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CN113655227A - 一种新生儿疾病筛查用多联检测试剂盒及其制备方法和使用方法 - Google Patents

一种新生儿疾病筛查用多联检测试剂盒及其制备方法和使用方法 Download PDF

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CN113655227A CN202110747892.1A CN202110747892A CN113655227A CN 113655227 A CN113655227 A CN 113655227A CN 202110747892 A CN202110747892 A CN 202110747892A CN 113655227 A CN113655227 A CN 113655227A
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李婉君
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Guangzhou Juntong Biotechnology Co ltd
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Abstract

本发明公开了一种新生儿疾病筛查用多联检测试剂盒及其制备方法和实用方法，包括缓冲液、至少两个的反应杯、吖啶酯标记物微球、校准品、质控品、激发液、浓缩洗液、溶血剂；所述反应杯为内表面包被有目标抗体或抗原耦联物的微孔；所述目标抗体或抗原耦联物为:抗TSH抗体蛋白、甲状腺素T4偶联牛血清白蛋白、17α‑羟孕酮偶联牛血清白蛋白、抗GAA抗体蛋白。本发明实现了使用一个试剂盒进行多项（2～8项）血液标志物的联合筛查，大大简化准备工作，减少人为操作的失误，提高了工作效率；运用以吖啶酯为标记物的化学发光标记免疫分析技术和荧光分析法，保证定量检测的优越性能。

Description

一种新生儿疾病筛查用多联检测试剂盒及其制备方法和使用 方法
技术领域
本发明涉及新生儿疾病筛查技术领域，具体涉及一种新生儿疾病筛查用多联检测试剂盒及其制备方法和使用方法。
背景技术
新生儿疾病筛查是指通过血液检查对某些危害严重的先天性代谢病及内分泌病进行群体过筛，使患儿得以早期诊断，早期治疗，避免因脑、肝、肾等损害导致生长、智力发育障碍甚至死亡。新生儿疾病筛查的对象为所有出生72小时（哺乳至少6～8次）的活产新生儿。筛查疾病的种类依种族、国家、地区而别，还与各国的社会、科学技术的发展、经济水平及疾病危害程度有关。国际公认的作为筛查疾病的条件有：①有一定的发病率；②早期缺乏特殊症状；③危害严重；④可以治疗；⑤有可靠的并适合大规模进行的筛查方法。1974年欧洲召开的一次会议上曾推荐20种疾病作为筛查内容，其中包括苯丙酮尿症（PKU）、枫糖尿症、组氨酸血症、半乳糖血症等。2006年美国医学遗传学会新生儿筛查专家组对现有84种新生儿先天性疾病的严重程度进行评估，根据筛查技术、诊断、鉴别诊断和治疗等条件，分为第一类29种首要筛查疾病，第二类25种次要筛查疾病及现阶段不易筛查疾病。我国目前筛查疾病仍以苯丙酮尿症（PKU）和先天性甲状腺功能减低症（CH）为主，某些地区则根据疾病的发生率选择如葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PD）缺乏症、先天性肾上腺皮质增生症（CAH）和地中海贫血等筛查或开始试用串联质谱技术进行其他氨基酸、有机酸、脂肪酸等少见遗传代谢病的新生儿筛查。
目前新生儿疾病筛查主要以滤纸干血斑为检测样品，采血点严格按照新生儿遗传代谢病筛查血片采集步骤采集足跟血，制成滤纸干血片，并在规定时间内递送至新生儿遗传代谢病筛查实验室检验。通过荧光分析法和标记免疫分析法原理进行筛查的常见疾病如下：
苯丙酮尿症以苯丙氨酸（Phe）作为筛查指标，Phe 浓度阳性切值根据实验室及试剂盒而定，一般大于120μmol/L（2mg/dL）为筛查阳性；筛查方法为荧光分析法、定量酶法、细菌抑制法和串联质谱法。
天性甲状腺功能减低症以促甲状腺素（TSH）和游离甲状腺素（FT4）作为筛查指标。TSH 浓度的阳性切值根据实验室及试剂盒而定，一般大于10～20μIU/mL且FT4浓度的阳性切值根据实验室及试剂盒而定，一般小于9.7pmol/L 为筛查阳性。
葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PD）缺乏症先天性甲状腺功能减低症以G6PD作为筛查指标，一般小于2.6U/gHb为筛查阳性。
先天性肾上腺皮质增生症以测定干血滤纸片中17a-羟孕酮（17α-OHP）浓度进行21-OHD筛查（一级筛查），结合国内实验室的经验，推荐足月儿或正常体重儿（≥2500g）的17α-OHP阳性切值为30nmol/L；早产儿或低体重儿（＜2500g）为50nmol/L。
进行性肌营养不良症以检测血清中肌酸激酶（CK）或肌酸激酶同工酶（CK-MM）作为筛查指标，CK初筛结果＜200U/L的新生儿判读为正常，如果CK初筛结果＞200U/L，则需要复查；CK初筛结果＞200U/L的新生儿三次CK检测结果均值≤250U/L，则认为该新生儿正常；如果这部分新生儿三次CK检测结果均值≥250U/L，则归入监测患儿，在随后的6～8周内进行随访监测血清CK值。
半乳糖血症以检测半乳糖和1-磷酸半乳糖血浓度作为筛查指标。
糖原累积病Ⅱ型以检测血清中肌酸激酶（CK）及血细胞裂解液中酸性-α-葡萄糖苷酶（GAA）活性缺乏或显著降低作为筛查指标。
酶联免疫吸附试验（酶联免疫试剂盒）：是酶免疫测定技术中应用最广的技术。其基本方法是将已知的抗原或抗体吸附在固相载体 ( 聚苯乙烯微量反应板 ) 表面，使酶标记的抗原抗体反应在固相表面进行，用洗涤法将液相中的游离成分洗除。常用的酶联免疫吸附试验方法有双抗体夹心法和间接法，前者用于检测大分子抗原，后者用于测定特异抗体。
时间分辨免疫荧光测定技术是八十年代初问世的一项新型的超微量免疫分析技术。荧光的时间分辨技术是利用荧光发射体的荧光寿命差别，将其荧光分开的荧光光谱技术。以镧系元素为示踪剂代替放射性同位素，用具有双功能基团的镧系元素来标记抗原或抗体，当解离下来的镧系元素与特制的扩增液形成新的螯合物时，其荧光明显增强而持久。用延迟测量的办法可消除标本自身的本底荧光，从而大大提高检测灵敏度。
荧光分析法是指利用某些物质被紫外光照射后处于激发态，激发态分子经历一个碰撞及发射的去激发过程所发生的能反映出该物质特性的荧光，可以进行定性或定量分析的方法。荧光分析是一种先进的分析方法，它比电子探针法、质谱法、光谱法、极谱法等都应用的较广泛和普及，这同荧光分析具有很多优点分不开的。荧光分析所用的设备较简单，如目测荧光仪和荧光光度计构造非常简单完全可以自己制造。比起质谱仪、极谱仪和电子探针仪来它在造价上要便宜很多倍，而且荧光分析的最大特点是：分析灵敏度高、选择性强和使用简便。同时具备这三大特点的仪器并不多。
化学发光标记免疫分析又称化学发光免疫分析(CLIA ) ，是用化学发光剂直接标记抗原或抗体的免疫分析方法。常用于标记的化学发光物质有吖啶酯类化合物--acridinium ester (AE)，是有效的发光标记物，其通过起动发光试剂(NaOH、H2O2 )作用而发光。强烈的直接发光在一秒钟内完成，为快速的闪烁发光。吖啶酯作为标记物用于免疫分析，其化学反应简单、快速、无须催化剂；检测小分子抗原采用竞争法，大分子抗原则采用夹心法，非特异性结合少，本底低；与大分子的结合不会减小所产生的光量，从而增加灵敏度。
随着药物研发、干预手段和医疗保险体系的完善，新生儿疾病筛查病种会扩大，筛查实验室检测技术遍及许多生命学科，包括微生物学技术，如BIA法；免疫学技术，如时间分辨免疫荧光分析法（TrFIA)、荧光酶免疫分析法（FEIA)、酶联免疫吸附法（ELISA)等；生物化学技术，如定量酶法；生物物理学技术，如荧光分析法，串联质谱法等。目前上述疾病的筛查均为单一指标筛查，而且市面的筛查试剂盒均为单一检测项目。滤纸干血片血斑采集是新生儿遗传性疾病筛查过程的首个环节，标本合格与否，直接影响实验结果。血片采集不合格是筛查漏诊的最主要的原因之一，而漏诊将会延误治疗，对新生儿造成终生影响。
发明内容
本发明提供一种新生儿疾病筛查用多联检测试剂盒及其制备方法和使用方法，使用一个试剂盒进行多项血清标志物的联合筛查，大大简化准备工作，减少人为操作的失误，提高了工作效率，且具有良好的准确度、精密度、稳定性。
本发明解决其技术问题采用以下技术方案：
一种新生儿疾病筛查用多联检测试剂盒，包括缓冲液、至少两个检测反应杯、吖啶酯标记物微球、校准品、质控品、激发液、浓缩洗液、溶血剂；
所述检测反应杯为内表面包被有目标抗体或抗原耦联物的反应杯；
所述目标抗体或抗原耦联物为抗TSH抗体蛋白、甲状腺素T4偶联牛血清白蛋白、17α-羟孕酮偶联牛血清白蛋白、抗GAA抗体蛋白。
作为一种优选方案，所述检测反应杯的制备方法为：
将纯品目标抗体或抗原耦联物用包被缓冲液稀释成浓度为1～10μg/mL的包被工作液；在空白反应杯中加入包被工作液100～200 μL/孔，2~8℃条件下孵育过夜；孵育好的反应杯用洗涤工作液清洗1~2次，将洗涤过的反应杯按200～280μL/孔加入封闭液，27~37℃条件下孵育过夜；吸干封闭液后27~37℃条件下晾干、密封，置于2～8℃条件下保存。
作为一种优选方案，所述吖啶酯标记物微球为抗TSH吖啶酯标记物微球、抗T4吖啶酯标记物微球、抗17α-羟孕酮吖啶酯标记物微球、抗GAA吖啶酯标记物微球中的至少两种；
所述抗TSH吖啶酯标记物微球、抗T4吖啶酯标记物微球、抗17α-羟孕酮吖啶酯标记物微球、抗GAA吖啶酯标记物微球的制备方法为：将另外一株抗TSH抗体蛋白、抗T4抗体蛋白、抗17α-羟孕酮抗体蛋白、另外一株抗GAA抗体蛋白分别与DMF复溶的吖啶酯，按分子个数1∶1～1∶5比例充分混匀，4～35℃恒温振荡10～60min得到反应液；反应液上Sephadex G－25柱，用纯化缓冲液洗脱，分离吖啶酯-抗体结合物与未结合吖啶酯，采用全自动部分收集器以0.8~1.5mL/管的速度进行液体收集；于荧光计数仪上进行荧光计数，收集第一峰中荧光计数大于10000000的洗脱液，得吖啶酯标记物工作液；采用棋盘滴定法确定吖啶酯标记物工作液浓度，然后用含色素的吖啶酯标记物稀释液稀释成相对应的浓度，再冻干成微球，分别得到抗TSH吖啶酯标记物微球、抗T4吖啶酯标记物微球、抗17α-羟孕酮吖啶酯标记物微球、抗GAA吖啶酯标记物微球。
作为一种优选方案，所述缓冲液包括第一缓冲液、第二缓冲液；
所述第一缓冲液的pH为6.8～7.4，包含5～10g/L的牛血清白蛋白、0.05～0.2M的Na2CO3-NaHCO3、0.405～0.425mol/L NaCl、0.05～0.2% Tween-20、纯化水；
所述第二缓冲液为纯化水；
所述激发液包括第一激发液、第二激发液，所述第一激发液包括0.05～0.4MHNO3、0.01～1.0M H2O2的水溶液；
所述第二激发液包括1.0～5.0%TritonX-100、0.05～0.5M NaOH的水溶液；
所述浓缩洗液的pH为5.5～6，包含有2.0～8.0ml/L的Tween-20、10.0～25g/L的NaCl、10.0～17.0g/L 的三羟甲基氨基甲烷、6.0～10.0mL的浓HCl、0.2～2g/L的 NaN3；
所述溶血剂包含：50mmol/L的Tris～HCl、20～200mmol/L的NaCl、0.2～2mmol/L的EDTA、0.5～5%的Triton X-100、0.5～5%的脱氧胆酸钠。
作为一种优选方案，还包括苯丙氨酸试剂酶冻干微球、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶试剂底物冻干微球、半乳糖试剂酶冻干微球、肌酸激酶试剂酶试剂底物冻干微球中的一种或多种、荧光反应终止液、至少两个空白检测反应杯。
作为一种优选方案，所述苯丙氨酸试剂酶冻干微球的制备方法为：在1L的50mmol/L的磷酸盐缓冲液中加入10～40mmol/L的NADP·Na2、6～25g/L的海藻糖、6～35g/L的甘露醇、80～280mmol/L的甘氨酸、100～500U/L的苯丙氨酸脱氢酶，冻干成微球，即得苯丙氨酸试剂酶冻干微球；
所述葡萄糖-6-磷酸脱氢酶试剂底物冻干微球的制备方法为：在1L的pH6.8～7.4的Tris-HCl缓冲液中分别加入8～20g/L的葡萄糖-6-磷酸、15～35g/L的NADP·Na2、6～25g/L的海藻糖、6～35g/L的甘露醇、30～60g/L的NaCl、15～25g/L的MgCl2、15～28/L的Gly-Gly，冻干成微球，即得葡萄糖-6-磷酸脱氢酶试剂底物冻干微球；
所述半乳糖试剂酶冻干微球的制备方法为：在1L的1.211～6.06g/L的TRIS、0.9～8.1g/L的（NH4）2SO4、1.8～4.1g/L的KCl、0.3～3.0g/L的 NaN3、0.2～2.0ml/L的HCl缓冲液中分别加入0.2～2.0mg/L的碱性磷酸酶、0.4～3.8g/L的NADP·Na2、100～500U/L的半乳糖脱氢酶、6～25g/L的海藻糖、6～35g/L的甘露醇、0.01～0.08g/L的MgCl2·6H2O、0.02～0.12g/L的BSA，冻干成微球，即得半乳糖试剂酶冻干微球；
所述肌酸激酶试剂酶试剂底物冻干微球的制备方法为：在1L的50～250mmol/L的咪唑缓冲液中分别加入2～8mmol/L的NADP、3～12KU/L的己糖激酶、2～20mmol/L的醋酸镁、1～10mmol/L的AMP、0.05～1g/L的腺苷-5'-二磷酸三锂盐、2mmol/L EDTA、5～30mmol/L的D-葡萄糖、0.1～1mmol/L的 N-乙酰半胱氨酸、0.1～1mmol/L的HEDP、1～10KU/L G6PDH、1～10mmol/L的 ADP、2～20mmol/L的磷酸肌酸、0.1～3g/L的NaN3、2～20g/L的丙酮、6～25g/L的海藻糖、6～35g/L的甘露醇制成，冻干成微球，即得肌酸激酶试剂酶试剂底物冻干微球。
作为一种优选方案，所述荧光反应终止液的pH为7.4～8.0，包含有：0.1～1.0g/L的CuSO4·5H2O、0.2～2.0mmol/L的酒石酸钾钠、1.0～10g/L的Na2CO3。
作为一种优选方案，所述校准品包括第一校准品或第二校准品；
所述第一校准品的制备方法为：用去激素阴性血清将一号纯品原料稀释成五个浓度点的校准品，按0.3~2.0mL/瓶进行分装；
所述第二校准品的制备方法为：用全血溶血后和二号纯品原料制备成五个浓度点的校准品，然后0.3~2.0mL/瓶进行分装冻干；
所述质控品包括第一质控品或第二质控品，所述第一质控品的制备方法为：用去激素阴性血清将一号纯品原料稀释成两个浓度点的质控品，按0.3~2.0mL/瓶进行分装；
所述第二质控品的制备方法为：用全血溶血后和二号纯品原料制备成两个浓度点的质控品，然后0.3~2.0ml/瓶进行分装冻干；
所述一号纯品原料为TSH、Phe、FT4、17a-羟孕酮、CK、GALT中的一种或多种；
所述二号纯品原料为G6PD、GAA中的一种或两种。
本发明还提供了一种新生儿疾病筛查用多联检测试剂盒的使用方法，包括以下步骤：
S1、试剂准备：将试剂所需数量的检测反应杯平衡至室温；将浓缩洗液和去离子水按1：20混合成洗涤工作液，将校准品、质控品用纯化水按标示体积复溶或平衡至室温；
S2、校准曲线卡信息录入：扫描校准曲线卡上二维码，由全自动设备自动录入该批次质控品校准品浓度、校准品浓度对应的荧光值信息；
S3、样品制备：使用分离管将末梢全血分离成血浆和血细胞，在血细胞中加入200ul溶血剂，快速振荡混匀0.5分钟成为血细胞裂解液待用；
S4、向检测反应杯中分别加入100～200μL第一缓冲液和25～100μL校准品或质控品或待测标本，再向检测反应杯中，分别加入100～200μL第二缓冲液和25～100μL校准品或质控品或待测样本，反应体系在37℃下，振荡孵育10～30分钟，所述检测物为TSH、FT4、17a-OHP、GAA中的至少两种；
S5、由相应自动化设备振荡孵育结束后，用洗涤工作液清洗反应杯组4~6次；设备分别加入向每孔反应杯中分别加入50～100μL激发A液和激发B液迅速于荧光读数仪内进行荧光计数；按测定参数进行拟合分析，得到定量结果。
作为一种优选方案，若检测物为Phe、G6PD、GALT 、CK中的一种或多种时，步骤还包括：由相应自动化设备振荡孵育结束后，向检测苯丙氨酸、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、半乳糖和半乳糖-1-磷酸、肌酸激酶的反应杯组分别加入100～200μL荧光分析终止液，振荡0~30秒，及时于荧光读数仪内进行荧光计数；按测定参数进行拟合分析，得到定量结果。
本发明的有益效果：（1）本发明实现了使用一个试剂盒进行多项（2～8项）血清标志物的联合筛查，大大简化准备工作，减少人为操作的失误，提高了工作效率；（2）本发明将运用以吖啶酯为标记物的化学发光标记免疫分析技术及荧光分析法，保证定量检测的优越性能；（3）本发明以收集新生儿末梢血制备的血浆或红细胞裂解液作为样本，可以有效解决滤纸干血斑样品检测导致的各种质量问题和提高各项检测指标的检测性能；（4）本发明30分钟内的实验时间可大大提高筛查的时效性，使新生儿得到早检查，早发现，早治疗，则可使患儿免受损害，避免出现智力低下甚至避免对生命的危害。（5）本发明可将促甲状腺素（TSH）、游离甲状腺素（FT4）、17a-羟孕酮（17a-OHP）、苯丙氨酸（Phe）、半乳糖（GALT）和半乳糖-1-磷酸、肌酸激酶（CK）配制成以血清为基质的混合型校准品或混合型质控；将葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PD）、酸性-α-葡萄糖苷酶（GAA）配制成以全血为基质的混合型校准品或混合型质控简化准备工作，减少人为操作的失误，提高了工作效率。（6）本发明可通过配套的过滤管对末梢全血进行血浆（清）和细胞裂解液的制备，快速高效。（7）本发明可有效节约试剂组分，减低试剂盒的制造成本。（8）本发明可做全定量检测，可用于治疗过程指标的定量观测；（9）本发明促甲状腺激素的最低检测限不高于2 uIU/mL；游离甲状腺素的最低检测限不高于5pmol/L；17-α羟孕酮的最低检测限不高于2 nmol/L；酸性-α-葡萄糖苷酶的最低检测限不高于2 pmol/L；苯丙氨酸的最低检测限不高于0.4 mg/dL；葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的最低检测限不高于0.5 U/gHb；半乳糖脱氢酶的最低检测限不高于0.5 mg/dL；肌酸激酶的最低检测限不高于2 U/gHb。
附图说明
图1为本发明与国内试剂盒对标本中促甲状腺激素检测线性相关性图；
图2为本发明与国内试剂盒对标本中苯丙氨酸检测线性相关性图；
图3为本发明测定试剂盒与国内试剂盒对标本总葡萄糖-6-磷酸脱氢酶检测线性相关性图。
图4为本发明测定试剂盒与国内试剂盒对标本中17-α羟孕酮检测线性相关性图。
图5为本发明测定试剂盒与国内试剂盒对标本中肌酸激酶检测线性相关性图。
图6为本发明测定试剂盒与国内试剂盒对标本中游离甲状腺素检测线性相关性图。
图7为本发明测定试剂盒与国内试剂盒对标本中酸性-α-葡萄糖苷酶检测线性相关性图。
图8为本发明测定试剂盒与国内试剂盒对标本中半乳糖脱氢酶检测线性相关性图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
一种新生儿疾病筛查用多联检测试剂盒，包括缓冲液、至少两个检测反应杯、吖啶酯标记物微球、校准品、质控品、激发液、浓缩洗液、溶血剂；
所述检测反应杯用于检测TSH（促甲状腺素）、FT4（游离甲状腺素）、17a-OHP(17α-羟孕酮)、GAA(酸性-α-葡萄糖苷酶)。
所述检测反应杯为内表面包被有目标抗体或抗原耦联物的反应杯；
所述目标抗体或抗原耦联物为抗TSH抗体蛋白、甲状腺素T4偶联牛血清白蛋白、17α-羟孕酮偶联牛血清白蛋白、抗GAA抗体蛋白。
所述检测反应杯的制备方法为：
将纯品目标抗体或抗原耦联物用包被缓冲液稀释成浓度为5μg/ml的包被工作液；在空白反应杯中加入包被工作液150μl/孔，5℃条件下孵育过夜；孵育好的反应杯用洗涤工作液清洗2次，将洗涤过的反应杯组按250μL/孔加入封闭液，28℃条件下孵育过夜；吸干封闭液后28℃条件下晾干、密封，置于5℃条件下保存。
所述吖啶酯标记物微球为抗TSH吖啶酯标记物微球、抗T4吖啶酯标记物微球、抗17α-羟孕酮吖啶酯标记物微球、抗GAA吖啶酯标记物微球中的至少两种；
所述抗TSH吖啶酯标记物微球、抗T4吖啶酯标记物微球、抗17α-羟孕酮吖啶酯标记物微球、抗GAA吖啶酯标记物微球的制备方法为：将另外一株抗TSH抗体蛋白、抗T4抗体蛋白、抗17α-羟孕酮抗体蛋白、另外一株抗GAA抗体蛋白分别与DMF复溶的吖啶酯，按分子个数1∶3比例充分混匀，20℃恒温振荡18h得到反应液；反应液上Sephadex G－25柱，用纯化缓冲液洗脱，分离吖啶酯-抗体结合物与未结合吖啶酯，采用全自动部分收集器以1mL/管的速度进行液体收集；于荧光计数仪上进行荧光计数，收集第一峰中荧光计数大于10000000的洗脱液，得吖啶酯标记物工作液；采用棋盘滴定法确定吖啶酯标记物工作液浓度，然后用含色素的吖啶酯标记物稀释液稀释成相对应的浓度，再冻干成微球，分别得到抗TSH吖啶酯标记物微球、抗T4吖啶酯标记物微球、抗17α-羟孕酮吖啶酯标记物微球、抗GAA吖啶酯标记物微球。
所述缓冲液包括第一缓冲液、第二缓冲液。
所述第一缓冲液的pH为7.2，包含8g/L的牛血清白蛋白、1.2M的Na2CO3-NaHCO3、0.415mol/L NaCl、0.15% Tween-20、纯化水；
所述第二缓冲液为纯化水。
所述激发液包括第一激发液、第二激发液，所述第一激发液包括0.25M HNO3、0.4MH2O2的水溶液；
所述第二激发液包括4.0%TritonX-100、2M NaOH的水溶液；
所述浓缩洗液的pH为5.8，包含有6ml/L的Tween-20、16g/L的NaCl、14.0g/L 的三羟甲基氨基甲烷、7.0mL的浓HCl、1.3g/L的 NaN3；
所述溶血剂包含：50mmol/L的Tris～HCl、100mmol/L的NaCl、1mmol/L的EDTA、3%的Triton X-100、3.5%的脱氧胆酸钠。
所述质控品包括第一校准品或第二校准品；
所述第一校准品的制备方法为：用去激素阴性血清将TSH、FT4、17α-羟孕酮纯品原料稀释成五个浓度点的质控品（表1），按1mL/瓶进行分装；
表1 第一校准品浓度点
Figure DEST_PATH_IMAGE001
所述第二校准品的制备方法为：用溶血后全血和二号纯品原料制备成五个浓度点（表2）的校准品，然后1.0mL/瓶进行分装冻干；
表2 第二校准品浓度点
Figure 443471DEST_PATH_IMAGE002
所述质控品包括第一质控品或第二质控品，所述第一质控品的制备方法为：用去激素阴性血清将TSH、FT4、17a-羟孕酮纯品原料稀释成两个浓度点的质控品（表3），按1ml/瓶进行分装；
表3 第一质控品浓度点
Figure DEST_PATH_IMAGE003
所述第二质控品的制备方法为：用溶血后全血和二号纯品原料制备成两个浓度点（表4）的质控品，然后1.0mL/瓶进行分装冻干；
表4 第二质控点浓度点
Figure 207028DEST_PATH_IMAGE004
所述的新生儿疾病筛查用多联检测试剂盒的使用方法，包括以下步骤：
S1、试剂准备：将试剂所需数量的反应杯组平衡至室温；将浓缩洗液和去离子水按1：20混合成洗涤工作液，将校准品、质控品用纯化水按标示体积复溶或平衡至室温；
S2、校准曲线卡信息录入：扫描校准曲线卡上二维码，由全自动设备自动录入该批次质控品校准品浓度、校准品浓度对应的荧光值信息；
S3、样品制备：使用分离管将末梢全血分离成血浆（待用）和血细胞（待进一步处理），在血细胞中加入200ul溶血剂，快速振荡混匀0.5分钟成为血细胞裂解液（待用），血浆用于TSH、FT4、17a-羟孕酮一种或多种检测项目的待检测样本；血细胞裂解液用于GAA检测项目的待检测样本。
S4、向检测TSH（促甲状腺素）、FT4（游离甲状腺素）、17a-OHP(17α-羟孕酮)、GAA(酸性-α-葡萄糖苷酶)的检测反应杯中分别加入150μl第一缓冲液和50μl校准品或质控品或待测标本，反应体系在37℃下，振荡孵育20分钟所述检测物为TSH、FT4、17a-OHP、GAA中的至少两种；
S5、由相应自动化设备振荡孵育结束后，用洗涤工作液清洗检测微孔5次；设备分别加入向每孔中分别加入80μL激发A液和激发B液迅速于荧光读数仪内进行荧光计数；按测定参数进行拟合分析，得到定量结果。
本实施例可以根据需求进行促甲状腺素、游离甲状腺素、17a-羟孕酮、酸性-α-葡萄糖苷酶中的两种以上，最多四种。
实施例2
一种新生儿疾病筛查用多联检测试剂盒，包括缓冲液、至少两个检测反应杯或空白反应杯、吖啶酯标记物微球、校准品、质控品、激发液、浓缩洗液、溶血剂、苯丙氨酸试剂酶冻干微球、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶试剂底物冻干微球、半乳糖试剂酶冻干微球、肌酸激酶试剂底物冻干微球中的一种或多种、荧光反应终止液。
所述检测反应杯用于检测TSH（促甲状腺素）、FT4（游离甲状腺素）、17a-OHP(17α-羟孕酮)、GAA(酸性-α-葡萄糖苷酶)，所述空白反应杯用于检测Phe(苯丙氨酸）、G6PD(葡萄糖-6-磷酸脱氢酶)、GALT(半乳糖和半乳糖-1-磷酸)、CK（肌酸激酶）。
所述检测反应杯为内表面包被有目标抗体或抗原耦联物的反应杯；
所述目标抗体或抗原耦联物为抗TSH抗体蛋白、甲状腺素T4偶联牛血清白蛋白、17α-羟孕酮偶联牛血清白蛋白、抗GAA抗体蛋白。
所述检测反应杯的制备方法为：
将纯品目标抗体或抗原耦联物用包被缓冲液稀释成浓度为5μg/ml的包被工作液；在空白反应杯中加入包被工作液150μL/孔，5℃条件下孵育过夜；孵育好的反应杯用洗涤工作液清洗2次，将洗涤过的反应杯组按250μl/孔加入封闭液，28℃条件下孵育过夜；吸干封闭液后28℃条件下晾干、密封，置于5℃条件下保存。
所述吖啶酯标记物微球为抗TSH吖啶酯标记物微球、抗T4吖啶酯标记物微球、抗17α-羟孕酮吖啶酯标记物微球、抗GAA吖啶酯标记物微球中的至少两种；
所述抗TSH吖啶酯标记物微球、抗T4吖啶酯标记物微球、抗17α-羟孕酮吖啶酯标记物微球、抗GAA吖啶酯标记物微球的制备方法为：将另外一株抗TSH抗体蛋白、抗T4、抗17α-羟孕酮、抗GAA分别与DMF复溶的吖啶酯，按分子个数1∶3比例充分混匀，20℃恒温振荡18h得到反应液；反应液上Sephadex G－25柱，用纯化缓冲液洗脱，分离吖啶酯-抗体结合物与未结合吖啶酯，采用全自动部分收集器以1mL/管的速度进行液体收集；于荧光计数仪上进行荧光计数，收集第一峰中荧光计数大于10000000的洗脱液，得吖啶酯标记物工作液；采用棋盘滴定法确定吖啶酯标记物工作液浓度，然后用含色素的吖啶酯标记物稀释液稀释成相对应的浓度，再冻干成微球，分别得到抗TSH吖啶酯标记物微球、抗T4吖啶酯标记物微球、抗17α-羟孕酮吖啶酯标记物微球、抗GAA吖啶酯标记物微球。
所述缓冲液包括第一缓冲液、第二缓冲液。
所述第一缓冲液的pH为7.2，包含8g/L的牛血清白蛋白、1.2M的Na2CO3-NaHCO3、0.415mol/L NaCl、0.15% Tween-20、纯化水；
所述第二缓冲液为纯化水。
所述激发液包括第一激发液、第二激发液，所述第一激发液包括0.25M HNO3、0.4MH2O2的水溶液；
所述第二激发液包括4.0%TritonX-100、2M NaOH的水溶液；
所述浓缩洗液的pH为5.8，包含有6ml/L的Tween-20、16g/L的NaCl、14.0g/L 的三羟甲基氨基甲烷、7.0mL的浓HCl、1.3g/L的 NaN3；
所述溶血剂包含：50mmol/L的Tris～HCl、100mmol/L的NaCl、1mmol/L的EDTA、3%的Triton X-100、3.5%的脱氧胆酸钠。
所述苯丙氨酸试剂酶冻干微球的制备方法为：在1L的50mmol/L的磷酸盐缓冲液中加入30mmol/L的NADP·Na2、15g/L的海藻糖、20g/L的甘露醇、150mmol/L的甘氨酸、400U/L的苯丙氨酸脱氢酶，冻干成微球，即得苯丙氨酸试剂酶冻干微球；
所述葡萄糖-6-磷酸脱氢酶试剂底物冻干微球的制备方法为：在1L的pH7.2的Tris-HCl缓冲液中分别加入16g/L的葡萄糖-6-磷酸、25g/L的NADP·Na2、16g/L的海藻糖、20g/L的甘露醇、50g/L的NaCl、20g/L的MgCl2、24g/L的Gly-Gly，冻干成微球，即得葡萄糖-6-磷酸脱氢酶试剂底物冻干微球；
所述半乳糖试剂酶冻干微球的制备方法为：在1L的4g/L的TRIS、5g/L的（NH4）2SO4、3g/L的KCl、2g/L的 NaN3、1ml/L的HCl缓冲液中分别加入1mg/L的碱性磷酸酶、2g/L的NADP·Na2、300U/L的半乳糖脱氢酶、15g/L的海藻糖、20g/L的甘露醇、0.05g/L的MgCl2·6H2O、0.08g/L的BSA，冻干成微球，即得半乳糖试剂酶冻干微球；
所述肌酸激酶试剂底物冻干微球的制备方法为：在1L的150mmol/L的咪唑缓冲液中分别加入5mmol/L的NADP、8KU/L的己糖激酶、10mmol/L的醋酸镁、5mmol/L的AMP、0.4g/L的腺苷-5'-二磷酸三锂盐、2mmol/L EDTA、20mmol/L的D-葡萄糖、0.5mmol/L的 N-乙酰半胱氨酸、0.6mmol/L的HEDP、8KU/L G6PDH、8mmol/L的 ADP、15mmol/L的磷酸肌酸、2g/L的NaN3、10g/L的丙酮、15g/L的海藻糖、20g/L的甘露醇制成，冻干成微球，即得肌酸激酶试剂底物冻干微球。
所述荧光反应终止液的pH为7.8，包含有：0.5g/L的CuSO4·5H2O、1mmol/L的酒石酸钾钠、6g/L的Na2CO3。
所述质控品包括第一校准品或第二校准品；
所述第一校准品的制备方法为：用去激素阴性血清将TSH、Phe、
FT4、17a-羟孕酮、CK、GALT纯品原料稀释成五个浓度点的质控品（表5），按1mL/瓶进行分装；
表5 第一校准品浓度点
Figure DEST_PATH_IMAGE005
所述第二校准品的制备方法为：用溶血后全血和二号纯品原料制备成五个浓度点（表6）的校准品，然后1.0mL/瓶进行分装冻干；
表6 第二校准品浓度点
Figure 181937DEST_PATH_IMAGE006
所述质控品包括第一质控品或第二质控品，所述第一质控品的制备方法为：用去激素阴性血清将TSH、Phe、FT4、17a-羟孕酮、CK、GALT纯品原料稀释成两个浓度点的质控品（表7），按1ml/瓶进行分装；
表7 第一质控品浓度点
Figure DEST_PATH_IMAGE007
所述第二质控品的制备方法为：用溶血后全血和二号纯品原料制备成两个浓度点（表8）的质控品，然后1.0mL/瓶进行分装冻干；
表8 第二质控点浓度点
Figure 273521DEST_PATH_IMAGE008
所述的新生儿疾病筛查用多联检测试剂盒的使用方法，包括以下步骤：
S1、试剂准备：将试剂所需数量的反应杯组平衡至室温；将浓缩洗液和去离子水按1：20混合成洗涤工作液，将校准品、质控品用纯化水按标示体积复溶或平衡至室温；
S2、校准曲线卡信息录入：扫描校准曲线卡上二维码，由全自动设备自动录入该批次质控品校准品浓度、校准品浓度对应的荧光值信息；
S3、样品制备：使用分离管将末梢全血分离成血浆（待用）和血细胞（待进一步处理），在血细胞中加入200uL溶血剂，快速振荡混匀0.5分钟成为血细胞裂解液（待用），血浆用于TSH、Phe、FT4、17a-羟孕酮、CK、GALT中的一种或多种检测项目的待检测样本；血细胞裂解液用于G6PD、GAA中的一种或两种检测项目的待检测样本。
S4、向检测TSH（促甲状腺素）、FT4（游离甲状腺素）、17a-OHP(17α-羟孕酮)、GAA(酸性-α-葡萄糖苷酶)的检测反应杯中分别加入150μL第一缓冲液和50μL校准品或质控品或待测标本，再向检测Phe(苯丙氨酸）、G6PD(葡萄糖-6-磷酸脱氢酶)、GALT(半乳糖和半乳糖-1-磷酸)、CK（肌酸激酶）的空白反应杯中，分别加入150μl第二缓冲液和50μL校准品或质控品或待测样本，反应体系在37℃下，振荡孵育20分钟，所述检测物为TSH、FT4、17α-OHP、GAA中的至少两种。
S5、由相应自动化设备振荡孵育结束后，用洗涤工作液清洗反应杯组4~6次；设备分别加入向每孔反应杯中分别加入80μL激发A液和激发B液迅速于荧光读数仪内进行荧光计数；按测定参数进行拟合分析，得到定量结果。
S6、由相应自动化设备振荡孵育结束后，向检测Phe(苯丙氨酸）、G6PD(葡萄糖-6-磷酸脱氢酶)、GALT(半乳糖和半乳糖-1-磷酸)、CK（肌酸激酶）的反应杯中，分别加入150μL荧光分析终止液，振荡20秒，及时于于荧光读数仪内进行荧光计数；按测定参数进行拟合分析，得到定量结果。
本实施例可以根据需要检测促甲状腺素、游离甲状腺素、17a-羟孕酮、酸性-α-葡萄糖苷酶、苯丙氨酸、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、半乳糖和半乳糖-1-磷酸、肌酸激酶中的两种或以上，最多八种。
实施例3
一种新生儿疾病筛查用多联检测试剂盒，包括缓冲液、四个检测反应杯、四个空白反应杯、吖啶酯标记物微球、校准品、质控品、激发液、浓缩洗液、溶血剂、苯丙氨酸试剂酶冻干微球、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶冻干微球、半乳糖试剂酶冻干微球、肌酸激酶冻干微球、荧光反应终止液。
所述检测反应杯用于检测TSH（促甲状腺素）、FT4（游离甲状腺素）、17a-OHP(17α-羟孕酮)、GAA(酸性-α-葡萄糖苷酶)，所述空白反应杯用于检测Phe(苯丙氨酸）、G6PD(葡萄糖-6-磷酸脱氢酶)、GALT(半乳糖和半乳糖-1-磷酸)、CK（肌酸激酶）。
所述检测反应杯为内表面包被有目标抗体或抗原耦联物的反应杯；
所述目标抗体或抗原耦联物为抗TSH抗体蛋白、甲状腺素T4偶联牛血清白蛋白、17α-羟孕酮偶联牛血清白蛋白、抗GAA抗体蛋白。
所述检测反应杯的制备方法为：
将纯品目标抗体或抗原耦联物用包被缓冲液稀释成浓度为5μg/ml的包被工作液；在空白反应杯中加入包被工作液150μL/孔，5℃条件下孵育过夜；孵育好的反应杯用洗涤工作液清洗2次，将洗涤过的反应杯组按250μL/孔加入封闭液，28℃条件下孵育过夜；吸干封闭液后28℃条件下晾干、密封，置于5℃条件下保存。
所述吖啶酯标记物微球为抗TSH吖啶酯标记物微球、抗T4吖啶酯标记物微球、抗17α-羟孕酮吖啶酯标记物微球、抗GAA吖啶酯标记物微球；
所述抗TSH吖啶酯标记物微球、抗T4吖啶酯标记物微球、抗17α-羟孕酮吖啶酯标记物微球、抗GAA吖啶酯标记物微球的制备方法为：将另外一株抗TSH抗体蛋白、抗T4抗体蛋白、抗17α-羟孕酮抗体蛋白、另外一株抗GAA抗体蛋白分别与DMF复溶的吖啶酯，按分子个数1∶3比例充分混匀，20℃恒温振荡18h得到反应液；反应液上Sephadex G－25柱，用纯化缓冲液洗脱，分离吖啶酯-抗体结合物与未结合吖啶酯，采用全自动部分收集器以1mL/管的速度进行液体收集；于荧光计数仪上进行荧光计数，收集第一峰中荧光计数大于10000000的洗脱液，得吖啶酯标记物工作液；采用棋盘滴定法确定吖啶酯标记物工作液浓度，然后用含色素的吖啶酯标记物稀释液稀释成相对应的浓度，再冻干成微球，分别得到抗TSH吖啶酯标记物微球、抗T4吖啶酯标记物微球、抗17α-羟孕酮吖啶酯标记物微球、抗GAA吖啶酯标记物微球。
所述缓冲液包括第一缓冲液、第二缓冲液。
所述第一缓冲液的pH为7.2，包含8g/L的牛血清白蛋白、1.2M的Na2CO3-NaHCO3、0.415mol/L NaCl、0.15% Tween-20、纯化水；
所述第二缓冲液为纯化水。
所述激发液包括第一激发液、第二激发液，所述第一激发液包括0.25M HNO3、0.4MH2O2的水溶液；
所述第二激发液包括4.0%TritonX-100、2M NaOH的水溶液；
所述浓缩洗液的pH为5.8，包含有6ml/L的Tween-20、16g/L的NaCl、14.0g/L 的三羟甲基氨基甲烷、7.0mL的浓HCl、1.3g/L的 NaN3；
所述溶血剂包含：50mmol/L的Tris～HCl、100mmol/L的NaCl、1mmol/L的EDTA、3%的Triton X-100、3.5%的脱氧胆酸钠。
所述苯丙氨酸试剂酶冻干微球的制备方法为：在1L的50mmol/L的磷酸盐缓冲液中加入30mmol/L的NADP·Na2、15g/L的海藻糖、20g/L的甘露醇、150mmol/L的甘氨酸、400U/L的苯丙氨酸脱氢酶，冻干成微球，即得苯丙氨酸试剂酶冻干微球；
所述葡萄糖-6-磷酸脱氢酶试剂底物冻干微球的制备方法为：在1L的pH7.2的Tris-HCl缓冲液中分别加入16g/L的葡萄糖-6-磷酸、25g/L的NADP·Na2、16g/L的海藻糖、20g/L的甘露醇、50g/L的NaCl、20g/L的MgCl2、24g/L的Gly-Gly，冻干成微球，即得葡萄糖-6-磷酸脱氢酶试剂底物冻干微球；
所述半乳糖试剂酶冻干微球的制备方法为：在1L的4g/L的TRIS、5g/L的（NH4）2SO4、3g/L的KCl、2g/L的 NaN3、1ml/L的HCl缓冲液中分别加入1mg/L的碱性磷酸酶、2g/L的NADP·Na2、300U/L的半乳糖脱氢酶、15g/L的海藻糖、20g/L的甘露醇、0.05g/L的MgCl2·6H2O、0.08g/L的BSA，冻干成微球，即得半乳糖试剂酶冻干微球；
所述肌酸激酶试剂底物冻干微球的制备方法为：在1L的150mmol/L的咪唑缓冲液中分别加入5mmol/L的NADP、8KU/L的己糖激酶、10mmol/L的醋酸镁、5mmol/L的AMP、0.4g/L的腺苷-5'-二磷酸三锂盐、2mmol/L EDTA、20mmol/L的D-葡萄糖、0.5mmol/L的 N-乙酰半胱氨酸、0.6mmol/L的HEDP、8KU/L G6PDH、8mmol/L的 ADP、15mmol/L的磷酸肌酸、2g/L的NaN3、10g/L的丙酮、15g/L的海藻糖、20g/L的甘露醇制成，冻干成微球，即得肌酸激酶试剂底物冻干微球。
所述荧光反应终止液的pH为7.8，包含有：0.5g/L的CuSO4·5H2O、1mmol/L的酒石酸钾钠、6g/L的Na2CO3。
所述质控品包括第一校准品、第二校准品；
所述第一校准品的制备方法为：用去激素阴性血清将TSH、Phe、
FT4、17a-羟孕酮、CK、GALT纯品原料稀释成五个浓度点的质控品（表9），按1mL/瓶进行分装；
表9第一校准品浓度点
Figure DEST_PATH_IMAGE009
所述第二质控品的制备方法为：用溶血后的全血将G6PD、GAA纯品原料制备成两个浓度点（表10）的质控品，然后1.0mL/瓶进行分装冻干；
表10 第二校准品浓度点
Figure 687185DEST_PATH_IMAGE010
所述质控品包括第一质控品、第二质控品，所述第一质控品的制备方法为：用去激素阴性血清将TSH、Phe、FT4、17a-羟孕酮、CK、GALT纯品原料稀释成两个浓度点的质控品（表11），按1mL/瓶进行分装。
表11 第一质控品浓度点
Figure DEST_PATH_IMAGE011
所述第二质控品的制备方法为：用溶血后的全血将G6PD、GAA纯品原料制备成两个浓度点（表12）的质控品，然后1.0mL/瓶进行分装冻干。
表12 第二质控点浓度点
Figure 242931DEST_PATH_IMAGE012
所述的新生儿疾病筛查用多联检测试剂盒的使用方法，包括以下步骤：
S1、试剂准备：将试剂所需数量的反应杯组平衡至室温；将浓缩洗液和去离子水按1：20混合成洗涤工作液，将校准品、质控品用纯化水按标示体积复溶或平衡至室温；
S2、校准曲线卡信息录入：扫描校准曲线卡上二维码，由全自动设备自动录入该批次质控品校准品浓度、校准品浓度对应的荧光值信息；
S3、样品制备：使用分离管将末梢全血分离成血浆（待用）和血细胞（待进一步处理），在血细胞中加入200uL溶血剂，快速振荡混匀0.5分钟成为血细胞裂解液（待用），血浆用于TSH、Phe、FT4、17a-羟孕酮、CK、GALT检测项目的待检测样本；血细胞裂解液用于G6PD、GAA中的检测项目的待检测样本；
S4、分别向检测TSH（促甲状腺素）、FT4（游离甲状腺素）、17a-OHP(17α-羟孕酮)、GAA(酸性-α-葡萄糖苷酶)的检测反应杯中分别加入150μL第一缓冲液和50μL校准品或质控品或待测标本，再分别向检测Phe(苯丙氨酸）、G6PD(葡萄糖-6-磷酸脱氢酶)、GALT(半乳糖和半乳糖-1-磷酸)、CK（肌酸激酶）的空白反应杯中，分别加入150μL第二缓冲液和50μL校准品或质控品或待测样本，反应体系在37℃下，振荡孵育20分钟，所述检测物为TSH、FT4、17α-OHP、GAA。
S5、由相应自动化设备振荡孵育结束后，用洗涤工作液清洗反应杯组4~6次；设备分别加入向每孔反应杯中分别加入80μL激发A液和激发B液迅速于荧光读数仪内进行荧光计数；按测定参数进行拟合分析，得到定量结果。
S6、由相应自动化设备振荡孵育结束后，向检测Phe(苯丙氨酸）、G6PD(葡萄糖-6-磷酸脱氢酶)、GALT(半乳糖和半乳糖-1-磷酸)、CK（肌酸激酶）的反应杯中，分别加入150μl荧光分析终止液，振荡20秒，及时于于荧光读数仪内进行荧光计数；按测定参数进行拟合分析，得到定量结果。
本实施例可以根据需要检测促甲状腺素、游离甲状腺素、17a-羟孕酮、酸性-α-葡萄糖苷酶、苯丙氨酸、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、半乳糖和半乳糖-1-磷酸、肌酸激酶八种。
以市场上常见的广州市丰华生物工程有限公司生产的促甲状腺激素测定试剂盒（时间分辨荧光免疫分析法，96人份/盒为例，该型号的示踪物使用稀释比例为1:50，理论使用量为0.2mL（为便于计算，按100孔实验量计算），其半自动试剂盒装量为0.5mL（0.3mL试剂浪费），而其全自动试剂盒装量为1.0mL（0.8mL试剂浪费，浪费程度更显著），其他项目的浪费情况基本一致；
现在市场上试剂盒种类的区别除了各组分上的标签外，大部分的厂家选择关联项目选用不同外形的反应板，或在反应板侧面印上项目名称，或在反应板上划上不同的颜色。却难见到示踪物工作液配制后，关联项目之间呈现明显的色差，也常听闻误将A的示踪物加入到B缓冲液中而导致实验失败的消息；
目前市场上时间分辨荧光免疫分析法的试剂盒基本按分析物进行包装，每盒产品内配约6个校准品点，1瓶示踪物及缓冲液，以甲功类检测项目为例，医院开展的检测项目为3~8项（大部分为五项）；这样检测一例标本就需复溶21~56瓶，不仅操作繁琐、浪费时间，还容易引起交叉污染，因此大部分医院为提高工作效率，采取标本集中后再进行检测的措施，然而该措施实施影响了标本的检测时效，同时难免出现急诊病人要求尽快出结果的情况。多年前，已见多厂家能提供甲功类多分析物质控品，因此配制一种含五种上述分析物的校准品已不存在技术难点。目前，自动化设备在分配校准品时，基本为一吸一分，而检测标本为一吸多分，不仅造成分液速度偏低，还容易因分液方式不一致产生差异。该技术的突破可以让校准品同标本一样实现一吸多分，提高分液速度，提高准确率。同时，因示踪物本就密封于微孔板内，在产品组装时，可提前进行拆板、拼板。组成不同人份、多分析物的联合试剂盒。
采用本发明检测的样本与现有血清样本为对象的检测结果具有高度的一致性。
产品性能指标（以实施例3所述的试剂盒作为检测）
1）最低检测限：本发明促甲状腺激素的最低检测限不高于2 uIU/mL；游离甲状腺素的最低检测限不高于5pmol/L；17-α羟孕酮的最低检测限不高于2 nmol/L；酸性-α-葡萄糖苷酶的最低检测限不高于2 pmol/L；苯丙氨酸的最低检测限不高于0.4 mg/dL；葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的最低检测限不高于0.5 U/gHb；半乳糖脱氢酶的最低检测限不高于0.5 mg/dL；肌酸激酶的最低检测限不高于2 U/L；
2）线性：在线性区间内，五项指标的相关系数（r）均不低于0.9900；
3）准确度：在试剂盒规定的线性区间范围内检测国家标准品配制的企业校准品，其测量结果的相对偏差在±10%范围内；
4）批内精密度：平行测定试剂盒范围内的高、低质控品，测定结果的变异系数（CV）不高于10%；
5）批间精密度：在3个不同批次产品之间，平行测定试剂盒范围内的高、低质控品，测定结果的变异系数（CV）不高于15%；
6）特异性：促甲状腺激素与250U/L黄体生成素、250U/L促卵泡激素、10000U/L绒毛膜促性腺激素的样本表观浓度不高于0.25μU/mL；游离甲状腺素与游离三碘甲状腺原氨酸的交叉反应率不高于5%；17α羟孕酮与11000nmol/L雌二醇、3350nmol/L睾酮、6880 nmol/L孕酮、800nmol/L雌三醇交叉反应率不高于3%；
7）稳定性：试剂盒在37℃条件下放置6天，上述性能指标依然符合要求；
8）本发明试剂盒（实施例3）与国内试剂盒样本检测线性相关性图。
以上述依据本发明的理想实施例为启示，通过上述的说明内容，相关工作人员完全可以在不偏离本发明技术思想的范围内，进行多样的变更以及修改。本发明的技术性范围并不局限于说明书上的内容，必须要根据权利要求范围来确定其技术性范围。

Claims (10)

1.一种新生儿疾病筛查用多联检测试剂盒，其特征在于，包括缓冲液、至少两个检测反应杯、吖啶酯标记物微球、校准品、质控品、激发液、浓缩洗液、溶血剂；
所述检测反应杯为内表面包被有目标抗体或抗原耦联物的反应杯；
所述目标抗体或抗原耦联物为抗TSH抗体蛋白、甲状腺素T4偶联牛血清白蛋白、17α-羟孕酮偶联牛血清白蛋白、抗GAA抗体蛋白。
2.根据权利要求1所述的新生儿疾病筛查用多联检测试剂盒，其特征在于，所述检测反应杯的制备方法为：
将纯品目标抗体或抗原耦联物用包被缓冲液稀释成浓度为1～10μg/mL的包被工作液；在空白反应杯中加入包被工作液100～200 μL/孔，2~8℃条件下孵育过夜；孵育好的反应杯用洗涤工作液清洗1~2次，将洗涤过的反应杯按200～280μL/孔加入封闭液，27~37℃条件下孵育过夜；吸干封闭液后4~27℃条件下晾干、密封，置于2～8℃条件下保存。
3.根据权利要求1所述的新生儿疾病筛查用多联检测试剂盒，其特征在于，所述吖啶酯标记物微球为抗TSH吖啶酯标记物微球、抗T4吖啶酯标记物微球、抗17α-羟孕酮吖啶酯标记物微球、抗GAA吖啶酯标记物微球中的至少两种；
所述抗TSH吖啶酯标记物微球、抗T4吖啶酯标记物微球、抗17α-羟孕酮吖啶酯标记物微球、抗GAA吖啶酯标记物微球的制备方法为：将另外一株抗TSH抗体蛋白、抗T4抗体蛋白、抗17α-羟孕酮抗体蛋白、另外一株抗GAA抗体蛋白分别与DMF复溶的吖啶酯，按分子个数1∶1～1∶5比例充分混匀，4～35℃恒温振荡10～60min得到反应液；反应液上Sephadex G－25柱，用纯化缓冲液洗脱，分离吖啶酯-抗体结合物与未结合吖啶酯，采用全自动部分收集器以0.8~1.5mL/管的速度进行液体收集；于荧光计数仪上进行荧光计数，收集第一峰中荧光计数大于10000000的洗脱液，得吖啶酯标记物工作液；采用棋盘滴定法确定吖啶酯标记物工作液浓度，然后用含色素的吖啶酯标记物稀释液稀释成相对应的浓度，再冻干成微球，分别得到抗TSH吖啶酯标记物微球、抗T4吖啶酯标记物微球、抗17α-羟孕酮吖啶酯标记物微球、抗GAA吖啶酯标记物微球。
4.根据权利要求1所述的新生儿疾病筛查用多联检测试剂盒，其特征在于，所述缓冲液包括第一缓冲液、第二缓冲液；
所述第一缓冲液的pH为6.8～7.4，包含5～10g/L的牛血清白蛋白、0.05～0.2M的Na2CO3-NaHCO3、0.405～0.425mol/L NaCl、0.05～0.2% Tween-20、纯化水；
所述第二缓冲液为纯化水；
所述激发液包括第一激发液、第二激发液，所述第一激发液包括0.05～0.4M HNO3、0.01～1.0M H2O2的水溶液；
所述第二激发液包括1.0～5.0%TritonX-100、0.05～0.5M NaOH的水溶液；
所述浓缩洗液的pH为5.5～6，包含有2.0～8.0ml/L的Tween-20、10.0～25g/L的NaCl、10.0～17.0g/L 的三羟甲基氨基甲烷、6.0～10.0mL的浓HCl、0.2～2g/L的 NaN3；
所述溶血剂包含：50mmol/L的Tris～HCl、20～200mmol/L的NaCl、0.2～2mmol/L的EDTA、0.5～5%的Triton X-100、0.5～5%的脱氧胆酸钠。
5.根据权利要求1所述的新生儿疾病筛查用多联检测试剂盒，其特征在于，还包括苯丙氨酸试剂酶冻干微球、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶试剂底物冻干微球、半乳糖试剂酶冻干微球、肌酸激酶试剂酶试剂底物冻干微球中的一种或多种、荧光反应终止液、至少两个空白检测反应杯。
6.根据权利要求5所述的新生儿疾病筛查用多联检测试剂盒，其特征在于，所述苯丙氨酸试剂酶冻干微球的制备方法为：在1L的50mmol/L的磷酸盐缓冲液中加入10～40mmol/L的NADP·Na2、6～25g/L的海藻糖、6～35g/L的甘露醇、80～280mmol/L的甘氨酸、100～500U/L的苯丙氨酸脱氢酶，冻干成微球，即得苯丙氨酸试剂酶冻干微球；
所述葡萄糖-6-磷酸脱氢酶试剂底物冻干微球的制备方法为：在1L的pH6.8～7.4的Tris-HCl缓冲液中分别加入8～20g/L的葡萄糖-6-磷酸、15～35g/L的NADP·Na2、6～25g/L的海藻糖、6～35g/L的甘露醇、30～60g/L的NaCl、15～25g/L的MgCl2、15～28/L的Gly-Gly，冻干成微球，即得葡萄糖-6-磷酸脱氢酶试剂底物冻干微球；
所述半乳糖试剂酶冻干微球的制备方法为：在1L的1.211～6.06g/L的TRIS、0.9～8.1g/L的（NH4）2SO4、1.8～4.1g/L的KCl、0.3～3.0g/L的 NaN3、0.2～2.0ml/L的HCl缓冲液中分别加入0.2～2.0mg/L的碱性磷酸酶、0.4～3.8g/L的NADP·Na2、100～500U/L的半乳糖脱氢酶、6～25g/L的海藻糖、6～35g/L的甘露醇、0.01～0.08g/L的MgCl2·6H2O、0.02～0.12g/L的BSA，冻干成微球，即得半乳糖试剂酶冻干微球；
所述肌酸激酶试剂酶试剂底物冻干微球的制备方法为：在1L的50～250mmol/L的咪唑缓冲液中分别加入2～8mmol/L的NADP、3～12KU/L的己糖激酶、2～20mmol/L的醋酸镁、1～10mmol/L的AMP、0.05～1g/L的腺苷-5'-二磷酸三锂盐、2mmol/L EDTA、5～30mmol/L的D-葡萄糖、0.1～1mmol/L的 N-乙酰半胱氨酸、0.1～1mmol/L的HEDP、1～10KU/L G6PDH、1～10mmol/L的 ADP、2～20mmol/L的磷酸肌酸、0.1～3g/L的NaN3、2～20g/L的丙酮、6～25g/L的海藻糖、6～35g/L的甘露醇制成，冻干成微球，即得肌酸激酶试剂酶试剂底物冻干微球。
7.根据权利要求5所述的新生儿疾病筛查用多联检测试剂盒，其特征在于，所述荧光反应终止液的pH为7.4～8.0，包含有：0.1～1.0g/L的CuSO4·5H2O、0.2～2.0mmol/L的酒石酸钾钠、1.0～10g/L的Na2CO3。
8.根据权利要求1或5任一所述的新生儿疾病筛查用多联检测试剂盒，其特征在于，所述校准品包括第一校准品或第二校准品；
所述第一校准品的制备方法为：用去激素阴性血清将一号纯品原料稀释成五个浓度点的校准品，按0.3~2.0mL/瓶进行分装；
所述第二校准品的制备方法为：用全血溶血后和二号纯品原料制备成五个浓度点的校准品，然后0.3~2.0mL/瓶进行分装冻干；
所述质控品包括第一质控品或第二质控品，所述第一质控品的制备方法为：用去激素阴性血清将一号纯品原料稀释成两个浓度点的质控品，按0.3~2.0mL/瓶进行分装；
所述第二质控品的制备方法为：用全血溶血后和二号纯品原料制备成两个浓度点的质控品，然后0.3~2.0mL/瓶进行分装冻干；
所述一号纯品原料为TSH、Phe、FT4、17a-羟孕酮、CK、GALT中的一种或多种；
所述二号纯品原料为G6PD、GAA中的一种或两种。
9.根据权利要求1~8任一所述的新生儿疾病筛查用多联检测试剂盒的使用方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、试剂准备：将试剂所需数量的检测反应杯平衡至室温；将浓缩洗液和去离子水按1：20混合成洗涤工作液，将校准品、质控品用纯化水按标示体积复溶或平衡至室温；
S2、校准曲线卡信息录入：扫描校准曲线卡上二维码，由全自动设备自动录入该批次质控品校准品浓度、校准品浓度对应的荧光值信息；
S3、样品制备：使用分离管将末梢全血分离成血浆和血细胞，在血细胞中加入200uL溶血剂，快速振荡混匀0.5分钟成为血细胞裂解液待用；
S4、向检测反应杯中分别加入100～200μL第一缓冲液和25～100μl校准品或质控品或待测标本，再向检测微孔中，分别加入100～200μL第二缓冲液和25～100μL校准品或质控品或待测样本，反应体系在37℃下，振荡孵育10～30分钟，所述检测物为TSH、FT4、17a-OHP、GAA中的至少两种；
S5、由相应自动化设备振荡孵育结束后，用洗涤工作液清洗反应杯组4~6次；设备分别加入向每孔反应杯中分别加入50～100μL激发A液和激发B液迅速于荧光读数仪内进行荧光计数；按测定参数进行拟合分析，得到定量结果。
10.根据权利要求9所述的新生儿疾病筛查用多联检测试剂盒的使用方法，其特征在于，若检测物为Phe、G6PD、GALT 、CK中的一种或多种时，步骤还包括：由相应自动化设备振荡孵育结束后，向检测苯丙氨酸、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、半乳糖和半乳糖-1-磷酸、肌酸激酶的反应杯组分别加入100～200μL荧光分析终止液，振荡0~30秒，及时于荧光读数仪内进行荧光计数；按测定参数进行拟合分析，得到定量结果。
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