CN113832170B

CN113832170B - 玉米ZmHSMT3基因及其在降低水稻籽粒镉积累中的应用

Info

Publication number: CN113832170B
Application number: CN202110952858.8A
Authority: CN
Inventors: 曹方彬; 林凯娜
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2021-08-19
Filing date: 2021-08-19
Publication date: 2022-09-06
Anticipated expiration: 2041-08-19
Also published as: CN113832170A

Abstract

本发明公开了玉米ZmHSMT3基因及其在降低水稻籽粒镉积累中的应用，属于基因工程技术领域。玉米ZmHSMT3基因的CDS区核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明通过对玉米ZmHSMT3基因的克隆分析，并结合转基因技术在水稻中进行异源过表达对该基因进行功能验证，ZmHSMT3过表达植株对镉的耐受性显著增强，且籽粒中的镉含量显著降低。本发明为水稻籽粒低积累育种与生产提供了一种可行的技术方案。

Description

玉米ZmHSMT3基因及其在降低水稻籽粒镉积累中的应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及玉米ZmHSMT3基因及其在调控水稻耐镉性及降低水稻籽粒镉积累中的应用。

背景技术

镉(Cadmium,Cd)是生物毒性强和农田受污染最普遍的重金属之一，镉的迁移性较强，易被植物吸收并转移至地上部，超过一定限度不仅对作物生长发育造成伤害，导致产量和品质下降，更有可能通过食物链严重威胁人类健康。因此，减少作物食用器官重金属积累已成为持续高效利用土地资源和保证农产品质量安全的一项重要科学任务。

对于已污染土壤，虽然曾提出过包括生物修复、降低土壤重金属含量等多种方法(技术)，但迄今均未能有效地应用于大面积土壤的治理。事实上，对于中、轻度大面积镉污染的农田，实现生产的连续性和产品的安全性且最经济有效的途径就是培育与种植食用器官镉积累少的作物品种，而挖掘镉低积累种质与相关基因，是开展相关作物育种和生产调控的基础。

如专利文献CN107177599A公开了一个从哥伦比亚野生型的拟南芥中克隆得到的增强植物对镉毒害的耐受性并降低植物镉含量的编码基因 WRKY13(AT4G39410)，具体公开：利用基因工程技术构建35S:WRKY13 过量表达载体，通过浸花法转入野生型植株，使其在野生型中过量表达，植物表现为耐镉。又如专利文献CN109880829A公开了一个从大麦中克隆得到的具有耐镉特性的基因HvPAA1，该基因能调控大麦对镉的吸收，沉默后使大麦对镉的吸收增加，耐受性显著降低。

水稻是全世界重要的粮食作物，全球有一半以上人口以水稻为主食。水稻对镉的吸收和积累较强，即使种植在非镉污染土壤中，籽粒镉含量也可能会超过我国所规定的最大限额。因此，我们迫切需要发掘出籽粒低镉积累关键基因，对培育水稻籽粒低镉积累新品种具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一个能够参与调控水稻籽粒镉积累的基因，用于培育籽粒低镉积累水稻品种。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明以前期筛选出的玉米籽粒镉高积累和低积累基因型为材料，镉胁迫后进行根系转录组测序，从结果中鉴定出一个在玉米籽粒镉低积累基因型中高表达的基因ZmHSMT3。该基因的CDS区全长1017bp，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明还提供了所述玉米ZmHSMT3基因编码的蛋白质，其氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示。ZmHSMT3蛋白由338个氨基酸残基组成，分子量为37.0KDa，等电点为5.53，功能域预测分析显示含1个S-甲基转移酶功能域。

本发明提供了所述的玉米ZmHSMT3基因在调控作物对镉胁迫耐受性中的应用。本发明研究表明，将玉米ZmHSMT3基因在作物中异源过表达，可显著提高作物对镉胁迫的耐受性。

进一步的，所述作物为水稻。

所述应用包括：将核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的ZmHSMT3基因片段通过转基因技术转入水稻中，筛选得到功能性获得的转基因植株。

当玉米ZmHSMT3基因在水稻中异源过表达使植株耐镉性增强，显著减少植株对镉的吸收，降低水稻籽粒的镉积累。

具体的，本发明还提供了一种降低水稻籽粒镉积累的育种方法，包括以下步骤：

(1)将核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的ZmHSMT3基因片段插入具有 35s启动子的过表达载体中，构建重组质粒；

(2)利用农杆菌介导技术将目的片段转入受体水稻中，培育筛选得到功能性获得的转基因植株。

优选的，所述过表达载体为pCAMBIA2300。

优选的，所述农杆菌介导技术采用的宿主菌为农杆菌EHA105。遗传转化材料采用水稻胚性愈伤组织。

所述受体水稻的品种为中花11。

本发明具备的有益效果：

本发明通过对玉米ZmHSMT3基因的克隆分析，并结合转基因技术在水稻中进行异源过表达对该基因进行功能验证，ZmHSMT3过表达植株对镉的耐受性显著增强，且籽粒中的镉含量显著降低。本发明为水稻籽粒低积累育种与生产提供了一种可行的技术方案。

附图说明

图1为ZmHSMT3功能域预测。

图2为转基因水稻阳性苗鉴定结果。

图3为野生型和转基因水稻ZmHSMT3表达量。

图4为镉处理5天对野生型和转基因水稻幼苗生长和镉含量的影响，其中(a)为自然生长条件下和镉处理5d后，水稻幼苗的生长表型；(b)为地上部干重，红色为野生型WT，蓝色为转基因株系L11，黄色为转基因株系L19；(c)为地下部干重；(d)为镉处理5d后水稻幼苗叶、根部镉含量(mg kg^-1)；(e)为镉处理5d后水稻幼苗叶、根部镉积累量(mg plant^-1)；(f)镉由地下部向地上部的转移率。

图5为镉处理对野生型和转基因水稻籽粒镉含量的影响，其中(a)中从左到右依次为水稻植株生长表型、株高、千粒重、结实率；(b)中从左到右依次为叶、茎、根、籽粒中镉含量。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。以下实施例仅用于说明本发明，不用来限制本发明的适用范围。在不背离本发明精神和本质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所做的修改或替换，均属于本发明的范围。

下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

实施例1 ZmHSMT3基因CDS区和启动子区克隆和分析

1、ZmHSMT3基因CDS区克隆

以前期筛选出的玉米籽粒镉高积累和低积累基因型为材料，镉胁迫后进行根系转录组测序，从结果中鉴定出一个在玉米籽粒镉低积累基因型 L63中高表达的HSMT家族基因，克隆了该基因全长CDS序列，相应核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，并将其命名为ZmHSMT3。

采用总RNA提取试剂盒提取L63叶片总RNA，DNaseI去除基因组 DNA污染，随后利用PrimeScripffM II 1st Strand cDNA Synthesis Kit反转录成单链cDNA。根据Blast到的序列设计引物，采用KOD ONE高保真酶扩增，引物序列为：

ZmHSMT3-CDS-F：5'-ATGGTGGGGACGGCGGAAGG-3'；

ZmHSMT3-CDS-R：5'-TGCTACAGGTAACTGATGCTTGTGGCAG -3'。

将扩增出的产物，连接pMD18-T载体，转化大肠杆菌DH5α，挑取单克隆测序。

2、ZmHSMT3基因序列分析

该基因CDS全长1017bp，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码 338个氨基酸，相应氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，该蛋白分子量为37.0 KDa，等电点为5.53。

将ZmHSMT3氨基酸序列通过SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/) 网站进行功能域预测和分析。预测分析显示，该蛋白含1个功能域：S-甲基转移酶(图1)。

实施例2转基因水稻

1、重组质粒构建

根据前期克隆的序列，设计特异性引物，引物序列如下(下划线为酶切位点)：

ZmHSMT3-PCR-F：

5'-TCCCCCCGGGATGGTGGGGACGGCGGAAGG-3'；

ZmHSMT3-PCR-R：

5'-CTAGTCTAGATGCTACAGGTAACTGATGCTTGTGGCAG-3'

利用LA Taq DNA Polymerase扩增全长CDS，割胶回收后，连接 pMD18-T载体，转化摇菌，挑取单克隆测序，M13正反向引物测序正确后用XmaI和XbaI内切酶双酶切酶切，连入经相同内切酶酶切的35S空载体中。连接产物热击转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，摇菌后，划板挑单克隆摇菌，抽质粒酶切检测。

2、农杆菌介导遗传转化

将质粒热击转化农杆菌EHA105，涂布于到含有25mg/L利福平和50 mg/L卡那霉素的LB固体培养基表面，于28℃条件下培养过夜，挑取单菌落扩大培养。之后，从中吸取200-300μL的新鲜菌液接入到20mL含有25mg/L利福平和50mg/L卡那霉素的LB液体培养基中，28℃振荡(220 rpm)培养16-18h。取足量的菌液于4000rpm下离心15min，弃去LB培养基上清液；加入20mL 0.1M MgSO₄溶液重新悬浮农杆菌(用移液器轻轻吹打重悬)，于4000rpm下离心10-15min，弃去含有抗生素的MgSO₄上清液；再加入5mL含有200μM乙酰丁香酮(AS)的AA-AS侵染培养基重新悬浮农杆菌，再加入适量的AA-AS侵染培养基调整菌液的OD₆₀₀值最终调整在0.2-0.8之间；用无菌的50mL离心管分装菌液，20-25mL/管，待用。

将预培养7天左右的中花11胚性愈伤从继代培养皿中转移至覆有无菌滤纸的空培养皿中，在超净工作台上风干，转入装有菌液离心管中，轻轻晃动40min，将离心管置于超净台静置10min；将侵染后的愈伤置于无菌滤纸干燥，然后转移至含有AS(200μM)的共培养基中培养，28℃下暗培养50-55h，挑取未污染和表面无农杆菌大量生长的愈伤，转移至含潮霉素的培养基上，28℃暗室中培养；挑选生长状态良好的愈伤于新鲜筛选培养基上继代；光照培养，获取转基因阳性苗，随后将苗转入土壤中，提取幼苗DNA，设计特异性引物进行阳性苗鉴定，引物序列如下，其中正向引物为载体序列，反向引物为基因序列：

ZmHSMT3-JD-F：CACTGACGTAAGGGATGACGCACAA；

ZmHSMT3-JD-R：AGCTTCCAATTTGTTGGGGATCGTT。

鉴定结果如图2所示，经过筛选鉴定，得到转基因株系L11、L19。

3、转基因株系ZmHMT3表达量分析

同时提取转基因株系L11、L19和野生型植株叶片总RNA，反转录成cDNA后，利用SYBR绿色荧光酶复合物和Light Cycler 480PCR仪分析 ZmHMT3表达量变化(qRT-PCR)，引物序列为：

ZmHMT3-qRT-PCR-F：5'-CTGGAAGCCCGTGAGATGTT-3'；

ZmHMT3-qRT-PCR-R：5'-AGAGCTGCTGCAACCAGAAT-3'。

结果如图3所示，转基因株系L11和L19 ZmHMT3表达量显著提高。

实施例3镉胁迫对水稻幼苗生长和镉含量的影响

将野生型(WT)、过表达株系L11和L19种子浸泡于2％H₂O₂中消毒 20分钟，蒸馏水彻底冲洗，温室浸种2天，30℃催芽1天。挑选完整健康已发芽种子播种于沙床中，人工气候箱中预培养，培养温度为30℃/26℃，相对湿度为85％。于二叶期挑选健康长势一致水稻幼苗移栽至营养液中。预培养7天后，进行镉处理。试验共设2个处理：Control(基本营养液，BNS)和Cd(BNS+10μM Cd)。

结果如图4所示，镉处理5d后，L11和L19株系的耐镉性显著强于野生型。Cd处理之后，与WT相比，L11和L19地上部干重分别增加62.6％， 27.5％，地下部干重无显著差异(图4a,b,c)。Cd含量方面，与WT相比， L11和L19的地上部镉含量分别显著下降34.5％和31.1％，地下部镉含量并没有呈现显著差异(图4d)，且具有较低的镉由地下部向地上部的转移率 (图4f)。

实施例4异源表达ZmHSMT3对水稻籽粒镉含量的影响

试验开始前30d准备土壤样品，添加2L水稻营养液+Cd(10mg Cd kg^-1土壤)，混合均匀，温室平衡30d。

WT、L11和L19种子在2％H₂O₂中消毒15min，蒸馏水彻底冲洗，温室浸种2d，30℃催芽1d。挑选健康完整并已发芽种子播种于沙床中，置于人工气候培养箱培养，播种后约20d(4叶期)，选取长势一致幼苗移栽至各处理土壤中。成熟期取样，将植株分为叶、茎、根和籽粒，80℃烘干至恒重。同时测量株高、结实率和千粒重。

结果如图5所示，与WT相比，转基因水稻L11和L19植株株高、千粒重和结实率等无显著差异(图5a)，但籽粒Cd含量显著下降18.1％和 25.5％，叶片Cd含量显著下降37.8％和41.9％，根部则显著下降了57.6％和70.2％(图5b)。

序列表

<110> 浙江大学

<120> 玉米ZmHSMT3基因及其在降低水稻籽粒镉积累中的应用

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1017

<212> DNA

<213> 玉米(Zea mays)

<400> 1

atggtgggga cggcggaagg cggcgcggag agggcggtgc ggcggtgggt ggacgccgcc 60

ggcgggcgcc tggtcctgga cggcgggctg gccacggagc tcgaggccaa cggcgccgac 120

ctcaacgacc cgctctggag cgccaagtgc ctcctctcct ccccgcacct catccgcaag 180

gtccatatgg actacctaga agccggggcg aacattataa tcacagcatc gtatcaggct 240

actatccaag ggtttgaatc aaagggcttt tcaaaagaac aaagtgaaaa cttgttaaca 300

aagagtgttc agattgcact ggaagcccgt gagatgttct tgaaggaaca tttggagaaa 360

tccactccta tacagcatcc tattctggtt gcagcagctc tagggagtta tggggcttat 420

cttgctgatg gctctgagta cagtggggat tatggtgaag ctggtacgaa agagttcctg 480

aaggactttc atcggcggag gcttcaggtt cttgctgaag caggcccgga tttgattgct 540

tttgaaacga tccccaacaa attggaagct caggcatatg ttgaactcct tgaggaatgt 600

aacattaata tcccttcatg gctttccttc aactcaaaag atggagtgca tgttgtgagt 660

ggtgattcgt taattgaatg cgctactatt gctgacaagt gtgcaaaggt tggtgcagtc 720

gggataaatt gcacacctcc aagatttatt catggactga tactctccat tcgaaaggtc 780

acagacaagc ctattctgat atatcccaac agtggtgaaa gatatgatgg tgaaaaaaag 840

gagtgggtgg aatccactgg tgtgtcagat ggtgattttg tttcgtacgt aaatgaatgg 900

tgcaaagatg gggctgcgct tatcgggggc tgctgcagga caactccaaa cactatcagg 960

gccatacaca gaactcttaa ccaaggctgc cacaagcatc agttacctgt agcatag 1017

<210> 2

<211> 338

<212> PRT

<213> 玉米(Zea mays)

<400> 2

Met Val Gly Thr Ala Glu Gly Gly Ala Glu Arg Ala Val Arg Arg Trp

1 5 10 15

Val Asp Ala Ala Gly Gly Arg Leu Val Leu Asp Gly Gly Leu Ala Thr

20 25 30

Glu Leu Glu Ala Asn Gly Ala Asp Leu Asn Asp Pro Leu Trp Ser Ala

35 40 45

Lys Cys Leu Leu Ser Ser Pro His Leu Ile Arg Lys Val His Met Asp

50 55 60

Tyr Leu Glu Ala Gly Ala Asn Ile Ile Ile Thr Ala Ser Tyr Gln Ala

65 70 75 80

Thr Ile Gln Gly Phe Glu Ser Lys Gly Phe Ser Lys Glu Gln Ser Glu

85 90 95

Asn Leu Leu Thr Lys Ser Val Gln Ile Ala Leu Glu Ala Arg Glu Met

100 105 110

Phe Leu Lys Glu His Leu Glu Lys Ser Thr Pro Ile Gln His Pro Ile

115 120 125

Leu Val Ala Ala Ala Leu Gly Ser Tyr Gly Ala Tyr Leu Ala Asp Gly

130 135 140

Ser Glu Tyr Ser Gly Asp Tyr Gly Glu Ala Gly Thr Lys Glu Phe Leu

145 150 155 160

Lys Asp Phe His Arg Arg Arg Leu Gln Val Leu Ala Glu Ala Gly Pro

165 170 175

Asp Leu Ile Ala Phe Glu Thr Ile Pro Asn Lys Leu Glu Ala Gln Ala

180 185 190

Tyr Val Glu Leu Leu Glu Glu Cys Asn Ile Asn Ile Pro Ser Trp Leu

195 200 205

Ser Phe Asn Ser Lys Asp Gly Val His Val Val Ser Gly Asp Ser Leu

210 215 220

Ile Glu Cys Ala Thr Ile Ala Asp Lys Cys Ala Lys Val Gly Ala Val

225 230 235 240

Gly Ile Asn Cys Thr Pro Pro Arg Phe Ile His Gly Leu Ile Leu Ser

245 250 255

Ile Arg Lys Val Thr Asp Lys Pro Ile Leu Ile Tyr Pro Asn Ser Gly

260 265 270

Glu Arg Tyr Asp Gly Glu Lys Lys Glu Trp Val Glu Ser Thr Gly Val

275 280 285

Ser Asp Gly Asp Phe Val Ser Tyr Val Asn Glu Trp Cys Lys Asp Gly

290 295 300

Ala Ala Leu Ile Gly Gly Cys Cys Arg Thr Thr Pro Asn Thr Ile Arg

305 310 315 320

Ala Ile His Arg Thr Leu Asn Gln Gly Cys His Lys His Gln Leu Pro

325 330 335

Val Ala

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atggtgggga cggcggaagg 20

<210> 4

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tgctacaggt aactgatgct tgtggcag 28

<210> 5

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tccccccggg atggtgggga cggcggaagg 30

<210> 6

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ctagtctaga tgctacaggt aactgatgct tgtggcag 38

<210> 7

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

cactgacgta agggatgacg cacaa 25

<210> 8

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

agcttccaat ttgttgggga tcgtt 25

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

ctggaagccc gtgagatgtt 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

agagctgctg caaccagaat 20

Claims

1.玉米ZmHSMT3基因过表达在提高水稻对镉胁迫耐受性中的应用，其特征在于，该基因的CDS区核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述应用包括：将核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的ZmHSMT3基因片段通过转基因技术转入水稻中，筛选得到功能性获得的转基因植株。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述玉米ZmHSMT3基因编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，玉米ZmHSMT3基因在水稻中异源过表达降低水稻籽粒的镉积累。

4.一种降低水稻籽粒镉积累的育种方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的ZmHSMT3基因片段插入具有35s启动子的过表达载体中，构建重组质粒；

5.如权利要求4所述的育种方法，其特征在于，所述过表达载体为pCAMBIA2300。

6.如权利要求4所述的育种方法，其特征在于，所述受体水稻的品种为中花11。