上任一菌株的反应溶液中均没有检测到脱氧胞嘧啶核苷，这说明了这些菌株本身没有对应于胞嘧啶-核苷磷酸化酶的酶活性。

另一方面，日本公开特许3-12986描述了一种可作用与嘌呤碱和嘧啶碱作用的新的核苷磷酸化酶。其中，嘧啶碱可是脱氧尿嘧啶核苷，脱氧胞嘧啶核苷或脱氧胸腺嘧啶核苷。但是此发明中未公开特定的酶底物的详细情况。并且，此申请已经被撤回，因此无法再对酶活性进行表征了。但它的发明人从与此申请相同指定的菌株中提纯得到了核苷磷酸化酶，并对它进行了表征，结果发表于“Applied and EnvironmentalMicrobiology，Vol.56.pp.3830-3834(1990)”。这篇文章得出：上述的酶对胞嘧啶，胞嘧啶核苷或者脱氧胞嘧啶核苷没有活性。

除了上面提到的酶之外，目前，还不清楚是否胞嘧啶或它的衍生物可以作为嘌呤核苷磷酸化酶或嘧啶核苷磷酸化酶的底物。例如，在“Method.Enzymology，Vol.51，pp.437-442(1978)中提到的由鼠伤寒沙门氏菌(Salmonera typhimurium)得到的一种属于嘧啶核苷磷酸化酶类的胸腺嘧啶苷磷酸化酶对脱氧胞嘧啶核苷没有活性。又如在“J.Biol.Chem.，Vol.248，No.6，pp.2040-2043(1973)”中报道的，由鼠伤寒沙门氏菌得到的嘌呤核苷磷酸化酶对嘧啶核苷，如尿嘧啶核苷，胞嘧啶核苷，脱氧尿嘧啶核苷或脱氧胞嘧啶核苷没有活性。

对以上的研究综合考虑后可知，本发明中涉及到的对应于胞嘧啶核苷磷酸化酶的酶可能已经存在，但还没有任何研究结果能够证实它并实际得到这种酶。

发明内容

使用核苷磷酸化酶来生产核苷化合物可以使反应在温和的条件下进行，并得到具有区域选择性和立体选择性的核苷化合物，因此关于各种核苷化合物的合成研究也不断地兴起。但是，至今还没有任何有关以胞嘧啶或其衍生物与磷酸糖作为酶作用底物，合成胞嘧啶核苷化合物的核苷磷酸化酶的分离和提纯方面的报道。

发明者还发现，如果使用的细菌细胞本身或细菌细胞或其培养基制得的酶制剂有残余的胞嘧啶或胞嘧啶核苷脱氨酶活性，则底物胞嘧啶或它的衍生物和产物胞嘧啶核苷都可能被脱氨基，从而难于有效获得胞嘧啶核苷化合物。

本发明的目的在于提供能合成胞嘧啶核苷化合物的核苷磷酸化酶的氨基酸序列；本发明的另一目的在于提供一种包含相应基因的重组质粒，一种载有重组质粒的转化体，以及一种使用转化菌株产生酶的方法和一种使用转化菌株产生一种胞嘧啶核苷化合物的方法；本发明的又一目的在于提供一种能够降低胞嘧啶或胞嘧啶核苷脱氨酶活性，同时能保持核苷磷酸化酶活性的方法，或提供一种有效地生成胞嘧啶核苷化合物的方法，即使用一种能在其他缺乏脱氨酶的菌株上表现出胞嘧啶核苷磷酸化酶活性的菌株来完成。

本发明的再一目的是提供一种能降低对原料磷酸糖进行脱磷酸的酶的活性的方法，或提供一种有效地制备胞嘧啶核苷化合物的方法，即使用一种能在其他缺乏这种酶的菌株上表现出胞嘧啶核苷磷酸化酶活性的菌株来完成。

在生产胞嘧啶核苷化合物，特别是用于医药上的胞嘧啶核苷化合物时，混入甚至是很微量的副产物都可能导致严重的问题。因此，在提纯阶段，从胞嘧啶核苷化合物中分离出核苷副产物是一项很艰苦的工作，并且这会降低化合物的收率，这在商业化生产中将是一个很严重的问题。这时就要求从酶制剂中尽可能地去除胞嘧啶或胞嘧啶核苷的脱氨酶活性。

本发明者致力于为以上目标提供解决方案，并意外地发现了一种能催化以嘌呤碱基作为底物的嘌呤核苷磷酸化酶，也能够催化由嘧啶类碱基的胞嘧啶或其衍生物与1-磷酸戊糖来制备胞嘧啶核苷化合物的反应。

发明者发现的嘌呤核苷磷酸化酶的存在也说明了这种胞嘧啶核苷磷酸化酶是存在的。

但是，在有这种酶活性的细菌存在下的胞嘧啶或其衍生物与1-磷酸戊糖的反应得到的几乎全是胞嘧啶或其衍生物和胞嘧啶核苷化合物的脱氨基产物，因此无法有效地获得目标化合物-胞嘧啶核苷化合物。更深入的研究表明，形成脱氨基产物是由于脱氨酶的作用。可以通过将细菌细胞静置于有机溶剂中，搅拌或不搅拌；或者通过对它们加热，而使胞嘧啶和胞嘧啶核苷脱氨酶的活性降低，此外，向待处理的溶液中加入磷酸盐或磷酸糖可以有效控制胞嘧啶核苷磷酸化酶的活性的降低，并使其活性得以保留。

现已发现，通过以上描述的方法，可以做到：在保留核苷磷酸化酶活性的同时，减少底物和/或产物的分解；在已去除脱氨酶活性或用以上方法处理使其脱氨酶减活的细菌细胞的作用下，由胞嘧啶或其衍生物与磷酸糖制备含有少量或不含副产物的胞嘧啶核苷化合物也是可能的。因此，项发现是具有创造性的。

用本发明中的去除或减小脱氨酶活性的处理方法可以几乎彻底地去除其分解活性，同时胞嘧啶核苷磷酸化酶的活性几乎可以完全保留。此外，还发现，可以通过在一种没有胞嘧啶和胞嘧啶核苷脱氨酶活性的细胞上表达磷酸化酶有效地制备胞嘧啶核苷化合物。因此这些发现是具有创造性的。

还发现，在一种能使起始原料磷酸糖脱磷酸的酶的存在下，反应的产率将会降低。可以通过向被破坏的具有这种酶活性的细菌细胞中填加极性溶剂的方法来使这种酶被选择性地去除活性。还可以通过对胞嘧啶核苷磷酸化酶的提纯处理，如由盐析或离子-交换树脂吸附等类似方法来去除这种酶的活性。现已发现这些处理可以促进胞嘧啶核苷化合物的有效制备。此外，还发现，在一种没有脱磷酸化酶的细菌上表达胞嘧啶核苷磷酸化酶可以有效地制得胞嘧啶核苷化合物。这些发现是具有创造性的。

本发明提供了一种用从未获得的胞嘧啶核苷磷酸化酶来有效制备胞嘧啶核苷化合物的方法。

本发明具体内容如下：

一种胞嘧啶核苷化合物的制备方法，其特征在于包含一步骤，所述步骤为用磷酸糖与胞嘧啶或胞嘧啶衍生物在一种具有胞嘧啶核苷磷酸化酶活性的酶的作用下反应生成胞嘧啶核苷化合物。

这种酶包括了具有嘌呤核苷磷酸化酶活性的酶，因此，具有某种嘌呤核苷磷酸化酶活性的酶制剂就可被适当地用于本发明中的胞嘧啶核苷化合物的制备中。例如，一种由大肠杆菌(Escherichia coli)得到的酶，就具有这种嘌呤核苷磷酸化酶活性。

以上描述的胞嘧啶衍生物可用以下结构通式(I)表示：

式中，X代表了一个碳原子或氮原子，Y代表了一个氢原子，一个卤原子或一个低链的烷基。例如：氮胞嘧啶和5-氟胞嘧啶。

上述的具有胞嘧啶核苷磷酸化酶活性的酶可由以下途径得到：从具有这种酶的细菌细胞中，或从包含原酶提取物的酶制剂和从反应体系中的细胞或其培养基中获得的提纯的酶制剂中获得。

细菌细胞或酶制剂最好都没有胞嘧啶和胞嘧啶核苷脱氨酶活性。即使有的话，也应去除，以便利用胞嘧啶核苷磷酸化酶的活性来制备胞嘧啶核苷化合物。例如，在细菌细胞或酶制剂中，具有比胞嘧啶和胞嘧啶核苷脱氨酶的活性高的高活性的胞嘧啶核苷磷酸化酶是更有利于制备反应的。

例如，经处理后而使其本身具有的胞嘧啶和胞嘧啶核苷脱氨酶活性降低了的细菌细胞或酶制剂。

这样可以获得上述的处理过的去除了或减小了脱氨基活性的细菌细胞：例如，将具有胞嘧啶核苷磷酸化酶活性的细菌细胞与有机溶剂的水溶液接触，可以选择性地减小胞嘧啶和胞嘧啶核苷脱氨酶的活性。这些有机溶剂包括极性溶剂，如醇类。可选用下列溶剂中的至少一种组成，例如，甲醇，乙醇，丙醇，丁醇，二氧杂环乙烷，丙酮。

此外，为使这些有机溶剂能去除或减小胞嘧啶和胞嘧啶核苷脱氨酶活性，有机溶剂水溶液的浓度最好是20％(V/V)或更大。

另一方面，可由加热使细菌细胞的脱氨酶活性得以去除或减小：即在能选择性地减小胞嘧啶和胞嘧啶核苷脱氨酶活性的温度下，加热这种具有胞嘧啶核苷磷酸化酶活性的细菌细胞的水溶液。加热过程可以在50℃，或更高温度下持续10分钟至40小时。

另外，在处理细菌细胞以减小脱氨酶活性的过程中，1-磷酸酯戊糖的存在可更有效地保持胞嘧啶核苷磷酸化酶的活性。1-磷酸酯戊糖的浓度最好是1mM至100mM。

附图说明

图.1A为对比例1中的HPLC分析图。图.1B为对比例1中的反应溶液的HPLC分析图。图.1C为例6中的HPLC分析图。

图.2A为对比例2中的HPLC分析图。图.2B为对比例2中的反应溶液的HPLC分析图。图.2C为例5中的HPLC分析图。

图.3显示了例8中的结果。

具体实施方式

胞嘧啶核苷磷酸化酶是指一种能够以胞嘧啶或其衍生物作为底物来产生胞嘧啶核苷化合物的酶。这种胞嘧啶或其衍生物可从任何满足要求的动物、植物或微生物体中得到。一般来说，这种被称为胞嘧啶核苷磷酸化酶的酶在文献中还未见报道。因此，这一术语仅在本发明中如上述被定义。可用作这种胞嘧啶核苷磷酸化酶的一个很好的例子是已知的属于埃希氏菌(Escherichia)菌属的含有嘌呤核苷磷酸化酶的细菌，例如同时具有胞嘧啶核苷磷酸化酶活性的大肠杆菌(Escherichia coli)。作为实施例，大肠杆菌的嘌呤核苷磷酸化酶的DNA碱基序列参见SEQ IDNO：3，由此碱基序列翻译得到的氨基酸序列参见SEQ ID NO：4。当今在基因工程上取得的进展使得通过对氨基酸上的部分碱基序列实行失活、插入或替换来对氨基酸序列进行改变更佳容易进行了。这种技术可以通过改变部分碱基序列来改变氨基酸序列，而不影响目标酶的活性。即是说，包括本发明中的胞嘧啶核苷磷酸化酶在内的酶的氨基酸序列得以改变，而其酶活性得以保留甚至提高。可用于本发明的氨基酸序列可以是：由氨基酸序列SEQ ID NO：4中通过缺失、替换或插入得到的2-3种未影响其目标酶活性的氨基酸；由碱基序列SEQ ID NO：3中通过缺失、替换或插入等突变得到的氨基酸。在不影响目标酶活性的同时，在本发明中互补的序列可使杂交在苛刻的条件下进行。

如果一种酶具有这种嘌呤核苷磷酸化酶活性，则它本身可同时产生嘌呤型和嘧啶型的核苷化合物，因此，这对核苷的商业化生产非常有利。

本发明中使用的具有胞嘧啶核苷磷酸化酶活性的酶可以从：含有这种酶的细菌细胞，或反应体系中的细胞或其培养基中制得的酶制剂中来获得。这种酶制剂包括了：经过不同处理得到的细菌细胞或其培养基，酶提取物，提纯到某种程度的或分离得到的酶提取物等。

这种细菌细胞或酶制剂可以购买到，或可用不同的方法制得。具有酶活性的制剂可以选自市售的酶，有酶活性的细菌细胞，和细菌处理得到的或其固定型的制剂等。经处理的细菌制剂包括：丙酮干燥的细胞，破裂的细胞，和通过机械破坏、超声波破坏、冷冻-融解、加压-去压、渗压震扰、自溶解、细胞壁裂变或表面活性剂等处理的细胞碎片。此外，还有用硫酸铵或内酮沉降得到的纯化的酶，如果需要的话，还可使用色谱柱进行纯化。

对具有胞嘧啶核苷磷酸化酶活性的细菌的范围并没有一定限制，只要这种细菌能表达出由胞嘧啶或其衍生物作为底物来生成胞嘧啶核苷化合物的胞嘧啶核苷磷酸化酶活性即可。这样的细菌通常可以选自能表达核苷磷酸化酶的细菌。较为适宜的能产生核苷磷酸化酶的细菌是埃希氏菌(Escherichia)属的细菌，例如，具有胞嘧啶核苷磷酸化酶活性的大肠杆菌(Escherichia coli)。近来，在分子生物学和基因工程方面取得的进展使得来由菌株得到的嘌呤核苷磷酸化酶的基因可能并且容易这样来获得：首先分析酶的分子生物特性和其氨基酸序列，然后通过插入表达此酶的基因和调节区来构建一个重组的质粒，然后再将此质粒转移到任何受体细菌体内，来产生一个表达这种酶的蛋白质特性的重组的细菌。考虑到现有的技术水平，本发明中使用的表达核苷磷酸化酶活性的细菌中也包含了这种将核苷磷酸化酶的基因掺入到受体细菌体内而产生的重组的细菌。

这里所述的基因表达所必需的调节区包括了一个启动子序列(包含一个控制转录的操纵基因序列)、一个核糖体-结合序列(SD序列)和一个转录终止序列。启动子序列可以是一个由大肠杆菌得到的作为色氨酸操纵子的trp启动子、一个作为乳糖操纵子的lac启动子、一个由λ噬菌体得到的PL或PR启动子、一个由枯草杆菌得到的葡糖酸酯合酶启动子(gnt)、一个碱性的蛋白酶启动子(apr)、一个中性的蛋白酶启动子(npr)和一个α-淀粉酶启动子(amy)。另外，也可使用经过特殊设计和改造的启动子，如tac启动子。核糖体-结合序列的受体可以是大肠杆菌或枯草杆菌，也可以是其他的能使它们在其中起作用的受体。例如，一个具有4个或更多的连续碱基互补于16S核糖体RNA的3’-末端区域的序列的共有序列可用于DNA的合成，并可用于上述的核糖体-结合序列。转录终止序列并不一定都是不依赖于ρ因子的，例如，可使用脂蛋白终止者和trp操纵子终止者。这些重组质粒中的调节区最好从上游一侧的5’-末端区域开始，以启动子序列、核糖体-结合序列、编码了核苷磷酸化酶的基因和转录终止序列的顺序排列。

这里描述的可用作载体的质粒可以是大肠杆菌中能够自我复制的pBR332、pUC18、Bluescript II SK(+)、pKK223-3、pSC101以及枯草杆菌中能够自我复制的pUB110、pTZ4、pC194、ρ11、φ1和φ105。此外，可在多个菌株中都能够自我复制并可用作载体的质粒是pHV14、TRp7、Yep7和pBS7。

所述的细菌受体中，大肠杆菌将被作为一个典型的例子在下面讨论。但这些细菌受体并不只限于大肠杆菌，还可以包括其他的微生物株，例如杆菌属的枯草杆菌，酵母和放射线菌。

本发明中涉及的胞嘧啶核苷化合物是指一类通过N-糖苷键的形成将磷酸糖与构成核酸碱基的胞嘧啶或其衍生物结合在一起的化合物。这些化合物中较为典型的是胞嘧啶核苷，二脱氧胞嘧啶核苷，氮胞嘧啶核苷，脱氧氮胞嘧啶核苷，5-氟胞嘧啶核苷和5-氟脱氧胞嘧啶核苷，但其范围并不仅限于此。

本发明中涉及的胞嘧啶衍生物是指一类具有嘧啶结构组成部分的，可被胞嘧啶核酸磷酸化酶转化为胞嘧啶核苷结构的化合物。上面的结构通式(1)代表了一类优选的胞嘧啶衍生物的结构。当式中的Y为低链烷基时，可以是有1至4碳原子的烷基，如，甲基，乙基，丙基，异丙基，正丁基，仲丁基和叔丁基。在这些胞嘧啶衍生物中，优选氮胞嘧啶，5-氟胞嘧啶和5-甲基胞嘧啶。

本发明中涉及的磷酸糖是指一类1位被磷酸酯化的多羟基醛、多羟基酮或它们的衍生物的酯类化合物。优选1-磷酸核糖，1-磷酸-2’-脱氧核糖，1-磷酸-2’-3’-二脱氧核糖，1-磷酸-阿戊糖，和二氧戊环型的磷酸糖。

由天然产物得到的多羟基醛或多羟基酮包括了：戊醛糖，如D-阿戊糖，L-阿戊糖，D-木糖，L-木糖或D-核糖；戊酮糖，如D-木酮糖，L-木酮糖或D-核酮糖；脱氧糖，如D-2-脱氧核糖，D-2，3-二脱氧核糖或类似的糖等，其范围不仅限于此。

这些磷酸糖可以通过在核苷磷酸化酶作用下，磷酸解核苷化合物来制备(J.Biol.Chem.Vol.184，437，1950)，或也可对端基异构物进行有选择性地化学合成方法来获得。

此外，还可参考WO 01/14566中描述的1-磷酸脱氧核糖的酶合成方法。(在那里还提到了根据Roche公司专利的1-磷酸脱氧核糖的合成路径。)

对本发明中涉及的减小胞嘧啶和胞嘧啶核苷的脱氨酶活性的方法没有特别的限制，只要能去除或减小脱氨酶活性而不减小核苷磷酸化酶活性即可。但是优选的方法是将细菌细胞及其培养基或其加工物暴露于有机溶液中，或将它们进行加热处理。

本发明中涉及的有机溶剂可以是任何能胞嘧啶和胞嘧啶核苷的脱氨酶活性的溶剂。它没有特别的限制，可以包括：极性溶剂，如甲醇，乙醇，丙醇，丁醇，二氧杂环乙烷，四氢呋喃，丁酮或丙酮；醇类，如1-己醇，2-甲基-1-戊醇，4-甲基-2-戊醇，2-乙基-1-丁醇，1-庚醇，2-庚醇，3-庚醇，1-辛醇，2-辛醇或1-壬醇；酯类，如丙基醋酸酯，丁基醋酸酯，异丁基醋酸酯，二级丁基醋酸酯，戊基醋酸酯，异戊基醋酸酯，环己基醋酸酯或苄基醋酸酯；烃类，如戊烷，己烷，2-甲基己烷，2，2-二甲基丁烷，2，3-二甲基丁烷，环己烷，甲基环己烷，庚烷，环庚烷，辛烷，环辛烷，异辛烷，壬烷，癸烷，十二烷，石油醚，石油挥发油，轻石油，工业汽油，煤油，苯，甲苯，二甲苯，乙苯，丙苯，异丙苯，荚或萘；卤代烃，如二氯甲烷，氯仿，四氯化碳，二氯乙烷，氯苯或二氯苯；酚类，如甲酚或二甲苯酚；酮类，如甲基异丁基酮或2-己酮；醚类，如二丙醚，二异丙醚，联苯醚和联苄醚；此外，还有烃类，如戊烷，己烷，庚烷，辛烷，环戊烷，环己烷，环庚烷，环辛烷，甲苯或乙基苯。本发明中使用的其他有机溶剂为氨基化合物，如N，N-二甲基甲酰胺，N，N-二甲基乙酰胺，N，N-二甲基苯甲酰胺，N-甲基2-吡咯烷酮，N-甲基甲酰胺，甲酰胺，乙酰胺，苯甲酰胺，尿素化合物，如脲，N，N’-二甲基脲，四甲基脲，和N，N’-二甲基咪唑二酮，亚砜化合物，如二甲基亚砜，二乙基亚砜和二苯亚砜。

对本发明中涉及的使用有机溶剂去除或降低脱氨酶活性的方法没有特别的限制，只要能去除或减小脱氨酶活性而不减小核苷磷酸化酶活性即可。但是处理过程优选的条件是：将细菌细胞及其培养基或其加工物静置或悬浮于pH值为4.0-10.0的有机溶剂水溶液中，优选pH值为6.0-9.0；有机溶剂水溶液浓度不小于10％(体积比)，优选不小于20％(体积比)，最好不小于30％(体积比)；温度不低于0℃，优选20℃-80℃范围内，最好在50℃-80℃范围内；时间为10分钟或更长，优选40小时，最好在1-20小时。

此外，向以上处理过的液体中加入不少于1mM的磷酸糖，最好少于100mM，可以使核苷磷酸化酶更加稳定。

向反应溶液中加入有机溶剂也可能同样有效。

对本发明中涉及到的加热处理过程并没有特别的限制，只要能去除或减小脱氨酶活性而不减小核苷磷酸化酶活性即可。但是加热处理过程优选的条件是：将细菌细胞及其培养基或其加工物静置或悬浮于pH值为4.0-10.0的有机溶剂水溶液中，优选pH值为6.0-9.0；加热温度不低于50℃，优选60℃-80℃范围内；加热时间为10分钟或更长，优选30分钟或更长。此外，向以上处理过的液体中加入不少于1mM的磷酸糖，优选10-100mM，可以使核苷磷酸化酶更加稳定。

就对某一细菌的缺乏胞嘧啶脱氨酶活性和胞嘧啶核苷脱氨酶活性二者之一的要求而言，一种本身就缺乏胞嘧啶核苷-脱氨酶的杆菌属的细菌，由于该杆菌属通常只有胞嘧啶核苷脱氨酶，没有胞嘧啶脱氨酶，因而这种细菌可作为满足此要求的细菌。例如，由杆菌基因库中心(BGCS)获得的枯草杆菌1A479。可以使用在这样的菌株上表达了核苷磷酸化酶的细菌细胞。

可用去除了碱性磷酸化酶的大肠杆菌K-12DH5α来代表本发明中涉及到的缺乏磷酸化酶的菌株。也可以使用在这样的菌株上表达了核苷磷酸化酶的细菌细胞。

对这种细菌细胞的热处理可能会去除或降低酸性磷酸化酶的活性，因而获得更高的产率。一种优选的加热处理过程的条件是：将细菌细胞及其培养基或其加工物静置或悬浮于pH值为4.0-10.0的有机溶剂水溶液中，优选pH值为6.0-9.0；加热温度不低于50℃，优选60℃-80℃范围内；加热时间为10分钟或更长，优选30分钟或更长。

对本发明中涉及到的减弱或除去一个对核苷磷酸化酶活性起作用的抑制因子的处理过程并没有特别的限制，只要抑制因子能被减弱或除去即可。但是，一个优选的处理过程一般包括：用超声波破坏细菌细胞的方法制备酶溶液，然后，向此酶溶液中加入极性溶剂使胞嘧啶核苷磷酸化酶沉淀；或向溶液中加入硫酸铵盐析，使酶沉淀出来，或用离子交换树脂提纯酶。

本发明中涉及到的合成胞嘧啶核苷化合物的反应是在满足以下条件情况下进行的：使用的细菌细胞及其培养基或其加工物来自于表达了胞嘧啶核苷磷酸化酶的细菌；这种胞嘧啶核苷磷酸化酶能够以胞嘧啶或其衍生物与磷酸糖为底物合成胞嘧啶核苷化合物；在底物中，细菌加工物已经失去了或被去除了降解胞嘧啶或其衍生物以及胞嘧啶核苷化合物的活性；反应一般在pH值为4-10，反应温度为10-80℃下进行；反应中磷酸糖和胞嘧啶或其衍生物的浓度最好是0.1-1000mM，胞嘧啶或其衍生物与磷酸糖或其盐的摩尔浓度比应为0.1-10，考虑到转化速率，摩尔浓度比最好为0.95。

一种能与磷酸形成难溶性磷酸盐的金属盐或是一个诸如离子交换树脂的载体也可加到反应体系中，以结合反应介质中生成的磷酸，从而提高反应产率。

可以利用不同化合物在溶剂中的溶解性的不同(如水中)，或使用离子交换或吸附树脂来从反应溶液中分离出胞嘧啶核苷化合物。

可将残留在反应溶液中的痕量的胞嘧啶转化为尿嘧啶的方法来清除它。这可通过一种处理过的已降低或去除了胞嘧啶核苷脱氨酶活性的而又表达了胞嘧啶脱氨酶活性的细菌来完成。或者通过一种可以将胞嘧啶脱氨酶表达到其他的没有胞嘧啶核苷脱氨酶活性的菌株上而设计的细菌来完成。

将反应溶液通过阳离子交换树脂，可使胞嘧啶核苷化合物立即得以分离和提纯，这是因为由残留的胞嘧啶转化得到的尿嘧啶与可能由胞嘧啶核苷化合物降解得到的尿嘧啶核苷化合物均不能被树脂吸附，而只有胞嘧啶核苷化合物被吸附。

[实施实例]

以下实施实例对本发明进行说明，但所列举的实施例并不限制本发明所保护的范围

分析过程：

[分析方法]

生成的胞嘧啶核苷化合物均经高效液相色谱(HPLC)进行了定量分析。分析条件如下：

色谱柱：Develosil ODS-MG-5，4.6×250mm(Nomura Kagaku)

柱温：40℃。

泵流速：1.0ml/min

检测：UV 254nm

淋洗液：50mM磷酸二氢钾∶甲醇＝8∶1(V/V)

参考实施例1：(关于日本公开特许1-60396的重现实验)

根据日本公开特许1-60396中实施例1来合成脱氧胞嘧啶核苷。从例1中描述的24个菌株中选取并获得了7个保存的菌株，列于表1。将50ml含等量的0.5g/dl的酵母提取物，1.0g/dl的胨，1.0g/dl的肉羹，10.5g/dl的NaCl的介质(pH值为7.0)注入500ml带有颈皮的烧瓶并搅拌。表1中的每种细菌最早都在营养丰富的肉汤琼脂中，在30℃下培养了16个小时，然后将细胞环植入以上的介质中并在30℃下振荡培养16个小时。然后，从培养液中离心分离出细胞群，再用0.05M的磷酸盐缓冲溶液(pH值为7.0)洗，再次离心得到干净的细胞群。

将上面得到的干净的细胞群加入到100ml含20mM的1-磷酸-2’-脱氧核糖与20mM的胞嘧啶的二羟甲基氨基甲烷缓冲液中(pH值为7.2)，将细胞群浓缩到5g/dl，然后在60℃下反应24小时。反应结束后，稀释反应液，再通过HPLC分析部分稀释液，发现底物胞嘧啶几乎100％地被降解了，也没有检测到脱氧胞嘧啶核苷。

[表1]

微生物菌株名称	保藏号
微生物菌株名称	保藏号	单纯杆菌(Bacillus simplex)AJ-1357	FERM P-9533
大肠杆菌(Escherichia coli)AJ-11075	FERM P-9534	单纯杆菌(Bacillus simplex)AJ-1357	FERM P-9533
大肠杆菌(Escherichia coli)AJ-11075	FERM P-9534	胡罗卜欧氏杆菌(Erwinia carotovora)AJ-2753	FERM P-6559
Pseudomonas roseobubalia AJ-2384	FERM P-9471	胡罗卜欧氏杆菌(Erwinia carotovora)AJ-2753	FERM P-6559
Pseudomonas roseobubalia AJ-2384	FERM P-9471	Rizobium melioti AJ-2823	FERM P-6565
Xanthomonas citri AJ-2785	FERM P-6560	Rizobium melioti AJ-2823	FERM P-6565
Xanthomonas citri AJ-2785	FERM P-6560	Proteus rettgeri AJ-2770	FERM P-941

参考实施例2：(PNP的克隆，表达克隆DNA菌株的制造，和对照细胞的制备)

由大肠杆菌得到的基因组DNA的制备方法如下：

将大肠杆菌菌株K-12/XL-10(源自层状基因(stratagent))植入50ml的LB介质中，在37℃下过夜，然后收集细菌群，用含1mg/ml的溶菌酶的溶液处理。再用苯酚处理溶菌液，通常可用乙醇得到DNA沉淀物。生成的DNA沿一支玻璃棒沉淀以便回收清洗后用于制备PCR。

分别具有SEQ ID Nos：1，2中的碱基序列的低聚核苷酸(由HokkaidoSystem Science合成)被用作PCR的引物。这些碱基序列是基于deoC基因的碱基序列(基因库中编号为AE000508(碱基编码区为11531-12250))设计的，此碱基序列是对一个已知的天然大肠杆菌的嘌呤核苷磷酸化酶进行的编码。这些引物分别在3’-端基和5’-端基附近具有限制性酶EcoRI和HindIII的识别序列。PCR循环30次以下反应：在96℃变性处理1分钟，在55℃退火1分钟，并在74℃进行1分钟的拉伸反应。反应中使用了0.1ml的含有6ng/μl上述的已完全被限制性酶HindIII消化的大肠杆菌基因组DNA的PCR反应溶液以及3μM的每种引物。

以上的反应产物和质粒pUC18(Takara Shuzo产)被EcoRI和HindIII消化，然后与连接Hi(Toyobo产)连接。于是，通过重组的质粒，大肠杆菌DH5α就被转化了。将此转化体置于含50μg/ml的氨必西林(Am)和X-Gal(5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖苷)的LB琼脂介质中进行培养，以获得白色的对Am具有抵抗性的转化体细菌群体。

从此转化体提取出的插入了感兴趣的基因的DNA片段的质粒被命名为pUC-PNP73。可通过一般测定碱基序列的方法测定插入pUC-PNP73的DNA片段的碱基序列。确定的碱基序列列于SEQ ID NO：3中。由此碱基序列翻译得到的氨基酸序列列于SEQ ID NO：4中。这种酶具有分子量约为26,000的亚基，而且它的活性是通过六聚体的形式表现的。其酶活性变现的最佳温度约为70℃，最佳pH范围约是7.0-7.5。这种转化体被命名为大肠杆菌MT-10905。

将大肠杆菌MT-10905置于100ml的含有50μg/ml的Am的LB介质中，在37℃下振荡培养过夜。然后将培养基以13,000rpm的速度离心10分钟，得到细胞群。再将得到细胞群悬浮于20ml的100mM的二羟甲基氨基甲烷氯化氢缓冲液中(pH值为8.0)。然后将此悬浮液以13,000rpm的速度离心10分钟，得到细胞群。然后再将之悬浮于2ml的含100mM的二羟甲基氨基甲烷氯化氢缓冲液(pH值为8.0)和10mM的1-磷酸-2’-脱氧核糖二单环己铵盐(2’-deoxyribose-1-phosphate di(monocyclohexylammonium)salt)(SIGMA产)的混合液中，并在-20℃下冷冻储藏。

大肠杆菌DH5α被质粒pUC18(Takara Shuzo产)所转化。这种转化的菌株被命名为pUC18/DH5α。将这种pUC18/DH5α菌株在100ml含有50μg/ml的Am的LB介质中，在37℃振荡培养过夜。然后培养基以13,000rpm的速度离心10分钟，得到细胞群。再将此细胞群悬浮于20ml的100mM的二羟甲基氨基甲烷氯化氢缓冲液中(pH值为8.0)。然后，再将此悬浮液以13,000rpm的速度离心10分钟，得到细胞群，再将之悬浮于2ml的含100mM的二羟甲基氨基甲烷氯化氢缓冲液(pH值为8.0)和10mM的1-磷酸-2’-脱氧核糖二单环己铵(2’-deoxyribose-1-phosphatedi(monocyclohexylammonium)salt)盐(SIGMA产)的混合液中，并在-20℃下冷冻储藏。

对比实施例1：

1.0ml含有20mM的1-磷酸-2’-脱氧核糖二单环己铵盐(2’-deoxyribose-1-phosphate di(monocyclohexylammonium)salt)(SIGMA产)，20mM的胞嘧啶(Wako Pure Chemicals产，保证级)，100mM的二羟甲基氨基甲烷氯化氢缓冲液(pH值为8.0)的反应液和0.1ml由参考实施例2中获得的pUC18/DH5α菌株的细胞群悬浮液在50℃下混合处理20小时。对另一组成相同，但没有底物的溶液也进行了相同的热处理，以作为参比对象。当稀释反应液并对它进行分析时，没有检测到脱氧胞嘧啶核苷。参比对象中的处理过的溶液的HPLC图分析见图.1A，相应的处理过的反应液的HPLC图分析见图.1B。

对比实施例2：

1.0ml含有20mM的1-磷酸-2’-脱氧核糖二单环己铵盐(2’-deoxyribose-1-phosphate di(monocyclohexylammonium)salt)(SIGMA产)，20mM的胞嘧啶(Wako Pure Chemicals产，保证级)，100mM的二羟甲基氨基甲烷氯化氢缓冲液(pH值为8.0)的反应液和0.1ml由参考例2中获得的MT-10905菌株的细胞群悬浮液在50℃下混合处理20小时。对另一组成相同，但没有底物的溶液也进行了相同的热处理，以作为参比对象。当稀释反应液并对它进行分析时，发现生成了10mM的脱氧尿嘧啶核苷和3mM的尿嘧啶，但没有检测到脱氧胞嘧啶核苷。参比对象中的处理过的溶液的HPLC图分析见图.2A，相应的处理过的反应液的HPLC图分析见图.2B。

实施例1：(有机溶剂处理过程)

通过向参考实施例2中获得的MT-10905菌株的细胞群悬浮液中加入一定量的甲醇以获得表2中列出的不同甲醇浓度的混合溶液。将此悬浮液在30℃下保持1小时。此后，胞嘧啶脱氨酶将以cdd形式表达。再将此细胞群悬浮液加入到1.0ml含有100mM的二羟甲基氨基甲烷氯化氢缓冲液(pH值为8.0)和20mM的胞嘧啶的反应液中，在50℃下处理2小时。这时，可对cdd活性进行分析。

对于以上所述的细胞群悬浮液，不加入甲醇在30℃下保持1小时后，cdd的相对活性计为100％。

将细胞群悬浮液加入到1.0ml含有20mM的1-磷酸-2’-脱氧核糖二单环己铵盐(2’-deoxyribose-1-phosphate di(monocyclohexylammonium)salt)(SIGMA产)，5.4mM的腺嘌呤(WakoPure Chemicals产，保证级)和100mM的二羟甲基氨基甲烷氯化氢缓冲液(pH值为8.0)的反应液中，在50℃下处理15分钟。这时，可对PNP活性进行分析。使用上述量的细胞群进行的反应最多能生成不超过2mM的脱氧腺嘌呤核苷。对于以上的细胞群悬浮液，不加入甲醇并在30℃下保持1小时后的悬浮液的PNP相对活性计为100％。表2中的结果显示出PNP活性有很微弱的减小，而cdd活性几乎完全丧失。

[表2]

甲醇(％)	Cdd残余活性(％)	PNP残余活性(％)
甲醇(％)	Cdd残余活性(％)	PNP残余活性(％)	10	80	100
25	50	99	10	80	100
25	50	99	50	10	98
70	0.5	97	50	10	98
70	0.5	97	90	0.1	97

实施例2：(有机溶剂处理过程)

向参考例2中获得的MT-10905菌株的细胞群悬浮液中加入表3中列出的有机溶剂，并将此悬浮液在30℃下保持1小时。

表3中的结果显示出PNP活性有很微弱的减小，而cdd活性几乎完全丧失。

[表3]

有机溶剂类型	有机溶剂浓度	Cdd活性	PNP活性
有机溶剂类型	有机溶剂浓度	Cdd活性	PNP活性	N，N-二甲基甲酰胺	50％	5％	97％
二甲基亚砜	50％	4％	96％	N，N-二甲基甲酰胺	50％	5％	97％
二甲基亚砜	50％	4％	96％	N，N-二甲基咪唑二酮	50％	4％	95％

实施例3：(热处理)

将参考例2中获得的MT-10905菌株的细胞群悬浮液保持在60℃。此后，胞嘧啶脱氨酶将以cod形式表达。再将此细胞群悬浮液加入到含有100mM的二羟甲基氨基甲烷氯化氢缓冲液(pH值为8.0)和20mM的胞嘧啶的反应液中，在50℃下处理2小时。这时，可对cod活性进行分析。未经过热处理的细胞群悬浮液的cod活性定为100％，其残余活性将以相对值表示。表4中的结果显示出PNP活性有很微弱的减小，而cod活性几乎完全丧失。

[表4]

加热时间(hr)	Cod残余活性(％)	PNP残余活性(％)
加热时间(hr)	Cod残余活性(％)	PNP残余活性(％)	0.1	90	100
0.2	80	98	0.1	90	100
0.2	80	98	0.5	20	98
2.0	2.0	98	0.5	20	98
2.0	2.0	98	20.0	0.8	97

实施例4：(热处理和有机溶剂处理)

例3中的经过20小时热处理后的细胞群悬浮液，按照实施例1中的方法再用甲醇对其进行处理。例3中的经过热处理20小时后的独立细胞群的活性被设为100％，其残余活性将以相对值表示。表5中的结果显示出PNP活性有很微弱的减小，而cod和cdd的活性几乎完全丧失。

[表5]

甲醇浓度(％)	Cod残余活性(％)	Cdd残余活性(％)	PNP残余活性(％)
甲醇浓度(％)	Cod残余活性(％)	Cdd残余活性(％)	PNP残余活性(％)	10	90	80	100
25	80	50	98	10	90	80	100
25	80	50	98	50	50	10	96
70	30	0.5	96	50	50	10	96
70	30	0.5	96	90	10	0.1	96

实施例5：(由表达PNP的重组细菌合成脱氧胞嘧啶核苷以及对按照实施例4对其进行处理)

1.0ml含有20mM的1-磷酸-2’-脱氧核糖二单环己铵盐(2’-deoxyribose-1-phosphate di(monocyclohexylammonium)salt)(SIGMA生产)，20mM的胞嘧啶(Wako Pure Chemicals产，保证级)，100mM的二羟甲基氨基甲烷氯化氢缓冲液(pH值为8.0)的反应液与0.1ml按照实施例4中用50％甲醇处理的细胞群悬浮液50℃下混合处理20小时。当稀释反应液，并对它进行分析时，发现生成了10.7mM的脱氧胞嘧啶核苷，0.2mM的脱氧尿嘧啶核苷和0.1mM的尿嘧啶。反应的产率为53％。处理过的反应液的HPLC图见图.2C。

实施例6：(用按照实施例4中处理的大肠杆菌合成脱氧胞嘧啶核苷)

1.0ml含有20mM的1-磷酸-2’-脱氧核糖二单环己铵盐(2’-deoxyribose-1-phosphate di(monocyclohexylammonium)salt)(SIGMA生产)，20mM的胞嘧啶(Wako Pure Chemicals产，保证级)，100mM的二羟甲基氨基甲烷氯化氢缓冲液(pH值为8.0)的反应液与0.1ml由参考例2中获得的并按照实施例4用50％甲醇处理过的pUC18/DH5α菌株的细胞群悬浮液，在50℃下混合处理20小时。当稀释反应液，并对它进行分析时，发现生成了0.14mM的脱氧胞嘧啶核苷和0.17mM的脱氧尿嘧啶核苷。反应的产率为0.7％。处理过的反应液的HPLC图见图.1C。

实施例7：(由表达PNP并按照实施例4对其进行处理的重组细菌合成脱氧胞嘧啶核苷)

1.0ml含有20mM的1-磷酸-2’-脱氧核糖二单环己铵盐(2’-deoxyribose-1-phosphate di(monocyclohexylammonium)salt)(SIGMA生产)，20mM的胞嘧啶(Wako Pure Chemicals产，保证级)，100mM的二羟甲基氨基甲烷氯化氢缓冲液(pH值为8.0)的反应液与0.1ml由参考例2中获得的并按照实施例4用50％甲醇处理过的细胞群悬浮液，在50℃下混合处理20小时。当稀释反应液，并对它进行分析时，发现生成了5mM的胞嘧啶核苷，0.1mM的尿嘧啶核苷和0.1mM的尿嘧啶。反应的产率为25％。

实施例8：(PNP的提纯，以及由纯净的PNP合成脱氧胞嘧啶核苷)

将实施例4中得到的细胞群悬浮于10ml的10mM的二羟甲基氨基甲烷氯化氢缓冲液(pH值为7.5)中，然后用超声波破坏器对它进行破坏。再对破坏的细胞悬浮液离心处理以获得粗酶溶液。然后将之注入载有Toso制造的DEAE-Toyopearl(3cm×10cm)的色谱柱中，其中的填料已用50mM二羟甲基氨基甲烷氯化氢缓冲液(pH值为7.5)平衡过。再用50mM-500mM的NaCl溶液对它进行线性梯度洗脱以收集活性馏分。洗脱液用70％的硫酸铵水溶液饱和以形成沉淀物。此沉淀物在10mM二羟甲基氨基甲烷氯化氢缓冲液(pH值为7.5)中进行渗析。将渗析后的溶液注入载有羟磷灰石(hydroxyapatite)(3cm×15cm)的色谱柱中，其中的填料已用10mM二羟甲基氨基甲烷氯化氢缓冲液(pH值为7.5)平衡过。再用10mM-50mM的二羟甲基氨基甲烷氯化氢缓冲液(pH值为7.5)溶液对它进行线性梯度洗脱以收集活性馏分。酶溶液用70％的硫酸铵水溶液饱和以形成沉淀物，并收集之。将收集到的沉淀物溶于1ml的10mM的二羟甲基氨基甲烷氯化氢缓冲液(pH值为7.5)中，渗析，得到了2ml纯的PNP。纯的PNP在SDS-聚丙稀酰胺体系的电泳实验中呈现出一个单带。结果见图3.。

1.0ml含有20mM的1-磷酸-2’-脱氧核糖二单环己铵盐(2’-deoxyribose-1-phosphate di(monocyclohexylammonium)salt)(SIGMA产)，20mM的胞嘧啶(Wako Pure Chemicals产，保证级)，100mM的二羟甲基氨基甲烷氯化氢缓冲液(pH值为8.0)的反应液与0.1ml纯的PNP，在50℃下混合处理20小时。当稀释反应液，并对它进行分析时，发现生成了11.5mM的脱氧胞嘧啶核苷，反应的产率为57.5％。

实施例9：(由表达PNP并按照实施例4对其进行处理的重组细菌合成氮胞嘧啶核苷)

1.0ml含有20mM的1-磷酸-2’-脱氧核糖二单环己铵盐(2’-deoxyribose-1-phosphate di(monocyclohexylammonium)salt)(SIGMA产)，20mM的氮胞嘧啶(SIGMA产)，100mM的二羟甲基氨基甲烷氯化氢缓冲液(pH值为8.0)的反应液与0.1ml按照实施例4用50％甲醇处理过的细胞群悬浮液，在50℃下混合处理20小时。当稀释反应液，并对它进行分析时，发现生成了3.2mM的氮胞嘧啶核苷，反应的产率为16％。

实施例10：(由表达PNP并按照实施例4对其进行处理的重组细菌合成氟胞嘧啶核苷)

1.0ml含有20mM的1-磷酸-2’-脱氧核糖二单环己铵盐(2’-deoxyribose-1-phosphate di(monocyclohexylammonium)salt)(SIGM生产)，20mM的5-氟胞嘧啶(SIGMA产)，100mM的二羟甲基氨基甲烷氯化氢缓冲液(pH值为8.0)的反应液与0.1ml按照实施例4用50％甲醇处理过的细胞群悬浮液，在50℃下混合处理20小时。当稀释反应液，并对它进行分析时，发现生成了2.4mM的5-氟胞嘧啶核苷，反应的产率为12％。

实施例11：(由表达PNP并按照实施例4对其进行处理的重组细菌合成甲基胞嘧啶核苷)

1.0ml含有20mM的1-磷酸-2’-脱氧核糖二单环己铵盐(2’-deoxyribose-1-phosphate di(monocyclohexylammonium)salt)(SIGMA产)，20mM的5-甲基胞嘧啶(SIGMA产)，100mM的二羟甲基氨基甲烷氯化氢缓冲液(pH值为8.0)的反应液与0.1ml按照实施例4用50％甲醇处理过的细胞群悬浮液，在50℃下混合处理20小时。当稀释反应液，并对它进行分析时，发现生成了2.1mM的5-甲基胞嘧啶核苷，反应的产率为10.5％。

实施例12：(由掺入PNP而失去降解活性的细菌群来合成脱氧胞嘧啶核苷)

(1)为使大肠杆菌的PNP能在枯草杆菌中表达，设计出了大肠杆菌-枯草杆菌穿梭质粒pPNP04和pPNP05。

PCR以pUC-PNP73作为模板，以序列号为SEQ ID Nos：5和6的合成的低聚核苷酸作为引物，可生成0.8kb的DNA片段A。这种低聚核苷酸可以使大肠杆菌的嘌呤核苷磷酸化酶的基因得以放大。然后，PCR以日本公开特许60-21-986中描述的pPNP150(FERM BP-425)作为模板，以合成的低聚核苷酸作为引物SED ID Nos：7和8，可以使由淀粉液化杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)的中性蛋白酶得到的包括转录启动子和翻译调节区在内的区域得到放大，并生成1.0kb的DNA片段B。然后对DNA的片段A和片段B的重叠区进行退火处理。然后，PCR又以退火处理得到的片段作为模板，以合成的序列号为SEQ ID Nos：6和7的低聚核苷酸作为引物，通过放大，可生成1.8kb的DNA片段C。这个DNA片段被限制性酶EcoRI和HindIII消化，产生插入片段。大肠杆菌-枯草杆菌穿梭质粒pPNP373和pPNP374由杆菌基因库中心(BGSC；OH)获得，并都被限制性酶EcoRI和HindIII消化，产生载体片段。载体片段在过量的上述的插入片段存在下连接到一起，产生表达大肠杆菌嘌呤核苷磷酸化酶的穿梭质粒pPNP04和pPNP05。

(2)pPNP04和pPNP05进入枯草杆菌，并由此转化体合成脱氧胞嘧啶核苷。

由杆菌基因库中心(BGSC；OH)获得的枯草杆菌菌株1A4791和A480均没有胞嘧啶核苷脱氨酶活性。

步骤(1)中，根据Chang(Chang，S.and Cohen，S.N.；Mol.Gen.Genet.168，111(1978)))提出的原型方法，使用质粒pPNP04和pPNP05可得到转化体1A480(pPNP04)，1A480(pPNP05)，1A479(pPNP04)和1A479(pPNP05)。

以下是对菌株1A480(pPNP04)对合成脱氧胞嘧啶核苷反应活性的评价：

将菌株1A480(pPNP04)置于20ml的其两倍浓度的L介质中，在35℃下培养17小时。取出1.5ml培养液，经离心后获得细胞群，并将之在-20℃下冷冻储藏。将1.0ml含有24mM的1-磷酸-2’-脱氧核糖二单环己铵盐(2’-deoxyribose-1-phosphate di(monocyclohexylammonium)salt)(SIGMA产)，20mM的胞嘧啶(Wako Pure Chemicals产，保证级)和100mM的二羟甲基氨基甲烷氯化氢缓冲液(pH值为8.0)的反应液加入到0.1ml的冷冻的细胞群中，并在50℃下振荡。反应1.5小时和18小时后分别取样，用水稀释20倍后，离心除去细胞群。用HPLC分析上层清液，得知：1.5小时后，脱氧胞嘧啶核苷浓度为1.4-1.5mM，18小时后，脱氧胞嘧啶核苷浓度为6.4-7.0mM。而且没有检测到任何底物或产物的降解物。

对由菌株1A480(pPNP05)，1A479(pPNP04)和1A479(pPNP05)合成脱氧胞嘧啶核苷进行分析得知：与菌株1A480(pPNP04)一样，它们对脱氧胞嘧啶核苷的合成同样有效。

实施例13：(保留胞嘧啶核苷磷酸化酶活性的氨基酸取代酶的制备)

用参照实施例2中得到的模板pUC-PNP73的质粒DNA，和源自层状基因(STRATAGENE)的快速变换位置引导的突变发生Kit(以下简称Kit)来引发突变。以下的例子基本上遵循Kit的基本原理和过程。

在一个30ml的试管中加入10mlLB液体介质，然后将之置于高压灭菌器中在121℃下灭菌处理20分钟。向介质中加入一定量的安必西林以调节其最终浓度为100μg/ml。将参照实施例2中得到MT-10905菌株以细胞群环种植到培养液中，在37℃，300rpm转速下培养20小时。然后，取1ml等量培养液，倒入离心管中。在15,000rpm转速下，离心5分钟，分离细胞群。然后，用碱性SDS萃取细胞群得到pUC-PNP73的质粒DNA。

PCR通过使用pUC-PNP73的质粒DNA作为模板，并分别使用以下序列的DNA作为引物得以进行，SEQ ID Nos：9和10，11和12，13和14，15和16，17和18，19和20，21和22，23和24，25和26，27和28，29和30，31和32，33和34，35和36，37和38，39和40，41和42，43和44，45和46。PCR介质的组分如表6所示。放大的条件如表7所示。

向以上的PCR介质中加入4个单位的限制性酶DpnI，并在37℃下保持1小时。然后取1μl的反应介质，加入到100μl的大肠杆菌K-12DH5α的竞争细胞中(Toyobo产)。将它们在冰中保持30分钟后，将细胞悬浮液放入42℃的恒温水浴中，保持30秒。再向细胞悬浮液中加入0.9ml的竞争细胞的辅助物，NZY+介质，并在37℃下振荡1小时。

将上述的培养基涂片到LB琼脂介质上。琼脂介质中已事先加入了一定量的安必西林以调节其最终浓度为100μg/ml。然后在37℃下保持20小时以形成菌落。

从菌落中挑选出5种克隆。这些菌落是通过将每种细胞群环种植到100ml含50μg/ml的Am的LB介质中并在37℃下振荡培养形成的。将培养基以13,000rpm速度离心10分钟以得到细胞群，然后将之悬浮于20ml的100mM的二羟甲基氨基甲烷氯化氢缓冲液(pH值为8.0)中。再将此悬浮液以13,000rpm速度离心10分钟以得到细胞群，然后再将之悬浮于2ml的含100mM的二羟甲基氨基甲烷氯化氢缓冲液(pH值为8.0)和10mM的1-磷酸-2’-脱氧核糖二单环己铵盐(2’-deoxyribose-1-phosphate di(monocyclohexylammonium)salt)(SIGMA产)(如例4所述处理)的混合液中，进行例5中的合成脱氧胞嘧啶核苷的反应。对脱氧胞嘧啶核苷的HPLC分析得知：5种克隆中有4种产生了脱氧胞嘧啶核苷，因此它们具有胞嘧啶核苷磷酸化酶活性。

取1ml分析完胞嘧啶核苷磷酸化酶活性后剩余的以上培养基，从中分离出以上的4种克隆的细胞群。通过碱性SDS萃取从细胞群中得到以上每种克隆的质粒DNA。并用一般的确定碱基序列的方法对DNA片段的碱基序列进行了测定。酶活性通过例1中的方法测定。结果见表8。

[表6]

模板质粒	2μl(5μg/ml)
模板质粒	2μl(5μg/ml)	引物(敏感链)	1.25μl(100μg/ml)
引物(抗敏感链)	1.25μl(100μg/ml)	引物(敏感链)	1.25μl(100μg/ml)
引物(抗敏感链)	1.25μl(100μg/ml)	加入的缓冲液	5μl
加入的dNTP	1μl(5μg/ml)	加入的缓冲液	5μl
加入的dNTP	1μl(5μg/ml)	水	39.5μl
酶	1μl	水	39.5μl

[表7]

循环	温度	周期
循环	温度	周期	1	95℃	30秒
2	95℃	30秒	1	95℃	30秒
2	95℃	30秒	3	55℃	1分钟
4	68℃	6分钟，然后回到循环2(12次)	3	55℃	1分钟

[表8]

获得基因的碱基序列和其活性

氨基酸序号	天然碱基	天然氨基酸	改变的碱基	改变的氨基酸	活性
氨基酸序号	天然碱基	天然氨基酸	改变的碱基	改变的氨基酸	活性	10	atg	蛋氨酸(methionine)	gca	丙胺酸(alanine)	+
16	gta	缬氨酸(valine)	gca	丙胺酸(alanine)	+	10	atg	蛋氨酸(methionine)	gca	丙胺酸(alanine)	+
16	gta	缬氨酸(valine)	gca	丙胺酸(alanine)	+	42	aac	精氨酸(arginine)	ctg	亮氨酸(leucine)	+
54	aaa	赖氨酸(lysine)	tcc	丝氨酸(serine)	+	42	aac	精氨酸(arginine)	ctg	亮氨酸(leucine)	+
54	aaa	赖氨酸(lysine)	tcc	丝氨酸(serine)	+	67	atc	异亮氨酸(isoleucine)	ctg	亮氨酸(leucine)	+
74	acc	苏氨酸(threonine)	gcc	丙胺酸(alanine)	+	67	atc	异亮氨酸(isoleucine)	ctg	亮氨酸(leucine)	+
74	acc	苏氨酸(threonine)	gcc	丙胺酸(alanine)	+	104	gtc	缬氨酸(valine)	atc	异亮氨酸(isoleucine)	+
135	gtg	缬氨酸(valine)	atg	蛋氨酸(methionine)	+	104	gtc	缬氨酸(valine)	atc	异亮氨酸(isoleucine)	+
135	gtg	缬氨酸(valine)	atg	蛋氨酸(methionine)	+	157	gct	丙胺酸(alanine)	tcc	丝氨酸(serine)	+
167	atg	蛋氨酸(methionine)	acg	苏氨酸(threonine)	+	157	gct	丙胺酸(alanine)	tcc	丝氨酸(serine)	+
167	atg	蛋氨酸(methionine)	acg	苏氨酸(threonine)	+	168	ttc	苯基丙胺酸(phenylalanine)	tcc	丝氨酸(serine)	+
178	ggc	氨基乙酸(glycine)	gca	丙胺酸(alanine)	+	168	ttc	苯基丙胺酸(phenylalanine)	tcc	丝氨酸(serine)	+
178	ggc	氨基乙酸(glycine)	gca	丙胺酸(alanine)	+	179	gtg	缬氨酸(valine)	acc	苏氨酸(threonine)	+
183	gcg	丙胺酸(alanine)	tcc	丝氨酸(serine)	+	179	gtg	缬氨酸(valine)	acc	苏氨酸(threonine)	+
183	gcg	丙胺酸(alanine)	tcc	丝氨酸(serine)	+	199	acc	苏氨酸(threonine)	gca	丙胺酸(alanine)	+
204	tct	丝氨酸(serine)	ttt	苯基丙胺酸(phenylalanine)	+	199	acc	苏氨酸(threonine)	gca	丙胺酸(alanine)	+
204	tct	丝氨酸(serine)	ttt	苯基丙胺酸(phenylalanine)	+	210	cac	组氨酸(histidine)	ctg	亮氨酸(leucine)	+
228	atc	异亮氨酸(isoleucine)	tcc	丝氨酸(serine)	+	210	cac	组氨酸(histidine)	ctg	亮氨酸(leucine)	+
228	atc	异亮氨酸(isoleucine)	tcc	丝氨酸(serine)	+	233	gtt	缬氨酸(valine)	ctg	亮氨酸(leucine)	+

参考例3：(大肠杆菌菌株K-12 W3110的转化)

大肠杆菌菌株K-12 W3110(ATCC27325)被参考例2中得到的质粒pUC-PNP73所转化。得到的转化体命名为MT-10948。当此转化体在参考实施例2中培养时，它的活性相当于大肠杆菌菌株K-12DH5α转化体的活性的两倍。

实施例14：(用极性溶剂产生沉淀，以去除反应抑制因子)

在参考实施例2中培养的MT-10948菌株的细胞群被超声破坏器破坏。向破坏液中加入与等体积的丙酮，然后离心去除沉淀物。

将收集到的沉淀物用真空干燥剂干燥。将干燥的沉淀物溶于2ml的100mM的二羟甲基氨基甲烷氯化氢缓冲液(pH值为8.0)和10mM的1-磷酸-2’-脱氧核糖二单环己铵盐(2’-deoxyribose-1-phosphatedi(monocyclohexylammonium)salt)(SIGMA产)的混合液中，然后按照实施例4中的方法进行处理。向2ml用丙酮分馏得到的酶溶液中加入105.3g水，并和6.96g胞嘧啶，18.7g 1-磷酸-2’-脱氧核糖二铵盐和6.2g氢氧化镁一起在50℃下反应24小时。反应后的HPLC分析证实了有11.4g(80％)的2’-脱氧胞嘧啶核苷生成。为了比较，另取2ml未加入丙酮的酶溶液，也进行类似的反应，结果生成了8.5g(60％)的2’-脱氧胞嘧啶核苷。

实施例15：(用硫酸铵产生沉淀，以去除反应抑制因子)

在参考例2中培养的MT-10948菌株的细胞群被超声破坏器破坏。

将研磨碎的硫酸铵缓缓加入到破坏液中，以便最后得到40％的饱和溶液。在冰中缓缓搅拌此溶液1小时后，离心去除沉淀物。类似的，将研磨碎的硫酸铵缓缓加入到离心得到的上层清液中，最后得到70％的饱和溶液。再在冰中缓缓搅拌此溶液1小时后，离心获得沉淀物。将此沉淀物溶于2ml的100mM的二羟甲基氨基甲烷氯化氢缓冲液(pH值为8.0)和10mM 的1-磷酸-2’-脱氧核糖二单环己铵盐(2’-deoxyribose-1-phosphate di(monocyclohexylammonium)salt)(SIGMA产)的混合液中，然后按照实施例4中的方法进行处理并按照实施例14进行脱氧胞嘧啶核苷的合成反应。结果，生成了11.0g(80％)的2’-脱氧胞嘧啶核苷。

实施例16：(反应抑制因子的去除：实施例8中的纯净的酶)

2ml实施例8中获得的酶被用于实施例14中的脱氧胞嘧啶核苷的合成反应。结果，生成了11.0g(80％)的2’-脱氧胞嘧啶核苷。

实施例17：(缺乏phoA的菌株的影响)

2ml实施例4中获得的细胞群悬浮液被用于实施例14中的相同反应。结果，生成了11.0g(80％)的2’-脱氧胞嘧啶核苷。另一方面，当菌株MT-10948按照实施例4中的方法处理后，它的活性是MT-10905菌株活性的两倍。但是当用这种菌株进行例14中的反应时，只有8.5g(60％)的2’-脱氧胞嘧啶核苷生成。

实施例18：

在96.4g水和4.8g环己烷的混合溶剂中，加入6.96g(62.6mmol)胞嘧啶，18.7g(75.4mmol)1-磷酸-2’-脱氧核糖二铵盐，7.58g(132mmol)氢氧化镁和2.0g参考实施例3中制得的冷冻的细胞群。反应在45℃下进行18小时，并用乙酸控制反应液的pH值为8.8。反应后的HPLC分析证明了有10.03g(70.5mol％/胞嘧啶)目标化合物2’-脱氧胞嘧啶核苷生成。同时，还分别有0.73g(10.4mol％/胞嘧啶)尿嘧啶和1.80g(12.6mol％/胞嘧啶)2’-脱氧尿嘧啶核苷生成。

实施例19

在与实施例18相同的条件下进行2’-脱氧胞嘧啶核苷的合成反应，但用于处理细胞群的溶剂和/或在反应中加入的溶剂与实施例18中的不同。结果见表9和10。

[表9]

实施例19

[表10]

对比实施例

实施例20：2’-脱氧胞嘧啶核苷的合成

在20g纯净水中加入20ml(完全交换能力24mmol)强碱性阴离子交换树脂(Levatit MP500：交换能力1.1eq/L)和4.96g(20mmol)1-磷酸-2-脱氧核糖二铵盐。在室温下搅拌此混合物30分钟。然后，向其中加入0.5ml例4中制备的酶溶液和2.11g(19mmol)胞嘧啶，并在50℃下搅拌10小时。对反应混合物的HPLC分析得出，目标化合物2’-脱氧胞嘧啶核苷的产率为80％。

由于一种核苷磷酸化酶的使用，可使生成核苷化合物的反应在温和的条件下进行，并且该反应具有区域和立体选择性。因此希望获得一种至今还未得到的此类化合物的工业生产的方法。本发明提供了一种由1-磷酸戊糖与胞嘧啶或其衍生物在对胞嘧啶有活性的核苷磷酸化酶作用下，生成胞嘧啶核苷化合物的方法。本发明还提供了一种方法，用以专门减小降解底物或产物的物质的活性，从而能够有效地获得胞嘧啶核苷化合物。

序列表

<110>三井化学株式会社

<120>一种制备胞嘧啶核苷化合物的方法

<130>MCI02P083

<160>46

<210>1

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用作PCR的引物来克隆大肠杆菌K-12的嘌呤核苷磷酸化酶的低聚核苷酸

<400>1

gtgaattcac aaaaaggata aaacaatggc 30

<210>2

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<400>2

tcgaagcttg cgaaacacaa ttactcttt 29

<210>3

<211>720

<212>DNA

<213>大肠杆菌

<400>3

atggctaccc cacacattaa tgcagaaatg ggcgatttcg ctgacgtagt tttgatgcca 60

ggcgacccgc tgcgtgcgaa gtatattgct gaaactttcc ttgaagatgc ccgtgaagtg 120

aacaacgttc gcggtatgct gggcttcacc ggtacttaca aaggccgcaa aatttccgta 180

atgggtcacg gtatgggtat cccgtcctgc tccatctaca ccaaagaact gatcaccgat 240

ttcggcgtga agaaaattat ccgcgtgggt tcctgtggcg cagttctgcc gcacgtaaaa 300

ctgcgcgacg tcgttatcgg tatgggtgcc tgcaccgatt ccaaagttaa ccgcatccgt 360

tttaaagacc atgactttgc cgctatcgct gacttcgaca tggtgcgtaa cgcagtagat 420

gcagctaaag cactgggtat tgatgctcgc gtgggtaacc tgttctccgc tgacctgttc 480

tactctccgg acggcgaaat gttcgacgtg atggaaaaat acggcattct cggcgtggaa 540

atggaagcgg ctggtatcta cggcgtcgct gcagaatttg gcgcgaaagc cctgaccatc 600

tgcaccgtat ctgaccacat ccgcactcac gagcagacca ctgccgctga gcgtcagact 660

accttcaacg acatgatcaa aatcgcactg gaatccgttc tgctgggcga taaagagtaa 720

<210>4

<211>239

<212>PRT

<213>大肠杆菌

<300>

<400>4

Met Ala Thr Pro His Ile Asn Ala Glu Met Gly Asp Phe Ala Asp Val

1 5 10 15

Val Leu Met Pro Gly Asp Pro Leu Arg Ala Lys Tyr Ile Ala Glu Thr

20 25 30

Phe Leu Glu Asp Ala Arg Glu Val Asn Asn Val Arg Gly Met Leu Gly

35 40 45

Phe Thr Gly Thr Tyr Lys Gly Arg Lys Ile Ser Val Met Gly His Gly

50 55 60

Met Gly Ile Pro Ser Cys Ser Ile Tyr Thr Lys Glu Leu Ile Thr Asp

65 70 75 80

Phe Gly Val Lys Lys Ile Ile Arg Val Gly Ser Cys Gly Ala Val Leu

85 90 95

Pro His Val Lys Leu Arg Asp Val Val Ile Gly Met Gly Ala Cys Thr

100 105 110

Asp Ser Lys Val Asn Arg Ile Arg Phc Lys Asp His Asp Phe Ala Ala

115 120 125

Ile Ala Asp Phe Asp Met Val Arg Asn Ala Val Asp Ala Ala Lys Ala

130 135 140

Leu Gly Ile Asp Ala Arg Val Gly Asn Leu Phe Ser Ala Asp Leu Phe

145 150 155 160

Tyr Ser Pro Asp Gly Glu Met Phe Asp Val Met Glu Lys Tyr Gly Ile

165 170 175

Leu Gly Val Glu Met Glu Ala Ala Gly Ile Tyr Gly Val Ala Ala Glu

180 185 190

Phe Gly Ala Lys Ala Leu Thr Ile Cys Thr Val Sar Asp His Ile Arg

195 200 205

Thr His Glu Gln Thr Thr Ala Ala Glu Arg Gln Thr Thr Phe Asn Asp

210 215 220

Met Ile Lys Ile Ala Leu Glu Ser Val Leu Leu Gly Asp Lys Glu

225 230 235

<210>5

<211>42

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用作PCR的引物的低聚核苷酸

<400>5

cattattttc aaaaaggggg atttattatg gctaccccac ac 42

<210>6

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用作PCR的引物的低聚核苷酸

<400>6

cagaagcttg cgaaacacaa ttac 24

<210>7

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用作PCR的引物的低聚核苷酸

<400>7

tttgaattcc ttagtgcttt catagattaa act 33

<210>8

<211>42

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用作PCR的引物的低聚核苷酸

<400>8

ttctgcatta atgtgtgggg tagccataat aaatccccct tt 42

<210>9

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用作PCR的引物的低聚核苷酸

<400>9

ccacacatta atgcagaagc aggcgatttc gct 33

<210>10

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用作PCR的引物的低聚核苷酸

<400>10

agcgaaatcg cctgcttctg cattaatgtg tgg 33

<210>11

<211>41

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用作PCR的引物的低聚核苷酸

<400>11

cttgaagatg cccgtgaagt gaacctggtt cgcggtatgc t 41

<210>12

<211>41

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用作PCR的引物的低聚核苷酸

<400>12

agcataccgc gaaccaggtt cacttcacgg gcatcttcaa g 41

<210>13

<211>42

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用作PCR的引物的低聚核苷酸

<400>13

ctgggcttca ccggtactta ctccggccgc aaaatttccg ta 42

<210>14

<211>42

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用作PCR的引物的低聚核苷酸

<400>14

tacggaaatt ttgcggccgg agtaagtacc ggtgaagccc ag 42

<210>15

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用作PCR的引物的低聚核苷酸

<400>15

atgggtcacg gtatgggtct gccgtcctgc tccatctaca 40

<210>16

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用作PCR的引物的低聚核苷酸

<400>16

tgtagatgga gcaggacggc agacccatac cgtgacccat 40

<210>17

<211>42

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用作PCR的引物的低聚核苷酸

<400>17

cgcgtgggta acctgttctc ctccgacctg ttctactctc cg 42

<210>18

<211>42

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用作PCR的引物的低聚核苷酸

<400>18

cggagagtag aacaggtcgg aggagaacag gttacccacg cg 42

<210>19

<211>42

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用作PCR的引物的低聚核苷酸

<400>19

atggaaaaat acggcattct cgcagtggaa atggaagcgg ct 42

<210>20

<211>42

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用作PCR的引物的低聚核苷酸

<400>20

agccgcttcc atttccactg cgagaatgcc gtatttttcc at 42

<210>21

<211>41

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用作PCR的引物的低聚核苷酸

<400>21

aaatacggca ttctcggcac cgaaatggaa gcggctggta t 41

<210>22

<211>41

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>22

ataccagccg cttccatttc ggtgccgaga atgccgtatt t 41

<210>23

<211>42

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

用作PCR的引物的低聚核苷酸

<223>

<400>23

gtatctgacc acatccgcac tctggagcag accactgccg ct 42

<210>24

<211>42

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用作PCR的引物的低聚核苷酸

<400>24

agcggcagtg gtctgctcca gagtgcggat gtggtcagat ac 42

<210>25

<211>42

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用作PCR的引物的低聚核苷酸

<400>25

accttcaacg acatgatcaa atccgcactg gaatccgttc tg 42

<210>26

<211>42

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用作PCR的引物的低聚核苷酸

<400>26

cagaacggat tccagtgcgg atttgatcat gtcgttgaag gt 42

<210>27

<211>41

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用作PCR的引物的低聚核苷酸

<400>27

atcaaaatcg cactggaatc cctgctgctg ggcgataaag a 41

<210>28

<211>41

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用作PCR的引物的低聚核苷酸

<400>28

tctttatcgc ccagcagcag ggattccagt gcgattttga t 41

<210>29

<211>42

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用作PCR的引物的低聚核苷酸

<400>29

attctcggcg tggaaatgga atccgctggt atctacggcg tc 42

<210>30

<211>42

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用作PCR的引物的低聚核苷酸

<400>30

gacgccgtag ataccagcgg attccatttc cacgccgaga at 42

<210>31

<211>42

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用作PCR的引物的低聚核苷酸

<400>31

gaatttggcg cgaaagccct ggcaatctgc accgtatctg ac 42

<210>32

<211>42

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用作PCR的引物的低聚核苷酸

<400>32

gtcagatacg gtgcagattg ccagggcttt cgcgccaaat tc 42

<210>33

<211>39

<212>DNA

<213>

人工序列

<220>

<223>用作PCR的引物的低聚核苷酸

<400>33

tactctccgg acggcgaaac gttcgacgtg atggaaaaa 39

<210>34

<211>39

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用作PCR的引物的低聚核苷酸

<400>34

tttttccatc acgtcgaacg tttcgccgtc cggagagta 39

<210>35

<211>39

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用作PCR的引物的低聚核苷酸

<400>35

tctccggacg gcgaaatgtc cgacgtgatg gaaaaatac 39

<210>36

<211>39

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用作PCR的引物的低聚核苷酸

<400>36

gtatttttcc atcacgtcgg acatttcgcc gtccggaga 39

<210>37

<211>36

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用作PCR的引物的低聚核苷酸

<400>37

ggcgatttcg ctgacgcagt tttgatgcca ggcgac 36

<210>38

<211>36

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用作PCR的引物的低聚核苷酸

<400>38

gtcgcctggc atcaaaactg cgtcagcgaa atcgcc 36

<210>39

<211>36

<212>DNA

<213>Art

<220>

<223>用作PCR的引物的低聚核苷酸

<400>39

accatctgca ccgtatttga ccacatccgc actcac 36

<210>40

<211>36

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用作PCR的引物的低聚核苷酸

<400>40

gtgagtgcgg atgtggtcaa atacggtgca gatggt 36

<210>41

<211>36

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用作PCR的引物的低聚核苷酸

<400>41

ccgtcctgct ccatctacgc caaagaactg atcacc 36

<210>42

<211>36

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用作PCR的引物的低聚核苷酸

<400>42

ggtgatcag ttctttggcgt agatggagca ggacgg 36

<210>43

<211>36

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用作PCR的引物的低聚核苷酸

<400>43

atcgctgact tcgacatgat gcgtaacgca gtagat 36

<210>44

<211>36

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用作PCR的引物的低聚核苷酸

<400>44

atctactgcg ttacgcatca tgtcgaagtc agcgat 36

<210>45

<211>36

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用作PCR的引物的低聚核苷酸

<400>45

gtaaaactgc gcgacatcgt tatcggtatg ggtgcc 36

<210>46

<211>36

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用作PCR的引物的低聚核苷酸

<400>46

ggcacccata ccgataacga tgtcgcgcag ttttac 36

Claims

1.制备胞嘧啶核苷化合物的方法，其特征在于包含用磷酸糖与胞嘧啶或胞嘧啶衍生物在一种具有氨基酸序列SEQ ID NO：4的具有胞嘧啶核苷磷酸化酶活性的酶的作用下反应生成胞嘧啶核苷化合物的步骤，其中没有胞嘧啶脱氨酶和胞嘧啶核苷脱氨酶的活性或者胞嘧啶脱氨酶和胞嘧啶核苷脱氨酶的活性被减小，这样通过胞嘧啶核苷磷酸化酶的活性能够获得胞嘧啶核苷化合物的情况下，其中所述胞嘧啶衍生物为式(I)表示的化合物：

其中，X为碳或氮，Y为氢，卤素或低链的烷基。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的酶具有嘌呤核苷磷酸化酶的活性。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述的酶由大肠杆菌制得。

4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述的磷酸糖为1-磷酸核糖、1-磷酸-2-脱氧核糖、1-磷酸-2′，3′-二脱氧核糖或磷酸二氧戊环糖。

5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述的磷酸糖为1-磷酸核糖、1-磷酸-2-脱氧核糖、1-磷酸-2′，3′-二脱氧核糖或磷酸二氧戊环糖。

6.根据权利要求1、2、5中任一项所述的方法，其特征在于所述的酶活性是由具有胞嘧啶核苷磷酸化酶活性的细菌群提供的，或者是由从细菌群或其培养基得到的酶制剂提供的。

7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述的酶活性是由具有胞嘧啶核苷磷酸化酶活性的细菌群提供的，或者是由从细菌群或其培养基得到的酶制剂提供的。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的酶活性是由具有胞嘧啶核苷磷酸化酶活性的细菌群提供的，或者是由从细菌群或其培养基得到的酶制剂提供的。

9.根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述的酶活性是由具有胞嘧啶核苷磷酸化酶活性的细菌群提供的，或者是由从细菌群或其培养基得到的酶制剂提供的。

10.一种胞嘧啶核苷磷酸化酶，通过用不同氨基酸来代替氨基酸序列SED ID NO：4中的一个或几个氨基酸来制备，被代替的氨基酸对应于SED ID NO：4中的NO.10，NO.16，NO.42，NO.54，NO.67，NO.74，NO.104，NO.135，NO.157，NO.167，NO.168，NO.178，NO.179，NO.183，NO.199，NO.204，NO.210，NO.228或NO.233。

11.重组质粒，其含有编码了权利要求10的胞嘧啶核苷磷酸化酶的基因。

12.转化菌株，其载有权利要求11的重组质粒。

13.一种制备胞嘧啶核苷磷酸化酶的方法，其中根据权利要求11所述的转化菌株是经过培养过的，并从培养的转化菌株、培养液和其加工物中收集得到胞嘧啶核苷磷酸化酶。