CN113845589B

CN113845589B - SmcL单克隆抗体、分泌该抗体的杂交瘤细胞株及其应用和竞争ELISA检测方法

Info

Publication number: CN113845589B
Application number: CN202110959325.2A
Authority: CN
Inventors: 焦新安; 殷月兰; 冯有为; 徐尧; 陈祥; 潘志明; 黄金林; 顾丹
Original assignee: Yangzhou University
Current assignee: Yangzhou University
Priority date: 2021-08-20
Filing date: 2021-08-20
Publication date: 2023-04-07
Anticipated expiration: 2041-08-20
Also published as: CN113845589A

Abstract

本发明提供了一种SmcL单克隆抗体、分泌该抗体的杂交瘤细胞株及其应用和竞争ELISA检测方法，该单克隆抗体由保藏于中国典型培养物保藏中心的杂交瘤细胞株或其传代细胞株分泌产生，保藏编号为CCTCC NO:C2021175。本发明的杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体具有效价高、特异性好、与天然抗原亲和力较强的优势。基于此抗体建立的伊氏李斯特菌SmcL单抗竞争ELISA检测方法，灵敏度高，稳定性良好，与其它病原菌无交叉反应，能有效检测羊临床血清中SmcL抗体的水平，并可用于伊氏李斯特菌流行病学调查及临床免疫监测。

Description

SmcL单克隆抗体、分泌该抗体的杂交瘤细胞株及其应用和竞争ELISA检测方法

技术领域

本发明涉及生物技术检测技术领域，尤其涉及一种SmcL单克隆抗体、分泌该抗体的杂交瘤细胞株及其应用和竞争ELISA检测方法。

背景技术

单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes,Lm)和伊氏李斯特菌(Listeria ivanovii)是李斯特菌属的主要致病菌，能引起人和动物的李斯特菌病。其中伊氏李斯特菌主要感染反刍动物，导致牛羊的暴发性流产，给养殖业带来巨大的经济损失。近年来也出现了伊氏李斯特菌引起人胃肠炎、败血症的病例报道，需引起高度重视。

加强对养殖环节李斯特菌病的监测，能够在农场阶段发现感染动物并及时采取措施，从而防止患病家畜进入食品产业链，对公共卫生安全具有重要意义。李斯特菌病诊断的“金标准”是病原菌的分离。该方法耗时长，且由于活菌存在时间短和不定时排菌等原因，往往导致检测结果不准确。血清学检测方法常用于感染性疾病的辅助诊断，是对传统细菌分离培养方法的补充和支持。其中ELISA方法具有操作简便、速度快、能够高通量筛选大批量样品的优势，在动物流行病学调查及临床免疫监测中广泛使用。目前，已有用于检测李斯特菌病的商品化诊断试剂盒，是基于李斯特菌溶血素O(Listerolysin,LLO)的间接ELISA方法，该试剂盒无法区分单核细胞增生李斯特菌和伊氏李斯特菌引起的感染。迄今为止，尚未有针对伊氏李斯特菌感染的血清学检测方法的报道。

发明内容

本发明旨在解决现有技术中存在的技术问题。为此，本发明提供一种SmcL单克隆抗体、分泌该抗体的杂交瘤细胞株及其应用和竞争ELISA检测方法，目的是实现对伊氏李斯特菌的有效检测，且杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体具有效价高、特异性好、亲和力高、与天然抗原亲和力较强的优势。

基于上述目的，本发明提供了一种分泌伊氏李斯特菌SmcL单克隆抗体的杂交瘤细胞株，于中国典型培养物保藏中心保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:C2021175，保藏地址为中国.武汉.武汉大学，保藏时间为2021年7月8日，分类命名为：杂交瘤细胞株6E10。

本发明还提供一种伊氏李斯特菌的SmcL单克隆抗体，由所述的杂交瘤细胞株或其传代细胞株分泌产生。该SmcL单克隆抗体用于检测伊氏李斯特菌。

所述单克隆抗体包括重链和轻链，所述轻链包括氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1-3所示的三个互补决定区；所述重链包括氨基酸序列分别如SEQ ID NO.4-6所示的三个互补决定区。

优选的，所述轻链的全长氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示，所述重链的全长氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示。

本发明还提供一种多核苷酸，所述多核苷酸编码所述单克隆抗体。

优选的，所述多核苷酸中编码轻链的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，所述多核苷酸中编码重链的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示。

本发明还提供所述单克隆抗体在检测伊氏李斯特菌的检测试剂或试剂盒中的应用。

本发明还提供一种用于检测伊氏李斯特菌的试剂盒，所述试剂盒包括酶标抗体，所述酶标抗体为不限于辣根过氧化物酶标记的伊氏李斯特菌SmcL单克隆抗体。

优选的，所述试剂盒还包括包被抗原(原核表达的rHis-SmcL蛋白)、伊氏李斯特菌阳性血清/阴性血清、空白对照、包被液、封闭液、稀释液、洗涤液、3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)底物液、反应等本领域人员采用竞争ELISA检测的一般实验材料。

进一步地，所述包被抗原可预先包被在酶标板上，也可以提供空白酶标板与检测抗原，在检测前由操作者自行采用常规方法在酶标板上包被检测抗原。

进一步地，所述包被液可以为PH 9.6的碳酸盐缓冲液(CBS)；所述洗涤液为pH 7.2的PBST溶液，可以根据需要选用浓缩或未浓缩的洗涤液；所述封闭液为含有2％脱脂奶粉的PBS溶液；所述空白对照为pH 7.2的PBS溶液；所述稀释液为含有1％BSA的PBS溶液；所述反应终止液为2mol/L的H₂SO₄溶液。

通常情况下，本发明的试剂盒中，各试剂分别隔离储存。

本发明还提供所述伊氏李斯特菌SmcL单克隆抗体的竞争ELISA检测方法，所述检测方法包括采用所述SmcL单克隆抗体来检测伊氏利斯特菌；其是采用酶标抗体与血清中的天然抗体竞争包被抗原SmcL的结合位点，之后进行孵育和检测。

利用本发明的检测方法检测血清中SmcL抗体的具体步骤如下：

1)检测抗原包被酶标板；

①将待检测抗原用包被液稀释后，加入酶标板各孔；

②以洗涤液洗涤酶标板3次，每次2min；

③每孔加入300μL封闭液，37℃孵育3h；

④以洗涤液洗涤酶标板3次，每次2min；

2)样品孵育及检测；

①将用稀释液稀释后的伊氏李斯特菌阴性血清和阳性血清、空白对照与上述酶标抗体按照体积比1:1混合后加入各孔中，100μL/孔，37℃孵育3h；

②弃去样品反应液，以洗涤液洗涤酶标板6次，每次2min；

③加入底物液，100μL/孔，37℃孵育5min；

④加入终止液，50μL/孔，使用酶标仪于OD_450nm波长下测定吸光值；计算抑制率PI＝(1-血清样品的OD_450nm值/空白对照的OD_450nm)×100％，PI＞28.61％为阳性，PI≤28.61％为阴性。

本发明的有益效果：本发明的杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体具有效价高、特异性好、与天然抗原亲和力较强的优势。基于此抗体建立的伊氏李斯特菌SmcL单抗竞争ELISA检测方法，灵敏度高，稳定性良好，与其它病原菌无交叉反应，能有效检测羊临床血清中SmcL抗体的水平。该方法的建立填补了伊氏李斯特菌血清学检测方法的空白，并可用于伊氏李斯特菌流行病学调查及临床免疫监测。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明SmcL单抗竞争ELISA方法的ROC曲线图；

图2为本发明SmcL单抗竞争ELISA方法的灵敏度曲线图；

图3为本发明SmcL单抗竞争ELISA方法的特异性结果；

图4为本发明临床阳性血清样本中SmcL抗体效价测定图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明进一步详细说明。

需要说明的是，除非另外定义，本发明实施例使用的技术术语或者科学术语应当为本公开所属领域内具有一般技能的人士所理解的通常意义。

实施例1

杂交瘤细胞株6E10的获得

保藏号为CCTCC NO:C2021175。

1.1动物免疫

具体免疫步骤如下：以rHis-SmcL蛋白免疫6～8周龄雌性BALB/c小鼠。首次免疫时，将rHis-SmcL蛋白与弗氏完全佐剂按照体积比1:1进行混合并充分乳化，免疫剂量为50μg/只，皮下多点注射。14天后进行第二次免疫，二免使用的佐剂为弗氏不完全佐剂，其余步骤与一免完全相同。二免后7天，采集小鼠血清，并通过间接ELISA检测血清中SmcL的抗体效价，选择抗体水平最高的小鼠加强免疫。二免后14天进行加强免疫，将rHis-SmcL蛋白腹腔注射入小鼠体内，免疫剂量为100μg/只。加强免疫后第3天，取小鼠脾脏淋巴细胞用于细胞融合。

1.2细胞融合

具体步骤如下：按生物安全方法处死免疫鼠，75％酒精浸泡消毒5min，无菌取脾细胞与处于对数生长期的骨髓瘤细胞SP2/0在PEG(MW1450)作用下融合，用ICR小鼠腹腔巨噬细胞作为饲养细胞，融合好的细胞及饲养细胞用HAT培养基悬浮，分装96孔板，置37℃、5％CO₂培养箱中培养。5天后加入新鲜HAT培养基，10天后改用HT培养基进行培养，定期观察，换液和检测。

1.3间接ELISA检测方法的建立

采用间接ELISA方法筛选阳性细胞克隆。方阵试验确定检测抗原rMBP-SmcL蛋白的包被浓度。检测抗原包被缓冲液横向梯度稀释，每孔100μL包被酶标板，4℃过夜；PBST洗涤3次，每孔加入300μL封闭液，4℃过夜；免疫鼠血清纵向倍比稀释，每孔100μL，SPF小鼠血清以同样倍数稀释作为阴性对照，37℃孵育2h；用PBST洗第三次，加入工作浓度的HRP标记的羊抗鼠IgG抗体，每孔100μL，37℃孵育1h；PBST洗涤后，每孔加入100μL TMB显色5min；加入终止液后，使用酶标仪于OD_450nm波长下测定吸光值，判定检测抗原的最佳包被浓度。

1.4筛选阳性克隆

采用建好的间接ELISA方法检测杂交瘤细胞分泌的抗体情况。具体方法如下：将杂交瘤细胞培养上清加入预先包被好的酶标板中，100μL/孔，以SP2/0细胞上清作为阴性对照，免疫多抗血清作为阳性对照，37℃水浴2h；PBST洗涤3次；加入工作浓度的HRP标记的羊抗鼠IgG抗体，100μL/孔，37℃水浴1h；洗涤后，TMB显色5min，显色终止后酶标仪测定OD_450nm读数。被测孔OD_450nm读数大于阴性对照两倍以上判定为阳性。将筛选到的1株阳性克隆命名为阳性细胞克隆6E10。

1.5阳性杂交瘤细胞的克隆化

采用有限稀释法对筛选到的阳性细胞克隆6E10进行连续3次的亚克隆并进行保藏。阳性细胞克隆6E10对应保藏号为CCTCC NO:C2021175的杂交瘤细胞株。

伊氏李斯特菌SmcL单抗的制备

2.1腹水的制备

制备腹水时选用10周龄左右的BALB/c雌鼠。以液体石蜡作为诱导剂腹腔注射到小鼠体内，500μL/只。一周以后，每只小鼠注射5×10 ⁵个杂交瘤细胞。待到小鼠腹部明显膨大即可采集腹水。将收集的腹水室温离心去除沉淀，收集上清，置于-70℃保存。保藏号为CCTCC NO:C2021175的杂交瘤细胞株或其传代细胞株(对应杂交瘤细胞6E10)分泌产生的单克隆抗体记作单克隆抗体6E10。

2.2腹水效价的测定

在包被有检测原的酶标板中加入倍比稀释的单抗腹水，每孔100μL；以同样倍比稀释SP2/0腹水作为阴性对照，37℃孵育2h；用PBST洗涤3次，加入工作浓度的HRP标记的羊抗鼠IgG抗体，每孔100μL，37℃孵育1h；PBST洗涤后，加入TMB显色，终止后读取OD_450nm处吸光度值并分析实验结果。以P/N值≥2.1为判定标准，分析单克隆抗体腹水效价。

结果显示，单克隆抗体6E10的腹水效价达到1:52428800。

2.3单抗的纯化和标记

将制备的6E10腹水使用Protein G亲和层析方法进行纯化。

将纯化后的6E10单抗进行辣根过氧化物酶标记。

2.4杂交瘤细胞测序

杂交瘤细胞测序结果表明，单克隆抗体6E10轻链可变区互补决定区1(CDR1)氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，具体为：KASQDINSNLS。

轻链可变区互补决定区2(CDR2)氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，具体为：RTNRLLD。

轻链可变区互补决定区3(CDR3)氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，具体为：LQYAEFPPT。

重链可变区互补决定区1(CDR1)氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，具体为：DAWMD。

重链可变区互补决定区2(CDR2)氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，具体为：EIRSKAKNHATYYAESVKG。

重链可变区互补决定区3(CDR3)氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示，具体为：GFAY。

轻链全长氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示：

MRTPAQFLGILLLWFPGIKCDIKMTQSPSSMYASLGERVTITCKASQDINSNLSWFQQKPGKSPKTLMYRTNRLLDGVPSRFSGSGSGQDYSLTISSLEYEEMGMYYCLQYAEFPPTFGGGTKLEIK

编码轻链的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示：

ATGAGGACCCCTGCTCAGTTTCTTGGAATCTTGTTGCTCTGGTTTCCAGGTATCAAATGTGACATCAAGATGACCCAGTCTCCATCTTCCATGTATGCATCTCTAGGAGAGAGGGTCACTATCACTTGCAAGGCGAGTCAGGACATTAATAGCAATTTAAGCTGGTTCCAGCAGAAACCAGGGAAATCTCCTAAGACCCTGATGTATCGTACAAACAGACTCTTAGATGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGCAAGATTATTCTCTCACCATCAGCAGCCTGGAGTATGAAGAAATGGGAATGTATTATTGTCTACAGTATGCTGAGTTTCCTCCGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAA

重链全长氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示：

MYLGLNYVFIVFLLNGVQSEVKLEESGGGLVQPGGSKKLSCAASGFTFSDAWMDWVRQSPEKGLEWVAEIRSKAKNHATYYAESVKGRFTISRDDSKSSVYLQMNSLRAEDTGIYYCNGGFAYWGQGTLVTVSA

编码重链的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示：

ATGTACTTGGGACTGAACTATGTATTCATAGTTTTTCTCTTAAATGGTGTCCAGAGTGAAGTAAAGCTTGAGGAGTCTGGAGGAGGCTTGGTGCAACCTGGAGGATCCAAGAAACTCTCTTGTGCTGCCTCTGGATTCACTTTTAGTGACGCCTGGATGGACTGGGTCCGCCAGTCTCCAGAGAAGGGGCTTGAGTGGGTTGCTGAAATTAGAAGCAAAGCTAAAAATCATGCAACATACTATGCTGAGTCTGTGAAAGGGAGGTTCACCATCTCAAGAGATGATTCCAAAAGTAGTGTCTACCTGCAAATGAACAGCTTAAGAGCTGAAGACACTGGCATTTATTACTGTAACGGGGGGTTTGCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCA

单克隆抗体的特性鉴定

3.1单抗的亚类鉴定

使用商品化鼠源单抗亚类试剂盒对单抗进行鉴定。在包被好检测原蛋白的酶标板中加入杂交瘤细胞培养上清，37℃孵育2h。将羊抗鼠IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgM、IgA按照1:1000进行稀释，每孔100μL，37℃孵育30min。将HRP-兔抗羊IgG按照1:5000稀释，100μL/孔，37℃孵育15min。加入TMB显色，终止后读取OD_450nm处吸光度值并分析实验结果。

结果显示，单抗6E10为IgG1亚类。

3.2单抗的特异性鉴定

通过Western blot对单抗6E10所识别抗原的特异性进行鉴定。分别取纯化后的rHis-SmcL、rMBP-SmcL、His标签蛋白、MBP标签蛋白进行SDS-PAGE电泳。电泳结束后，使用快速转印仪将蛋白转印至NC膜上。封闭条件是5％脱脂奶的PBST室温孵育2h。将纯化后的6E10单抗用5％脱脂奶的PBST稀释至工作浓度，室温摇床孵育3h，结束后以PBST洗5次，每次2min。将HRP-羊抗鼠IgG 1:8000稀释，室温摇床孵育1h，结束后以PBST洗6次，每次2min。ECL显色2min后，置于GE Amersham Imager 600超敏感多功能成像仪下成像。

结果显示，单抗6E10与纯化后的rHis-SmcL和rMBP-SmcL蛋白特异性反应，条带大小正确，与His标签蛋白及MBP标签蛋白均无反应。

3.3单抗的交叉反应性鉴定

分别提取伊氏李斯特菌、Lm、无害李斯特菌、塞氏李斯特菌、沙门菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的天然分泌蛋白。利用Western blot鉴定单抗6E10对不同菌株的交叉反应性。

结果显示，单抗6E10仅与伊氏李斯特菌的天然分泌蛋白反应，与其它常见病原菌无交叉反应。

3.4单抗的亲和力测定

将检测原蛋白分别稀释至不同浓度加入酶标板中，每孔100μL。将纯化后的单抗6E10梯度稀释，每孔100μL，置于37℃孵育2h。加入HRP-羊抗鼠IgG(1:5000稀释)，每孔100μL，置于37℃孵育1h。结束后进行显色。抗体亲和力常数(Kaff)的计算公式为Kaff＝(n－1)/2(n[Ab′]－[Ab]_t)。其中，[Ab′]和[Ab]_t分别表示抗原浓度为[Ag′]和[Ag]_t时，OD＝1/2OD_max所对应的抗体浓度；n为抗原[Ag′]和[Ag]_t之间的稀释倍数。

根据公式计算单抗6E10的亲和力常数为1.97×10¹⁰M^-1，属于高亲和力抗体。

SmcL单抗竞争ELISA方法的建立

4.1包被抗原和酶标抗体工作浓度的确定

通过ELISA棋盘法确定抗原最佳包被浓度和酶标抗体最佳稀释倍数。使用CBS将rHis-SmcL蛋白分别稀释至不同浓度(1.5μg/mL、1.25μg/mL、1.0μg/mL和0.75μg/mL)，100μL/孔，4℃过夜孵育。次日每孔加入300μL含有2％BSA的PBS，于37℃孵育3h。血清样品按照1:10进行稀释，酶标抗体HRP-6E10分别按照1：10000、1:20000、1:30000和1:40000进行稀释。将稀释好的血清样品和酶标抗体同时加入酶标板中，每孔各50μL，置于摇床上室温混匀5min，随后于37℃孵育2h。加入TMB显色，终止后读取OD_450nm处吸光度值。血清抑制率(PI)的计算公式为：抑制率＝(1-检测血清OD_450nm/空白对照OD_450nm)×100％。选择阳性抑制率/阴性抑制率(P/N)数值最大的条件作为抗原和酶标抗体的最适工作浓度。

比较各组阴、阳性血清抑制率和P/N值，确定rHis-SmcL蛋白最佳包被抗原浓度为1.25μg/mL，酶标抗体最佳稀释倍数为1:10000(72ng/mL)。

4.2血清稀释倍数的确定

以最适抗原浓度包被酶标板。将血清样品按照1:10、1:15、1:20和1:25进行稀释后，分别与最适浓度的酶标抗体1:1混合均匀。计算各个稀释倍数下的PI值及P/N值，选取P/N值最大的条件作为血清样品的最佳稀释倍数。

综合考虑P/N值及阴阳性抑制率，选择1:15作为血清样品的最适稀释倍数。

4.3封闭液的确定

分别设置2％BSA、5％BSA、2％脱脂奶和5％脱脂奶作为封闭液，对不同封闭液的封闭效果进行探索。比较各条件下的PI值及P/N值，选择P/N值最大条件下的封闭液作为最适封闭液。

结果显示，2％脱脂奶为最佳封闭液。

4.4封闭时间的确定

在上述最适条件的基础上，设置不同的封闭时间(2h、2.5h、3h和3.5h)，其余操作不变。分别计算各个时间点的PI值及P/N值，选择P/N值最大的时间点作为最适封闭时间。

封闭3h时P/N数值较大且稳定性更好。因此最理想的封闭时间为3h。

4.5酶标抗体孵育时间的确定

基于上述实验确定的最适条件，设置不同的酶标抗体孵育时间(0.5h、1.0h、1.5h、2.0h、2.5h和3h)，其余操作不变。分别计算不同时间点的PI值及P/N值，选择P/N值最大的时间点作为酶标抗体最适孵育时间。

选择3.0h作为酶标抗体的最适孵育时间。

4.6底物作用时间的确定

在上述确定的最佳条件的基础上，分别设置不同的显色时间(5min、7min、9min和11min)，其余操作不变。对不同显色时间下的PI值及P/N值进行计算，选择P/N值最大的时间点作为底物最适作用时间。

当底物作用时间为5min时，P/N值最大，因此选择5min作为底物最适作用时间。

4.7Cut off值的确定

按照上述实验确定的竞争ELISA反应条件，对62份阳性血清和40份阴性血清进行检测，计算每份血清的PI值。利用SPSS Statistics 17.0软件对数据进行分析，并绘制受试者工作特征曲线(ROC曲线)。以尤登指数(尤登指数＝敏感性+特异性-1)最大处的数值作为竞争ELISA的Cut off值。

利用SPASS软件对数据进行分析并绘制ROC曲线(图1)，对角线为参考线。对ROC曲线下面积进行检验，结果表明曲线下面积为0.989，P<0.001，统计学上存在极显著差异，说明该方法可用于对血清中SmcL抗体的检测。当尤登指数最大时，竞争ELISA的最佳临界值为28.61％，此时敏感性和特异性分别为88.7％和100％。这表明当样品的抑制率大于28.61％时，判定为阳性，反之则为阴性。

SmcL单抗竞争ELISA方法的特性分析

5.1竞争ELISA的检测限测定

基于自身抑制率实验的原理，将纯化的SmcL单抗6E10梯度稀释至不同浓度(5μg/mL、2.5μg/mL、1.25μg/mL、0.63μg/mL、0.32μg/mL、0.16μg/mL、0.08μg/mL和0.04μg/mL)，分别与最适工作浓度的酶标抗体等体积混合。按照建立的竞争ELISA方法对不同浓度的样品进行检测，并计算PI值。以样品浓度为横坐标、PI值为纵坐标绘制竞争ELISA的灵敏度曲线如图2所示。PI值大于Cut off时的最低抗体浓度即为该方法的检测限。

根据上述结果，可以初步确定SmcL单抗竞争ELISA方法的检测限为0.16μg/mL。

5.2竞争ELISA的特异性测定

按照上述建立的竞争ELISA方法，分别对Lm、大肠杆菌、弯曲菌、结核分枝杆菌、肠炎沙门菌、鼠伤寒沙门菌和甲型流感病毒H5N1的阳性血清进行检测，同时设立阳性血清以及阴性血清对照。计算各血清样品的PI值并与该方法的Cut off进行比较，判断是否存在交叉反应。

结果如图3所示，该竞争ELISA检测方法的特异性良好，与其它常见的病原菌或病毒阳性血清无交叉反应。

5.3竞争ELISA重复性实验

对SmcL单抗竞争ELISA方法的重复性进行检测。对于批内重复性实验，使用同一批次抗原包被的酶标板，分别在三个时间点对8份羊血清样品进行检测，统计实验数据并分析三次实验中各样品的变异系数(CV)。对于批间重复性实验，分别制备三个批次的抗原，在完全相同的实验条件下，用包被有不同批次抗原的酶标板对8份羊血清样品进行检测，统计实验数据并分析CV值。

随机选择8份抗体水平不同的羊血清样品进行批内和批间重复性实验。对实验数据进行统计学分析，结果如表1所示。该竞争ELISA方法的批内变异系数在2.99％～13.49％之间，批间变异系数在3.31％～11.30％之间，均低于15％。上述结果表明，SmcL单抗竞争ELISA变异程度较小，具有良好的重复性。

表1竞争ELISA重复性实验结果

羊血清样品的检测

利用本研究建立的竞争ELISA方法，针对流行病学调查中分离到伊氏李斯特菌的5家羊养殖场的73份血清样品进行检测，分析羊血清中SmcL蛋白的抗体水平。参考实施例1中的间接ELISA方法的实验条件，随机挑选7份检测结果为阳性的临床血清样品，对其SmcL抗体效价进行测定。

利用该方法检测了来自5家羊养殖场的73份血清样品，结果显示共有30份血清样品中SmcL抗体呈阳性，43份血清抗体水平为阴性，阳性率达41.10％。随机选择7份阳性样品进行效价分析，结果如图4所示，血清中SmcL抗体效价均在1:800以上，表明该竞争ELISA的检测结果可靠。

所属领域的普通技术人员应当理解：以上任何实施例的讨论仅为示例性的，并非旨在暗示本公开的范围(包括权利要求)被限于这些例子；在本发明的思路下，以上实施例或者不同实施例中的技术特征之间也可以进行组合，步骤可以以任意顺序实现，并存在如上所述的本发明的不同方面的许多其它变化，为了简明它们没有在细节中提供。

本发明的实施例旨在涵盖落入所附权利要求的宽泛范围之内的所有这样的替换、修改和变型。因此，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何省略、修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 扬州大学

<120> SmcL单克隆抗体、分泌该抗体的杂交瘤细胞株及其应用和竞争ELISA检测方法

<130> 1

<141> 2021-08-20

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Ser Asn Leu Ser

1 5 10

<210> 2

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Arg Thr Asn Arg Leu Leu Asp

1 5

<210> 3

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Leu Gln Tyr Ala Glu Phe Pro Pro Thr

1 5

<210> 4

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Asp Ala Trp Met Asp

1 5

<210> 5

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Glu Ile Arg Ser Lys Ala Lys Asn His Ala Thr Tyr Tyr Ala Glu Ser

1 5 10 15

Val Lys Gly

<210> 6

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Gly Phe Ala Tyr

1

<210> 7

<211> 127

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

Met Arg Thr Pro Ala Gln Phe Leu Gly Ile Leu Leu Leu Trp Phe Pro

1 5 10 15

Gly Ile Lys Cys Asp Ile Lys Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Met Tyr

20 25 30

Ala Ser Leu Gly Glu Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp

35 40 45

Ile Asn Ser Asn Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro

50 55 60

Lys Thr Leu Met Tyr Arg Thr Asn Arg Leu Leu Asp Gly Val Pro Ser

65 70 75 80

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Gln Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser

85 90 95

Ser Leu Glu Tyr Glu Glu Met Gly Met Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Ala

100 105 110

Glu Phe Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

115 120 125

<210> 8

<211> 381

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

atgaggaccc ctgctcagtt tcttggaatc ttgttgctct ggtttccagg tatcaaatgt 60

gacatcaaga tgacccagtc tccatcttcc atgtatgcat ctctaggaga gagggtcact 120

atcacttgca aggcgagtca ggacattaat agcaatttaa gctggttcca gcagaaacca 180

gggaaatctc ctaagaccct gatgtatcgt acaaacagac tcttagatgg ggtcccatca 240

aggttcagtg gcagtggatc tgggcaagat tattctctca ccatcagcag cctggagtat 300

gaagaaatgg gaatgtatta ttgtctacag tatgctgagt ttcctccgac gttcggtgga 360

ggcaccaagc tggaaatcaa a 381

<210> 9

<211> 134

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

Met Tyr Leu Gly Leu Asn Tyr Val Phe Ile Val Phe Leu Leu Asn Gly

1 5 10 15

Val Gln Ser Glu Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln

20 25 30

Pro Gly Gly Ser Lys Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe

35 40 45

Ser Asp Ala Trp Met Asp Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu

50 55 60

Glu Trp Val Ala Glu Ile Arg Ser Lys Ala Lys Asn His Ala Thr Tyr

65 70 75 80

Tyr Ala Glu Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser

85 90 95

Lys Ser Ser Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr

100 105 110

Gly Ile Tyr Tyr Cys Asn Gly Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

115 120 125

Leu Val Thr Val Ser Ala

130

<210> 10

<211> 402

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

atgtacttgg gactgaacta tgtattcata gtttttctct taaatggtgt ccagagtgaa 60

gtaaagcttg aggagtctgg aggaggcttg gtgcaacctg gaggatccaa gaaactctct 120

tgtgctgcct ctggattcac ttttagtgac gcctggatgg actgggtccg ccagtctcca 180

gagaaggggc ttgagtgggt tgctgaaatt agaagcaaag ctaaaaatca tgcaacatac 240

tatgctgagt ctgtgaaagg gaggttcacc atctcaagag atgattccaa aagtagtgtc 300

tacctgcaaa tgaacagctt aagagctgaa gacactggca tttattactg taacgggggg 360

tttgcttact ggggccaagg gactctggtc actgtctctg ca 402

Claims

1.一种分泌伊氏李斯特菌SmcL单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其特征在于，所述杂交瘤细胞株的保藏号为CCTCC NO:C2021175。

2.一种伊氏李斯特菌SmcL单克隆抗体，其特征在于，由权利要求1所述的杂交瘤细胞株分泌产生。

3.根据权利要求2所述的伊氏李斯特菌SmcL单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体包括重链和轻链，所述轻链包括氨基酸序列分别如SEQ ID NO .1-3所示的三个互补决定区；所述重链包括氨基酸序列分别如SEQ ID NO .4-6所示的三个互补决定区。

4.根据权利要求3所述的伊氏李斯特菌SmcL单克隆抗体，其特征在于，所述轻链的全长氨基酸序列如SEQ ID NO .7所示，所述重链的全长氨基酸序列如SEQ ID NO .9所示。

5.一种多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸编码如权利要求2-4任一项所述单克隆抗体。

6.根据权利要求5所述的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸中编码轻链的核苷酸序列如SEQ ID NO .8所示，所述多核苷酸中编码重链的核苷酸序列如SEQ ID NO .10所示。

7.一种用于检测伊氏李斯特菌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括酶标抗体，所述酶标抗体为辣根过氧化物酶标记的伊氏李斯特菌SmcL单克隆抗体, 伊氏李斯特菌SmcL单克隆抗体由权利要求1所述的杂交瘤细胞株分泌产生。

8.根据权利要求7所述的用于检测伊氏李斯特菌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括包被抗原、伊氏李斯特菌阳性血清和/或阴性血清、包被液、封闭液、稀释液、洗涤液、底物液或反应终止液中的一种或多种。