CN111289758B - 用于h-fabp定量检测的试剂盒、h-fabp定量检测的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于H‑FABP定量检测的试剂盒及一种H‑FABP定量检测的方法。本发明的用于H‑FABP定量检测的试剂盒包括试剂条,在试剂条上包含有若干容纳槽体,本发明的试剂盒还包括分别预存于不同的容纳槽体中的磁微粒试剂、标记试剂、清洗液和碱性磷酸酶的发光底物,磁微粒试剂由抗H‑FABP一抗包被的磁珠制备得到,标记试剂由经过活化处理的抗H‑FABP二抗和经过活化处理的碱性磷酸酶制备得到。利用本发明的试剂盒进行检测时,操作简单,出结果快,且检测结果准确,检测精密度高。
Description
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域,具体涉及一种用于H-FABP定量检测的试剂盒和H-FABP定量检测的方法。
背景技术
近年来,急性冠状动脉综合症的发病率越来越高,其病情发展迅速,如不能及时做出治疗将会对患者带来生命危险。在我国,急性冠状动脉综合症的发病率约50/10万,据统计,每年我国死于急性心肌梗死的人数超过100万。
对急性冠状动脉综合症的确诊时间长短直接关系到治疗效果。目前,用于急性冠状动脉综合症的生化指标主要有肌红蛋白、肌钙蛋白和肌酸激酶同工酶。但是,肌红蛋白的半衰期很短,易于得到假阳性的检测结果。而肌钙蛋白和肌酸激酶同工酶的检测时间均较长,尤其是,肌酸激酶同工酶更是要在心肌受损时长超过6小时才会进入血液中,因而,造成了临床诊断结果的判断的延误。
心型脂肪酸结合蛋白(H-FABP)是富含于心脏中的一种新型小胞质蛋白,其具有高度心脏特异性,在心肌缺血性损伤出现后,H-FABP可在胸痛发作后1至3小时出现在血液中,因而,H-FABP可作为一种在心肌损伤早期诊断的有效标志物。
目前,对H-FABP检测技术常用的方法有如下几种:放射免疫测定法(RIA)、荧光免疫测定法(FIA)、酶联免疫测定法(ELISA)、免疫胶体金技术、胶乳增强免疫比浊法等。其中,胶乳增强免疫比浊法因其成本较低,且检测耗时短,因而在目前使用最为广泛,但是其精密度和灵敏度较差。但是,其他检测方法则存在检测成本高、耗时长的缺陷,且对操作人员的专业度要求较高。
发明内容
为克服上述缺点,本发明的目的在于提供一种用于H-FABP定量检测的试剂盒,其检测灵敏度高,检测性能稳定,检测结果准确。
本发明的用于H-FABP定量检测的试剂盒,包括至少一根试剂条,在每根所述试剂条上均包含有若干容纳槽体,所述试剂盒还包括分别预存于不同的容纳槽体中的磁微粒试剂、标记试剂和发光底物,所述磁微粒试剂由抗H-FABP一抗包被的磁珠制备得到,所述标记试剂由抗H-FABP二抗和碱性磷酸酶制备得到。
进一步的,所述磁微粒试剂按如下方法制备而来:
将抗H-FABP一抗和磁珠以及EDC混合并经充分孵育后,集磁去上清,加入封闭剂孵育后集磁去上清,再加入磁珠保存液后即制得磁微粒试剂半成品;
再将磁微粒试剂半成品分散于磁珠缓冲液中,即制备得到磁微粒试剂。
更进一步的,所述磁珠为羧基磁珠,所述抗H-FABP一抗、所述磁珠和所述EDC的质量比为1-5:50-500:1-50,所述封闭剂为CE210。
更进一步的,所述磁珠缓冲液的配方组分包括TRIS、NaCl、吐温20、BSA和Proclin-300。
进一步的,所述标记试剂由经过活化的抗H-FABP二抗和经过活化的碱性磷酸酶混合,并经充分连接后制备得到。
更进一步的,制备所述标记试剂的抗H-FABP二抗经2-IT溶液活化处理得到,制备所述标记试剂的碱性磷酸酶经过SMCC试剂活化处理得到。
更进一步的,经活化后的抗H-FABP二抗和经活化后的碱性磷酸酶经充分连接反应后溶解于酶缓冲液中,所述酶缓冲液的配方组分包括TRIS、NaCl、吐温20、MgCl2、ZnCl2、BSA和Proclin-300。
更进一步的,还包括清洗液。
更进一步的,还包括校准品。
本发明还提供了一种H-FABP定量检测的方法,包括如下步骤:
(1)制备磁微粒试剂:所述磁微粒为抗H-FABP一抗包被的磁微粒,将抗H-FABP一抗和磁珠以及EDC混合并经充分孵育后,集磁去上清,加入封闭剂孵育后集磁去上清,再加入磁珠保存液后即制得磁微粒试剂半成品;
再将磁微粒试剂半成品分散于磁珠缓冲液中,即制备得到磁微粒试剂。
(2)制备标记试剂;
将经过活化的抗H-FABP二抗和经过活化的碱性磷酸酶混合,在二者充分连接后,终止反应,即制备得到标记试剂。
(3)校准品溶液配制:
将H-FABP抗原标准品使用校准品稀释液分别配制浓度为5μg/ml和100μg/ml的A、B两个校准品。
(4)标准曲线的绘制:
将步骤(1)制备得到的磁微粒试剂、步骤(2)制备得到的标记试剂以及碱性磷酸酶的发光底物的混合物分别与步骤(3)制备得到的A、B两个校准品进行充分反应后进行发光值测定,对H-FABP的浓度与发光值的曲线进行校准。
(5)将待测样品与步骤(1)制备得到的磁微粒试剂、步骤(2)制备得到的标记试剂以及碱性磷酸酶的发光底物进行充分反应后进行发光值测定,依据步骤(4)得到的标准曲线,即可得到待测样品中H-FABP的含量。
本发明具有如下有益效果:
本发明的H-FABP检测试剂盒是基于抗原抗体的反应原理,并结合化学发光技术实现对人血样中心型脂肪酸结合蛋白的检测,在其检测过程不引入桥联物质,从而避免人自身抗体对检测产生干扰的可能性。
本发明的试剂盒结合全自动化学发光仪器,具有操作简单,出结果快等特点,利用本发明的试剂盒检测所需时间只需要15分钟,有效提高了检测效率。
本发明的试剂盒对H-FABP的检测结果准确,检测精密度高。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案,下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其它的附图,其中:
图1是本发明的用于H-FABP定量检测的试剂盒的试剂条的结构示意图;
图2是利用本发明的试剂盒检测与常规的检测方法对H-FABP的含量进行检测结果的相关性分析曲线。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的较佳实施例进行详细阐述,以使本发明的优点和特征能更易于被本领域技术人员理解,从而对本发明的保护范围做出更为清楚明确的界定。
本发明各个实施例中的原料来源为:羧基磁珠购买于日本JSR公司;封闭剂CE210购买于JSR株式会社;碱性磷酸酶购买于BBI生命科学有限公司;H-FABP抗原、抗H-FABP一抗和抗H-FABP二抗购买于杭州华葵金配生物科技有限公司。
实施例1:磁微粒试剂的制备
本发明的磁微粒试剂按如下方法制备:将1mg抗H-FABP一抗和100mg MS-300的磁珠以及10mg EDC混合,在37℃孵育2小时,集磁、去上清,加入封闭剂CE210,常温孵育1H,集磁、去上清,加入1ml磁珠保存液即制备得到磁微粒试剂半成品。将制备得到的磁微粒试剂半成品与磁珠缓冲液按体积比为1:50混合均匀,即制备得到磁微粒试剂。本实施例的磁珠为羧基改性磁珠,其也可以为氨基磁珠、羟基磁珠或巯基磁珠等其他改性磁珠。
本发明的磁珠缓冲液的配方为:4.58g/L TRIS、6.81g/L NaCl、0.1%吐温20、3g/LBSA、0.02%Proclin-300,pH8.0。
实施例2:抗H-FABP二抗的活化
将活化剂2-IT溶解于pH7.2的磷酸缓冲溶液中,配制浓度为1.367mg/ml的2-IT溶液,将2-IT与抗H-FABP二抗按质量比1:50混匀,充分活化反应15分钟,加入抗H-FABP二抗的2%质量份的甘氨酸,终止活化反应,然后,使用PD10柱脱盐去除多余的2-IT。
实施例3:碱性磷酸酶的活化
使用DMF配制浓度为1.367mg/ml的SMCC试剂,将SMCC试剂与碱性磷酸酶按质量比为1:50,混匀、活化反应15分钟,加入碱性磷酸酶的2%质量份的甘氨酸终止活化反应,使用PD10柱脱盐去除多余的SMCC。
实施例4:标记试剂的制备
将实施2的经活化的抗H-FABP二抗与实施3的经活化的碱性磷酸酶按质量比1:0.8混合,充分反应4H后,使用乙醇胺终止反应,再使用PD10柱脱盐去除多余的乙醇胺。
再将经过充分连接的抗H-FABP二抗-碱性磷酸酶溶解于试剂酶缓冲液中,终体系中的抗H-FABP二抗浓度为1μg/ml。
本实施例中选用的碱性磷酸酶为天然少糖碱性磷酸酶。
实施例5:校准品配制
将瓶标浓度为2mg/ml的H-FABP抗原标准品使用校准品稀释液分别配制浓度为5μg/ml和100μg/ml的A、B两个校准品,使用实施例1的磁微粒试剂和实施例4的标记试剂,用朗道质控作曲线对A、B两个校准品赋值,结果分别为5.02μg/ml、98.96μg/ml。
实施例6:清洗液和碱性磷酸酶的发光底物溶液的制备
本发明的清洗液按如下配方制备:0.03M Tris、0.15M Nacl、0.5%tween20、0.01%PC300,pH8.5。
本发明的碱性磷酸酶的发光底物按如下配方制备:0.03M Tris、0.15M NaCl、0.5%tween20、300mg/L APS-5,pH9.6。
实施例7:用于H-FABP定量检测的试剂盒的制备
本发明的用于H-FABP定量检测的试剂盒包括试剂条。参见附图1所示,在本发明的试剂条上包含有多个容纳槽体,容纳槽体1-5中分别盛装有待反应的样品、磁微粒试剂、标记试剂、清洗液和碱性磷酸酶的发光底物。在试剂盒内还可设置有H-FABP抗原的标准品。
实施例8:用于H-FABP定量检测的试剂盒的性能验证
本发明的试剂盒在每次检测前需要对该批次试剂条进行定标,本试剂盒采用两点定标模式:在仪器上点击定标,将实施例5的校准品A和B分别加100μl到试剂条的两个容纳槽体内,放入检测仪器中,仪器自行完成定标过程。
仪器定完标后利用灵敏度参考品(即空白缓冲液)对试剂条进行灵敏度性能评估:
将灵敏度参考品加入到试剂条的容纳槽体1中,点击开始就可以检测,取20次的测量值,结果如表1所示:
表1试剂条灵敏度分析
由此可见,利用本发明的试剂盒在无H-FABP存在时的发光值均处于较低水平,对灵敏度参考品的检出值远低于1μg/ml,本发明的试剂盒的检测灵敏度高。
试剂盒检测重复性验证:利用实施5的校准品A和B,将灵敏度参考品加入到试剂条中,重复10次检测,结果如表2所示:
表2试剂盒检测重复性结构验证
试剂盒的高低温稳定性检测:采用4℃、37℃加速实验,将试剂盒分别于4℃、37℃放置15天后,检测信号值偏差,结果如表3所示:
表3试剂盒高低温稳定性检测结果
试剂盒检测与常规检测结果对比:利用本发明的试剂盒检测并与常规的检测方法进行比对,结果如表4所示,将两种方法的检测结果进行相关性分析,结果如图2所示。
表4本发明的试剂盒检测与常规的检测方法检测结果对比
综上所述,本发明的用于H-FABP定量检测的试剂盒具有良好的检测灵敏度,试剂盒的检测性能稳定,且经过与传统检测方法比对,其与传统检测结果的相关度高,检测结果准确度高。
以上实施方式只为说明本发明的技术构思及特点,其目的在于让熟悉此项技术的人了解本发明的内容并加以实施,并不能以此限制本发明的保护范围,凡根据本发明精神实质所做的等效变化或修饰,都应涵盖在本发明的保护范围内。
Claims (5)
1.一种用于H-FABP定量检测的试剂盒,其特征在于,包括至少一根试剂条,在每根所述试剂条上包含有若干容纳槽体,所述试剂盒还包括分别预存于不同的容纳槽体中的磁微粒试剂、标记试剂和发光底物,所述磁微粒试剂由抗H-FABP一抗包被的磁珠制备得到,所述标记试剂由抗H-FABP二抗和碱性磷酸酶制备得到,
所述磁微粒试剂按如下方法制备:将1mg抗H-FABP一抗和100mg MS-300的磁珠以及10mg EDC混合,在37℃孵育2小时,集磁、去上清,加入封闭剂CE210,常温孵育1H,集磁、去上清,加入1ml磁珠保存液即制备得到磁微粒试剂半成品;将制备得到的磁微粒试剂半成品与磁珠缓冲液按体积比为1:50混合均匀,即制备得到磁微粒试剂;所述磁珠缓冲液的配方为:4.58 g/L TRIS、6.81 g/L NaCl、0.1%吐温20、3 g/L BSA、0.02% Proclin-300,pH8.0;
所述抗H-FABP二抗为经活化的抗H-FABP二抗,按如下步骤进行活化:将活化剂2-IT溶解于pH7.2的磷酸缓冲溶液中,配制浓度为1.367mg/ml的2-IT溶液,将2-IT与抗H-FABP二抗按质量比1:50混匀,充分活化反应15分钟,加入抗H-FABP二抗的2%质量份的甘氨酸,终止活化反应,然后,使用PD10柱脱盐去除多余的2-IT;
所述碱性磷酸酶为经活化的碱性磷酸酶,按如下步骤进行活化:使用DMF配制浓度为1.367mg/ml的SMCC试剂,将SMCC试剂与碱性磷酸酶按质量比为1:50,混匀、活化反应15分钟,加入碱性磷酸酶的2%质量份的甘氨酸终止活化反应,使用PD10柱脱盐去除多余的SMCC;
所述标记试剂按如下方法制备:将经活化的抗H-FABP二抗与经活化的碱性磷酸酶按质量比1:0.8混合,充分反应4H后,使用乙醇胺终止反应,再使用PD10柱脱盐去除多余的乙醇胺,再将经过充分连接的抗H-FABP二抗-碱性磷酸酶溶解于试剂酶缓冲液中,终体系中的抗H-FABP二抗浓度为1μg/ml,所述碱性磷酸酶为天然少糖碱性磷酸酶。
2.根据权利要求1所述的用于H-FABP定量检测的试剂盒,其特征在于,经活化后的抗H-FABP二抗和经活化后的碱性磷酸酶经充分连接反应后溶解于酶缓冲液中,所述酶缓冲液的配方组分包括TRIS、NaCl、吐温20、MgCl2、ZnCl2、BSA和Proclin-300。
3.根据权利要求1或2所述的用于H-FABP定量检测的试剂盒,其特征在于,还包括清洗液。
4.根据权利要求1或2所述的用于H-FABP定量检测的试剂盒,其特征在于,还包括校准品。
5.一种H-FABP定量检测的方法,其特征在于,包括如下步骤:
(1)制备磁微粒试剂:所述磁微粒试剂按如下方法制备:将1mg抗H-FABP一抗和100mgMS-300的磁珠以及10mg EDC混合,在37℃孵育2小时,集磁、去上清,加入封闭剂CE210,常温孵育1H,集磁、去上清,加入1ml磁珠保存液即制备得到磁微粒试剂半成品;将制备得到的磁微粒试剂半成品与磁珠缓冲液按体积比为1:50混合均匀,即制备得到磁微粒试剂;所述磁珠缓冲液的配方为:4.58 g/L TRIS、6.81 g/L NaCl、0.1%吐温20、3 g/L BSA、0.02%Proclin-300,pH8.0;
再将磁微粒试剂半成品分散于磁珠缓冲液中,即制备得到磁微粒试剂;
(2)制备标记试剂;
将经过活化的抗H-FABP二抗和经过活化的碱性磷酸酶混合,在二者充分连接后,终止反应,即制备得到标记试剂,所述碱性磷酸酶按如下步骤进行活化:使用DMF配制浓度为1.367mg/ml的SMCC试剂,将SMCC试剂与碱性磷酸酶按质量比为1:50,混匀、活化反应15分钟,加入碱性磷酸酶的2%质量份的甘氨酸终止活化反应,使用PD10柱脱盐去除多余的SMCC;
所述抗H-FABP二抗为经活化的抗H-FABP二抗,按如下步骤进行活化:将活化剂2-IT溶解于pH7.2的磷酸缓冲溶液中,配制浓度为1.367mg/ml的2-IT溶液,将2-IT与抗H-FABP二抗按质量比1:50混匀,充分活化反应15分钟,加入抗H-FABP二抗的2%质量份的甘氨酸,终止活化反应,然后,使用PD10柱脱盐去除多余的2-IT;
将经活化的抗H-FABP二抗与经活化的碱性磷酸酶按质量比1:0.8混合,充分反应4H后,使用乙醇胺终止反应,再使用PD10柱脱盐去除多余的乙醇胺,再将经过充分连接的抗H-FABP二抗-碱性磷酸酶溶解于试剂酶缓冲液中,终体系中的抗H-FABP二抗浓度为1μg/ml,所述碱性磷酸酶为天然少糖碱性磷酸酶;
(3)校准品溶液配制:
将H-FABP抗原标准品使用校准品稀释液分别配制浓度为5μg/ml和100μg/ml的A、B两个校准品;
(4)标准曲线的绘制:
将步骤(1)制备得到的磁微粒试剂、步骤(2)制备得到的标记试剂以及碱性磷酸酶的发光底物的混合物分别与步骤(3)制备得到的A、B两个校准品进行充分反应后进行发光值测定即制备得到H-FABP的浓度与发光值曲线;
(5)将待测样品与步骤(1)制备得到的磁微粒试剂、步骤(2)制备得到的标记试剂以及碱性磷酸酶的发光底物进行充分反应后进行发光值测定,依据步骤(4)得到的标准曲线,即可得到待测样品中H-FABP的含量。
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