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CN1285640C - 聚羟基链烷酸酯的分子量控制方法 - Google Patents

聚羟基链烷酸酯的分子量控制方法 Download PDF

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CN1285640C CNB031068049A CN03106804A CN1285640C CN 1285640 C CN1285640 C CN 1285640C CN B031068049 A CNB031068049 A CN B031068049A CN 03106804 A CN03106804 A CN 03106804A CN 1285640 C CN1285640 C CN 1285640C
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Abstract

提供了一种含至少一种如下单元的聚羟基链烷酸酯的分子量控制方法：单元-[OCH((CH2)mR1)CH2C(O)]-(m＝1-8)；R1是带有苯基结构或噻吩结构的任一种环结构的残基；和单元-[OCH((CH2)kC6H10R2)CH2C(O)]-(k＝0-8)；R2表示环己基上的取代基，包括H原子、CN基、NO2基、卤原子、CH3基、C2H5基、C3H7基、CF3基、C2F5基或C3F7基；其中在含羟基化合物存在下培养能够由如下化合物生产聚羟基链烷酸酯的微生物：R3(CH2)qCH2CH2COOH(q＝1-8；R3含有带有苯基或噻吩基环结构的残基)或R4C6H10(CH2)rCH2CH2COOH(r＝0-8；R4表示环己基上的取代基，包括H、CN、NO2、卤素、CH3、C2H5、C3H7、CF3、C2F5或C3F7)。

Description

聚羟基链烷酸酯的分子量控制方法
技术领域
本发明涉及作为聚酯的一种的聚羟基链烷酸酯(PHA)的分子量控制方法。更详细地讲，涉及使用生产该PHA并储存在菌体内的微生物的该PHA的分子量控制方法。
背景技术
过去，报道了许多的微生物生产聚-3-羟基丁酸(PHB)或其他的PHA并储存在菌体内的研究(生物降解性塑料手册，生物降解性塑料研究会编，N.T.S.公司，P178-197(1995))。这些的聚合物与过去的塑料同样地可利用熔融加工等生产各种制品。此外，由于是生物降解性，具有可在自然界利用微生物完全降解的优点，不象过去众多的合成高分子化合物那样残留在自然环境中，不会引起污染。另外，对生物体适合性也好，期待着作为医疗用软质部件材料等的应用。
众所周知，这样的微生物生产的PHA，根据其生产使用的微生物的种类或培养基组成、培养条件等的不同，可获得各种组成或结构的PHA。过去主要从改进PHA物性的观点出发，研究了有关这样的组成或结构的控制。
微生物生产的PHA从其生物合成机理考虑，大致可分成2类。一类是聚羟基丁酸(PHB)、聚羟基戊酸(PHV)、或这些的共聚物所代表的短链长PHA(short-chain-length PHA；以下称scl-PHA)，另一类是碳链长6～14左右的中链长3-羟基链烷酸为单元的中链长PHA(medium-chain-length PHA；以下称mcl-PHA)。
前者，即scl-PHA是称为葡萄糖或葡糖酸的糖类、或称为乳酸、丙酮酸、苹果酸的有机酸类在微生物体内代谢的产物即乙酸基Co A为起始物质，由酶二聚化，经还原作用而聚合物化。
后者，即mcl-PHA，以链烷酸为起始物质，经作为脂肪酸分解体系的β氧化路线由酶经辅酶A加成、脱氢化、水加成反应而聚合物化。
这样，经详细研究搞清了两类经完全不同的生物合成路线而合成聚合物，实际生物体内的酶群也不同。
另外，众知，后者即生产mcl-PHA的微生物中，某种的微生物生产含各种官能基、残基的PHA。
其中，近年单元中有芳香环的PHA的研究相当活跃。
Makromol.Chem.，191，1957-1965(1990)及Macromolecules，24，5256-5260(1991)，报道了5-苯基戊酸为底物，食油假单胞菌(Pseudomonas oleovorans)生产含3-羟基-5-苯基戊酸作为单元的PHA。
Macromolecules，29，1762-1766(1996)，报道了5-(4’-甲苯基)戊酸为底物，食油假单胞菌生产含3-羟基-5-(4’-甲苯基)戊酸作为单元的PHA。
Macromolecules，32，2889-2895(1999)，报道了5-(2’，4’-二硝基苯基)戊酸为底物，食油假单胞菌生产含3-羟基-5-(2’，4’-二硝基苯基)戊酸及3-羟基-5-(4’-硝基苯基)戊酸作为单元的PHA。
Macromol.Chem.Phys.，195，1665-1672(1994)，报道了11-苯氧基十一烷酸为底物，食油假单胞菌生产3-羟基-5-苯氧基戊酸与3-羟基-9-苯氧基壬酸的PHA共聚物。
特许公报第2989175号公开了有关由3-羟基、5-(一氟苯氧基)戊酸酯(3H5(MFP)P)单元或3-羟基、5-(二氟苯氧基)戊酸酯(3H5(DFP)P)单元组成的均聚物、至少含3H5(MFP)P单元或3H5(DFP)P单元的共聚物；合成这些聚合物的恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)；使用假单胞菌属的前述聚合物的制造法，作为其效果，将具有取代基的长链脂肪酸资源化，可合成侧链末端有1～2个的氟原子取代的苯氧基的聚合物，不仅熔点高，而且保持良好的加工性，赋予立体规整性、疏水性。
除这样的氟基取代体以外，也研究了氰基或硝基的取代体。
Can.J.Microbiol.，41，32-43(1995)及Polymer International，39，205-213(1996)，报道了用食油假单胞菌ATCC 29347菌株及恶臭假单胞菌KT2442菌株，以辛酸和对-氰基苯氧基己酸或对硝基苯氧基己酸为底物，生产含3-羟基-对-氰基苯氧基己酸或3-羟基-对-硝基苯氧基己酸作为单体单元的PHA。
另外，作为新的种类，Macromolecules，32，8315-8318(1999)及Polymer Preprints，日本，49(5)，1034(2000)，报道了恶臭假单胞菌27N01菌株以11-硫代苯氧基戊酸为底物，生产3-羟基-5-硫代苯氧基戊酸及3-羟基-7-硫代苯氧基庚酸的PHA共聚物。
从这样的PHA在实用时扩大应用范围的意义考虑，探索了控制分子量的方法。
美国专利6,156,852公开了用Ralstonia eutropha，Ralstonialatus及Comamonas testosteroni作为生产菌种，通过在生物合成PHB时的培养基中加入乙二醇、新戊二醇、丙二醇、丁二醇或己二醇、辛二醇之类的二醇类；丁三醇、聚丙二醇、丙三醇、对苯二酚、苯二甲醇、季戊四醇及其衍生物；山梨糖醇或甘露糖醇之类的糖醇类；可降低数均分子量。这些的内容在化学论文Biotechnology andBioengineering，62，106-113(1999)及International Journal ofBiological Macromolecules，25，43-53(1999)中已详细报道。
这样的分子量控制技术，具有不用酸或碱之类的化学物质、在生物合成PHA工艺中进行的优点。如前所述，有苯基等官能基的PHA，从扩大其实用用途范围的意义考虑，虽然要求分子量的控制技术，但迄今没有开发出这样的技术。
发明内容
本发明提供分子中含有侧链含带有苯基结构、噻吩基结构、环己基结构的残基的单元的聚羟基链烷酸酯的分子量控制方法。
本发明人为了解决上述的课题潜心研究的结果，完成了以下的发明。即，本发明是分子中含化学式(1)表示的3-羟基-ω-取代链烷酸单元或一般式(2)表示的3-羟基-ω-环己基链烷酸单元之中任一种以上的聚羟基链烷酸酯的分子量控制方法，
化学式(1)：
Figure C0310680400111
(m是从化学式中表示的范围内选出的整数；R1是带有苯基结构或噻吩基结构的任一环结构的残基；多个的单元存在时，m与R1在每个单元中独立地表示上述的意思)
一般式(2)：
Figure C0310680400112
(式中，R2表示环己基上的取代基，R2是H原子、CN基、NO2基、卤原子、CH3基、C2H5基、C3H7基、CF3基、C2F5基或C3F7基；k是化学式表示的范围内选出的整数；多个的单元存在时，在每个单元中独立地表示上述的意思)
在特征在于，在含有化学式(3)表示的ω-取代链烷酸或一般式(4)表示的ω-环己基链烷酸之中任一种以上，和其有羟基的化合物的条件下，培养能由化学式(3)或(4)表示的化合物生产分子中含化学式(1)或(2)表示的单元之中任一种以上单元的聚羟基链烷酸酯的微生物。
化学式(3)：
Figure C0310680400121
(q是从化学式表示的范围内选出的整数；R3是带有苯基结构或噻吩茎结构的任一种环结构的残基；多个的单元存在时，q与R3在每个单元中独立地表示上述的意思)
一般式(4)：
Figure C0310680400122
(式中，R4表示环己基上的取代基，R4是H原子、CN基、NO2基、卤原子、CH3基、C2H5基、C3H7基、CF3基、C2F5基或C3F7基；r是从化学式表示的范围内选出的整数；多个的单元存在时，在每个单元中独立地表示上述的意思)
这里，若更详细地叙述化学式(1)与(3)中的R1与R3，即有苯基结构或噻吩基结构的残基，则是化学式(5)表示的未取代或取代苯基；一般式(6)表示的未取代或取代苯氧基；一般式(7)表示的未取代或取代苯甲酰基；一般式(8)表示的未取代或取代苯硫基；一般式(9)表示的未取代或取代(苯基甲基)硫基；式(10)表示的2-噻吩基；式(11)表示的2-噻吩硫基；式(12)表示的2-噻吩羰基；一般式(13)表示的未取代或取代苯亚磺酰基(只R1时)；一般式(14)表示的未取代或取代苯磺酰基(只R1时)；式(15)表示的(苯甲基)氧基；所表示的残基。
化学式(5)：
Figure C0310680400131
(式中，R5表示芳香环上的取代基，R5是H原子、卤原子、CN基、NO2基、CH3基、C2H5基、C3H7基、乙烯基、COOR51(R51表示H原子、Na原子、K原子的任一种，只R1时)、CF3基、C2F5基或C3F7基；多个的单元存在时，在每个单元中独立地表示上述的意思)
一般式(6)：
Figure C0310680400132
(式中，R6表示芳香环上的取代基，R6是H原子、卤原子、CN基、NO2基、CH3基、C2H5基、C3F7基、SCH3基、CF3基、C2F5基或C3F7基；多个的单元存在时，在每个单元中独立地表示上述的意思)
一般式(7)：
(式中，R7表示芳香环上的取代基，R7是H原子、卤原子、CN基、NO2基、CH3基、C2H5基、C3H7基、CF3基、C2F5基或C3F7基；多个的单元存在时，在每个单元中独立地表示上述的意思)
一般式(8)：
(式中，R8表示芳香环上的取代基，R8是H原子、卤原子、CN基、NO2基、COOR81、SO2R82(R81表示H、Na、K、CH3、C2H5的任一种，R82表示OH、ONa、OK、卤原子、OCH3、OC2H5的任一种)、CH3基、C2H5基、C3F7基；(CH3)2-CH基或(CH3)3-C基；多个单元存在时，在每个单元中独立地表示上述的意思)
一般式(9)：
Figure C0310680400141
(式中，R9表示芳香环上的取代基，R9是H原子、卤原子、CN基、NO2基、COOR91、SO2R92(R91表示H、Na、K、CH3、C2H5的任一种，R92表示OH、ONa、OK、卤原子、OCH3、OC2H5的任一种)、CH3基、C2H5基、C3H7基；(CH3)2-CH基或(CH3)3-C基；多个的单元存在时，在各单元中独立地表示上述的意思)
式(10)
Figure C0310680400142
式(11)
Figure C0310680400143
式(12)
Figure C0310680400144
一般式(13)：
(式中，R13表示芳香环上的取代基，R13是H原子、卤原子、CN基、NO2基、COOR131、SO2R132(R131表示H、Na、K、CH3、C2H5的任一种，R132表示OH、ONa、OK、卤原子、OCH3、OC2H5的任一种)、CH3基、C2H5基、C3H7基、(CH3)2-CH基或(CH3)3-C基；多个单元存在时，在每个单元中独立地表示上述的意思)
一般式(14)：
Figure C0310680400151
(式中，R14表示芳香环上的取代基，R14是H原子、卤原子、CN基、NO2基、COOR141、SO2R142(R141表示H、Na、K、CH3、C2H5的任一种，R142表示OH、ONa、OK、卤原子、OCH3、OC2H5的任一种)、CH3基、C2H5基、C3H7基、(CH3)2-CH基或(CH3)3-C基；多个单元存在时，在每个单元中独立地表示上述的意思)
式(15)：
另外，有羟基的化合物是从醇类、二醇类、三醇类、亚烷基二醇类、聚乙二醇类、聚环氧乙烷类、亚烷基二醇单酯类、聚乙二醇单酯类、聚环氧乙烷单酯类化合物中选出的至少一种，若更详细地叙述，则如下。即，
醇类、二醇类及三醇类化合物是C3～C14的直链及支链醇、二醇、三醇。
亚烷基二醇类及亚烷基二醇单酯类化合物的碳链是具有C2～C10的直链及支链结构的化合物。
聚乙二醇类、聚环氧乙烷类、聚乙二醇单酯类、聚环氧乙烷单酯类化合物的数均分子量是100～20000的范围。
这样的具有羟基的化合物的浓度，相对于培养微生物时的培养基，优选添加0.01％～10％(W/V)，更优选添加0.02％～5％(W/V)，添加次数和时期可采用在培养初期一次添加的方法、在培养期间分几次添加在培养基中的方法的任一种。
另外，本发明的方法用的微生物，是能由化学式(3)或(4)生产分子中含化学式(1)或(2)之中任一种以上的聚羟基链烷酸酯的微生物。
另外，本发明的聚羟基链烷酸酯是分子中含化学式(16)表示的3-羟基-ω-取代链烷酸单元或一般式(17)表示的3-羟基-ω-环己基链烷酸单元之中任一种以上的聚羟基链烷酸酯。
化学式(16)：
Figure C0310680400161
(m是从化学式中表示的范围内选出的整数；R1是前述化学式(1)的定义，优选是选自化学式(5)-(15)的残基；多个单元存在时，m与R1在每个单元中独立地表示上述的意思；R16是醇类、二醇类、三醇类、亚烷基二醇类、聚乙二醇类、聚环氧乙烷类、亚烷基二醇单酯类、聚乙二醇单酯类、聚环氧乙烷单酯类衍生的基团)
一般式(17)：
Figure C0310680400162
(式中，R2表示环己基上的取代基，R2是H原子、CN基、NO2基、卤原子、CH3基、C2H5基、C3H7基、CF3基、C2F5基或C3F7基；k是从化学式中表示的范围内选出的整数；多个单元存在时，在每个单元中独立地表示上述的意思；R17是醇类、二醇类、三醇类、亚烷基二醇类、聚乙二醇类、聚环氧乙烷类、亚烷基二醇单酯类、聚乙二醇单酯类、聚环氧乙烷单酯类衍生的基团)
这里，化学式(16)中的R1，即有苯基结构或噻吩基结构的残基，具体来讲，是选自(5)-(15)的基团。
另外，使用上述微生物对本发明来讲是必需的构成条件。即，相关背景技术公开的美国专利6,156,852、Biotechnology andBioengineering，62，106-113(1999)及International Journal ofBiological Macromolecules，25，43-53(1999)中用的微生物，不具有这样的性质，即由化学式(3)与(4)表示的化合物生产分子中含化学式(1)与(2)所示单元之中任一种以上的聚羟基链烷酸酯。
这些的特许公报与科学文献展示的微生物，据报道通常生产聚3-羟基丁酸(以下，称PHB)、聚3-羟基戊酸(以下，称PHV)的均聚物或这些的共聚物。PHB所代表的生物合成路线是：
①乙酰基辅酶A→乙酰乙酰基辅酶A
②乙酰乙酰基辅酶A→3-羟基丁基辅酶A
③3-羟基丁基辅酶A→聚3-羟基丁酸
而本发明的方法用的微生物，将化学式(3)与(4)表示的化合物导入称作(“β氧化过程”的脂肪酸分解过程中，经如下的变换生物合成分子中含化学式(1)与(2)所示单元之中任一种以上的聚羟基链烷酸酯。即经<1>～<4>所示过程生物合成聚合物。
<1>化合物(2)→酰基辅酶A
<2>酰基辅酶A→Enoyl辅酶A
<3>Enoyl辅酶A→3-羟基酰基辅酶A
<4>3-羟基酰基辅酶A→化学式(1)表示的聚羟基链烷酸酯
另外，直接用于合成聚羟基链烷酸酯的酶，众知上述③工序用的是PHB合成酶或短链长PHA合成酶，而本发明的<4>工序用的是PHA合成酶或中链长PHA合成酶，是底物特性不同的另一种酶。这些在FEMSMicrobiology Reviews，103，217-230(1992)或Jounal ofBiotechnology，65，127-161(1998)等综述论文中有详细报道。
即，相关背景技术中公开的美国专利6,156,852、Biotechnologyand Bioengineering，62，106-113(1999)及International Journalof Biological Macromolecules，25，43-53(1999)中用的微生物与本发明的方法使用的微生物完全不同。
这样，作为本发明的方法使用的微生物，只要是能由化学式(3)与(4)表示的化合物生产分子中含化学式(1)与(2)所示单元之中任一种以上的聚羟基链烷酸酯的微生物，则可以是任何的微生物，其中优选归属假单胞菌属的微生物，更详细地讲，优选菊苣假单胞菌(Pseudomonas cichorii)，恶臭假单胞菌，荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescense)，食油假单胞菌，铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginos)，司徒茨假单胞菌(Pseudomonas stutzer)，Pseudomonas jessenii等。再详细地讲，可列举PseudomoHas cichoriiYN2，FERM BP-7375；Pseudomonas cichorii H45，FERMBP-7374；Pseudomonas jessenii P161，FERM BP-7376；恶臭假单胞菌P91，FERM BP-7373。这4种微生物是保藏在独立行政法人产业技术综合研究所(原通商产业省工业技术院)生命工学工业技术研究所专利微生物保藏中心、特开2001-371863号公报所述的微生物。
本发明方法中微生物的培养条件如下。
在磷酸缓冲液及铵盐或硝酸盐为基本成分的无机盐培养基中，加入如下所示各种的必要底物及营养素。
作为用于生产目的聚羟基链烷酸酯的底物，上述化学式(2)表示的化合物的含量优选为培养基的0.01％～1％(W/V)，更优选0.02％～0.2％。
作为微生物繁殖用的碳源及氮源、聚羟基链烷酸酯生产用的能量供给源，通常以下的共存底物的含量优选为培养基的0.1％～5％(W/V)，更优选0.2％～2％。
共存底物：
天然培养基成分：酵母提取物，肉提取物、麦芽提取物、kazaminicacid、酪蛋白水解物、聚胨、胰化胨(trypton)、胨等。
·糖类：甘油醛、赤藓糖、阿拉伯糖、木糖、葡萄糖、半乳糖、甘露糖、果糖之类的醛(式)糖、
丙三醇、赤藓醇、木糖醇等糖醇、
葡糖酸等的糖酸、
葡糖醛酸、半乳糖醛酸等的糖醛酸、
麦芽糖、蔗糖、乳糖之类的二糖等。
·有机酸或其盐：丙酮酸、苹果酸、乳酸、柠檬酸、琥珀酸、草酰乙酸、异柠檬酸、氧代戊二酸、富马酸或其盐等。
·氨基酸：谷氨酸、天冬氨酸或基盐等。
·链烷酸：C4～C12的直链或支链烷酸等。
作为本发明用的培养基，只要是含磷酸盐及铵盐或硝酸盐等氮源的无机盐培养基，则可用任何的培养基，通过调节氮源的浓度可提高PHA的生产性。
作为培养温度，可以是上述菌种可良好繁殖的温度，优选15℃～37℃、更优选20℃～30℃左右。
培养只要是液体培养、固体培养等微生物繁殖生产PHA的培养方法，则可以用任何的培养方法。此外，间歇培养、间歇给料培养、半连续培养、连续培养等的种类均可使用。作为液体间歇培养的方法，有采用振荡烧瓶振荡给氧的方法、采用发酵罐搅拌通气方式供给氧的方法。
作为在微生物中生产储存PHA的方法，除了以上所示方法外，有时一旦充分繁殖后，把菌体移往如氯化铵那样的限制氮源的培养基，在加入作为目的单元底物的化合物的状态下进一步培养，提高生产性。
本发明中，作为从如上述培养的微生物细胞中分离目的PHA的方法，可以使用通常进行的方法。例如，用氯仿、二氯甲烷、丙酮等的有机溶剂进行萃取是最简便的方法。除此以外，有时也用二噁烷、四氢呋喃、乙腈。另外，在难以使用有机溶剂的环境中，可以使用下述方法：采用SDS等表面活性剂的处理、用溶菌酶等酶的处理、用次氯酸盐、氨、EDTA等试剂的处理，或用超声波粉碎法、均化法、压力粉碎法、有机玻璃珠冲击法、磨碎法、研磨粉碎法、冷冻熔解法的任一种方法，通过物理性地粉碎微生物细胞，去除PHA以外的菌体成分、回收PHA。
再者，本发明的微生物的培养、用本发明的微生物生产PHA及在菌体中储存PHA、以及本发明回收来自菌体的PHA，不限于上述的方法。
从以下的实施例可以看出，根据本发明的方法，可控制分子中含有侧链含带有苯基结构、噻吩基结构、环己基结构残基单元的聚羟基链烷酸酯的分子量。
具体实施方式
以下列出本发明的一种方法用的无机盐培养基(M9培养基)的组成。
[M9培养基]
Na2HPO4                    6.3
KH2PO4                     3.0
NH4Cl                       1.0
NaCl                         0.5g/L，pH＝7.0
此外，为了更好的繁殖及生产PHA，必须在上述的无机盐培养基中添加以下所示的微量成分溶液0.3％(V/V)左右。
[微量成分溶液]
氮川三乙酸1.5、MgSO43.0、MnSO40.5、NaCl1.0、FeSO40.1、CaCl20.1、CoCl20.1、ZnSO40.1、CuSO40.1、AlK(SO4)20.1、H3BO30.1、Na2MoO40.1、NiCl20.1               (g/L)
(实施例)
[实施例1]用聚乙二醇控制聚3-羟基-5-苯基戊酸(PHPV)的分子量-1
在含聚胨(和光纯药)0.5％(W/V)、5-苯基戊酸0.1％(W/V)及分子量控制剂聚乙二醇200(PEG200：平均分子量190-210；キシダ化学制)0％、1％、2％、5％(V/V)的M9培养基200ml中，加入预先用含聚胨0.5％的M9培养基在30℃振荡8小时培养的Pseudomonascichorii YN2菌的培养液1mL，在容积500mL振荡烧瓶中在30℃培养24小时。培养后离心分离获取菌体，用甲醇洗涤后进行冷冻干燥。称量干燥菌体后，加氯仿，在50℃搅拌24小时萃取聚合物。过滤萃取聚合物的氯仿，用蒸发器进行浓缩后，收集用冷甲醇沉淀固化的部分，减压干燥、制得目的聚合物。
采用1H-NMR(FT-NMR：Bruker DPX400；1H共振频率：400MHz；测定核种：1H；使用溶剂：CDCl3；参考：毛细管封入TMS/CDCl3；测定温度：室温)进行所得聚合物的结构确定，结果大致是聚3-羟基-5-苯基戊酸(以下，称PHPV)的均聚物(以下的化学式(18))。
这些聚合物的分子量用凝胶渗透色谱仪(GPC)进行测定(东曹HLC-8220GPC、谱柱：东曹TSK-GEL Super HM-H，溶剂：氯仿，聚苯乙烯换算)。
把所得菌体及聚合物的重量、聚合物与菌体的重量比、所得聚合物的分子量及分子量分布示于表1。
表1
  PEG200(％)   CDW(mg/L)   PDW(mg/L)   P/C(％)   Mn   Mw/Mn
  0   1238   603   48.7   92000   1.9
  1   1022   523   51.1   26000   2.0
  2   1007   513   50.9   18000   2.1
  5   625   343   54.8   15000   2.1
CDW：菌体干燥重量；PDW：聚合物干燥重量；P/C：PDW/CDW；Mn：数均分子量；Mw/Mn：分子量分布
[实施例2]用聚乙二醇控制PHPV的分子量-2
作为分子量控制剂除了用PEG600(平均分子量：570～630)代替PEG200以外，其他采用与实施例1同样的方法进行实验。用1H-NMR解析的所得聚合物的结构与实施例1相同，大致是PHPV均聚物。把所得的菌体及聚合物的重量、聚合物与菌体的重量比、所得聚合物的分子量及分子量分布示于表2。
[表2]
  PEG600(％)   CDW(mg/L)   PDW(mg/L)   P/C(％)   Mn   Mw/Mn
  0   1205   600   49.8   92000   1.9
  1   1100   533   48.5   70000   1.9
  2   1090   533   48.9   55000   2.1
  5   605   321   53.1   49000   2.0
CDW：菌体干燥重量；PDW：聚合物干燥重量；P/C：PDW/CDW；Mn：数均分子量；Mw/Mn：分子量分布
[实施例3]用聚乙二醇控制PHPV的分子量-3
作为分子量控制剂除了用PEG2000(平均分子量：1800～2200)代替PEG200以外，其他采用与实施例1同样的方法进行实验。用1H-NMR解析的所得聚合物的结构与实施例1相同，大致是PHPV均聚物。把所得的菌体及聚合物的重量、聚合物与菌体的重量比、所得聚合物的分子量及分子量分布示于表3。
[表3]
 PEG2000(％)   CDW(mg/L)   PDW(mg/L)   P/C(％)   Mn   Mw/Mn
 0   1225   602   49.1   92000   1.9
 1   1090   519   47.6   80000   2.1
 2   1070   522   48.8   67000   2.0
 5   618   320   51.8   61000   1.9
CDW：菌体干燥重量；PDW：聚合物干燥重量；P/C：PDW/CDW；Mn：数均分子量；Mw/Mn：分子量分布
[实施例4]用聚乙二醇控制聚3-羟基-5-苯氧基戊酸的分子量
在含聚胨0.5％(W/V)、5-苯氧基戊酸0.1％(W/V)、不含PEG200作为分子量控制剂、或含1％(V/V)的M9培养基200mL中，分别加入预先用含聚胨0.5％的M9培养基在30℃振荡8小时培养的Psendomonascichorii YN2菌、Psendomonas putida P161菌的培养液1mL，用容积500mL振荡烧瓶在30℃培养45小时。培养后，采用与实施例1所示方法相同的方法，制得目的聚合物。
采用’H-NMR进行所得聚合物的结构确定，结果均大致是聚3-羟基-5-苯氧基戊酸的均聚物(以下的化学式(19))。
Figure C0310680400231
这些聚合物的分子量与实施例1同样采用GPC进行测定。
把所得的菌体及聚合物的重量、聚合物与菌体的重量比、所得聚合物的分子量及分子量分布示于表4。
[表4]
  菌株  PEG200：1％   CDW(mg/L)   PDW(mg/L)   P/C(％)   Mn   Mw/Mn
YN2  不含   760   360   47.4   225000   2.1
 含   750   175   23.3   92000   2.0
P161  不含   680   150   22.1   160000   1.9
 含   530   40   7.5   40000   2.0
CDW：菌体干燥重量；PDW：聚合物干燥重量；P/C：PDW/CDW；Mn：数均分子量；Mw/Mn：分子量分布
[实施例5]用各种分子量控制剂控制PHPV的分子量
在含聚胨0.5％(W/V)、5-苯基戊酸0.1％(W/V)及不含分子量控制剂、或作为分子量控制剂各含PEG200、异丙醇(キシダ化学)、正丁醇(キシダ化学)0.1％(V/V)的M9培养基200mL中，加入预先用含聚胨0.5％的M9培养基在30℃振荡8小时培养的Psendomonascichorii YN2菌的培养液1mL，用容积500ml振荡烧瓶在30℃培养40小时。培养后，采用与实施例1所示方法同样的方法，制得目的聚合物。
采用’H-NMR进行所得聚合物的结构确定，结果均大致是PHPV的均聚物。
这些聚合物的分子量与实施例1同样采用GPC进行测定。
把所得的菌体及聚合物的重量、聚合物与菌体的重量比、所得聚合物的分子量及分子量分布示于表5。
[表5]
  分子量控制剂   CDW(mg/L)   PDW(mg/L)   P/C(％)   Mn   Mw/Mn
  未添加   1170   705   60.3   94000   1.9
  PEG200   1100   540   49.1   65000   2.1
  IPA   1210   600   49.6   79000   1.9
  BA   1470   635   43.2   36000   2.3
CDW：菌体干燥重量；PDW：聚合物干燥重量；P/C：PDW/CDW；Mn：数均分子量；Mw/Mn：分子量分布；IPA：异丙醇；BA：正丁醇
[实施例6]用各种分子量控制剂控制聚3-羟基-5-(苯硫基)戊酸的分子量
在含聚胨0.5％及5-(苯硫基)戊酸0.1％、不含分子量控制剂、或作为分子量控制剂含1，2-丁二醇、1，4-丁二醇、1，6-己二醇、1，2，3-丁三醇、乙二醇、乙二醇单甲醚各0.1％(V/V)的M9培养基200mL中，加预先用含聚胨0.5％的M9培养基在30℃振荡8小时培养的Psendomonas cichorii YN2菌的培养液1ml，用容积500ml振荡烧瓶在30℃培养48小时。培养后，采用与实施例1所示方法同样的方法，制得目的聚合物。
采用1H-NMR进行所得聚合物的结构确定，结果均大致是聚3-羟基-5-(苯硫基)戊酸的均聚物(以下的化学式(20))。
这些聚合的分子量与实施例1同样采用GPC进行测定。
把所得的菌体及聚合物的重量、聚合物与菌体的重量比、所得聚合物的分子量及分子量分布示于表6。
[表6]
  分子量控制剂   CDW(mg/L)   PDW(mg/l)   P/C(％)   Mn   Mw/Mn
  未添加   1210   590   48.8   150000   2.3
  1，2-BD   1200   570   47.5   42000   2.2
  1，3-BD   1215   565   46.5   44000   2.1
  1，6-HD   1150   575   50.0   29000   2.1
  1，2，3-BT   1090   505   46.3   45000   2.3
  EG   1230   600   48.8   50000   2.2
  MEG   1200   590   49.2   53000   2.2
CDW：菌体干燥重量；PDW：聚合物干燥重量；P/C：PDW/CDW；Mn：数均分子量；Mw/Mn：分子量分布；1，2-BD：1，2-丁二醇；1，4-BD：1，4-丁二醇；1，6-HD：1，6-己二醇；1，2，3-BT：1，2，3-丁三醇；EG：乙二醇；MEG：乙二醇单甲醚。
[实施例7]用PEG控制聚3-羟基-5-(2-噻吩基)戊酸的分子量
在含酵母提取物(Difco)0.5％、5-(2-噻吩基)戊酸0.1％、不含PEG200作为分子量控制剂、或含1％(V/V)的M9培养基200mL中、分别加入预先用含酵母提取物0.5％的M9培养基在30℃振荡培养8小时的Psendomonas putida P91菌的培养液1mL，用容积500ml振荡烧瓶在30℃培养45小时。培养后，采用与实施例1所示方法同样的方法，制得目的聚合物。
采用1H-NMR进行所得聚合物的结构确定，结果大致是聚3-羟基-5-(2-噻吩基)戊酸的均聚物(以下的化学式(21))。
Figure C0310680400261
这些聚合物的分子量与实施例1同样采用GPC进行测定。
把所得的菌体及聚合物的重量、聚合物与菌体的重量比、所得聚合物的分子量及分子量分布示于表7
[表7]
 PEG200：1％   CDW(mg/L)   PDW(mg/l)   P/C(％)   Mn   Mw/Mn
 不含   600   15   2.5   72000   3.2
 含   540   16   3.0   30000   2.8
CDW：菌体干燥重量；PDW：聚合物干燥重量；P/C：PDW/CDW；Mn：数均分子量；Mw/Mn：分子量分布。
[实施例8]用PEG控制聚3-羟基-5-(4-氟苯基)戊酸的分子量
在含D-葡萄糖(キシダ化学)0.5％、5-(4-氟苯基)戊酸0.1％、作为分子量控制剂不含PEG200、或含1％(V/V)的M9培养基200ml中，分别加入预先用含聚胨0.5％的M9培养基在30℃、振荡8小时培养的Pseudomonas cichorii YN2菌的培养液1ml，用容积500ml振荡烧瓶在30℃培养48小时。培养后，采用与实施例1所示方法相同的方法，制得目的聚合物。
采用1H-NMR进行所得聚合物的结构确定，结果大致是聚3-羟基-5-(4-氟苯基)戊酸的均聚物(以下的化学式(22))。
Figure C0310680400271
这些聚合物的分子量与实施例1同样地采用GPC进行测定。
把所得的菌体及聚合物的重量，聚合物与菌体的重量比，所得聚合物的分子量及分子量分布示于表8。
表8
  PEG200：1％   CDW(mg/L)   PDW(mg/l)   P/C(％)   Mn   Mw/Mn
  不含   790   430   54.4   90000   2.1
  含   700   390   55.7   22000   2.0
CDW：菌体干燥重量；PDW：聚合物干燥重量；P/C：PDW/CDW；Mn：数均分子量；Mw/Mn：分子量分布。
[实施例9]用PEG控制聚3-羟基-4-苯基丁酸及聚3-羟基-6-苯基己酸的分子量
除了把聚合物合成底物改成4-苯基丁酸及6-苯基己酸以外，其他采用与实施例8同样的方法评价PEG200的分子量控制效果。
采用1H-NMR进行所得聚合物的结构确定，结果分别大致是聚3-羟基-4-苯基丁酸(以下的化学式(23))及3-羟基-6-苯基己酸(以下的化学式(24))的均聚物。
这些聚合物的分子量与实施例1同样地采用GPC进行测定。
把所得的菌体及聚合物的重量，聚合物与菌体的重量比，所得聚合物的分子量及分子量分布示于表9。
表9
聚合物 PEG200：1％   CDW(mg/L)   PDW(mg/l) P/C(％) Mn Mw/Mn
PHPB  不含   420   66   15.7   78000   2.2
 含   420   69   16.4   19000   2.1
PHPHx  不含   700   72   10.3   80000   2.3
 含   660   69   10.5   23000   2.1
PHPB：聚3-羟基-4-苯基丁酸；PHPHx：3-羟基-6-苯基己酸；CDW：菌体干燥重量；PDW：聚合物干燥重量；P/C：PDW/CDW；Mn：数均分子量；Mw/Mn：分子量分布。
[实施例10]用PEG控制聚3-羟基-4-环己基丁酸的分子量
把繁殖底物由D-葡萄糖改成聚胨，把聚合物生物合成底物改成4-环己基丁酸，与实施例8同样地进行评价。
采用1H-NMR进行所得聚合物的结构确定，结果大致是聚3-羟基-4-环己基丁酸的均聚物(以下的化学式(25))。
这些聚合物的分子量与实施例1同样地采用GPC进行测定。
把所得的菌体及聚合物的重量，聚合物与菌体的重量比，所得聚合物的分子量及分子量分布示于表10。
表10
  PEG200：1％   CDW(mg/L)   PDW(mg/l)   P/C(％)   Mn   Mw/Mn
  不含   820   480   58.5   71000   2.2
  含   820   430   52.4   18000   2.1
CDW：菌体干燥重量；PDW：聚合物干燥重量；P/C：PDW/CDW；Mn：数均分子量；Mw/Mn：分子量分布。
[实施例11]用PEG控制含有3-羟基-5-苯氧基戊酸及3-羟基-5-(4-氰基苯氧基)戊酸单元的PHA的分子量
在含聚胨0.5％及5-(4-氰基苯氧基)戊酸0.05％、5-苯氧基戊酸0.05％、不含作为分子量控制剂的PEG200、或含PEG2001％(V/V)的M9培养基200ml中，分别加入预先用含聚胨0.5％的M9培养基在30℃、振荡8小时培养的Pseudomonas cichorii YN2菌的培养液1ml，用容积500ml振荡烧瓶在30℃培养48小时。培养后，采用与实施例1所示方法同样的方法进行精制，再只回收丙酮可溶成分，制得目的聚合物。
采用1H-NMR进行所得聚合物的结构确定，结果表明是含以下的化学式(26)所示单元的比例A∶B∶C∶D＝2∶25∶5∶68(不含PEG体系)及3∶24∶7∶66(含PEG体系)的3-羟基-5-苯氧基戊酸及3-羟基-5-(4-氰基苯氧基)戊酸单元的PHA。
这些聚合物的分子量与实施例1同样地采用GPC进行测定。
把所得的菌体及聚合物的重量，聚合物与菌体的重量比，所得聚合物的分子量及分子量分布示于表11。
表11
  PEG200：1％   CDW(mg/L)   PDW(mg/l)   P/C(％)   Mn   Mw/Mn
  不含   680   110   16.2   72000   2.3
  含   660   100   15.2   20000   2.1
CDW：菌体干燥重量；PDW：聚合物干燥重量；P/C：PDW/CDW；Mn：数均分子量；Mw/Mn：分子量分布。
[实施例12]用PEG控制含有3-羟基-5-苯氧基戊酸及3-羟基-5-(4-硝基苯氧基)戊酸单元的PHA的分子量
除了把聚合物生产底物中5-(4-氰基苯氧基)戊酸改成5-(4-硝基苯氧基)戊酸以外，其他采用与实施例11同样的方法制得聚合物，评价PEG的分子量控制效果。
采用1H-NMR进行所得聚合物的结构确定，结果表明是含以下的化学式(27)所示单元的比例A∶B∶C∶D＝2∶22∶4∶72(不含PEG的体系)及4∶23∶5∶68(含PEG的体系)的3-羟基-5-苯氧基戊酸及3-羟基-5-(4-硝基苯氧基)戊酸单元的PHA。
Figure C0310680400311
这些聚合物的分子量与实施例1同样地采用GPC进行测定。
把所得的菌体及聚合物的重量，聚合物与菌体的重量比，所得聚合物的分子量及分子量分布示于表12。
表12
  PEG200：1％   CDW(mg/L)   PDW(mg/l)   P/C(％)   Mn   Mw/Mn
  不含   590   95   16.1   70000   2.2
  含   570   80   14.0   17000   2.1
CDW：菌体干燥重量；PDW：聚合物干燥重量；P/C：PDW/CDW；Mn：数均分子量；Mw/Mn：分子量分布。
[实施例13]用PEG控制含有3-羟基-5-苯氧基戊酸、3-羟基-7-苯氧基庚酸及3-羟基-9-苯氧基壬酸单元的PHA的分子量
除了作为聚合物合成底物用11-苯氧基十一烷酸，作为生产菌种用Pseudomonas cichorii H45菌以外，其他进行与实施例10同样的操作，制得聚合物，进行PEG的分子量控制评价。
采用’H-NMR进行所得聚合物的结构确定，结果表明是含以下的化学式(28)所示单元的比例、A∶B∶C∶D∶E＝3∶1∶34∶51∶11(不含PEG的体系)及3∶1∶35∶52∶9(含PEG的体系)的，3-羟基-5-苯氧基戊酸、3-羟基-7-苯氧基庚酸及3-羟基-9-苯氧基壬酸单元的PHA。
Figure C0310680400321
这些聚合物的分子量与实施例1同样地采用GPC进行测定。
把所得的菌体及聚合物的重量，聚合物与菌体的重量比，所得聚合物的分子量及分子量分布示于表13。
表13
  PEG200：1％   CDW(mg/L)   PDW(mg/l)   P/C(％)   Mn   Mw/Mn
  不含   820   290   35.4   33000   1.9
  含   815   280   34.4   10000   1.9
CDW：菌体干燥重量；PDW：聚合物干燥重量；P/C：PDW/CDW；Mn：数均分子量；Mw/Mn：分子量分布。
[实施例14]用PEG控制含有3-羟基-5-(2-噻吩酰基)戊酸单元的PHA的分子量
除了作为聚合物合成底物用5-(2-噻吩酰基)戊酸以外，其他进行与实施例8同样的操作制得聚合物，进行PEG的分子量控制评价。
采用1H-NMR进行所得聚合物的结构确定，结果表明是含以下的化学式(29)所示单元的比例、A∶B∶C＝1∶37∶62(不含PEG的体系)及1∶35∶64(含PEG的体系)的，3-羟基-5-(2-噻吩酰基)戊酸单元的PHA。
Figure C0310680400331
这些聚合物的分子量与实施例1同样地采用GPC进行测定。
把所得的菌体及聚合物的重量，聚合物与菌体的重量比，所得聚合物的分子量及分子量分布示于表14。
表14
  PEG200：1％   CDW(mg/L)   PDW(mg/l) P/C(％) Mn Mw/Mn
  不含   870   95   10.9   110000   2.4
  含   875   100   11.4   45000   2.2
CDW：菌体干燥重量；PDW：聚合物干燥重量；P/C：PDW/CDW；Mn：数均分子量；Mw/Mn：分子量分布。
[实施例15]用PEG控制含有3-羟基-5-苯甲酰戊酸单元的PHA的分子量
除了作为聚合物合成底物用5-苯甲酰戊酸以外，其他进行与实施例8同样的操作制得聚合物，进行PEG的分子量控制评价。
采用1H-NMR进行所得聚合物的结构确定，结果表明是含以下的化学式(30)所示单元的比例、A∶B＝16∶84(不含PEG的体系)及15∶85(含PEG的体系)的，3-羟基-5-苯甲酰戊酸单元的PHA。
Figure C0310680400341
这些聚合物的分子量与实施例1同样地采用GPC进行测定。
把所得的菌体及聚合物的重量，聚合物与菌体的重量比，所得聚合物的分子量及分子量分布示于表15。
表15
  PEG200：1％   CDW(mg/L)   PDW(mg/l)   P/C(％)   Mn   Mw/Mn
  不含   660   170   25.8   330000   3.9
  含   665   180   27.1   95000   3.7
CDW：菌体干燥重量；PDW：聚合物干燥重量；P/C：PDW/CDW；Mn：数均分子量；Mw/Mn：分子量分布。
[实施例16]用PEG控制含3-羟基-5-(2-噻吩硫基)戊酸单元的PHA的分子量
除了作为聚合物合成底物用5-(2-噻吩硫基)戊酸以外，其他进行与实施例11同样的操作制得聚合物。进行PEG的分子量控制评价。
采用1H-NMR进行所得聚合物的结构确定，结果表明是以下的化学式(31)表示的聚3-羟基-5-(2-噻吩硫基)戊酸的大致均聚物。
Figure C0310680400351
这些聚合物的分子量与实施例1同样地采用GPC进行测定。
把所得的菌体及聚合物的重量，聚合物与菌体的重量比，所得聚合物的分子量及分子量分布示于表16。
表16
  PEG200：1％   CDW(mg/L)   PDW(mg/l)   P/C(％)   Mn   Mw/Mn
  不含   1100   350   31.8   196000   2.9
  含   1050   350   33.3   74000   2.6
CDW：菌体干燥重量；PDW：聚合物干燥重量；P/C：PDW/CDW；Mn：数均分子量；Mw/Mn：分子量分布。
[实施例17]用PEG控制含3-羟基-5-[(苯基甲基)硫基]戊酸单元的PHA的分子量
除了作为聚合物合成底物用5-[(苯基甲基)硫基]戊酸以外，其他进行与实施例8同样的操作制得聚合物，进行PEG的分子量控制评价。
采用1H-NMR进行所得聚合物的结构确定，结果表明是含有以下的化学式(32)所示单元的比例A∶B∶C＝2∶8∶90(不含PEG的体系)及2∶9∶89(含PEG的体系)的3-羟基-5-[(苯基甲基)硫基]戊酸单元的PHA。
Figure C0310680400361
这些聚合物的分子量与实施例1同样地采用GPC进行测定。
把所得的菌体及聚合物的重量，聚合物与菌体的重量比，所得聚合物的分子量及分子量分布示于表17。
表17
  PEG200：1％   CDW(mg/L)   PDW(mg/l)   P/C(％)   Mn   Mw/Mn
  不含   980   440   44.9   15000   3.6
  含   990   400   40.4   9000   3.2
CDW：菌体干燥重量；PDW：聚合物干燥重量；P/C：PDW/CDW；Mn：数均分子量；Mw/Mn：分子量分布。
[实施例18]用PEG控制含有3-羟基-5-苯基戊酸及3-羟基-5-(4-乙烯基苯基)戊酸单元的PHA的分子量
作为聚合物合成底物用5-苯基戊酸(0.09％)及5-(4-乙烯基苯基)戊酸(0.02％)，采用氯仿的萃取条件为23.5℃，72小时，除此以外，其他进行与实施例10同样的操作制得聚合物。进行PEG的分子量控制评价。
采用1H-NMR进行所得聚合物的结构确定，结果表明是含有以下的化学式(33)所示单元的比例，A∶B∶C＝1∶14∶85(不含PEG的体系)及1∶15∶84(含PEG的体系)的3-羟基-5-苯基戊酸及3-羟基-5-(4-乙烯基苯基)戊酸单元的PHA。
这些聚合物的分子量与实施例1同样地采用GPC进行测定。
把所得的菌体及聚合物的重量，聚合物与菌体的重量比，所得聚合物的分子量及分子量分布示于表18。
表18
  PEG200：1％   CDW(mg/L)   PDW(mg/l)   P/C(％)   Mn   Mw/Mn
  不含   1200   600   50.0   59000   2.0
  含   1150   580   50.4   19000   1.9
CDW：菌体干燥重量；PDW：聚合物干燥重量；P/C：PDW/CDW；Mn：数均分子量；Mw/Mn：分子量分布。
[实施例19]用PEG控制含有3-羟基-5-[(甲硫基)苯氧基]戊酸单元的PHA的分子量
除了作为聚合物合成底物用5-[(甲基硫)苯氧基]戊酸以外，其他进行与实施10同样的操作制得聚合物。进行PEG的分子量控制评价。
采用1H-NMR进行所得聚合物的结构确定，结果表明是含有以下的化学式(34)所示单元的比例A∶B∶C＝8∶68∶24(不含PEG的体系)及7∶66∶27(含PEG的体系)的3-羟基-5-[(甲硫基)苯氧基]戊酸单元的PHA。
Figure C0310680400381
这些聚合物的分子量与实施例1同样地采用GPC进行测定。
把所得的菌体及聚合物的重量，聚合物与菌体的重量比，所得聚合物的分子量及分子量分布示于表19。
表19
  PEG200：1％   CDW(mg/L)   PDW(mg/l)   P/C(％)   Mn   Mw/Mn
  不含   990   150   15.2   16000   2.3
  含   1000   130   13.0   9000   2.1
[实施例20]分子量被控制的聚3-羟基-5-(苯硫基)戊酸向聚3-羟基-5-(苯磺酰基)戊酸的变换
把实施例6制得的聚3-羟基-5-(苯硫基)戊酸的均聚物(以下的化学式(20))，通过氧化处理变换成聚3-羟基-5-(苯磺酰基)戊酸。
把聚羟基链烷酸酯400mg加到容积100ml烧瓶中，加入氯仿10ml进行溶解。将其置于冰浴下，慢慢加在20ml氯仿中溶解的间氯过苯甲酸1386mg进行搅拌。在冰浴下搅拌75分钟后，加水100ml及亚硫酸氢钠3020mg。然后用氯仿进行萃取，回收聚合物，再加100ml乙醇，洗涤2次，经减压干燥得到聚合物。
采用1H-NMR(FT-NMR：Bruker DPX400；共振频率：400MHz；测定核种：1H；使用溶剂：CDCl3；参考：毛细管封入TMS/CDCl3；测定温度：室温)进行所得聚合物的结构确定。结果确认是化学式(35)表示的3-羟基-5-(苯磺酰基)戊酸的均聚物。
Figure C0310680400391
这些聚合物的分子量与实施例1同样地采用GPC进行测定。
把所得的聚合物的重量，所得聚合物的分子量及分子量分布示于表20。
表20
  分子量控制剂   重量(mg)   Mn   Mw/Mn
  未添加   378   135000   2.0
  1，2-BD   366   37000   1.9
  1，3-BD   389   35000   2.1
  1，6-HD   384   26000   1.9
  1，2，3-BT   375   42000   2.1
  EG   369   48000   2.0
  MEG   382   49000   2.1
CDW：菌体干燥重量；PDW：聚合物干燥重量；P/C：PDW/CDW；Mn：数均分子量；Mw/Mn：分子量分布；1，2-BD：1，2-丁二醇；1.4-BD：1，4-丁二醇；1，6-HD：1，6-己二醇、1，2，3-BT：1，2，3-丁三醇；EG：乙二醇；MEG：乙二醇单甲醚。
[实施例21]分子量被控制的含有3-羟基-5-苯基戊酸及3-羟基-5-(4-乙烯基苯基)戊酸单元的PHA经氧化处理向含有3-羟基-5-苯基戊酸及3-羟基-5-(4-羧基苯基)戊酸单元的PHA的变换
实施例18制得的含3-羟基-5-苯基戊酸及3-羟基-5-(4-乙烯基苯基)戊酸单元的PHA(化学式36)经氧化处理进行向含有3-羟基-5-苯基戊酸及3-羟基-5-(4-羧基苯基)戊酸单元的PHA的变换
氧化开裂反应如下地进行，在氮气环境气氛下，100ml烧瓶中加入含3-羟基-ω-(4-乙烯基苯基)链烷酸单元的聚酯0.3g，18-冠-6-醚0.1923g，二氯甲烷10.0ml，进行搅拌。把烧瓶置于冰浴中，使反应体系为0℃。30分钟后加入高锰酸钾0.1517g，用铝箔包围反应容器，搅拌21小时。反应结束后加入溶解亚硫酸氢钠的水，通过使该反应溶液在甲醇中再沉淀，回收聚合物。然后，用氯仿将所得的聚合物进行透析，精制。
所得聚合物的结构确定，采用傅里叶变换一红外吸收(FT-IR)光谱(Nicolet AVATAR360FT-IR)进行分析。其结果，从发现1693cm-1有新羧酸产生的吸收判断，所得的PHA有3-羟基-ω-(4-羧基苯基)链烷酸单元。
另外，把所得的聚合物和三甲硅烷基重氮甲烷反应的产物用‘H-NMR(FT-NMR：Bruker DPX400；1H共振频率：400MHz；测定核种1H；使用溶剂：CDCl3；参考：毛细管封入TMS/CDCl3；测定温度：室温)进行分析，结果确认是含下述式(37)所示单元的聚羟基链烷酸酯共聚物。
Figure C0310680400411
另外，对所得的聚合物和三甲基甲硅烷基重氮甲烷反应的产物，采用凝胶渗透色谱仪(GPC：东曹HLC-8220、谱柱：东曹TSK-GEL SuperHM-H，溶剂：氯仿，聚苯乙烯换算)评价平均分子量。
把所得的聚合物的重量，所得聚合物的分子量及分子量分布示于表21。
表21
  PEG200：1％   重量(mg)   Mn   Mw/Mn
  不含   285   32000   1.9
  含   279   10500   1.7
CDW：菌体干燥重量；PDW：聚合物干燥重量；P/C：PDW/CDW；Mn：数均分子量；Mw/Mn：分子量分布。
[实施例22]用PEG控制含有3-羟基-5-[(苯甲基)氧基]戊酸单元的PHA的分子量
除了作为聚合物合成底物用5-[(苯甲基)氧基]戊酸以外，其他进行与实施例8同样的操作制得聚合物，进行PEG的分子量控制评价。
采用1H-NMR进行所得聚合物的结构确定，结果表明是以下的化学式(38)表示的3-羟基-5-[(甲硫基)苯氧基]戊酸单元的均聚物。
Figure C0310680400421
这些聚合物的分子量与实施例1同样地采用GPC进行测定。
把所得的菌体及聚合物的重量，聚合物与菌体的重量比，所得聚合物的分子量及分子量分布示于表22。
表22
  PEG200：1％   CDW(mg/L)   PDW(mg/l)   P/C(％)   Mn   Mw/Mn
  不含   1350   165   12.2   128000   2.4
  含   1140   125   11.0   52000   2.0

Claims (7)

1.分子中含有化学式(1)表示的3-羟基-ω-取代链烷酸单元或一般式(2)表示的3-羟基-ω-环己基链烷酸单元之中任一种以上的聚羟基链烷酸酯的分子量的控制方法，
化学式(1)：
Figure C031068040002C1
m是从化学式中表示的范围内选出的整数；R1含带有苯基结构或噻吩基结构的任一环结构的残基；多个单元存在时，m与R1在每个单元中独立地表示上述的意思，
一般式(2)
Figure C031068040002C2
式中，R2表示环己基上的取代基，R2是H原子、CN基、NO2基、卤原子、CH3基、C2H5基、C3H7基、CF3基、C2F5基或C3F7基；k是从化学式中表示的范围内选出的整数；多个单元存在时，在每个单元中独立地表示上述的意思，
其特征在于，在含有化学式(3)表示的ω-取代链烷酸或一般式(4)表示的ω-环己基链烷酸之中任一种以上、和具有羟基的化合物的条件下，培养能由化学式(3)或(4)表示的化合物生产分子中含化学式(1)或(2)表示的单元之中任一种以上单元的聚羟基链烷酸酯的微生物，该微生物是归属假单胞菌属的微生物，
化学式(3)：
q是从化学式中表示的范围内选出的整数；R3是带有苯基结构或噻吩基结构的任一种环结构的残基；多个单元存在时，q与R3在每个单元中独立地表示上述的意思，
一般式(4)：
Figure C031068040003C2
式中，R4表示环己基上的取代基，R4是H原子、CN基、NO2基、卤原子、CH3基、C2H5基、C3H7基、CF3基、C2F5基或C3F7基；r是从化学式中表示的范围内选出的整数；多个单元存在时，在每个单元中独立地表示上述的意思，
所述具有羟基的化合物是从醇类、二醇类、三醇类、亚烷基二醇类、聚乙二醇类、聚环氧乙烷类、亚烷基二醇单酯类、聚乙二醇单酯类、聚环氧乙烷单酯类化合物中选出的至少1种。
2.权利要求1所述的聚羟基链烷酸酯的分子量的控制方法，其特征在于，化学式(1)与(3)中的R1与R3，是从化学式(5)表示的未取代或取代苯基；一般式(6)表示的未取代或取代苯氧基；一般式(7)表示的未取代或取代苯甲酰基；一般式(8)表示的未取代或取代苯硫基；一般式(9)表示的未取代或取代(苯基甲基)硫基；式(10)表示的2-噻吩基；式(11)表示的2-噻吩硫基；式(12)表示的2-噻吩羰基；一般式(13)表示的未取代或取代苯亚磺酰基；一般式(14)表示的未取代或取代苯磺酰基；式(15)表示的(苯基甲基)氧基中选出的残基，所述一般式(13)和一般式(14)仅适用于R1，
化学式(5)
式中，R5表示芳香环上的取代基，R5是H原子、卤原子、CN基、NO2基、CH3基、C2H5基、C3H7基、乙烯基、COOR51、CF3基、C2F5基或C3F7基，其中，COOR51仅适用于R1，并且R51表示H原子、Na原子、K原子的任一种；多个单元存在时，在每个单元中独立地表示上述的意思，
一般式(6)：
Figure C031068040004C2
式中，R6表示芳香环上的取代基，R6是H原子、卤原子、CN基、NO2基、CH3基、C2H5基、C3H7基、SCH3基、CF3基、C2F5基或C3F7基；多个单元存在时，在每个单元中独立地表示上述的意思，
一般式(7)：
式中，R7表示芳香环上的取代基，R7是H原子、卤原子、CN基、NO2基、CH3基、C2H5基、C3H7基、CF3基、C2F5基或C3F7基；多个单元存在时，在每个单元中独立地表示上述的意思，
一般式(8)：
Figure C031068040004C4
式中，R8表示芳香环上的取代基，R8是H原子、卤原子、CN基、NO2基、COOR81、SO2R82、CH3基、C2H5基、C3H7基、(CH3)2-CH基或(CH3)3-C基，其中，R81表示H、Na、K、CH3、C2H5的任一种，R82表示OH、ONa、OK、卤原子、OCH3、OC2H5的任一种；多个单元存在时，在每个单元中独立地表示上述的意思，
一般式(9)：
Figure C031068040005C1
式中，R9表示芳香环上的取代基，R9是H原子、卤原子、CN基、NO2基、COOR91、SO2R92、CH3基、C2H5基、C3H7基、(CH3)2-CH基或(CH3)3-C基，其中，R91表示H、Na、K、CH3、C2H5的任一种，R92表示OH、ONa、OK、卤原子、OCH3、OC2H5的任一种；多个单元存在时，在每个单元中独立地表示上述的意思，
式(10)：
Figure C031068040005C2
式(11)：
Figure C031068040005C3
式(12)：
Figure C031068040005C4
一般式(13)：
式中，R13表示芳香环上的取代基，R13是H原子、卤原子、CN基、NO2基、COOR131、SO2R132、CH3基、C2H5基、C3H7基、(CH3)2-CH基或(CH3)3-C基，其中，R131表示H、Na、K、CH3、C2H5的任一种，R132表示OH、ONa、OK、卤原子、OCH3、OC2H5的任一种；多个单元存在时，在每个单元中独立地表示上述的意思，
一般式(14)：
Figure C031068040006C1
式中，R14表示芳香环上的取代基，R14是H原子、卤原子、CN基、NO2基、COOR141、SO2R142、CH3基、C2H5基、C3H7基、(CH3)2-CH基或(CH3)3-C基，其中，R141表示H、Na、K、CH3、C2H5的任一种，R142表示OH、ONa、OK、卤原子、OCH3、OC2H5的任一种；多个单元存在时，在每个单元中独立地表示上述的意思。
式(15)：
Figure C031068040006C2
3.权利要求1所述的聚羟基链烷酸酯的分子量控制方法，其特征在于，所述醇类、二醇类及三醇类化合物是C3-C14的直链与支链醇、二醇、三醇。
4.权利要求1所述的聚羟基链烷酸酯的分子量控制方法，其特征在于，所述亚烷基二醇类及亚烷基二醇单酯类化合物的碳链是有C2-C10的直链及支链结构的化合物。
5.权利要求1所述的聚羟基链烷酸酯的分子量控制方法，其特征在于，所述聚乙二醇类、聚环氧乙烷类、聚乙二醇单酯类、聚环氧乙烷单酯类化合物的数均分子量是100-20000。
6.权利要求1所述的聚羟基链烷酸酯的分子量控制方法，其特征在于，所述具有该羟基的化合物的浓度相对于微生物培养时的培养基是0.01％-10％(w/v)。
7.权利要求1所述的方法，其特征在于，所述微生物是菊苣假单胞菌YN2株(Pseudomonas cichorii YN2；FERM BP-7375)、菊苣假单胞菌H45株(Pseudomonas cichorii H45、FERM BP-7374)、Pseudomonasjessenii P161、FERM BP-7376、恶臭假单胞菌P91株(恶臭假单胞菌P91、FERM BP-7373)的任一种以上的菌株。
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