[go: up one dir, main page]
More Web Proxy on the site http://driver.im/

CN1213400A - N－保护d－脯氨酸衍生物的制备方法 - Google Patents

N－保护d－脯氨酸衍生物的制备方法 Download PDF

Info

Publication number
CN1213400A
CN1213400A CN97192958A CN97192958A CN1213400A CN 1213400 A CN1213400 A CN 1213400A CN 97192958 A CN97192958 A CN 97192958A CN 97192958 A CN97192958 A CN 97192958A CN 1213400 A CN1213400 A CN 1213400A
Authority
CN
China
Prior art keywords
amino acid
proline
acid derivative
protected
pro
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN97192958A
Other languages
English (en)
Inventor
M·绍特
D·韦内茨
F·亨岑
D·施米特哈尔特
G·普法芬
O·韦尔比茨基
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Lonza AG
Original Assignee
Lonza AG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Lonza AG filed Critical Lonza AG
Publication of CN1213400A publication Critical patent/CN1213400A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P41/00—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture
    • C12P41/006—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture by reactions involving C-N bonds, e.g. nitriles, amides, hydantoins, carbamates, lactames, transamination reactions, or keto group formation from racemic mixtures
    • C12P41/007—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture by reactions involving C-N bonds, e.g. nitriles, amides, hydantoins, carbamates, lactames, transamination reactions, or keto group formation from racemic mixtures by reactions involving acyl derivatives of racemic amines
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/78—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5)
    • C12N9/80—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5) acting on amide bonds in linear amides (3.5.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P41/00—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Pyrrole Compounds (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明涉及能将用通式Ⅰ表示的外消旋型或其光学活性异构体之一的N－保护脯氨酸衍生物用作唯一的氮源、唯一的碳源、或唯一的碳和氮源的新颖微生物。式中R1是－(CH2)2－COOH、任意取代的C1－4烷氧基、芳基或芳氧基,R2是氢或=O。这些微生物可用于N－保护环状或脂族D－氨基酸衍生物和/或环状或脂族L－氨基酸衍生物(通式Ⅱ或Ⅴ)的制备方法,A与－N－和－CH一起以及R3、R4和R5具有给定的含义。

Description

N-保护D-脯氨酸衍生物的制备方法
本发明涉及能将用通式Ⅰ表示的外消旋型或其光学活性异构体之一的N-保护脯氨酸衍生物用作唯一的氮源、唯一的碳源、或唯一的碳和氮源的新颖微生物。
Figure A9719295800071
式中R1是-(CH2)2-COOH、任意取代的C1-4烷氧基、芳基或芳氧基，R2是氢或=O。这些微生物及其无细胞酶可用于N-保护环状或脂族D-氨基酸衍生物和/或环状或脂族L-氨基酸衍生物的新颖制备方法。
N-保护的环状D-氨基酸衍生物(如N-保护的D-脯氨酸衍生物，如N-苄氧羰基-D-脯氨酸(N-Z-D-脯氨酸))是制备药物的重要中间体(J.Org.Chem.,1994,59,7496-7498)。
至今，仅已知少数的酶例如可将N-Z-L-脯氨酸用作底物，并将其水解成L-脯氨酸。这些酶是从红酵母菌属(JP-A 01074987)、假单胞菌属(JP-A 55 071 491；Kikuchi等，Biochim.Biophys.Acta,744(1983),180-188)或从产碱杆菌属(JP-A 55 007 015)微生物中分离得到的。
所有这些酶较好与N-Z-L-脯氨酸的结构相关底物(如与N-氯乙酰基-L-脯氨酸)反应，但与N-Z-L-脯氨酸只有低活性。因此，这些酶不适用于经济的方法，例如不适用于制备N-Z-D-脯氨酸。另一缺点是底物不是与定整个细胞反应，而是与粗提取物或分离的酶进行反应，所以明显增加了工业支出。
EP-A 0416 282揭示一种N-酰基-L-脯氨酸酰基转移酶，例如它优选N-乙酰基-L-脯氨酸为底物，并用于得到L-脯氨酸。这种N-酰基-L-脯氨酸酰基转移酶是从睾丸酮丛毛单胞菌(Comamonas testosteroni)或反硝化产碱杆菌属微生物中分离得到。这些微生物的缺点是它们不能将N-Z-L-脯氨酸用作唯一的氮源，并水解用作底物的N-Z-L-脯氨酸。
WO 95/10604揭示了用反硝化产碱杆菌属微生物制备L-2-哌啶酸的微生物方法。这些微生物的缺点也是不能将相应的N-酰基-底物(N-酰基-(DL)-2-哌啶酸)用作唯一的氮源。
本发明的目的是分离既可用于制备N-保护环状或脂族D-氨基酸衍生物的简便工业可行的方法，又可用于制备环状或脂族L-氨基酸衍生物的简便方法的微生物。同时，应以良好的对映体纯度分离相应的产物。
本发明的目的可用权利要求1中所述的微生物、权利要求5中所述的从这些微生物中分离得到的酶和按权利要求6、7、9和10所述的方法来达到。
本发明的微生物可用常规微生物学技术从土壤样品、污泥或污水中分离得到。本发明分离这些微生物的方法是按常规的方法在含有用通式Ⅰ表示的外消旋型或其光学活性异构体之一的N-保护脯氨酸衍生物
Figure A9719295800081
●为唯一碳和氮源或
●为利用合适碳源的唯一氮源或
●为利用合适氮源的唯一碳源
 的培养基中培养这些微生物。
然后从培养得到的培养物中方便地选择那些将通式Ⅰ表示的N-保护L-脯氨酸衍生物为唯一氮源、唯一碳源或唯一碳和氮源的微生物。
在用通式Ⅰ表示的N-保护脯氨酸衍生物中的R1基团是-(CH2)2-COOH、C1-4烷氧基、芳基或芳氧基。R2基团是氢或=O。
甲氧基、芴基甲氧基(fluorenylmethoxy)、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、丁氧基、叔丁氧基或异丁氧基可用作C1-4烷氧基。
取代或未取代的苯基或苄基(如4-甲氧基苄基或4-甲氧基苯基)可用作芳基。
下述的芳氧基定义为取代或未取代的苯氧基或苄氧基。芳氧基的实例是苄氧基、4-甲氧基苄氧基或4-硝基苄氧基。
特别优选的用通式Ⅰ表示的N-保护脯氨酸衍生物是：N-琥珀酰-L-脯氨酸(R1=-(CH2)2-COOH)、N-苯乙酰基-L-脯氨酸(R1=苯甲基)、N-Z-L-脯氨酸(R1=苄氧基)、N-苯甲酰基-L-脯氨酸(R1=苯基)、N-异丁氧羰基-L-脯氨酸(R1=异丁氧基)和N-Z-L-焦谷氨酸(R1=苄氧基、R2=O)。
作为合适的碳源，微生物例如可将糖、糖醇或羧酸用作生长底物，己糖(如葡萄糖、果糖)或戊糖可用作糖。二元羧酸或三元羧酸及它们的盐(如柠檬酸或苹果酸)可用作羧酸。甘油例如可用作糖醇。
这些微生物例如可将铵、硝酸盐、脲或甘氨酸用作合适的氮源。
本专业领域中常规使用的培养基(如表1中所述的培养基)可用作选择和培养基。较好使用表1中所述的培养基。
在培养和选择过程中，可方便地诱导微生物的活性酶。用通式Ⅰ表示的N-保护的脯氨酸衍生物或其L-异构体可用作酶诱导物。
进行培养和选择的温度通常为10-40℃，较好为20-35℃,pH通常为pH4-10，较好为pH5-9。
优选的微生物是利用N-Z-L-脯氨酸的节细菌属(第一种具有脯氨酸酰基转移酶活性的革兰氏阳性微生物)、土壤杆菌/根瘤菌属、牙孢杆菌、假单胞菌属或产碱杆菌属微生物。具体地说，分离了节细菌属HSZ5(DSM 10328)、土壤杆菌/根瘤菌属HSZ30、单纯杆菌K2、恶臭假单胞菌K32、皮氏产碱菌(Alcaligenes piechaudii)K4或木糖氧化产碱菌反硝化亚种HSZ17(DSM 10329)以及它们功能等同的变异体和突变体。按布达佩斯条约，微生物DSM 10329和10328于6.11.1995保藏在德意志微生物保藏中心(Mascheroderweg 1b,D38124 Braunschweig)。
“功能等同的变异体和突变体”是指具有与原微生物基本上相同的性质和功能的微生物。这种变异体和突变体例如可用紫外辐射偶然产生。
木糖氧化产碱菌反硝化亚种HSZ17(DSM 10329)的分类说明
该菌株的性质
细胞形状         杆菌
宽度，微米       0.5-0.6
长度，微米       1.5-3.0
能动性           +
鞭毛突出         周毛的
革兰氏反应       -
被3％KOH溶解     +
氨肽酶(Cerny)    +
芽胞             -
氧化酶           +
过氧化氢酶       +
厌氧生长         -
ADH(醇脱氢酶)    +
来源于NO3的NO2 +
反硝化作用       +
脲酶             -
明胶的水解       -
Tween 80的水解   -
由下列化合物产生的酸(OF试验)
葡萄糖需氧        -
木糖80            -
底物利用
葡萄糖            -
果糖              -
阿拉伯糖          -
柠檬酸酯(盐)      +
苹果酸酯(盐)      +
甘露糖醇          -
节细菌属HSZ5(DSM 10328)的分类说明表征鉴定：                        具有显著杆菌-球菌生长循环的革兰
                              氏阳性不规则杆菌；严格需氧；在葡
                              萄糖中没有形成酸或气体。能动性                             -芽胞                               -过氧化氢酶                         +细胞壁中的内消旋-二氨基庚二酸：    无肽聚糖类型：                       A3α,L-Lys-L-Ser-L-Thr-L-Ala16SrDNA序列相似性：                用滋养节杆菌，分枝节杆菌和氧化节
                               杆菌对变异性最大的区域进行测序时
                               发现的最大值为98.2％
土壤杆菌/根瘤菌属HSZ30的分类说明
细胞形状                 多型杆菌
宽度(微米)                0.6-1.0
长度(微米)                1.5-3.0
革兰氏反应                -
被3％KOH溶解              +
氨肽酶                    +
芽胞                      -
氧化酶                    +
过氧化氢酶                +
能动性                    +
厌氧生长                  -
由硝酸盐产生的亚硝酸盐    -
反硝化作用                -
脲酶                      +
明胶的水解                -
从如下物质中产生酸：
L-阿拉伯糖                +
半乳糖                    -
松三糖                    -
岩藻糖                    +
阿糖醇                    -
甘露糖醇                  -
赤藓醇                    -
石蕊汁的碱化              +
酮乳糖                    -
16S rDNA的部分测序揭示与土壤杆菌属和根瘤菌属的样本具有较大的相似性，约为96％。明确地将其确定为这些属内物种是不可能的。
单纯杆菌K2的分类说明
细胞形状                杆菌
宽度(微米)              0.8-1.0
长度(微米)                 3.0-5.0
芽胞                       -
椭圆体                     -
圆形体                     -
孢子囊                     -
过氧化氢酶                 +
厌氧生长                   -
VP反应                     n.g.
最大温度
正生长时温度，℃           40
负生长时温度，℃           45
在pH为5.7培养基中的生长    -
NaCl 2％                   +
5％                        -
7％                        -
10％                       -
溶菌酶培养基               +
由下列物质产生酸(ASS)
D-葡萄糖                   +
L-阿拉伯糖                 +
D-木糖                     -
D-甘露糖醇                 +
D-果糖                     +
由果糖产生的气体           -
卵磷脂酶                   -
下列物质的水解
淀粉                       +
明胶                       +
酪蛋白                     -
Tween 80                   +
七叶苷                     -
利用下列物质
柠檬酸盐                  +
丙酸盐                    -
由硝酸盐产生的亚硝酸盐    +
吲哚                      -
苯丙氨酸脱氨基酶          -
精氨酸脱羟基酶            -
对细胞脂肪酸的分析确定它是芽胞杆菌属。16S rDNA部分测序表明与单纯芽胞杆菌的相似性为100％。
皮氏产碱菌K4的分类说明
细胞形状                  杆菌
宽度，微米                0.5-0.6
长度，微米                1.0-2.5
能动性                    +
鞭毛突出                  周毛的
革兰氏反应                -
被3％KOH溶解              +
氨肽酶(Cerny)             +
芽胞                      -
氧化酶                    +
过氧化氢酶                +
ADH                       -
从硝酸盐转化为亚硝酸盐    +
反硝化作用                -
脲酶                      +
明胶的水解                -
底物利用
葡萄糖                    -
果糖                      -
阿拉伯糖                  -
己二酸酯(盐)              +
癸酸酯(盐)                +柠檬酸酯(盐)                +苹果酸酯(盐)                +甘露糖醇                    -庚二酸酯(盐)                +
细胞脂肪酸的分布型是产碱杆菌属特有的，16S rDNA的部分测序表明与皮氏产碱菌有99.3％的相似性。
恶臭假单胞菌K32的分类说明
细胞形状                  杆菌
宽度(微米)                0.8-0.9
长度(微米)                1.5-4.0
能动性                    +
鞭毛突出                  极性＞1
革兰氏反应                -
被3％KOH溶解              +
氨肽酶(Cerny)             +
芽胞                      -
氧化酶                    +
过氧化氢酶                +
厌氧生长                  -
色素
荧光性的
脓青素                    -
ADH                       +
来源于硝酸盐的亚硝酸盐    -
反硝化                    -
脲酶                      -
明胶的水解                -
底物利用
己二酸酯(或盐)            -
柠檬酸酯(或盐)            +
苹果酸酯(或盐)            +
D-扁桃酸酯(或盐)      +
苯基乙酸酯(或盐)      +
D-酒石酸酯(或盐)      -
D-葡萄糖              +
海藻糖酶              -
甘露糖醇              -
苯甲酰甲酸酯(或盐)    -
丙二醇                +
丁胺                  +
苄胺                  +
色胺                  -
乙酰胺                +
马尿酸盐(或酯)        +
细胞脂肪酸的分布型是恶臭假单胞菌属特有的。
16S rDNA的部分测序表明与门多萨假单胞菌和产碱假单胞菌的相似性约为98％。与恶臭假单胞菌的相似性为97.4％。
然而，根据表型数据，这种菌株可毫无疑问地确定为恶臭假单胞菌属。
本发明的酶，N-酰基-L-脯氨酸酰基转移酶，例如可用常规的破裂法从上述微生物细胞中得到，这些酶较好从节细菌属HSZ5(DSM 10329)中获得。为此，例如可以使用超声法、弗氏法或溶菌酶法。这些酶可用如下性质表征：
N-酰基-L-脯氨酸酰基转移酶，它可用如下性质表征：
a)底物专一性：
水解N-苄氧羰基-L-脯氨酸、N-苯甲酰基-L-脯氨酸、N-异丁氧基羰基-L-脯氨酸、N-苄氧羰基-L-焦谷氨酸、N-苄氧羰基-DL-2-哌啶酸、N-苄氧羰基-L-丙氨酸。
b)pH最佳值：
pH最佳值为pH6.5±0.2
c)温度稳定性：
在高达43℃和pH6.5条件下培养6小时后，仍检测不到活性的丧失。
d)温度活性：
在50℃和pH6.5的条件下能检测到良好的活性。
e)抑制剂的作用：
苄醇和N-苄氧羰基-D-脯氨酸具有抑制作用。
用通式Ⅱ表示的N-保护环状D-氨基酸衍生物和/或用通式Ⅲ表示的环状L-氨基酸衍生物的本发明制备方法
Figure A9719295800161
式中A与-N-和-CH一起构成任意取代的4-、5-或6-元饱和杂环，R3是-(CH2)2COOH、任意取代的烷基、烷氧基、芳基或芳氧基；是这样进行的：在用通式Ⅳ表示的外消旋N-保护环状氨基酸衍生物中
Figure A9719295800162
式中A与-N-和-CH以及R3具有上述的含义；N-保护的环状L-氨基酸衍生物用上述的微生物或用它们的无细胞酶转化成环状L-氨基酸衍生物(通式Ⅲ)，并加以选择性地分离。在该生物转化过程中，除上述L-氨基酸衍生物外，还可分离得到的N-保护D-氨基酸衍生物(通式Ⅱ)。
用通式Ⅴ表示的N-保护脂族D-氨基酸衍生物和/或用通式Ⅵ表示的脂族L-氨基酸衍生物的制备方法与相应环状氨基酸衍生物的方法相类似，式中R3具有上述的含义，R4是氢、任意取代的直链烷基或ω-羟烷基，R5是氢或任意取代的直链烷基。用通式Ⅶ表示的外消旋N-保护脂族氨基酸衍生物用作该方法的原料。
Figure A9719295800171
式中R3、R4和R5具有上述的含义。
任意取代的饱和五元杂环的实例是脯氨酸、吡唑烷、咪唑啉、噁唑烷、异噁唑烷、噻唑烷、三唑烷。5-氧代脯氨酸(焦谷氨酸盐)例如可用作取代的饱和五元杂环。
任意取代的饱和6元杂环的实例是哌嗪、2-甲基哌啶、吗啉、十氢喹啉、十氢异喹啉、喹喔啉。氮杂环丁烷可用作四元任意取代的饱和杂环。
在下文中烷基定义为取代或未取代的C1-18烷基。C1-18烷基的实例包括甲基、氯甲基、羟甲基、乙基、丙基、丁基、异丁基、异丙基和硬脂基。下文中直链烷基定义为甲基、乙基、丙基或丁基。下文中ω-羟烷基定义为羟甲基、羟乙基、羟丙基或羟丁基。
下文中烷氧基定义为取代或未取代的C1-18烷氧基。C1-18烷氧基的实例包括甲氧基、芴甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基、叔丁氧基、异丁氧基和硬脂氧基。
可以将上述的相同基团用作任意取代的芳基或芳氧基。
特别优选的N-保护环状或脂族氨基酸衍生物(通式Ⅳ或Ⅶ的原料)是：N-Z-脯氨酸(R3=苄氧基)、N-叔丁氧羰基脯氨酸(R3=叔丁氧基)、N-乙酰基脯氨酸(R3=甲基)、N-琥珀酰脯氨酸(R3=-(CH2)2-COOH)、N-苯乙酰基脯氨酸(R3=苄基)、N-苯甲酰基脯氨酸(R3=苯基)、N-氯乙酰基脯氨酸(R3=氯甲基)、N-异丁氧羰基脯氨酸(R3=异丁氧基)、N-Z-2-哌啶酸(R3=苄氧基；6元饱和杂环=2-甲基哌啶)、N-Z-丙氨酸(R3=苄氧基、R4=甲基、R5=氢)、N-Z-丝氨酸(R3=苄氧基，R4=羟乙基，R5=氢)N-Z-焦谷氨酸(R3=苄氧基、五元饱和取代杂环=5-氧代脯氨酸)和N-Z-肌氨酸(R3=苄氧基，R5=甲基)。
原则上已知制备外消旋N-保护环状或脂族氨基酸及其衍生物的方法。在制备时，根据EP-A 0 057 092用已知的方法将相应的L-氨基酸外消旋化，然后再根据Grassmann & Wuensch(Chem.Ber.91(1958),462-465)用已知的方法与相应的N-保护基团反应。
一种由相应L-氨基酸为原料，在水介质中进行外消旋化和引入保护基，而不分离外消旋氨基酸的制备N-保护环状或脂族氨基酸的方法是未知的。
原则上，可以利用所有将外消旋型或其光学活性异构体的N-保护脯氨酸衍生物用作唯一氮源、唯一碳源或唯一碳和氮源的微生物的生物转化是可能的。同样适合的是从这些微生物中分离得到的N-酰基-L-脯氨酸酰基转移酶。对该方法特别适合的是上述节细菌属、产碱杆菌属、土壤杆菌/根瘤菌属、牙孢杆菌属或假单胞菌属微生物，具体为土壤杆菌/根瘤菌属HSZ30、单纯杆菌K2、节细菌属HSZ5、木糖氧化产碱菌反硝化亚种HSZ17、恶臭假单胞菌K32或皮氏产碱菌K4以及它们功能等同的变异体和突变体。
通过用静止细胞(不再需要碳和能源的非生长细胞)或生长细胞常规培养微生物可进行上述的生物转化。该生物转化较好用静止细胞进行。
这种生物转化可使用常规的介质，如低摩尔浓度磷酸盐缓冲液、三羟甲基氨基甲烷缓冲液或表1中所述的介质。这种生物转化较好在表1中所述的介质中进行。
通过一次加入或连续加入N-保护的氨基酸衍生物，使它的浓度不超过50％重量，较好不超过20％重量，可方便地进行这种生物转化。
介质的pH可以为3-12，较好为5-9。生物转化的温度宜为10-70℃，较好为20-50℃。
在本发明的方法中，N-保护的环状或脂族氨基酸衍生物完全转化为环状或脂族L-氨基酸衍生物。在本发明方法中，高产率地得到高对映体纯度的N-保护D-氨基酸衍生物(对映体过量超过98％)，然后进行分离。
用本发明方法制得的N-保护D-氨基酸衍生物和/或L-氨基酸衍生物可用常规的后处理方法(如萃取)进行分离。
实施例1：
选择利用N-Z-L-脯氨酸的微生物
首先制备能满足许多微生物生长要求的小型培养基(表1)：表1：小型培养基Na2SO4        0.1克/升Na2HPO4.2H2O 2.5克/升KH2PO4        1.0克/升NaCl            3.0克/升MgCl2.6H2O    0.4克/升CaCl2.2H2O    14.5毫克/升FeCl3.6H2O    0.8毫克/升微量元素溶液    1.0毫升/升维生素溶液      1.0毫升/升pH              7.0
加入果糖(5克/升)作为碳源。为浓集能选择性水解N-Z-L-脯氨酸的微生物，在该基础培养基中加入N-Z-L-脯氨酸(5克/升)作为唯一的氮源。然后用采自不同地方的土壤试样移植各种批料，并加以培养(30℃,120转/分)，直到可检测到明显可见的生长为止。然后将这种培养物的等分试样移植到相同体积的新鲜培养基中，培养到出现明显的混浊为止。将这过程重复三次。然后在固体培养基(组成与液体培养基相同，但仅加入20克/升的琼脂)上分离浓集的微生物。按此方法，得到约30种能将N-Z-L-脯氨酸用作唯一氮源的不同细菌分离物。
实施例2：
培养所选择的微生物
在上述的培养基中复制用实施例1中所述方法制得的分离物。用离心分离法收集具有足够细胞密度(OD6502.0)的所有培养物。用0.85％NaCl将沉淀的细胞重新悬浮和洗涤。在氯化钠溶液中重新悬浮后，用静止细胞检测水解N-Z-L-脯氨酸的能力。为此，在缓冲溶液(50mM三羟甲基氨基甲烷/HCl,pH7.0)中用N-Z-L-脯氨酸(5克/升)培养(30℃)适当量的细胞。在不同的时间移取等分试样，用薄层色谱检测由N-Z-脯氨酸释放出脯氨酸。许多分离物具有这种水解活性，特别是两种菌株HSZ5和HSZ17，德意志微生物保藏中心将其鉴定为节细菌属和木糖氧化产碱菌反硝化亚种。
实施例3
节细菌属HSZ5(DSM 10328)的生长和酶活性
用不同的碳源(N-Z-L-脯氨酸用作氮源)或氮源(果糖用作碳源)培育节细菌属HSZ5。将碳源加至5克/升，氮源加至2克/升。为了诱导所需的酶活性，如有必要，再加入1克/升的N-Z-L-脯氨酸。在试验的碳源中，仅利用了果糖、葡萄糖、蔗糖或甘露糖醇。在所有其它情况下，N-Z-L-脯氨酸用作碳源。酶活性仅在很小程度上取决于所用的碳源。相反，利用了所有试验的氮源，但在某些情况下明显降低了酶活性(表2)：
表2：用各种碳源(A)或氮源(B)培养时节细菌属HSZ5的生长和酶活性
A)碳源          细胞密度[OD650]   相对活性[％]果糖           12.0               100葡萄糖         15.0               150蔗糖           12.4               148甘油           3.7                183甘露糖醇       11.2               154柠檬酸盐       2.7                106苹果酸盐       3.9                124乙酸盐         3.5                144N-Z-L-脯氨酸   2.8                109
B)氮源    细胞密度[OD650]   相对活性[％]铵          8.4             22硝酸盐      7.6             6脲          7.8             12甘氨酸      8.0             17L-谷氨酸    9.6             43L-脯氨酸    10.8            64
实施例4：
N-酰基-L-脯氨酸酰基转移酶的诱导物
将果糖(5克/升)用作碳源，将L-谷氨酸盐(2克/升)用作氮源，在小型培养基(实施例1)中生长节细菌属HSZ5。再加入N-Z-L-脯氨酸、N-Z-DL-脯氨酸、N-Z-D-脯氨酸、N-Z-肌氨酸、N-Z-二乙胺、N-Z-甘氨酸、L-苯丙氨酰胺、苯甲酰胺、N-乙酰基-L-脯氨酸、N-乙酰基甘氨酸、乙酰胺(在所有情况下为1克/升)或明胶(5克/升)。每种情况下，收集细胞后，用静止细胞测试对N-Z-L-脯氨酸和N-Z-D-脯氨酸的酶活性(按实施例2所述的方法)。用高压液相色谱分析检定脯氨酸的结果表明，仅N-Z-L-脯氨酸和N-Z-DL-脯氨酸诱导了所需的酶活性。在这两种情况下，仅N-Z-L-脯氨酸被接受为底物，即在这两种情况下酶的选择性是高的。
实施例5
制备N-Z-L-脯氨酸
a)将果糖(5克/升)用作碳源，将N-Z-L-脯氨酸(5克/升)用作氮源，在小型培养基(实施例1)中生长节细菌属HSZ5。按上述的方法收集和洗涤细胞。在30℃、pH停滞(pH7.0)和搅拌下用N-Z-DL-脯氨酸(50克/升)培养静止细胞(OD650=30)。在不同的时间，取等分试样，用高压液相色谱(HPLC)监测N-Z-L-脯氨酸和N-Z-D-脯氨酸的浓度(见图1)。60分钟后，N-Z-L-脯氨酸几乎完全水解，而N-Z-D-脯氨酸在溶液中没有变化。因此，溶液中的N-Z-D-脯氨酸是高光学纯度的(对映体过量＞99％)。
b)在Chemap发酵罐(工作体积为2升)中，在将葡萄糖(30克/升)和L-脯氨酸(7克/升)用作碳源或氮源的小型培养基(参见实施例1)中，于30℃时将节细菌属HSZ5生长到细胞密度OD650＞35。然后为了诱导酶活性，加入少量的N-Z-DL-脯氨酸(5克/升)，将此混合物再培养一段时间。最后在20小时内再连续加入145克N-Z-DL-脯氨酸，然后将此混合物再培养5小时。用离心分离法除去细胞。然后用盐酸将培养基液体调节到pH＜3，用乙酸丁酯萃取得到在这些条件几乎不溶于水的N-Z-脯氨酸。将两相分离后得到L-脯氨酸的水溶液和N-Z-脯氨酸的有机溶液。将有机相真空浓缩后，将所得的N-Z-脯氨酸溶解在乙酸乙酯中，加入己烷结晶。分离得到41.4克N-Z-脯氨酸结晶(理论产率的53.4％)，用1H-NMR和熔点测量(75.3℃)确定其同一性和纯度。它有极好的光学纯度(根据高压液相色谱的分析结果，对映体过量＞99.5％，乙酸中c=1时，[α]4=60.0)。1H-NMR(400MHz,CD3OD)；ppm    7.35(m,5H)；
                         5.1(m,2H)；
                         4.3(m,1H)；
                         3.6-3.4(m,2H)；
                         2.3-2.2(m,1H)；
                         2.1-1.9(m,3H)
c)在一个发酵罐(标称体积为20升)中，在将葡萄糖(20克/升)和L-脯氨酸(7克/升)用作碳源或氮源的6升小型培养基(参见实施例1)中，将节细菌属HSZ5生长到细胞密度OD650＞30。然后为了诱导酶活性，加入112克50％(重/重)N-Z-DL-脯氨酸溶液，将此混合物再培养1小时。然后通过排掉不需要的量将培养物的体积减少到4升。然后在5.5小时内向此含有诱导细胞的4升培养物中再连续加入709克50％(重/重)N-Z-DL-脯氨酸溶液。将此混合物再培养17.5小时。在生物转化过程中，pH保持在7.5-8.5。完成反应后，得到4077克细胞悬浮液。从中用超过滤法除去细胞，按6a)中所述的方法对培养基液体的等分试样(1000克)进行后处理。分离得到31.24克N-Z-D-脯氨酸结晶(理论产率的85.0％)。它有极好的纯度(滴定含量=99.6％)和光学纯度(根据高压液相色谱的分析结果，对映体过量＞99.5％，乙酸中c=2时，[α]4=60.2)。
d)在一个450升发酵罐中，在将葡萄糖(13克/升)和L-脯氨酸(7克/升)用作碳源或氮源的250千克小型培养基(参见实施例1)中，将节细菌属HSZ5生长到所需的细胞密度(OD650约为25)。然后为了诱导酶活性，加入4千克50％(重/重)N-Z-DL-脯氨酸溶液。培养1小时后，溶液的pH慢慢增高(pH=7.5-8.5)，然后在pH停滞的条件下以20千克/小时的速度再加入67千克50％(重/重)N-Z-DL-脯氨酸溶液。然后将此混合物再培养20小时。由于反应快(最大速率约为12克N-Z-L-脯氨酸被水解/升×小时)，培养后8小时，反应已基本上完成(对映体过量＞98％)。用超离心法从320千克最后所得的培养物中除去细胞，按6a)中所述的方法对无细胞的培养基液体的等分试样(1444克)进行后处理。分离得到50.0克N-Z-D-脯氨酸结晶(理论产率为83.2％)，其纯度非常好(滴定含量＞99％)，光学纯度非常高(根据高压液体色谱分析，对映体过量＞99％)。图1：N-Z-L-脯氨酸被节细菌属HSZ5的静止细胞酶水解。
Figure A9719295800231
实施例6：
L-脯氨酸的外消旋化
将500毫摩尔L-脯氨酸溶解在125毫升的4N NaOH(500毫摩尔)。然后在一个高压容器中将此溶液加热到160℃，在此温度保持6小时，压力最高达到4.5巴。溶液冷却后，用比旋([α]5=-1.5)可以表明脯氨酸已基本上完成外消旋化。当仅用0.15摩尔当量的NaOH进行外消旋化时，得到类似的结果。然而，反应时间要增加到16小时。
实施例7：
制备N-Z-(DL)-脯氨酸
将100.0克DL-脯氨酸溶解在217毫升4N NaCl中。在恒温(5-10℃)和pH停滞(pH=11.5-12.0)条件下将氯甲酸苄酯(Z-Cl)滴加到该溶液中。共加入158.1克氯甲酸苄酯，再加入251.2克4NNaOH。为保持反应混合物的可搅拌能力，还加入150毫升的蒸馏水。然后用浓盐酸(76毫升)将该混合物酸化到pH=2.4，共用584毫升乙酸丁酯萃取。按类似于实施例6中所述的方法，将有机相中所含的N-Z-DL-脯氨酸结晶。结果，得到187.4克N-Z-DL-脯氨酸(理论产率的86.5％)。
实施例8：
制备N-Z-(DL)-脯氨酸(单釜反应)
将80.0克L-脯氨酸溶解在174毫升4N NaOH。然后在一个高压容器中将此溶液加热到160℃，在此温度保持6小时，压力最高达到4.4巴。溶液冷却后，用比旋([α]5=-0.6)可以确定脯氨酸已基本上完成外消旋化。然后在恒温(4℃)和pH停滞(pH=11.5-12.0)条件下将氯甲酸苄酯(Z-Cl)滴加到该溶液中。共加入124.5克氯甲酸苄酯，再加入203.7克4N NaOH。为保持反应混合物的可搅拌能力，还加入50毫升的蒸馏水。然后用加入4.7克浓盐酸中和该混合物。加入200毫升乙酸丁酯后，用67.4克浓盐酸将水相的pH最后调节到2.0。分离水相，共用200毫升乙酸丁酯多次萃取。合并有机相，并按类似于实施例6中所述的方法，使N-Z-DL-脯氨酸结晶。结果，得到151.3克N-Z-DL-脯氨酸(理论产率的87.3％)。
实施例9：
表征节细菌属HSZ5的N-酰基-L-脯氨酸酰基转移酶
a)N-酰基-L-脯氨酸酰基转移酶的pH最佳值
在把果糖(5克/升)和N-Z-L-脯氨酸(5克/升)用作碳源或氮源的如表1所示的培养基中，生长节细菌属HSZ5(30℃,120转/分)。达到所需的细胞密度后，用离心法收集细胞，放在氯化钠溶液(0.9％)中洗涤，最后重新悬浮在氯化钠溶液中。在保持所有其它参数的条件下(30℃,50克/升N-Z-L-脯氨酸，OD650=15-20)，测定酶活性与pH的关系。该批料在pH=7.0时的结果用作100％值。图2：节细菌属HSZ5的N-酰基-L-脯氨酸酰基转移酶活性与pH的关系。
Figure A9719295800251
本实施例得到一个常规的最佳曲线，其最佳pH范围为6.4-6.6。pH=5.0和pH=8.5处，不再测出酶活性。
b)节细菌属HSZ5的N-酰基-L-脯氨酸酰基转移酶活性与温度的关系
按9a)中所述的方法制备具有N-酰基-L-脯氨酸酰基转移酶活性的细胞。这次测定酶活性随温度的变化。所有的其它参数保持不变(pH6.5,50克/升N-Z-L-脯氨酸，OD650=20-25)。将该批料在30℃时的结果用作100％值。图3：节细菌属HSZ5的N-酰基-L-脯氨酸酰基转移酶活性与温度的关系
酶活性基本上以S形曲线增加。即使在50℃时，仍能测得良好的活性。这表明这种酶具有好的稳定性。
c)节细菌属HSZ5的N-酰基-L-脯氨酸酰基转移酶稳定性与温度的关系
按9a)所述的方法制备具有N-Z-L-脯氨酸酰基转移酶活性的细胞。为测定该酶的稳定性，在不同的温度下培养细胞悬浮液的等分试样(搅拌，pH=6.5,OD650～40-50)。在不同的时间提取试样，在标准条件下(30℃,pH=6.5,50克/升N-Z-L-脯氨酸，OD650-15-20)分析各试样的剩余N-酰基-L-脯氨酸酰基转移酶活性。观察到如下结果：
●高达43℃时，至少在6小时内可检测到完整的活性
●在43-53℃温度间，开始时酶活性稳定增加，但随后活性稍微减少，结
果在5-6小时后，仍有约80％初始酶活性。
●更高的温度使酶失去活性(60℃时2小时后剩余50％活性或在65℃时
1小时后完全失去活性)。
d)产物对节细菌属HSZ5的N-酰基-L-脯氨酸酰基转移酶活性的抑制作用
按9a)所述的方法制备具有N-Z-L-脯氨酸酰基转移酶活性的细胞。用不同浓度的水解N-Z-L-脯氨酸时所得产物(L-脯氨酸、N-Z-D-脯氨酸、苄醇)将细胞悬浮液的等分试样培养30分钟(30℃,pH6.4)然后在标准条件下(30℃,pH=6.5,50克/升N-Z-L-脯氨酸，OD650～15-20)测定各批料的酶活性。这里将在不加入一种产物的条件下培养的批料的结果用作100％值。
图4：节细菌属HSZ5的N-酰基-L-脯氨酸酰基转移酶活性与产物浓度的关系。
Figure A9719295800271
由图中可见，即使在高浓度下，L-脯氨酸也根本没有抑制酶活性。相反，N-Z-D-脯氨酸和苄醇随着浓度的增加使酶活性迅速降低。虽然N-Z-D-脯氨酸似乎起竞争抑制剂的作用(随浓度增加抑制呈线性增高)，但苄醇以非竞争方式起到抑制作用(在极限浓度上有活性)。
实施例10：
具有N-酰基-L-脯氨酸酰基转移酶的各种菌株的底物谱
a)在把各种N-保护氨基酸用作唯一氮源的条件下生长
在把果糖(5克/升)用作唯一碳源的如表1所述的培养基中生长节细菌属HSZ5、木糖氧化产碱菌反硝化亚种HSZ17、土壤杆菌/根瘤菌属HSZ30、单纯杆菌K2、皮氏产碱菌K4和恶臭假单胞菌K32。在每种情况下加入不同的N-保护氨基酸作为唯一的氮源(5克/升)。当细胞密度OD650＞0.5时，该批料评定为正的。
表3：在把各种N-保护氨基酸用作唯一氮源的条件下各种菌株的生长
HSZ5  HSZ17  HSZ30  K2  K4  K32
N-Z-L-脯氨酸     +     +     +     +     +     +
N-乙酰基-L-脯氨酸     +     +     +     +
N-琥珀酰基-L-脯氨酸     +     +
N-苯乙酰基-L-脯氨酸     +     +
N-苯甲酰基-L-脯氨酸     +     +
N-异丁氧羰基-L-脯氨酸     +     +     +
N-Z-L-焦谷氨酸     +     +     +     +     +     +
N-Z-L-丙氨酸     +     +     +     +
N-Z-L-丝氨酸     +     +
N-Z-L-肌氨酸     +
b)各种N-保护氨基酸的酶水解
在把果糖(5克/升)和N-Z-L-脯氨酸(5克/升)用作碳源或氮源的如表1所述的培养基中生长节细菌属HSZ5、木糖氧化产碱菌反硝化亚种HSZ17、土壤杆菌/根瘤菌属HSZ30、单纯杆菌K2、皮氏产碱菌K4和恶臭假单胞菌K32。达到所需的细胞密度后，用离心法收集细胞，放在氯化钠溶液(0.9％)中洗涤。在测试所有菌株的所需酶活性后，将细胞重新悬浮在100 mM磷酸钾缓冲液中(pH7.0)。加入各种N-保护氨基酸(最后浓度为100mM)后，在摇动和30℃条件下培养各批料，在合适的间隔取出试样。然后分析这些用于水解所用底物的试样。
表4：用含不同N-酰基-L-脯氨酸酰基转移酶的菌株的完整细胞酶水解不同的N-保护氨基酸
HSZ5  HSZ17  HSZ30  K2  K4  K32
N-Z-L-脯氨酸     +     +     +     +     +     +
N-BOC-L-脯氨酸     +     +     +     +
N-乙酰基-L-脯氨酸     +     +     +
N-琥珀酰基-L-脯氨酸     +
N-苯乙酰基-L-脯氨酸     +     +
N-苯甲酰基-L-脯氨酸     +     +     +     +     +     +
N-氯乙酰基-L-脯氨酸     +     +
N-异丁氧羰基-L-脯氨酸     +     +     +     +     +
N-Z-DL-2-哌啶酸     +     +     +
N-Z-L-丙氨酸     +     +     ++
N-Z-L-丝氨酸     +     +     +
申请人文件参考号LO/709 Wd/sh 国际申请
                     与保藏微生物有关的证明
                         (PCT13款至)
A．以下所作的证明与说明书第3页第14行的微生物有关
B．保藏鉴定    附页上进一步确定保藏物在分类学上的位置
保藏机构名称德意志微生物保藏中心
保藏机构地址(包括邮政编码和国家)德国不伦瑞克市D-38124马舍尔奥特尔路1b
保藏日14.11.95 保藏号DSM 10328
C．其它证明(如没有申请，请空白)    该信息在附页上延续
D．本证明的指定国(如果本证明不适用于所有指定国)
E.证明的独立事项(如没有申请，请空白)
下列证明以后呈送国际局(说明证明的一般性质，如“保藏号”)
仅供受理局使用
本表与国际申请一起收到
授权官员
仅供国际局使用
本表于    被国际局收到
授权官员
PCT/RO/134表(1992年7月)
                 与保藏微生物有关的证明
                    (PCT13款至)
A．以下所作的证明与说明书第3页第16行的微生物有关
B．保藏鉴定    在附页上进一步确定保藏物在分类学上的位置
保藏机构名称德意志微生物保藏中心
保藏机构地址(包括邮政编码和国家)德国不伦瑞克市D-38124马舍尔奥特尔路1b
保藏日14.11.95 保藏号DSM 10329
C．其它证明(如没有申请，请空白)    该信息在附页上延续
D．本证明的指定国(如果本证明不适用于所有指定国)
E．证明的独立事项(如没有申请，请空白)
下列证明以后呈送国际局(说明证明的一般性质，如“保藏号”)
仅供受理局使用
本表与国际申请一起收到
授权官员
仅供国际局使用
本表于    被国际局收到
授权官员
PCT/RO/134表(1992年7月)

Claims (11)

1．微生物，其特征在于它们能将用通式Ⅰ表示的外消旋型或其光学活性异构体之一的N-保护脯氨酸衍生物用作唯一的氮源、唯一的碳源、或唯一的碳和氮源，
Figure A9719295800021
式中R1是-(CH2)2-COOH、任意取代的C1-4烷氧基、芳基或芳氧基，R2是氢或=O。
2．如权利要求1所述的微生物，其特征在于它们能将用通式Ⅰ表示的N-保护L-脯氨酸衍生物用作唯一的氮源、唯一的碳源、或唯一的碳和氮源。
3．如权利要求1或2所述的微生物，其特征在于它们是节细菌属、土壤杆菌/根瘤菌属、牙孢杆菌、假单胞菌属或产碱杆菌属微生物。
4．如权利要求1-3中至少一项所述的微生物，其特征在于它们是节细菌属HSZ5(DSM 10328)、木糖氧化产碱菌反硝化亚种HSZ17(DSM 10329)、土壤杆菌/根瘤菌属HSZ30、单纯杆菌K2、恶臭假单胞菌K32或皮氏产碱菌K4以及它们功能等同的变异体和突变体。
5．N-酰基-L-脯氨酸酰基转移酶，其特征在于它具有如下性质：
a)底物专一性：
水解N-苄氧羰基-L-脯氨酸、N-苯甲酰基-L-脯氨酸、N-异丁氧基羰基-L-脯氨酸、N-苄氧羰基-L-焦谷氨酸、N-苄氧羰基-DL-2-哌啶酸、N-苄氧羰基-L-丙氨酸，
b)pH最佳值：
pH最佳值为pH6.5±0.2
c)温度稳定性：
在高达43℃和pH6.5条件下培养6小时后，仍检测不到活性的丧失。
d)温度活性：
在50℃和pH6.5的条件下能检测到良好的活性。
e)抑制剂的作用：
苄醇和N-苄氧羰基-D-脯氨酸具有抑制作用。
6．用通式Ⅱ表示的N-保护环状D-氨基酸衍生物和/或用通式Ⅲ表示的环状L-氨基酸衍生物的制备方法，
Figure A9719295800031
式中A与-N-和-CH一起构成任意取代的4-、5-或6-元饱和杂环，R3是-(CH2)2COOH、任意取代的烷基、烷氧基、芳基或芳氧基；其特征在于它是在用通式Ⅳ表示的外消旋N-保护环状氨基酸衍生物中
Figure A9719295800032
式中A与-N-和-CH以及R3具有上述的含义；N-保护的环状L-氨基酸衍生物用权利要求1-4中任一项所述的微生物或用权利要求5所述的无细胞酶转化成环状L-氨基酸衍生物(通式Ⅲ)，并加以选择性地分离，在该生物转化过程中，除所述环状L-氨基酸衍生物外，还可得到可选择性分离的N-保护环状D-氨基酸衍生物(通式Ⅱ)。
7．用通式Ⅴ表示的N-保护脂族D-氨基酸衍生物和/或用通式Ⅵ表示的脂族L-氨基酸衍生物的制备方法，
Figure A9719295800033
式中R3具有上述的含义，R4是氢、任意取代的直链烷基或ω-羟烷基，R5是氢或任意取代的直链烷基，其特征在于它是在用通式Ⅶ表示的外消旋N-保护脂族氨基酸衍生物中
Figure A9719295800041
式中R3、R4和R5具有上述的含义；N-保护的脂族L-氨基酸衍生物用权利要求1-4中任一项所述的微生物或用权利要求5所述的无细胞酶转化成脂族L-氨基酸衍生物(通式Ⅵ)，并加以选择性地分离，在该生物转化过程中，除所述脂族L-氨基酸衍生物外，还可得到可选择性分离的N-保护脂族D-氨基酸衍生物(通式Ⅴ)。
8．如权利要求6或7所述的方法，其特征在于所述的生物转化用节细菌属、土壤杆菌/根瘤菌属、牙孢杆菌、假单胞菌属或产碱杆菌属微生物进行。
9．用通式Ⅱ表示的N-保护环状D-氨基酸衍生物的制备方法，
Figure A9719295800042
式中A与-N-和-CH一起是任意取代的4-、5-或6-元饱和杂环，R3是-(CH2)2COOH、任意取代的烷基、烷氧基、芳基或芳氧基；其特征在于将用通式Ⅲ表示的环状L-氨基酸衍生物
Figure A9719295800043
式中A与-N-和-CH一起具有上述的含义，被外消旋成相应的环状氨基酸衍生物，它被转化成用通式Ⅳ表示的N-保护环状氨基酸衍生物，
Figure A9719295800051
式中A与-N-和-CH一起以及R3具有上述的含义，在后者中，N-保护的L-氨基酸衍生物用权利要求1-4中任一项所述的微生物或用权利要求5所述的无细胞酶转化成环状L-氨基酸衍生物，并加以选择性地分离，在该生物转化过程中，除所述环状L-氨基酸衍生物外，还可分离得到N-保护环状D-氨基酸衍生物(通式Ⅱ)。
10．用通式Ⅴ表示的N-保护脂族D-氨基酸衍生物的制备方法，
Figure A9719295800052
式中R3、R4和R5具有上述的含义；其特征在于将用通式Ⅵ表示的脂族L-氨基酸衍生物
Figure A9719295800053
式中R4具有上述的含义，被外消旋成相应的脂族氨基酸衍生物，它被转化成用通式Ⅶ表示的N-保护脂族氨基酸衍生物，
Figure A9719295800054
式中R3、R4和R5具有上述的含义，在后者中，N-保护的脂族L-氨基酸衍生物是用权利要求1-4中任一项所述的微生物或用权利要求5所述的无细胞酶转化成脂族L-氨基酸衍生物，并加以选择性地分离，在该生物转化过程中，除所述脂族L-氨基酸衍生物外，还可分离得到N-保护D-氨基酸衍生物(通式Ⅴ)。
11．如权利要求9或10所述的方法，其特征在于所述的反应在水介质中进行，而且不分离外消旋的氨基酸衍生物。
CN97192958A 1996-03-13 1997-03-12 N－保护d－脯氨酸衍生物的制备方法 Pending CN1213400A (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CH65696 1996-03-13
CH656/96 1996-03-13

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN1213400A true CN1213400A (zh) 1999-04-07

Family

ID=4192092

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN97192958A Pending CN1213400A (zh) 1996-03-13 1997-03-12 N－保护d－脯氨酸衍生物的制备方法

Country Status (12)

Country Link
US (1) US20020037559A1 (zh)
EP (1) EP0896617A1 (zh)
JP (1) JP2000506728A (zh)
KR (1) KR19990087341A (zh)
CN (1) CN1213400A (zh)
AU (1) AU2155797A (zh)
CA (1) CA2245543A1 (zh)
CZ (1) CZ281198A3 (zh)
NO (1) NO984206L (zh)
PL (1) PL328795A1 (zh)
SK (1) SK282099B6 (zh)
WO (1) WO1997033987A1 (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104244919A (zh) * 2012-03-30 2014-12-24 味之素株式会社 化妆品组合物
CN104592083A (zh) * 2015-01-06 2015-05-06 宁波海硕生物科技有限公司 一种制备n-乙酰-dl-硫代脯氨酸的方法

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0944730A1 (de) * 1996-12-16 1999-09-29 Lonza A.G. Verfahren zur herstellung von d-prolinderivaten
CA2299324A1 (en) * 1997-08-11 1999-02-18 Lonza Ag Method for producing cyclic .alpha.-amino acids free from enantiomers or their n-protected derivatives by means of a d-specific aminoacylase
DE10050123A1 (de) * 2000-10-11 2002-04-25 Degussa Verfahren zur Herstellung von Aminosäuren
WO2005054186A2 (en) * 2003-12-04 2005-06-16 Pfizer Inc. Methods for the preparation of stereoisomerically enriched amines

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4401820A (en) * 1981-01-23 1983-08-30 Tanabe Seiyaku Co., Ltd. Process for racemizing optically active α-amino acids or a salt thereof
DE3929570A1 (de) * 1989-09-06 1991-03-07 Degussa Mikrobiologisch hergestellte n-acyl-l-prolin-acylase, verfahren zu ihrer gewinnung und ihre verwendung
US5219741A (en) * 1989-09-06 1993-06-15 Degussa Ag Method of making L-proline using an N-acyl-L-protine acylase
DE4116980A1 (de) * 1991-05-24 1992-11-26 Degussa Verfahren zur herstellung enantiomerenreiner offenkettiger n-alkyl-l oder d-aminosaeuren

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104244919A (zh) * 2012-03-30 2014-12-24 味之素株式会社 化妆品组合物
US9211245B2 (en) 2012-03-30 2015-12-15 Ajinomoto Co., Inc. Cosmetic composition
CN104244919B (zh) * 2012-03-30 2016-06-29 味之素株式会社 化妆品组合物
CN104592083A (zh) * 2015-01-06 2015-05-06 宁波海硕生物科技有限公司 一种制备n-乙酰-dl-硫代脯氨酸的方法

Also Published As

Publication number Publication date
NO984206D0 (no) 1998-09-11
WO1997033987A1 (de) 1997-09-18
NO984206L (no) 1998-09-11
SK282099B6 (sk) 2001-11-06
KR19990087341A (ko) 1999-12-27
US20020037559A1 (en) 2002-03-28
PL328795A1 (en) 1999-02-15
JP2000506728A (ja) 2000-06-06
CZ281198A3 (cs) 1998-12-16
CA2245543A1 (en) 1997-09-18
EP0896617A1 (de) 1999-02-17
SK117198A3 (en) 1999-03-12
AU2155797A (en) 1997-10-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN1032436A (zh) 生物学生产酰胺的方法
CN1308443C (zh) 从脂肪族α，ω－二腈中制备内酰胺
CN1068630C (zh) 羧酸的制备方法
CN1117861C (zh) 来自棒状杆菌属细菌的新基因及其用途
CN1860237A (zh) 从发酵液中纯化琥珀酸的方法
CN1233660A (zh) 生产l－谷氨酸的细菌和生产l－谷氨酸的方法
CN85101191A (zh) L-肉毒碱的微生物学制备方法
CN1224697C (zh) 氨基醇及其衍生物的制备方法
CN1302116C (zh) （1r，4s）－或（1s，4r）－1－氨基－4－（羟甲基）－2－环戊烯衍生物的对映体的制备方法
CN1171992C (zh) L-脯氨酸4位羟基化酶的制备方法
CN1020471C (zh) 改进蒸馏酒质量的方法
CN1308670A (zh) 有机废水处理用微生物体和制剂
CN1213400A (zh) N－保护d－脯氨酸衍生物的制备方法
CN1209463C (zh) 利用L－古洛糖酸－γ－内酯脱氢酶生产L－抗坏血酸的方法
CN1202244C (zh) 具有天冬氨酸酶活性的蛋白和编码该蛋白的基因dna
CN1639328A (zh) 新型脱氢酶和编码该脱氢酶的基因
CN1916164A (zh) 生产D－N－氨基甲酰基－α－氨基酸的方法
CN1269950C (zh) 酰胺的制备工艺
CN1387566A (zh) 环状缩肽合成酶及其基因、以及环状缩肽的大规模生产系统
CN1008922B (zh) 新的α-1，6-葡萄糖苷酶及其生产方法
CN101031652A (zh) 4－氨基－4－去氧分支酸盐/酯(adc)和[3r,4r]－4－氨基－3－羟基环己－1,5－二烯－1－羧酸（3,4－cha）的生物合成生产
CN1159448C (zh) 制备HMG-CoA还原酶抑制剂的方法
CN1184311C (zh) L－脯氨酸3位羟基化酶的制造方法
CN1302117C (zh) 生产l－抗坏血酸的方法
CN1254536C (zh) 新型(r)－2－羟基－3－苯基丙酸(d－苯基乳酸)脱氢酶及其编码基因

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C02 Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001)
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication