CN112553224B

CN112553224B - 组蛋白去乙酰化酶基因OsHDT701在延长植物种子寿命中的应用

Info

Publication number: CN112553224B
Application number: CN202011193511.1A
Authority: CN
Inventors: 刘军; 贾俊婷; 刘勋成; 段俊; 赵金会
Original assignee: Agro-Biological Gene Research Center Guangdong Academy Of Agricultural Sciences; South China Botanical Garden of CAS
Current assignee: Agro-Biological Gene Research Center Guangdong Academy Of Agricultural Sciences; South China Botanical Garden of CAS
Priority date: 2020-10-30
Filing date: 2020-10-30
Publication date: 2022-04-08
Anticipated expiration: 2040-10-30
Also published as: CN112553224A

Abstract

本发明公开了组蛋白去乙酰化酶基因OsHDT701在延长植物种子寿命的应用。本发明通过分别构建OsHDT701的过表达载体和RNAi沉默表达载体并转化水稻，分别获得过表达OsHDT701和敲减表达OsHDT701的转基因植株，结果显示敲减表达OsHDT701转基因水稻种子比野生型种子具有更长的种子寿命及更强的抵抗人工老化的能力；而过量表达OsHDT701的水稻种子表现出比野生型种子具有更短的种子寿命或者更弱的抵抗人工老化的能力，表明OsHDT701负调控水稻种子寿命，OsHDT701基因可用于提高作物种子寿命。

Description

组蛋白去乙酰化酶基因OsHDT701在延长植物种子寿命中的应用

技术领域

本发明涉及植物基因工程技术领域，更具体地，涉及组蛋白去乙酰化酶基因OsHDT701在延长植物种子寿命中的应用。

背景技术

水稻(Oryza sativa L.)是世界重要粮食作物之一，全世界半数以上的人口以其为主食，水稻生产是关系到国计民生的大事，与我国粮食安全保障密切相关。种子作为最基本的生产资料，是农业生产得以发展的必要条件。种子的活力与寿命对于植物繁殖、作物产量、种质资源保存和生物多样性起着决定性的影响。由于种子生产难以准确预测，经常需要对种子进行贮藏，随着贮藏时间的延长，大部分的种子开始发生劣变，严重影响农业生产。因此，对种子寿命遗传特性及其分子机理的研究已成为种子科学研究的重点。一般来讲，种子在贮藏过程中，生活力的丧失并不是等速率的下降：贮藏初期，生活力下降较慢，然后有一个快速下降阶段，尔后生活力下降又表现较为缓慢。老化过程涉及到有关酶活性的变化、染色体的损失及膜完整性的丧失。在种子老化劣变过程中，为尽可能保持种子活力，植物进化出一系列复杂的机制，包括保护，脱毒和修复机制。

调控水稻种子活力、寿命等品质相关性状的数量性状位点(QTLs)已在水稻中得到鉴定。位于染色体2和8上的两个QTLs：qSL-2和qSL-8，可以增加种子的寿命。蛋白质组学和代谢组学研究发现更多与老化过程种子寿命有关的蛋白，包括谷胱甘肽水解蛋白、DNA损伤修复蛋白、胚胎发育后期富含蛋白质(LEA)。尽管如此，对于种子活力保持的调控机制仍不够清晰，亟需对种子的寿命和活力进行更多层次多维度的深入研究。因此，继续深入筛选与研究寻找新的种子寿命相关基因，并进行克隆与功能研究，对研发新的抗老化长寿命的水稻品种，具有非常重大的意义。

在真核生物细胞核中，组蛋白乙酰转移酶(Histone acetyltransferases，HATs)和组蛋白去乙酰化酶(Histone deacetylases，HDACs)对组蛋白赖氨酸残基的乙酰化或去乙酰化进行可逆催化，分别对靶基因的转录激活和抑制进行催化。植物HDAC可分为三大类：RPD3/HDA1超家族、SIR2家族和植物特异性HD2家族。根据系统发育分析，水稻基因组至少包含19个HDAC基因，包括至少两个HD2基因——组蛋白去乙酰酶701(HDT701)和组蛋白去乙酰酶702(HDT702)。其中组蛋白去乙酰化酶HDT701或其编码基因在调控植物种子发育中发挥作用；专利CN106929498A公开了组蛋白去乙酰化酶OsHDT701或其编码基因在调控植物种子发育中的应用，具体为调控种子粒形和/或调控种子粒重，调控种子的粒宽和粒厚及千粒重。而关于组蛋白去乙酰化酶OsHDT701或其编码基因在调控植物种子寿命中的作用，目前还未见相关报道。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中存在的上述缺陷和不足，提供组蛋白去乙酰化酶基因OsHDT701在调控植物种子活力和/或寿命中的应用。

本发明的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：

本发明公开了水稻组蛋白去乙酰化酶OsHDT701基因的新应用，所述水稻OsHDT701基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，序列全长894bp，编码297个氨基酸，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

本发明通过分别构建OsHDT701的过表达载体和RNAi沉默表达载体并转化粳稻品种中花11，分别获得过表达OsHDT701和敲减表达OsHDT701的转基因水稻植株。发现敲减表达转基因水稻种子比野生型种子具有更长的种子寿命，过量表达水稻种子表现出比野生型种子具有更短的寿命。具体为敲减表达OsHDT701转基因水稻种子比野生型种子具有更强的抵抗人工老化的能力；而过量表达OsHDT701的水稻种子表现出比野生型种子具有更弱的抵抗人工老化的能力，表明OsHDT701负调控水稻种子寿命，OsHDT701基因可用于提高作物种子寿命，在农业生产中具有极其重要的价值和应用前景。

因此，本发明首先提供组蛋白去乙酰化酶基因OsHDT701的以下新用途：

SEQ ID NO：1所示组蛋白去乙酰化酶基因OsHDT701在调控植物种子寿命中的应用。

SEQ ID NO：2所示组蛋白去乙酰化酶OsHDT701在调控植物种子寿命中的应用。

SEQ ID NO：1所示组蛋白去乙酰化酶基因OsHDT701或SEQ ID NO：2所示组蛋白去乙酰化酶OsHDT701在培育长寿命的植物种子中的应用。

SEQ ID NO：1所示组蛋白去乙酰化酶基因OsHDT701或SEQ ID NO：2所示组蛋白去乙酰化酶OsHDT701在提高植物种子抗老化能力中的应用。

具体地，为敲减植物中蛋白去乙酰化酶基因OsHDT701的表达量。

优选地，为构建OsHDT701基因的RNAi干扰载体并转化植物，获得RNAi抑制表达的转基因植株。

进一步优选地，所述RNAi干扰载体为pTCK303-OsHDT701。

进一步优选地，所述RNAi干扰载体pTCK303-OsHDT701的构建方法为扩增OsHDT701基因序列如SEQ ID NO：3所示的RNAi目标片段，利用酶切法将其正向插入到植物表达载体pTCK303上，将此中间载体命名为pTCK303-OsHDA701-1；再利用不同的酶切位点，将目标片段反向连接到中间载体pTCK303-OsHDA701-1上，转化大肠杆菌后重提质粒进行酶切鉴定，最终将载体命名为pTCK303-OsHDA701。

优选地，所述植物为农作物。

进一步优选地，所述农作物为水稻。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明提供了组蛋白去乙酰化酶基因OsHDT701在调控水稻种子寿命中的新应用，本发明发现敲减表达OsHDT701转基因水稻种子比野生型种子具有更长的种子寿命；而过量表达OsHDT701的水稻种子表现出比野生型种子具有更短的种子寿命，表明OsHDT701负调控水稻种子寿命，OsHDT701基因可用于提高、延长植物种子寿命，具有较大的应用前景。

附图说明

图1为双元载体pUbiO图谱。

图2为双元载体pTCK303图谱。

图3为人工老化处理前后OsHDT701 RNAi转基因植株、野生型植株CK和OsHDT701OE的萌发表型。

图4为人工老化处理前后OsHDT701 RNAi转基因植株、野生型植株CK和OsHDT701OE的发芽率统计。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

实施例1组蛋白去乙酰化酶基因OsHDT701过表达转基因水稻的获得

为了构建OsHDT701过表达载体，首先扩增OsHDT701的cDNA片段(登录号:AK072845)，然后将该片段插入到载体pUbiO1301(质粒图谱如图1所示)，该载体是以pCAMIBA1301为基础进行了改造，并添加了一个玉米泛素启动子。将构建好的载体转化农杆菌株EHA105，然后转入水稻“中花11”成熟种子胚性愈伤组织。具体包括如下步骤：

1、组蛋白去乙酰化酶基因OsHDT701过表达载体的构建

根据NCBI已知的组蛋白去乙酰化酶基因0sHDT701全长序列设计特异的引物，而且同时在引物5'端分别加上BamH I酶切位点，扩增引物为：

oxHDT701F：5'-CGGGATCCATGGAGTTCTGGGGTCTTGA-3'；

oxHDT701R：5'-CGGGATCCTCACTTGGCGGGGTGCTTGG-3'

(下划线部分为BamH I酶切位点)。

以水稻中花11的cDNA为模板，利用高保真酶扩增获得0sHDT701基因的ORF全长。将上述片段和表达载体pUbiO1301利用BamH I分别酶切后，T4连接酶连接，得到目的质粒，然后鉴定插入正反向后，将正向插入的阳性克隆质粒进行PCR和测序验证，从而将ORF插入pUbiO1301上35S启动子后面，重组表达载体命名为pUbiO1301-0sHDT701。

2、过表达载体pUbiO1301-0sHDT701转化农杆菌株EHA105

取10μg过表达载体PUbiO1301-0sHDT701加入到100μL农杆菌EHA105感受态细胞中，轻轻混匀，冰浴30min，然后液氮速冻5min，再经37℃热激5min。加入900μL的YM液体培养基，28℃，100rpm震荡培养2～4h；5000rpm，5min，离心收集菌体；弃上清800μL，吹打重悬菌块，并涂布到YM平板(含50mg/L卡那霉素和50mg/L硫酸链霉素)。将平板倒置放在28℃的培养箱中培养，直至菌落长出(约2d)。挑取单克隆再次进行PCR鉴定。

3、农杆菌介导的水稻遗传转化

(1)水稻成熟胚愈伤组织的诱导

成熟水稻种子去壳，对其进行表面消毒处理，即利用70％乙醇浸泡1min，0.1％升汞浸泡15min，再用无菌水清洗3～4次；用无菌滤纸将水稻种子表面水分吸干后，接种在诱导培养基上，26℃暗培养10～15d后，去除膨大的盾片，转入继代培养基上，26℃暗培养。每两周继代培养一次，挑选大小适中、色泽淡黄的愈伤组织转到新的继代培养基上，26℃预培养3d。

(2)农杆菌EHA105的培养

将含有过表达载体pUbiO1301-0sHDT701的农杆菌划线于YM平板(含有50mg/L Kan和50mg/L Str)，28℃培养箱中倒置培养两天；挑取单菌落于5mL液体YM培养基中(含有50mg/L Kan和50mg/L Str)，28℃，200rpm培养12～24h，然后按照1：30的体积比进行扩大培养4～5h，5500rpm离心10min，收集菌体，用液体AAM培养基(内含乙酰丁香酮)重新悬浮菌体至OD600约为0.5，置于28℃摇床轻微振荡培养15-30min，该农杆菌悬浮液即可用于转化水稻愈伤。

(3)水稻愈伤组织与农杆菌的共培养

将步骤(1)中色泽淡黄、预培养3d的颗粒状愈伤组织放到50mL无菌三角瓶中，加入步骤(2)准备好的农杆菌悬浮液，静置培养20min，每隔5min轻轻晃动一下三角瓶。倒掉农杆菌悬浮液，利用无菌滤纸将愈伤组织上的多余菌液吸去，随后转移至铺有一层无菌滤纸的固体共培养基上，22℃暗培养3d。

(4)抗性愈伤组织的清洗及筛选

将步骤(3)中共培养3d后的愈伤组织利用无菌水(含500mg/L的头孢霉素Cef)中清洗，每次4～5min，共清洗4～5次。然后利用无菌滤纸将愈伤组织吸干水分。将愈伤组织放到筛选培养基上进行筛选培养(含50mg/L Hyg和500mg/L的Cef)，培养条件为26℃暗培养；2周后转移到新配制的筛选培养基上继续筛选。

(5)抗性愈伤组织的分化

经过两轮筛选后，在筛选培养基上挑选一定大小、乳黄色致密的抗性愈伤组织，将其转至预分化培养基上(含50mg/L Hyg和500mg/L Cef)，暗培养7d；然后转至分化培养基上，将其放在温度约为26℃，光照强度为10000lux，光周期16h光/8h黑暗的条件下培养，6～10d绿点出现，20～30d后进一步分化出小苗。

(6)生根、壮苗和移栽

当抗性愈伤组织分化的芽长约8cm左右时，将其转移至生根培养基上，培养约两周左右。选择株高10cm以上、根系健壮发达的水稻苗，洗去生根培养基，移栽入土，在温室中正常培养。

(7)GUS染色检测转基因阳性植株

将转化得到的苗进行GUS染色。染色后为蓝色的为转基因阳性植株,反之为阴性植株。

4、相应的检测验证，证明成功获得OsHDT701过表达转基因水稻

每个转基因株系取T2代种子50粒以上进行GUS染色，如果都能染上即为纯合体，在以后的种植过程中同样用GUS染色鉴定是否为纯合株系。之后进行转基因株系的OsHDT701基因的表达量分析，利用含有超表达OsHDT701基因的两周大水稻株系，提取RNA，逆转录，进行实时荧光定量PCR检测OsHDT701基因的表达水平，每个实时荧光定量PCR实验进行2个生物学重复，每个生物学重复有4个技术性重复。结果显示与野生型WT相比，超表达株系OE1和OE7的OsHDT701表达水平分别提高约60倍和130倍左右，因此检测的OsHDT701转基因株系可作为后续研究的材料。

实施例2组蛋白脱去乙酰化酶基因OsHDT701 RNAi转基因水稻的获得

OsHDT701 RNAi转基因水稻材料是根据OsHDT701的cDNA序列及其蛋白质的保守结构域，以中花11幼苗cDNA为模板，扩增OsHDT701基因300bp左右的RNAi目标片段，将其构建到干扰载体上，利用农杆菌菌浸染技术获得水稻RNAi转基因株系，RT-PCR分析结果表明转基因株系中OsHDT701基因的表达量低于野生型。具体包括如下步骤：

1、OsHDT701 RNAi载体的构建

选择合适的基因片段是成功构建RNA干涉载体的关键，构建该载体的目的是特异而有效的将目的基因的表达水平降至最低。将目的基因的cDNA序列放到NCBI上进行比对，寻找与水稻基因组内的其他基因没有同源性约300-500bp的一段序列。然后，在这一段特异序列的5’末端和3’末端设计特异性引物，引物序列如下:

RNAi-HDT701F：

5'-CGGGATCGAGCTCAAGGAAAATGAGCAGAAAAA-3'；

RNAi-HDT701R：

5'-GGGGTACCACTAGTTTGGCGGGGTGCTTGGCCTT-3'

扩增出目的基因的一小段，作为构建载体的干涉片段，所述干涉片段的序列如SEQID NO：3所示。将目的片段连接到pMD18-T载体上，然后转化大肠杆菌，对长出的单克隆进行菌落PCR鉴定，将阳性克隆各选取一个送往公司测序，进一步确定序列的正确性。用限制性内切酶将目的片段从鉴定好的pMD18-T载体上切下来回收纯化，然后连接到经同种酶消化的植物表达载体pTCK303(质粒图谱如图2所示))上，转化大肠杆菌后重提质粒进行酶切鉴定含正向片段的重组克隆，命名为pTCK303-OsHDT701-1。用限制性内切酶将目的片段从pMD18-T载体上切下来回收纯化，然后反向连接到经同种酶消化的已连上正向片段的pTCK303-OsHDT701-1上，转化大肠杆菌后重提质粒筛选含目的片段的重组克隆，命名为pTCK303-OsHDT701。

2、RNAi载体pTCK303-OsHDT701转化农杆菌株EHA105

取10μgRNAi载体pTCK303-OsHDT701加入到100μL农杆菌EHA105感受态细胞中，轻轻混匀，冰浴30min，然后液氮速冻5min，再经37℃热激5min。加入900μL的YM液体培养基，28℃，100rpm震荡培养2～4h；5000rpm，5min，离心收集菌体；弃上清800μL，吹打重悬菌块，并涂布到YM平板(含50mg/L卡那霉素和50mg/L硫酸链霉素)。将平板倒置放在28℃的培养箱中培养，直至菌落长出(约2d)。挑取单克隆再次进行PCR鉴定。

3、农杆菌介导的水稻遗传转化

以水稻成熟胚诱导的愈伤组织为外植体，经过与含重组质粒的农杆菌共培养、抗生素筛选、分化、生根壮苗和移栽等步骤，即可得到T0代转基因水稻植株。

(1)水稻成熟胚愈伤组织的诱导

(2)农杆菌EHA105的培养

将含有pTCK303-OsHDT701载体的农杆菌划线于YM平板(含有50mg/L Kan和50mg/LStr)，28℃培养箱中倒置培养两天；挑取单菌落于5mL液体YM培养基中(含有50mg/L Kan和50mg/L Str)，28℃，200rpm培养12～24h，然后按照1：30的体积比进行扩大培养4～5h，5500rpm离心10min，收集菌体，用液体AAM培养基(内含乙酰丁香酮)重新悬浮菌体至OD600约为0.5，置于28℃摇床轻微振荡培养15-30min，该农杆菌悬浮液即可用于转化水稻愈伤。

(3)水稻愈伤组织与农杆菌的共培养

(4)抗性愈伤组织的清洗及筛选

(5)抗性愈伤组织的分化

(6)生根、壮苗和移栽

(7)GUS染色检测转基因阳性植株

4、相应的检测验证，证明成功获得OsHDT701 RNAi转基因水稻

每个转基因株系取T2代种子50粒以上进行GUS染色，如果都能染上即为纯合体，在以后的种植过程中同样用GUS染色鉴定是否为纯合株系。之后进行转基因株系的OsHDT701基因的表达量分析，利用含有OsHDT701基因敲减的两周大水稻株系，提取RNA，逆转录，进行实时荧光定量PCR检测OsHDT701基因的表达水平，每个实时荧光定量PCR实验进行2个生物学重复，每个生物学重复有4个技术性重复。结果显示与野生型WT相比，OsHDT701敲减株系RNAi2和RNAi3的表达水平均有所下降，且下降明显。将野生型WT中OsHDT701的表达量设置为对照1，RNAi2和RNAi3株系分别下调至约0.2和0.6左右，因此检测的OsHDT701转基因株系可作为后续研究的材料。

实施例3 OsHDT701过表达/RNAi转基因水稻的活力检测

种子寿命的测定按照经典的方法即人工老化处理后的发芽率进行衡量(Chen2012，Bentsink et al.,2000；Tesnier et al.,2002；Oge et al.,2008；Rajjou andDebeaujon,2008)。将实施例1获得的OsHDT701过表达转基因水稻和实施例2获得的OsHDT701 RNAi转基因水稻分别进行如下实验：

1、人工老化处理

按刘军(2000年植物学报)和Chen(2012年Journal of Experimental Botany)的方法，稍作改动，人工老化在密封的干燥器中完成。将种子用去掉盖子的大离心管装好放于15℃、相对湿度(R.H)85％中预处理3d后,转移到已经平衡好的干燥器中42℃、85％R.H处理3-5d，然后置于25℃、32％R.H干燥3d，4℃保存备用。

2、标准发芽实验

以未老化种子作为对照(CK)。进行种子萌发实验，统计发芽势，发芽率，出苗率，干重等活力相关指标。水稻种子经0.5％次氯酸钠溶液消毒5min，用清水彻底洗净。将种子置于垫有三层湿润滤纸的发芽盒(12cm×12cm)中，28℃恒温条件发芽，光照设置为16h光照/8h黑暗。每处理3个重复，每重复30粒种子。发芽的标准为种子露白，每天记录发芽种子数。分别于发芽第3d和第7d统计发芽势和发芽率。发芽结束后，随机取幼苗10株/盒，分别测量苗高、根长及鲜重。

发芽率(％)＝正常幼苗数/供试种子数x100

发芽势(％)＝前3天发芽数/供试种子数x100

结果如图3所示，与野生型中花11的水稻种子对比，过表达OsHDT701的水稻种子在老化处理的条件下，种子发芽率下降更多；OsHDT701 RNAi转基因水稻的种子在人工老化10d及14d的情况下，种子发芽率比对照高。

图4所示，未老化处理时，CK、OE1、OE7、RNAi2和RNAi3转基因水稻的种子发芽率分别为95.56％、82.22％、81.11％、95.56％和88.89％；老化10d时，CK、OE1、OE7、RNAi2和RNAi3转基因水稻的种子发芽率分别为47.78％、23.22％、6.67％、94.44％和92.22％；老化14d时，CK、OE1、OE7、RNAi2和RNAi3转基因水稻的种子发芽率分别为15.56％、11.11％、2.22％、92.22％和81.11％；这些结果说明OsHDT701 RNAi转基因水稻的种子寿命明显延长。

从表1和表2可以看出对OsHDT701 RNAi、OsHDT701 OE和WT的种子进行老化处理14d以后，OsHDT701 RNAi植株的种子发芽率、发芽势和根鲜重比WT均明显提高，OsHDT701OE植株种子发芽率、发芽势和根鲜重比WT均下降，说明OsHDT701基因对水稻种子寿命延长与活力调控过程中起着十分重要的作用。可利用OsHDT701基因制备长寿命的植物种子。

表1人工老化前后，转基因与野生型水稻种子活力性状的统计

表2人工老化前后，水稻种子萌发第7d根的平均鲜重

序列表

<110> 广东省农业科学院农业生物基因研究中心

中国科学院华南植物园

<120> 组蛋白去乙酰化酶基因OsHDT701在延长植物种子寿命中的应用

<141> 2020-10-30

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 894

<212> DNA

<213> 水稻(Oryza sativa L.)

<400> 1

atggagttct ggggtcttga agtcaagcct ggacagactg tcaaatgtga gcctgaagat 60

gaacgctttt tgcacctttc tcaggctgct cttggggaat caaagaaagg atctgacaat 120

gcagtaatgt atgttaaaac tgatgatcaa aagctagtca ttggaaccct ctcagctgac 180

aagttccctc aaatccagtt tgatttggtc tttgacaaag agtttgagct gtcacacact 240

tcaaagactg ctagtgtgtt cttttctggc tacaaagttt cccagccggc tgaggaagat 300

gaaatggatt ttgattctga agaagttgaa gatgaagagg aggaagaaaa gatcattcca 360

gctcccaggg caaatggcaa agttgaaggg aaggaaaatg agcagaaaaa acaaggcaag 420

acagattctt cagcttcaaa atcaaaggct gcagtgaatg acgatgatga tgatgatgac 480

agtgatgagg atgattctga ggacgaagat ctttctcctg aggatgatga tgatgattct 540

tctgaggatg attccagcga agatgatgag gatgagagtg acgaggaaga tactcccaag 600

aagccagaga ctggaaagag gaaagtagct gaaattgtgt tgaagacacc ttcgtctgat 660

aagaaagcaa agattgctac accgtcaggc cagaagacag gtgacaagaa gggtgtccat 720

gtagcaactc cacatccggc aaagcaggct agcaagaccc ccgtgaatga caagtcaaag 780

gagaagtccc caaaatccgg tggtgggtca atttcttgca agtcatgcag caagacgttc 840

aacagtgaaa tggctctgca atctcactcg aaggccaagc accccgccaa gtga 922

<210> 2

<211> 297

<212> PRT

<213> 水稻(Oryza sativa L.)

<400> 2

Met Glu Phe Trp Gly Leu Glu Val Lys Pro Gly Gln Thr Val Lys Cys

1 5 10 15

Glu Pro Glu Asp Glu Arg Phe Leu His Leu Ser Gln Ala Ala Leu Gly

20 25 30

Glu Ser Lys Lys Gly Ser Asp Asn Ala Val Met Tyr Val Lys Thr Asp

35 40 45

Asp Gln Lys Leu Val Ile Gly Thr Leu Ser Ala Asp Lys Phe Pro Gln

50 55 60

Ile Gln Phe Asp Leu Val Phe Asp Lys Glu Phe Glu Leu Ser His Thr

65 70 75 80

Ser Lys Thr Ala Ser Val Phe Phe Ser Gly Tyr Lys Val Ser Gln Pro

85 90 95

Ala Glu Glu Asp Glu Met Asp Phe Asp Ser Glu Glu Val Glu Asp Glu

100 105 110

Glu Glu Glu Glu Lys Ile Ile Pro Ala Pro Arg Ala Asn Gly Lys Val

115 120 125

Glu Gly Lys Glu Asn Glu Gln Lys Lys Gln Gly Lys Thr Asp Ser Ser

130 135 140

Ala Ser Lys Ser Lys Ala Ala Val Asn Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp

145 150 155 160

Ser Asp Glu Asp Asp Ser Glu Asp Glu Asp Leu Ser Pro Glu Asp Asp

165 170 175

Asp Asp Asp Ser Ser Glu Asp Asp Ser Ser Glu Asp Asp Glu Asp Glu

180 185 190

Ser Asp Glu Glu Asp Thr Pro Lys Lys Pro Glu Thr Gly Lys Arg Lys

195 200 205

Val Ala Glu Ile Val Leu Lys Thr Pro Ser Ser Asp Lys Lys Ala Lys

210 215 220

Ile Ala Thr Pro Ser Gly Gln Lys Thr Gly Asp Lys Lys Gly Val His

225 230 235 240

Val Ala Thr Pro His Pro Ala Lys Gln Ala Ser Lys Thr Pro Val Asn

245 250 255

Asp Lys Ser Lys Glu Lys Ser Pro Lys Ser Gly Gly Gly Ser Ile Ser

260 265 270

Cys Lys Ser Cys Ser Lys Thr Phe Asn Ser Glu Met Ala Leu Gln Ser

275 280 285

His Ser Lys Ala Lys His Pro Ala Lys

290 295

<210> 3

<211> 500

<212> DNA

<213> 水稻(Oryza sativa L.)

<400> 3

aaggaaaatg agcagaaaaa acaaggcaag acagattctt cagcttcaaa atcaaaggct 60

gcagtgaatg acgatgatga tgatgatgac agtgatgagg atgattctga ggacgaagat 120

ctttctcctg aggatgatga tgatgattct tctgaggatg attccagcga agatgatgag 180

gatgagagtg acgaggaaga tactcccaag aagccagaga ctggaaagag gaaagtagct 240

gaaattgtgt tgaagacacc ttcgtctgat aagaaagcaa agattgctac accgtcaggc 300

cagaagacag gtgacaagaa gggtgtccat gtagcaactc cacatccggc aaagcaggct 360

agcaagaccc ccgtgaatga caagtcaaag gagaagtccc caaaatccgg tggtgggtca 420

atttcttgca agtcatgcag caagacgttc aacagtgaaa tggctctgca atctcactcg 480

aaggccaagc accccgccaa 500

Claims

1.SEQ ID NO：1所示组蛋白去乙酰化酶基因OsHDT701在延长水稻种子活力和/或寿命中的应用。

2.SEQ ID NO：2所示组蛋白去乙酰化酶OsHDT701在延长水稻种子寿命中的应用。

3.SEQ ID NO：1所示组蛋白去乙酰化酶基因OsHDT701或SEQ ID NO：2所示组蛋白去乙酰化酶OsHDT701在培育长寿命的水稻种子中的应用。

4.SEQ ID NO：1所示组蛋白去乙酰化酶基因OsHDT701或SEQ ID NO：2所示组蛋白去乙酰化酶OsHDT701在提高水稻种子抗老化能力中的应用。

5.根据权利要求3或4所述的应用，其特征在于，敲减水稻中组蛋白去乙酰化酶基因OsHDT701的表达量。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，为构建OsHDT701基因的RNAi干扰载体并转化水稻，获得RNAi抑制表达的转基因水稻植株。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述RNAi干扰载体为pTCK303-OsHDT701；所述RNAi干扰载体pTCK303-OsHDT701的构建方法为扩增OsHDT701基因序列如SEQ ID NO：3所示的RNAi目标片段，利用酶切法将其正向插入到植物表达载体pTCK303上，将此中间载体命名为pTCK303-OsHDA701-1；再利用不同的酶切位点，将目标片段反向连接到中间载体pTCK303-OsHDA701-1上，转化大肠杆菌后重提质粒进行酶切鉴定，最终将载体命名为pTCK303- OsHDA701。