CN116411132A - 一种快速检测猪伪狂犬病的方法 - Google Patents
一种快速检测猪伪狂犬病的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN116411132A CN116411132A CN202210110444.5A CN202210110444A CN116411132A CN 116411132 A CN116411132 A CN 116411132A CN 202210110444 A CN202210110444 A CN 202210110444A CN 116411132 A CN116411132 A CN 116411132A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- probe
- porcine pseudorabies
- nucleic acid
- primer pair
- extraction
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 31
- 208000009305 pseudorabies Diseases 0.000 title claims abstract description 14
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims abstract description 37
- 241000701093 Suid alphaherpesvirus 1 Species 0.000 claims abstract description 33
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 32
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims abstract description 26
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims abstract description 22
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims abstract description 22
- 239000006166 lysate Substances 0.000 claims abstract description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims abstract description 4
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 claims description 17
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 10
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 10
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 4
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 claims description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 abstract description 21
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 10
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 abstract description 10
- 241001135989 Porcine reproductive and respiratory syndrome virus Species 0.000 abstract description 6
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 abstract description 6
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 abstract description 5
- LXWYCLOUQZZDBD-LIYNQYRNSA-N csfv Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)[C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 LXWYCLOUQZZDBD-LIYNQYRNSA-N 0.000 abstract description 4
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 abstract description 3
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 abstract description 3
- 239000012530 fluid Substances 0.000 abstract description 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 11
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 9
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 6
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 6
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 5
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 5
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 4
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 238000013461 design Methods 0.000 description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 238000010791 quenching Methods 0.000 description 3
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 description 3
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241001533384 Circovirus Species 0.000 description 2
- 241000710777 Classical swine fever virus Species 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 2
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 2
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 2
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 2
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- 241001391944 Commicarpus scandens Species 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 208000032420 Latent Infection Diseases 0.000 description 1
- 206010060860 Neurological symptom Diseases 0.000 description 1
- 241001673669 Porcine circovirus 2 Species 0.000 description 1
- 208000003251 Pruritus Diseases 0.000 description 1
- 206010037660 Pyrexia Diseases 0.000 description 1
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 1
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 1
- 108020005202 Viral DNA Proteins 0.000 description 1
- 108020000999 Viral RNA Proteins 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000003287 bathing Methods 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000003748 differential diagnosis Methods 0.000 description 1
- 208000037771 disease arising from reactivation of latent virus Diseases 0.000 description 1
- 230000004064 dysfunction Effects 0.000 description 1
- 238000013399 early diagnosis Methods 0.000 description 1
- 201000002491 encephalomyelitis Diseases 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000001917 fluorescence detection Methods 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 238000012224 gene deletion Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 238000013412 genome amplification Methods 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 230000007803 itching Effects 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 210000005036 nerve Anatomy 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 238000004451 qualitative analysis Methods 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 230000001850 reproductive effect Effects 0.000 description 1
- 208000023504 respiratory system disease Diseases 0.000 description 1
- 239000003161 ribonuclease inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 238000011895 specific detection Methods 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
- C12Q1/701—Specific hybridization probes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/6851—Quantitative amplification
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Immunology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Virology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明提供一种快速检测猪伪狂犬病的方法，从而可以快速、特异的对猪伪狂犬病毒进行扩增和诊断。本发明方法，其中使用的鉴定猪伪狂犬病毒的引物对和探针，其序列分别为SEQ ID NO:1‑3。所述的检测方法，是将待检测的样品的上清液体直接添加到核酸裂解液中作为扩增的模板。本发明利用所设计的引物和探针能够区分PRV野毒株和疫苗株，并且不与PPV、PRRSV、PCV2、CSFV、PCV1反应，具有很高的特异性；灵敏度可达到1×10拷贝/μL，比常规PCR高100倍，具有很好的重复性，采用的核酸免提取步骤极大的缩短提取时间，比常规提取方法，整个检测周期缩短了20‑30min，且给早期快速诊断以及定量分析PRV野毒株感染提供有利条件。
Description
技术领域
本发明属于动物疫病防控检测技术领域，具体涉及一种快速检测猪伪狂犬病的方法。
背景技术
伪狂犬病病毒(Pseudorabies Virus，PRV)可感染多种家畜和野生动物，引发以发热、奇痒以及急性脑脊髓炎等为典型神经症状的急性传染病。猪是该病毒的传染源及长期贮存宿主，该病毒可引起母猪繁殖障碍及仔猪的神经症状、严重的呼吸道疾病，仔猪死亡率较高；耐过猪则生长减缓甚至成僵猪。
20世纪70年代以来，中国多采用基因工程缺失疫苗以及与之相配套的血清学鉴别诊断方法以期根除猪伪狂犬病，然而随之也带来了野毒潜伏感染的弊端，导致野毒可长期在机体内复制和向外排毒，从而无法真正地消除猪伪狂犬病。而随着规模化养猪的不断发展和强毒株的出现，猪伪狂犬病的发生和流行日趋严重，对该病的防治带来很大的困难，因此对猪伪狂犬病毒感染早期进行及时、快速、准确的诊断，是有效防制该病的重要前提。
国内对猪伪狂犬的诊断方法主要包括病毒分离鉴定和血清学诊断方法，病毒分离方法好时长不适用疫病的防控与检测，由于病毒感染特异性抗体出现较晚，血清学方法也难以用于早期诊断。常规的PCR检测技术灵敏度低，并且只能作定性分析，不能进行定量检测，又易产生假阳性结果，不利于大量样本的快速诊断。
核酸提取技术对于分离核酸的质量、纯度以及完整性有直接的影响，在疫病检测领域，有着非常重要的作用，现有方法中存在着耗时长、成本高以及现场应用困难等问题，因此核酸免提取技术的开发对于样本的快速检测有着重要的意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种快速检测猪伪狂犬病的方法，从而可以快速、特异的对猪伪狂犬病毒进行扩增和诊断。
本发明首先提供一种用于鉴定猪伪狂犬病毒的引物对和探针，其序列信息如下：
上游引物：5’-ATCCCATTTGCAGCTCTTCTC-3'(SEQ ID NO:1)、
下游引物：5’-CTGATGTCCTCGCGCGAGT-3’(SEQ ID NO:2)、
探针：5’FAM-GTCGCACCGATGCCGC-NFQ3’(SEQ ID NO:3)；
所述的探针的5′端使用报告发光基团FAM进行标记，3′端使用淬灭基团NFQ进行标记。
本发明所提供的引物对和探针用于制备荧光定量PCR检测试剂盒。
本发明还提供一种检测猪伪狂犬病的方法，是使用上述的引物对和探针来进行检测。
所述的方法，是使用荧光定量PCR检测方法来进行检测。
所述的检测方法，是将待检测的样品的上清液体直接添加到核酸裂解液中作为扩增的模板。
本发明利用所设计的引物和探针能够区分PRV野毒株和疫苗株，并且不与PPV、PRRSV、PCV2、CSFV、PCV1反应，具有很高的特异性；灵敏度可达到1×10拷贝/μL，比常规PCR高100倍，具有很好的重复性，采用的核酸免提取步骤极大的缩短提取时间，比常规提取方法，整个检测周期缩短了20-30min，且给早期快速诊断以及定量分析PRV野毒株感染提供有利条件。
附图说明
图1为本发明阳性质粒标准品的10倍稀释的梯度标准曲线图，
图2为本发明常规PCR敏感性检测结果图，其中M：DL2000 Marker；泳道1:阴性对照；泳道2-9：稀释度为1×107-1×100copies/ul的模板DNA。
图3为本发明荧光定量PCR敏感性检测结果图。
图4为本发明特异检测结果图，其中曲线a为PRV野毒株阳性对照样品的扩增曲线，曲线b-f分别为猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒、圆环1型、圆环2型、PRV疫苗株、猪瘟病毒扩增曲线。
图5为本发明重复性检测结果图。
具体实施方式
PRV基因组约150kb，GC含量在70％以上，GC含量较高。因此其基因组内含有很多复杂的二级结构，使得氢键不易断裂从而阻碍Taq酶在模板链上顺利延伸，全长基因组扩增较为困难易引发非特异性扩增，因此设计出理想的引物和TaqMan探针是本发明的难点。本方面基于PRV基因的这个特点，通过对猪伪狂犬病毒野生毒株和疫苗株的基因组进行分析，在其保守区域设计了特异性的引物和探针，并结合核酸免提取步骤，可以快速、特异的对猪伪狂犬病毒进行扩增和诊断。探针的3′端的淬灭基团标记不发光的NFQ荧光基团，具有较背景信号较低的优势，从而能在定量中获得更好的精度，提高数据的灵敏度和精确度。另外镶嵌的MGB基团使探针设计长度缩短，提供更好的序列鉴别能力和灵活性，可适应更多靶标，增强其与DNA的结合，从而提高检测的灵敏度和特异性，使结果更精确。
下面结合实施例和附图对本发明进行详细的描述。
实施例1：引物和探针的设计以及阳性质粒标准品的制备
根据GenBank中公布的猪伪狂犬病毒的基因序列，通过对猪伪狂犬病毒野生毒株和疫苗株的基因组进行分析，在其保守区域设计了特异性的引物和探针，引物对和探针的序列信息如下：
上游引物：5’-ATCCCATTTGCAGCTCTTCTC-3'
下游引物：5’-CTGATGTCCTCGCGCGAGT-3’
探针核酸序列：5’FAM-GTCGCACCGATGCCGC-NFQ3’
探针的荧光标记选择FAM作为报告发光基团，NFQ为淬灭基团。
同时在PRV基因的保守区域内设计一对包含了荧光定量PCR扩增的产物在内的片段引物，扩增片段长为1100bp，上游引物：5’-ACGTGTTGGCCTTTCTGCTGC-3’下游引物：5’-CAGCAAGTGACATAGTCA GGC-3’。将该引物扩增的产物回收纯化后连接到PMD-19T载体，并进行克隆，构建重组质粒，作为阳性克隆质粒。测定DNA浓度后，按公式计算标准品的拷贝数，拷贝数(copies)＝(质量/分子量)×6.0×1023。以10倍系列稀释质粒标准品至下限达E，-20℃保存备用。
提取经PCR鉴定和通过序列测定分析验证的阳性克隆质粒。用核酸蛋白分析仪测定质粒DNA的浓度测定OD260值，并根据阿弗加德罗常数计算单位体积中质粒的拷贝数并稀释至1×109拷贝/μL，-20℃保存质粒。
实施例2荧光定量PCR检测方法的特性评价
1、标准曲线的建立
用10倍系列稀释质粒标准品102copies/μL～109copies/μL为模板，20μL反应液中包括：Premix Ex Taq(Probe qPCR)(2×)10μl；上、下游引物(20pmol/μL)各0.4μL；探针(25pmol/μL)0.8μL；模板(质粒或DNA)1μL，补DEPC水至20μL。反应参数：95℃变性5min，以95℃20s，54℃1min扩增40个循环，在54℃进行单点荧光检测。计算Ct值并绘制标准曲线(图1)。该曲线的斜率为-3.26，相关系数为0.999，扩增效率为102.629％.结果显示在102～109拷贝范围内有极好的线性关系。
2、荧光定量PCR检测的敏感性
用10倍系列稀释的标准品(100copies/μL～106copies/μL)为模板，用本发明建立的探针及引物进行检测，反应体系及条件按照步骤1中所示进行。结果显示浓度在10拷贝的反应体系有明显的荧光增加，而1拷贝和阴性对照均无荧光增加。并同时与常规PCR方法进行检测结果比较。常规PCR产物经1％的琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图2所示。图3为荧光定量PCR检测的动力学曲线。
3、荧光定量PCR方法的特异性
(1)病毒核酸的提取
将猪伪狂犬野毒株病毒、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒、圆环1型、圆环2型、PRV基因缺失株、猪瘟病毒等样品8000rmp速度进行离心，取上清与核酸裂解液按照1：3的比例震荡混合，72℃孵育15min。
(2)反转录
将提取的猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒和猪瘟病毒核酸5μ加入到加入20μL反转录体系中，其中包含4μL 5×反转录Buffer、2μL dNTPmix(10mmol/L)、2μL随机引物(50mmol/L)、1μL M-MLV(5u/μL)和0.5μL RNA酶抑制剂(40u/μL)，用无RNA酶的水补齐。轻轻混匀后于42℃水浴2h，最后冰浴2min，然后用于荧光定量PCR或置20℃保存备用。
(3)将制备的CSFV、PCV2、PRRSV等的cDNA和DNA按上述方法进行荧光定量PCR检测，并设空白对照，结果显示只有PRV野毒株呈阳性，其他病毒核酸均无荧光信号，表明TaqMan荧光PCR对PRV野毒株的检测有较好的特异性。(见图4)
4、荧光定量PCR方法的重复性
采用三份不同的PRV野毒株阳性病料，对每个浓度的样本做2个重复，计算其变异系数。变异系数(p)＝标准偏差(SD)/平均数(X)，结果见图5和表1，此方法扩增曲线稳定，每次检测之间的平均值误差非常小，具有良好的稳定性和重复性。
表1荧光定量PCR重复性实验结果表
实施例3核酸免提取技术与常规提取方法的敏感性研究
对临床上采集的鼻拭子、肛门拭子以及血样样品各五份，分别采用核酸免提取和核酸提取的情况下，按照本发明的荧光定量PCR技术进行检测，核酸提取试剂盒为病毒DNA/RNA膜柱法提取试剂盒(青岛英赛特生物科技有限公司)。如表2所示，本发明采用的核酸免提取技术与核酸提取条件下，检测数据的吻合度良好，说明该提取方法能够实现核酸的快速释放，实现后续的检测工作。
表2：两种提取方式的临床样品检测结果表
本发明所设计的引物对和探针，以及建立的检测方法能成功的检测出PRV野毒株，并能区分PRV疫苗株，并且不与PPV、PRRSV、PCV2、CSFV、PCV1、反应，具有很高的特异性；灵敏度可达到1×10拷贝/μL，比常规PCR高100倍，具有很好的重复性，采用的核酸免提取技术极大的缩短提取时间，比常规提取方法，整个检测周期缩短了20-30min，且给早期快速诊断以及定量分析PRV野毒株感染提供有利条件。
序列表
<110> 青岛蔚蓝生物股份有限公司、青岛蔚蓝生物制品有限公司
<120> 一种快速检测猪伪狂犬病的方法
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atcccatttg cagctcttct c 21
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ctgatgtcct cgcgcgagt 19
<210> 3
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gtcgcaccga tgccgc 16
Claims (7)
1.一种用于鉴定猪伪狂犬病毒的引物对和探针，其特征在于，所述的引物对和探针的序列信息如下：
上游引物的核酸序列为SEQ ID NO:1、
下游引物的核酸序列为SEQ ID NO:2、
探针的核酸序列为SEQ ID NO:3。
2.如权利要求1所述的引物对和探针，其特征在于，所述的探针的5′端使用报告发光基团进行标记，3′端使用淬灭基团进行标记。
3.如权利要求2所述的引物对和探针，其特征在于，所述的报告发光基团为FAM，淬灭基团为NFQ。
4.权利要求1-3任一项所述的引物对和探针在制备荧光定量PCR检测试剂盒中的应用。
5.一种用于检测检测猪伪狂犬病的荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，所述荧光定量PCR检测试剂盒包含有权利要求1-3任一项所述的引物对和探针。
6.一种检测猪伪狂犬病的方法，其特征在于，所述的方法是荧光定量PCR检测方法，使用权利要求1-3任一项所述的引物对和探针来进行检测。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的方法中，是将待检测的样品的上清液体直接添加到核酸裂解液中作为扩增的模板。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202111673593 | 2021-12-31 | ||
| CN2021116735934 | 2021-12-31 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN116411132A true CN116411132A (zh) | 2023-07-11 |
Family
ID=87053728
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202210110444.5A Pending CN116411132A (zh) | 2021-12-31 | 2022-01-29 | 一种快速检测猪伪狂犬病的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN116411132A (zh) |
-
2022
- 2022-01-29 CN CN202210110444.5A patent/CN116411132A/zh active Pending
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN110777220B (zh) | 一种引物组、探针、rpa试纸条试剂盒、鉴别方法 | |
| CN110760620A (zh) | 一种猪瘟病毒与非洲猪瘟病毒双重荧光pcr检测试剂、试剂盒和检测方法 | |
| CN110760617B (zh) | 检测非洲猪瘟病毒野毒的实时荧光pcr引物探针组合及试剂盒 | |
| CN111996191A (zh) | 一种基于多重qPCR技术同时鉴别非洲猪瘟野生毒株和基因缺失株用引物组和试剂盒 | |
| CN113462820A (zh) | 实时荧光定量检测四种猪腹泻病毒的多重rt-pcr引物探针组、试剂盒及其检测方法 | |
| CN105907890A (zh) | 一种快速区分HP-PRRS疫苗GDr180株与野毒株的引物、探针及方法 | |
| CN114015815B (zh) | 猪非典型瘟病毒的微滴数字pcr试剂盒及其检测方法 | |
| CN114634996B (zh) | 用于检测牛呼吸道疾病的引物探针组合、试剂盒及其应用 | |
| AU2021104086A4 (en) | Detection reagent for fluorescent duplex pcr for classical swine fever virus and african swine fever virus, kit, and detection method | |
| CN116162734B (zh) | 一种快速检测非洲猪瘟野毒株和基因缺失毒株的特异性引物、探针和试剂盒 | |
| CN111471802A (zh) | 一种猪德尔塔冠状病毒快速检测引物、试剂盒及其应用 | |
| CN114480726B (zh) | 非洲猪瘟病毒核酸检测的引物探针组、试剂盒及检测方法 | |
| CN116814859A (zh) | 鉴别非洲猪瘟病毒基因ⅰ型和ⅱ型的引物探针组合物、试剂盒及方法 | |
| CN114438265B (zh) | 同时检测猪德尔塔冠状病毒、呼肠孤病毒和猪嵴病毒的核酸组合物、试剂盒及检测方法 | |
| CN116004925A (zh) | 用于鉴别非洲猪瘟病毒野毒株和基因缺失株的三重荧光pcr引物探针组、试剂和方法 | |
| CN111334613B (zh) | 用于检测犬腺病毒的rpa引物对、探针、试剂盒及检测方法 | |
| CN115851705A (zh) | 鉴别猪流行性腹泻病毒强弱毒株的探针、引物及其试剂盒 | |
| CN116411132A (zh) | 一种快速检测猪伪狂犬病的方法 | |
| CN115725788A (zh) | 一种用于检测猫细小病毒的引物和TaqMan探针及其应用 | |
| CN110157836B (zh) | 一种检测ibrv和bvdv的引物、探针及方法 | |
| CN116144836B (zh) | 一种prrsv的四重荧光定量rt-pcr检测引物组及检测方法 | |
| CN116200546B (zh) | PRCV、PRRSV、SIV和PRV的多重RT-qPCR试剂盒及检测方法 | |
| CN113801961B (zh) | 检测猪塞内卡病毒A的rRT-RAA引物对和探针、试剂盒及应用 | |
| CN110607404B (zh) | 猪肠病毒g型的实时荧光定量pcr检测引物及其试剂盒 | |
| CN114752709A (zh) | 一种猪流行性腹泻病毒的通用型荧光定量pcr检测引物、试剂盒及应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |