CN113684318A

CN113684318A - 猪繁殖与呼吸综合征病毒m蛋白基因的荧光pcr检测试剂盒

Info

Publication number: CN113684318A
Application number: CN202111084872.7A
Authority: CN
Inventors: 孙英峰; 杨婧; 刘野; 李文忠; 李留安; 于晓雪; 付旭彬; 于海
Original assignee: Tianjin Agricultural University
Current assignee: Tianjin Agricultural University
Priority date: 2021-09-16
Filing date: 2021-09-16
Publication date: 2021-11-23

Abstract

本发明公开了一种基因2型猪繁殖与呼吸综合征病毒M蛋白基因的荧光PCR检测试剂盒及其制备方法与用途，设计合成了一套特异性的引物及Taqman探针，并利用该引物及探针建立了一种快速简便、特异性强、灵敏度高的荧光PCR检测体系，可在3~4小时内从被检样本中快速、准确、特异、安全、简便地检出基因2型不同谱系PRRSV M蛋白基因，可以在生产标准化试剂盒中应用。

Description

猪繁殖与呼吸综合征病毒M蛋白基因的荧光PCR检测试剂盒

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种基因2型猪繁殖与呼吸综合征病毒M蛋白基因的荧光PCR检测试剂及其用途。

背景技术

PRRSV是一种不分节段的单股正链RNA病毒，直径约为50~70nm，基因组长约15kb，含有8个开放阅读框（ORFs），ORF1编码非结构蛋白，ORF2-ORF7编码结构蛋白。 ORF1a和ORF1b编码的两条长多肽链被酶切生成14种非结构蛋白。ORF2至ORF7编码8种结构蛋白，包括GP2、E、GP3、GP4、GP5a、GP5、M和N。其中M蛋白是动脉炎病毒中最保守的蛋白，具有很强的免疫原性，因此，对M蛋白基因的检测可作为样品中含有PRRSV核酸的重要证据。

目前，中国流行的PRRSV主要为基因2型毒株，具体可分为4个谱系：谱系1、谱系3、谱系5（亚系5.1）和谱系8（亚系8.7）。其中谱系8在流行毒株中一直以来都占有主要地位，这其中包括最早的CH-1a株和2006年以前的经典毒株以及2006年之后流行的HP-PRRSV毒株。2013年之后谱系1开始流行，其中主要为类NADC30毒株，临床检出率逐年增多已经与谱系8的HP-PRRSV成为优势流行毒株。谱系3是主要分布在我国的南方地区，临床检出率约10%。谱系5（BJ-4/VR2332）早在1996年就已经出现了，虽在我国并没有形成大的流行，但在临床上时有检出。不同谱系PRRSV导致我国猪场PRRS的流行趋势呈现多样化，从而加剧了我国对PRRS防控的严峻性和复杂性。

目前，已建立的PRRSV检测方法包括病毒分离鉴定、病毒抗原检测方法和病毒核酸检测方法。PRRSV的分离鉴定试验周期长，不适合快速检测。采用荧光抗体实验检测PRRSV抗原，具备快速、准确的特点，但对低病毒载量样本缺乏足够的敏感性低，易出现假阴性结果。荧光PCR技术将PCR与荧光检测结合起来，克服了传统费时、易污染和扩增后需电泳检测等缺点，已在PRRSV核酸检测方面得到应用，目前已报道的PRRSV荧光PCR方法所采用的引物和标记探针，主要是针对Nsp2、GP5和N蛋白基因序列设计制备的，可检测某一谱系、两种谱系或三种谱系PRRSV核酸，但无法实现同时进行4种谱系PRRSV样品的检测，即采用1对引物和1条探针实现谱系1、谱系3、谱系5和谱系8的PRRSV核酸尚未见报道。

发明内容

本发明为解决4种谱系PRRSV核酸同时检测的技术问题，提供一种PRRSV M蛋白基因的荧光检测试剂及其制备方法与途，具体涉及一种以PRRSV M蛋白基因为扩增靶序列而研制的检测试剂，该检测试剂包括一对引物、一条标记探针和一个阳性对照。

为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是通过以下步骤实现；

一种用于基因2型猪繁殖与呼吸综合征病毒M蛋白基因的荧光PCR检测的特异性引物，其特征在于：

上游引物：M-F：5'-CTAGGCCGCAAGTACATTCTG-3' SEQ ID NO.1

下游引物：M-R：5'-GACGACAAATGCGTGGTTATC-3' SEQ ID NO.2

本发明进一步公开了一种基因2型猪繁殖与呼吸综合征病毒M蛋白基因的荧光PCR检测一条特异性探针，其特征在于为：

M-P：5'-FAM-TACATTCTGGCCCCTGCCCACCAC-TAMRA-3' SEQ ID NO.3。

本发明同时也公开了基因2型猪繁殖与呼吸综合征病毒M蛋白基因的荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，包含一对特异性引物、一条特异性探针和一个阳性对照，扩增目标长度96bp，引物、探针和靶序列为：

上游引物：M-F：5'-CTAGGCCGCAAGTACATTCTG-3' SEQ ID NO.1

下游引物：M-R：5'-GACGACAAATGCGTGGTTATC-3' SEQ ID NO.2

探针：M-P：5'-FAM-TACATTCTGGCCCCTGCCCACCAC-TAMRA-3' SEQ ID NO.3

阳性对照：TGCTAGGCCGCAAGTACATTCTGGCCCCTGCCCACCACGTY

GAAAGTGCCGCRGGCTTTCATCCGATWRCGGCAARTGATAACCACGCATTTGTCGTCCGGCGTCCCGGCTCCACTACGGTYAACGGCACAYTGGTGCCCGGGTTAAAAAGCCTCGTGTTGGGTGGCAGAA；SEQ ID NO.4。

本发明还公开了基因2型猪繁殖与呼吸综合征病毒M蛋白基因荧光PCR检测试剂盒在快速准确特异的检出基因2型不同谱系PRRSV M蛋白基因方面的应用；所述的不同谱系PRRSV M蛋白基因指的是4种谱系PRRSV核酸同时检测，主要指的是谱系1、谱系3、谱系5（亚系5.1）和谱系8（亚系8.7）。实验结果显示：本发明建立了一种快速简便、特异性强、灵敏度高的荧光PCR检测体系，可在3~4小时内从被检样本中快速、准确、特异、安全、简便地检出基因2型不同谱系PRRSV M蛋白基因，可以在生产标准化试剂盒中应用。

本发明主要是针对目前养殖场流行PRRSV谱系繁多，检测不同谱系PRRSV需要多种引物和探针等繁琐问题，为避免PRRSV检测漏洞及降低检测繁琐性，重点考察了采用1对引物和1条探针实现谱系1、谱系3、谱系5和谱系8的PRRSV核酸同时检测的可能性，主要难点在于靶序列选择与引物合探针设计，决定了实验成功与失败。

为详细阐述上述的PRRSV M蛋白基因的荧光检测试剂的制备方法，具体实验包括以下步骤：

一、实验步骤

1、病毒RNA的提取和cDNA合成

按照试剂盒说明书操作步骤提取病毒RNA。取总RNA 10.5µL加入20µL反转录体系中，其中包含4µL 5×MLV Buffer，2µL dNTPmix（10mmo1/L）、1µL随机引物（50mmo1/L），2µLMLV（5U/µL）和0.5µL RNA酶抑制剂（40U/µL），轻轻混匀后于42℃水浴1h，最后冰浴2min，然后用于荧光定量PCR或置-20℃保存备用。

2、阳性标准品的制备

以CMF/ CMR为引物做常规PCR，扩增PRRSV的M蛋白基因，PCR产物回收经试剂盒纯化后连接入pMD 18-T载体，转化至DH5α大肠杆菌，提取经PCR鉴定和通过序列测定分析验证的阳性克隆的质粒，测定DNA浓度后，按公式计算标准品的拷贝数，拷贝数（copies）=（质量/分子量）×6.0×10²³。以10倍系列稀释质粒标准品。

3、反应体系与条件的优化

在相同浓度模板与反应体系中，采用矩阵法优化引物和探针的最佳浓度。同时在TaqMan荧光定量RT-PCR反应条件中，结合用梯度PCR仪调整不同Tm值（50℃-65℃），选择最佳Tm值对相同浓度的阳性核酸模板进行检测。

4、标准曲线的建立

用10倍系列稀释质粒标准品7.6×10⁴ copies/µL-7.6×10¹¹ copies/µL为模板，经荧光定量PCR仪检测后，计算Ct值并绘制标准曲线。

5、特异性试验

选用基因2型PRRSV谱系1（NADC30-like）、谱系3（GM2）、谱系5（VR2332）和谱系8（JXA1-R）以及对照病毒CSFV，PRV，PPV，PCV2的DNA或cDNA，应用优化好的荧光定量PCR条件进行特异性试验。

6、敏感性试验

用7.6×10⁰ copies/µL-7.6×10¹¹ copies/µL阳性标准品做荧光定量PCR检测，检测上述稀释度的病毒核酸，检验方法的敏感性。

7、重复性试验

用4种浓度的质粒标准品分别进行批间重复性试验和批内重复性试验。

二、实验结果

1、阳性标准品的获得

用扩增PRRSV的M蛋白基因部分片段引物CMF、CMR和以PRRSV JXA1-R的cDNA为模板做常规PCR，结果扩增到171bp的PRRSV M蛋白基因的特异性片段（图1）。 PCR产物回收经试剂盒纯化后连接入pMD 18-T载体，转化至DH5α大肠杆菌，培养后用PCR鉴定和通过序列测定分析验证获得阳性克隆。用质粒提取试剂盒提取阳性克隆的质粒并测定DNA浓度后，按公式计算标准品的拷贝数，拷贝数（copies）=（质量/分子量）×6.0×10²³。

2、荧光定量PCR条件的优化

本研究对引物与探针浓度进行优化，以提高反应的扩增效率与敏感度。结果表明当引物浓度为10pmol/µL，探针浓度为50pmol/µL且Tm温度为60℃时，可获得最低Ct值和最高荧光强度增加值，优化后25µL反应体系：2× Premix Ex Taq （Probe qPCR）12.5 µL；上、下游引物（10pmol/µL）各0.5 µL，探针（50pmol/µL）1µL；模板（质粒或cDNA）2 µL，补DEPC水至25µL。荧光定量PCR反应参数：95℃变性30s，以95℃ 5s，60℃30s扩增40个循环，在60℃进行单点荧光信号检测收集。

3、标准曲线的建立

将RNA标准品系列稀释，用建立的荧光定量RT-PCR方法测定，以Ct值与不同浓度标准品的对数值绘制出标准曲线，得到标准曲线方程为y=-4.5204 X LOG C X ) +44.195，相关系数R²=0.99。所得标准曲线（见图2）。

4、特异性试验结果

选用基因2型PRRSV谱系1（NADC30-like）、谱系3（GM2）、谱系5（VR2332）和谱系8（JXA1-R）以及对照病毒CSFV，PRV，PPV，PCV2的DNA或cDNA，用优化好的荧光定量PCR条件做荧光定量PCR检测，其中PRRSV谱系1（NADC30-like）、谱系3（GM2）、谱系5（VR2332）和谱系8（JXA1-R）的检测结果为阳性，而除PRRSV外的对照样品检测结果均为阴性（荧光信号未到达阑值）（图3）。结果证明：本方法具有良好的特异性。

5、敏感性试验结果

用建立的方法对标准品（JXA1-R）进行荧光定量PCR检测，其阳性判定标准为 40cycles内的Ct>0且有典型的S扩增曲线（图4）。结果表明，本发明能检出最低浓度为104copies /µL模板，敏感性良好。

6、重复性试验结果

用4种浓度的质粒标准品进行重复性试验，变异系数均小于2%，表明重复性良好。

表1 PRRSV 实时荧光定量RT-PCR批内和批间重复性试验

附图说明

图1为PRRSV M蛋白基因的特异性片段；

图2为荧光定量RT-PCR检测PRRSV的标准曲线；

图3为荧光定量RT-PCR特异性试验结果；

图4为荧光定量RT-PCR检测PRRSV的动力学曲线。

具体实施方式

下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。本发明所用原料及试剂均有市售。

实施例1

基因2型猪繁殖与呼吸综合征病毒M蛋白基因的荧光PCR检测试剂盒的制备方法如下：

（1）选择基因2型PRRSV 4种谱系病毒 M蛋白基因序列保守片段为阳性对照制备和扩增的靶目标序列，其核苷酸序列如；SEQ ID NO.4所示: TGCTAGGCCGCAAGTACATTCTGGCCCCTGCCCACCACGTYGAAAGTGCCGCRGGCTTTCATCCGATWRCGGCAARTGATAACCACGCATTTGTCGTCCGGCGTCCCGGCTCCACTACGGTYAACGGCACAYTGGTGCCCGGGTTAAAAAGCCTCGTGTTGGGTGGCAGAA；

（2）根据基因2型PRRSV 4种谱系病毒 M蛋白基因序列设计多条引物，经过大量对比筛选实验，确定最适1对引物，扩增和制备M蛋白基因阳性对照，引物序列如下：

上游引物：CMF：5'-TGCTAGGCCGCAAGTACATTC-3' SEQ ID NO.5

下游引物：CMR：5'-TTCTGCCACCCAACACGAG-3' SEQ ID NO.6

（3）根据基因2型PRRSV 4种谱系病毒M蛋白基因阳性对照序列设计多对引物和多条探针，经过大量的对比筛选试验，确定最适的引物对和标记探针组合:

上游引物：M-F：5'-CTAGGCCGCAAGTACATTCTG-3' SEQ ID NO.1

下游引物：M-R：5'-GACGACAAATGCGTGGTTATC-3' SEQ ID NO.2

探针：M-P：5'-FAM-TACATTCTGGCCCCTGCCCACCAC-TAMRA-3' SEQ ID NO.3

实施例2

对收集的20份PRRSV可疑临床样品，分别进行实时荧光定量RT-PCR检测和商品化荧光RCR试剂盒（针对PRRSV 谱系3、谱系5和谱系8 的Nsp2，以及针对PRRSV 谱系1 的GP5蛋白基因）检测，结果表明，本发明实时荧光定量RT-PCR方法阳性检出率（40%），比商品化荧光定量PCR检测试剂盒（两种试剂盒阳性率合计35%）高，实现了谱系1、谱系3、谱系5和谱系8的PRRSV核酸同时检测，说明本发明检测（针对PRRSV M蛋白基因）的敏感性及准确度更高，检测时间短，可以在生产标准化试剂盒中应用。

SEQUENCE LISTING

<110> 天津农学院

<120> 猪繁殖与呼吸综合征病毒M蛋白基因的荧光PCR检测试剂盒

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

ctaggccgca agtacattct g 21

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gacgacaaat gcgtggttat c 21

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

tacattctgg cccctgccca ccac 24

<210> 4

<211> 171

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

tgctaggccg caagtacatt ctggcccctg cccaccacgt ygaaagtgcc gcrggctttc 60

atccgatwrc ggcaartgat aaccacgcat ttgtcgtccg gcgtcccggc tccactacgg 120

tyaacggcac aytggtgccc gggttaaaaa gcctcgtgtt gggtggcaga a 171

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

tgctaggccg caagtacatt c 21

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

ttctgccacc caacacgag 19

Claims

1.一种用于基因2型猪繁殖与呼吸综合征病毒M蛋白基因的荧光PCR检测的特异性引物，其特征在于：

上游引物：M-F：5'-CTAGGCCGCAAGTACATTCTG-3' SEQ ID NO.1

下游引物：M-R：5'-GACGACAAATGCGTGGTTATC-3' SEQ ID NO.2。

2.一种基因2型猪繁殖与呼吸综合征病毒M蛋白基因的荧光PCR检测一条特异性探针，其特征在于为：M-P：5'-FAM-TACATTCTGGCCCCTGCCCACCAC-TAMRA-3' SEQ ID NO.3。

3.一种基因2型猪繁殖与呼吸综合征病毒M蛋白基因的荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，包含一对特异性引物、一条特异性探针和一个阳性对照，扩增目标长度96bp，引物、探针和靶序列为：

上游引物：M-F：5'-CTAGGCCGCAAGTACATTCTG-3' SEQ ID NO.1

下游引物：M-R：5'-GACGACAAATGCGTGGTTATC-3' SEQ ID NO.2

探针：M-P：5'-FAM-TACATTCTGGCCCCTGCCCACCAC-TAMRA-3' SEQ ID NO.3

阳性对照：TGCTAGGCCGCAAGTACATTCTGGCCCCTGCCCACCACGTY

4.权利要求3所述的基因2型猪繁殖与呼吸综合征病毒M蛋白基因荧光PCR检测试剂盒是在快速准确特异的检出基因2型不同谱系PRRSV M蛋白基因方面的应用；所述的不同谱系PRRSV指的是4种谱系，即谱系1、谱系3、谱系5（亚系5.1）和谱系8（亚系8.7）PRRSV同时检测。