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CN113474633A - 寡核苷酸配制方法 - Google Patents

寡核苷酸配制方法 Download PDF

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CN113474633A
CN113474633A CN202080016654.7A CN202080016654A CN113474633A CN 113474633 A CN113474633 A CN 113474633A CN 202080016654 A CN202080016654 A CN 202080016654A CN 113474633 A CN113474633 A CN 113474633A
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I·阿佩尔多夫拉森
M·梅勒加尔德
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Roche Innovation Center Copenhagen AS
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Abstract

本发明涉及一种用于确定以粉末形式存在的寡核苷酸的量的方法。所述方法不需要实验确定所述寡核苷酸的消光系数、或连续稀释和A260测定。所述方法例如适用于经修饰的寡核苷酸，包括2’糖修饰的寡核苷酸、硫代磷酸寡核苷酸、报告基因标记的寡核苷酸和缀合的寡核苷酸。

Description

寡核苷酸配制方法
技术领域
本发明涉及一种用于确定以粉末形式存在的寡核苷酸的量的方法。所述方法不需要实验确定所述寡核苷酸的消光系数、或连续稀释和A260测定。所述方法例如适用于经修饰的寡核苷酸，包括2’糖修饰的寡核苷酸、硫代磷酸寡核苷酸、报告基因标记的寡核苷酸和缀合的寡核苷酸。
背景技术
寡核苷酸和水分子之间有许多潜在的氢键形成位点，诸如核糖部分或核苷间键或碱基部分中的氧原子，或其他修饰(诸如缀合物基团)中的氧原子。
Vovelle和Goodfellow,Int.J.Biol.Macromol.,1990,第12卷,第369-373页报告说DNA的水合水平取决于碱基序列和DNA构象。
因此，粉末状寡核苷酸具有吸水(吸收)或释放水(吸着)的趋势，这取决于周围的相对湿度，引起随相对湿度变化的重量增加或损失。
除非寡核苷酸保持在无水气氛中(例如在氮气下)，否则有必要在配制前确定寡核苷酸的水含量。这通常通过在水中溶解以及通过260nm(A260)下的吸收测定寡核苷酸浓度来完成，通常使用连续稀释程序：参见Handbook of Analysis of Oligonucleotide andRelated Products,第286–289页，其进一步公开了使用Karl Fischer分析来确定寡核苷酸的水含量，以及对于之后的临床阶段(其需要高精度)，应基于Beer-Lambert定律(＝260**)通过稀释系列对寡核苷酸的消光系数进行实验确定。
Murphy和Trapane,Analytical Biochemistry 1996,第240卷,第273-282页报告了一种用于基于寡聚体降解和化学计量磷确定来确定核酸寡聚物及其类似物的浓度的通用磷酸盐分析方法，这是一种不需要事先了解核酸寡聚体中各个核苷残基的吸收曲线的方法。
寡核苷酸的理化性质取决于寡核苷酸修饰的序列和存在-通常修饰寡核苷酸以增强其特性，例如2’糖修饰的修饰的并入用于增强寡核苷酸与互补靶序列的结合亲和力，可用于探针和引物以及研究试剂和治疗剂。通常，在核糖的2’位置存在带负电的取代基可提供增强的结合亲和力，并可进一步提供增强的核酸酶抗性(例如，如在2’-O-甲氧基乙基或LNA核苷的情况下所见)。带负电的取代基的添加和带负电的取代基的性质预计会影响糖修饰的寡核苷酸的水合特征。
用于生物系统或体内(包括治疗剂)的寡核苷酸通常含有经修饰的核苷间键-例如，包含两个氧原子的磷酸二酯键可以被硫代磷酸酯键或甲基膦酸酯键取代。
共价连接至寡核苷酸的缀合物部分的使用是公认的，例如用于分析寡核苷酸(其中可检测的缀合物部分连接至寡核苷酸，例如荧光团或生物素)，或用于增强寡核苷酸的药理学特性。一种广泛用于将寡核苷酸(诸如反义寡核苷酸或siRNA)靶向肝脏的缀合物是N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)-GalNAc部分被细胞(诸如肝细胞)上的脱唾液酸糖蛋白受体识别，引起GalNAc/寡核苷酸分子的内化。诸如GalNAc之类的缀合物基团提供了更多的氢键位点，因此预计与非缀合寡核苷酸相比会改变水合水平。
本发明人评估了一系列经修饰的寡核苷酸，包括各种2’糖修饰、主链键和缀合物基团，并开发了这样一种方法，该方法用于基于寡核苷酸或寡核苷酸缀合物的分子量、寡核苷酸或寡核苷酸缀合物所在环境中的相对湿度、以及寡核苷酸或寡核苷酸缀合物的固体形式在气氛中的平衡重量来确定固体样品中存在的寡核苷酸或寡核苷酸缀合物的量。或者说，本发明的方法可以用于确定寡核苷酸或寡核苷酸缀合物的样品(例如粉末或冻干样品)中存在的水量，从而所述方法可以用于计算存在于样品中的寡核苷酸或寡核苷酸缀合物的干重或摩尔量。
发明内容
本发明提供了一种用于确定以寡核苷酸盐的水合粉末形式存在的寡核苷酸盐的干重(m复合盐)的方法，所述方法包括以下步骤：
a.获得已知分子量(MW复合盐)的固体粉末形式的寡核苷酸复合盐；
b.使所述固体粉末形式的寡核苷酸复合盐暴露于气氛至少约2小时的时间段，其中所述气氛具有约10％至约70％之间的相对湿度(RH)；
c.在所述至少约2小时的时间段后测定所述固体粉末形式的寡核苷酸复合盐的重量(W＝m复合盐+H2O)；
d.确定所述寡核苷酸的干重；
其中所述干重(m复合盐)由下式确定：
Figure BDA0003228959760000031
其中
W为步骤c中测定的所述固体粉末形式的寡核苷酸盐的重量；
Y由方程式Y＝a*RH+b确定，其中a＝0.0545至0.0711之间的值，b＝-0.6818至1.365之间的值，并且RH为步骤b中所指的相对湿度；
MWH2O为水的分子量；
Z为所述寡核苷酸中的核苷酸的数量；
MW复合盐为所述寡核苷酸盐的分子量。
本发明提供了一种用于确定以寡核苷酸盐的水合粉末形式存在的寡核苷酸盐的摩尔数(n复合盐)的方法，所述方法包括以下步骤：
a.获得已知分子量(MW复合盐)的固体粉末形式的寡核苷酸复合盐；
b.使所述固体粉末形式的寡核苷酸复合盐暴露于气氛至少约2小时的时间段，其中所述气氛具有约10％至约70％之间的已知相对湿度(RH)；
c.在所述至少约2小时的时间段后测定所述固体粉末形式的寡核苷酸复合盐的重量(W＝m复合盐+H2O)；
d.确定所述寡核苷酸的干重；
其中所述干重(m复合盐)由下式确定：
Figure BDA0003228959760000041
其中
W为步骤c中测定的所述固体粉末形式的寡核苷酸盐的重量；
Y由方程式Y＝a*RH+b确定，其中a＝0.0545至0.0711之间的值，b＝-0.6818至1.365之间的值，并且RH为步骤b中所指的相对湿度；
MWH2O为水的分子量；
Z为所述寡核苷酸中的核苷酸的数量；
MW复合盐为所述寡核苷酸盐的分子量。
e.使用下式计算寡核苷酸盐的摩尔数(n复合盐)：
n复合盐＝m复合盐/MW复合盐。
本发明的方法可以进一步包括将已知干重的寡核苷酸盐等分到小瓶中的步骤。所述小瓶可以是无菌小瓶。
本发明提供了一种用于制备具有已知浓度(m复合盐/单位体积)的寡核苷酸盐的溶剂制剂的方法，所述方法包括：使用根据本发明的方法确定所述寡核苷酸盐的干重(m复合盐)，以及随后将具有计算出的干重的所述寡核苷酸盐(m复合盐)溶解在已知体积的溶剂中以提供所述具有已知浓度(m复合盐/单位体积)的寡核苷酸盐的溶剂制剂。
本发明提供了一种用于制备具有已知摩尔浓度(n复合盐/单位体积)的寡核苷酸盐的溶剂制剂的方法，所述方法包括：根据本发明的方法确定寡核苷酸盐的摩尔数(n复合盐)，以及随后将该摩尔数的所述寡核苷酸盐溶解在已知体积的溶剂中以提供所述具有已知摩尔浓度(n复合盐/单位体积)的寡核苷酸盐的溶剂制剂。
本发明的方法可以包括对所述溶剂制剂进行灭菌的进一步步骤，例如通过过滤灭菌。
本发明的方法可以进一步包括将所述溶剂制剂等分到小瓶或注射器中的步骤。灭菌步骤可以在等分步骤之前、期间或之后进行。
例如，对于实验或体内使用，所述制剂可以在使用前进行灭菌，例如装有所述溶剂制剂的所述小瓶或注射器可以是无菌的。
在等分步骤之后，其中所述方法进一步包括将所述溶剂制剂等分到小瓶中的步骤，所述方法可以包括从溶剂组合物中去除所述溶剂以提供装有已知量的干燥寡核苷酸盐的小瓶的进一步步骤。可以通过例如冷冻干燥、冻干或通过沉淀来去除所述溶剂。
在一些实施例中，所述寡核苷酸盐中存在的所述寡核苷酸包含缀合物部分，即所述寡核苷酸呈寡核苷酸缀合物的形式。在一些实施例中，所述寡核苷酸包含碳水化合物缀合物部分，诸如GalNAc缀合物部分。
在一些实施例中，步骤b)的气氛具有约10％至约60％之间的相对湿度，诸如约20％至约50％之间的相对湿度。
在一些实施例中，步骤b中所指的时间段(适应时间段)为至少约2小时或至少约3小时或至少约4小时。
在一些实施例中，所述寡核苷酸包含一个或多个2’糖修饰的核苷，诸如包含带负电的取代基/原子的2’糖修饰的核苷酸。在一些实施例中，所述寡核苷酸包含独立地选自由以下项组成的组的一种或多种2’糖修饰的核苷：2'-O-烷基-RNA、2'-O-甲基-RNA、2'-烷氧基-RNA、2'-O-甲氧基乙基-RNA(MOE)、2'-氨基-DNA、2'-氟-RNA和2'-F-ANA核苷以及LNA核苷。
在一些实施例中，所述寡核苷酸包含一个或多个LNA核苷。
在一些实施例中，所述寡核苷酸包含一个或多个2’-O-甲氧基乙基核苷(2’-MOE)。
在一些实施例中，所述寡核苷酸包含硫代磷酸酯核苷间键。
在一些实施例中，所述寡核苷酸包含二硫代磷酸酯核苷间键。
在一些实施例中，所述寡核苷酸包含硫代磷酸酯核苷间键和二硫代磷酸酯核苷间键。
在一些实施例中，所述寡核苷酸包含硫代磷酸酯核苷间键和磷酸二酯核苷间键。
在一些实施例中，所述盐的离子阳离子选自金属阳离子，诸如钠或钾阳离子，或铵阳离子。
附图说明
图1：平均化合物的DVS分析的实例。
图2：该图显示了所有分析化合物的每个核苷酸的RH与水分子比率之间的相关性。该图基于平均值，并且不区分DVS分析期间来自吸收和吸着的结果。在10％至90％之间的相对湿度范围内测试的寡核苷酸盐(化合物1至20)的每个核苷酸的水分子比率。注意所有化合物在RH 10％至60％之间的线性，以及除FAM标记化合物(20)之外的所有化合物在RH10％至70％之间的线性。
图3：该图示出了方程式4和比率模型之间的联系。比率模型的构建是使用来自DVS分析和方程式4的数据完成的。可以使用比率模型然后使用方程式4计算新化合物的质量变化。
图4：该图示出了基于来自转换后的DVS分析的平均值、最大值和最小值的趋势线。该模型不包括最大值的70％RH。
图5：DVS定量模型方法与基于A260吸收的方法的比较。
图6：DVS分析期间吸收和吸着的详细分析。
图7：在10％至65％之间的相对湿度范围内测试的寡核苷酸盐(化合物1至20)的每个核苷酸的水分子比率(图2的特写)。
定义
干重
术语“干重”是指在不存在水(即没有任何水合)的情况下固体形式的复合盐的计算的重量。为了配制特定浓度或剂量的复合盐，需要在配制前已知复合盐的干重。
制剂
术语“制剂”是指复合盐与一种或多种其他化合物的组合(混合物)。在一些实施例中，制剂包括将复合盐溶解在合适的溶剂中，诸如溶解在水中。在一些实施例中，制剂可以用无菌试剂制备或者可以在配制步骤之后进行灭菌，从而提供无菌制剂。制剂可以进一步包括添加除例如所述化合物和溶剂之外的另外的组分，例如可以添加防腐剂作为制剂的一部分。
寡核苷酸盐
术语“寡核苷酸盐”是指盐形式的寡核苷酸化合物。该术语包括寡核苷酸缀合化合物的盐以及未缀合的寡核苷酸化合物的盐。
寡核苷酸盐有利地以固体粉末形式存在，并且可以例如是寡核苷酸盐的样品或一批寡核苷酸盐。
水合形式/水合粉末形式
术语“水合形式”是指在存在水分子的情况下的复合盐，并且包括任何程度的水合，包括：部分水合形式，其中化合物和水分子之间形成一些氢键；以及完全水合形式，其中化合物上存在的所有水合位点都与水分子形成氢键。
水合形式是固体形式。
“水合粉末形式”是指水合固体化合物呈粉末形式，诸如通过冻干、喷雾干燥或沉淀制备的粉末形式。在本发明中有利地使用粉末形式以确保在寡核苷酸盐的整个样品或整批寡核苷酸盐中快速且均匀的DVS。
分子量(MW)
寡核苷酸盐的分子量为干燥形式(即不存在水合)的复合盐的分子量，并且可以是基于寡核苷酸复合盐的已知化学结构计算的MW。
寡核苷酸
如本文所用，术语“寡核苷酸”定义为如技术人员通常理解的包含两个或更多个共价连结的核苷的分子。这样的共价结合的核苷也可以称为核酸分子或寡聚物。寡核苷酸是合成的寡核苷酸。寡核苷酸通常是在实验室中制备，先经固相化学合成后再加以纯化和分离。当提及寡核苷酸的序列时，提及的是共价连结的核苷酸或核苷的核碱基部分或其修饰的序列或顺序。本发明的寡核苷酸是人造的，并且是化学合成的，并且通常是纯化或分离的。本发明的寡核苷酸可以包含一个或多个经修饰的核苷或核苷酸，诸如2'糖修饰的核苷。有利地，寡核苷酸是混合序列寡核苷酸，其包含选自A、T、C、G和U的组中的至少2个(诸如至少3个)不同的核碱基，其中C可以是5-甲基胞嘧啶。
有利地，寡核苷酸可以具有8至25个核苷酸的长度，例如在反义寡核苷酸或引物或探针的情况下。
在一些实施例中，寡核苷酸可以是反义寡核苷酸。
在一些实施例中，寡核苷酸可以是缺口聚物寡核苷酸。在一些实施例中，寡核苷酸是混聚物寡核苷酸。
在一些实施例中，寡核苷酸可以包含缀合物基团。
在一些实施例中，寡核苷酸可以是寡核苷酸探针或引物。在一些实施例中，寡核苷酸可以包含报告基团。
在一些实施例中，寡核苷酸可以是siRNA的链。在一些实施例中，寡核苷酸可以是核酶或适体。
核苷酸
核苷酸是寡核苷酸和多核苷酸的结构单元，并且出于本发明的目的，包括天然存在的和非天然存在的核苷酸。实际上，核苷酸诸如DNA和RNA核苷酸包括核糖糖部分、核碱基部分和一个或多个磷酸酯基团(它们在核苷中不存在)。核苷和核苷酸也可以可互换地称为“单元”或“单体”。
经修饰的核苷
如本文所用，术语“经修饰的核苷”或“核苷修饰”是指与同等的DNA或RNA核苷相比，通过引入糖部分或(核)碱基部分的一种或多种修饰而被修饰的核苷。在一优选的实施例中，经修饰的核苷包含经修饰的糖部分。术语“经修饰的核苷”在本文中还可以与术语“核苷类似物”或经修饰的“单元”或经修饰的“单体”可互换地使用。具有未修饰的DNA或RNA糖部分的核苷在本文中称为DNA或RNA核苷。如果允许Watson Crick碱基配对，则DNA或RNA核苷的碱基区域中修饰的核苷通常仍称为DNA或RNA。
经修饰的核苷间键
在一些实施例中，寡核苷酸包含一个或多个经修饰的核苷间键。
如技术人员通常所理解的，术语“经修饰的核苷间键”定义为除磷酸二酯(PO)键以外的键，其将两个核苷共价偶联在一起。因此，寡核苷酸可以包含经修饰的核苷间键。经修饰的核苷间键可以例如选自包括硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯(diphosphorothioate)及硼烷磷酸酯(boranophosphate)的组。在一些实施例中，所述核苷间键包含硫(S)，诸如硫代磷酸酯核苷间键。硫代磷酸酯核苷间键可用于在反义寡核苷酸中使用，特别是体内使用。
对于在本发明的背景中提及的寡核苷酸，在一些实施例中使用硫代磷酸酯核苷间键是有利的。在一些实施例中，所述寡核苷酸或其连续核苷酸序列中的至少50％的核苷间键为硫代磷酸酯，所述寡核苷酸或其连续核苷酸序列中的诸如至少60％、诸如至少70％、诸如至少75％、诸如至少80％或诸如至少90％的核苷间键为硫代磷酸酯。在一些实施例中，所述寡核苷酸或其连续核苷酸序列中的全部核苷间键均为硫代磷酸酯。在一些实施例中，除了二硫代磷酸酯键(phosphorodithioate linkage)外，本发明的寡核苷酸包含硫代磷酸酯核苷间键及至少一个磷酸二酯键，诸如2个、3个或4个磷酸二酯键。
核碱基
术语“核碱基”包括存在于核苷和核苷酸中的嘌呤(例如腺嘌呤和鸟嘌呤)和嘧啶(例如尿嘧啶、胸腺嘧啶和胞嘧啶)部分，其在核酸杂交中形成氢键。在本发明的背景中，术语“核碱基”也涵盖经修饰的核碱基，其可以不同于天然存在的核碱基，但是在核酸杂交期间起作用。在该背景中，“核碱基”是指天然存在的核碱基，诸如腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶、黄嘌呤和次黄嘌呤，以及非天然存在的变体。此类变体例如描述于Hirao等人(2012)Accounts of Chemical Research第45卷第2055页和Bergstrom(2009)CurrentProtocols in Nucleic Acid Chemistry Suppl.37 1.4.1中。
在一些实施例中，核碱基部分被修饰，其方式是将嘌呤或嘧啶改变为经修饰的嘌呤或嘧啶，诸如取代的嘌呤或取代的嘧啶，诸如选自异胞嘧啶、假异胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、5-噻唑胞嘧啶、5-丙炔基胞嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-噻唑尿嘧啶、2-硫代尿嘧啶、2’硫代胸腺嘧啶、肌苷、二氨基嘌呤、6-氨基嘌呤、2-氨基嘌呤、2,6-二氨基嘌呤和2-氯-6-氨基嘌呤的核碱基。
核碱基部分可以由每一个相应核碱基的字母代码来表示，例如A、T、G、C或U，其中每一个字母可以任选地包括具有同等功能的经修饰的核碱基。例如，在示例性的寡核苷酸中，核碱基部分选自A、T、G、C和5-甲基胞嘧啶。任选地，对于LNA缺口聚物，可以使用5-甲基胞嘧啶LNA核苷。
经修饰的寡核苷酸
术语“经修饰的寡核苷酸”描述了这样一种寡核苷酸，其包含一个或多个糖修饰的核苷和/或经修饰的核苷间键。术语“嵌合”寡核苷酸是在文献中已用于描述具有经修饰的核苷的寡核苷酸的术语。
高亲和力修饰的核苷
高亲和力修饰的核苷是这样一种经修饰的核苷，其在并入所述寡核苷酸中时可增强所述寡核苷酸对其互补靶的亲和力，例如以解链温度(Tm)所测定的。本发明的高亲和力修饰的核苷优选地使每一经修饰的核苷的解链温度增加+0.5至+12℃，更优选地是+1.5至+10℃，并且最优选地是+3至+8℃。许多高亲和力修饰的核苷是本领域已知的，并且包括例如许多2’取代的核苷以及锁定核酸(LNA)(参见例如Freier&Altmann；Nucl.Acid Res.,1997,25,4429-4443和Uhlmann；Curr.Opinion in Drug Development,2000,3(2),293-213)。
糖修饰
与DNA和RNA中发现的核糖糖部分相比时本发明的寡聚物可以包含一种或多种具有经修饰的糖部分(即糖部分的修饰)的核苷。
已经制备了许多具有核糖部分的修饰的核苷，主要目的是改善寡核苷酸的某些特性，诸如亲和力和/或核酸酶抗性。
此类修饰包括这样的修饰，其中例如通过用以下取代来修饰核糖环结构：己糖环(HNA)或一般在核糖环上C2碳和C4碳之间具有双基桥的双环状环(LNA)或一般在C2碳和C3碳之间缺少键的非连接核糖环(例如UNA)。其他糖修饰的核苷包括例如双环己糖核酸(WO2011/017521)或三环核酸(WO2013/154798)。经修饰的核苷还包括这样的核苷，其中糖部分被替换为非糖部分，例如在肽核酸(PNA)或吗啉代核酸的情况下。
糖修饰还包括通过将核糖环上的取代基更改为氢以外的基团或天然存在于DNA和RNA核苷中的2'-OH基团所做出的修饰。例如，可以在2'、3'、4'或5'位置引入取代基。
2'糖修饰的核苷
2'糖修饰的核苷是这样一种核苷，其在2'位置具有除H或-OH以外的取代基(2'取代的核苷)的核苷或包含能够在核糖环中2'碳与和第二个碳原子之间形成桥的2'连接双基，诸如LNA(2'-4'双基桥连的)核苷。
更确切地，2'糖取代的核苷的开发已经颇受关注，目前也已发现许多2'取代的核苷在并入寡核苷酸中时具有有益的特性。例如，2'修饰的糖可以提供增强的结合亲和力和/或增加的对寡核苷酸的核酸酶抗性。2'取代的经修饰的核苷实例是2'-O-烷基-RNA、2'-O-甲基-RNA、2'-烷氧基-RNA、2'-O-甲氧基乙基-RNA(MOE)、2'-氨基-DNA、2'-氟-RNA和2'-F-ANA核苷。其他实例请参见例如：Freier和Altmann；Nucl.Acid Res.,1997,25,4429-4443和Uhlmann；Curr.Opinion in Drug Development,2000,3(2),293-213，以及Deleavey和Damha,Chemistry and Biology 2012,19,937。下面是一些2'取代的经修饰的核苷的示意图。
Figure BDA0003228959760000111
在本发明中，2'取代的糖修饰的核苷并不包括2'桥连的核苷，如LNA。
锁核酸核苷(LNA核苷)
“LNA核苷”是一种2'-修饰的核苷，其包含连结所述核苷的核糖环的C2'和C4'的双基(也称为“2'-4'桥”)，其限制或锁定核糖环的构象。这些核苷在文献中也称为桥连核酸或双环核酸(BNA)。将LNA并入互补RNA或DNA分子的寡核苷酸中时，核糖构象的锁定与杂交的增强亲和力(双链体稳定化)有关。这可以常规地通过测定寡核苷酸/互补双链体的解链温度确定。
非限制性的示例性LNA核苷公开于WO 99/014226、WO 00/66604、WO 98/039352、WO2004/046160、WO 00/047599、WO 2007/134181、WO 2010/077578、WO 2010/036698、WO2007/090071、WO 2009/006478、WO 2011/156202、WO 2008/154401、WO 2009/067647、WO2008/150729、Morita等人,Bioorganic&Med.Chem.Lett.12,73-76,Seth等人J.Org.Chem.2010,第75(5)卷第1569-81页，以及Mitsuoka等人,Nucleic Acids Research2009,37(4),1225-1238，以及Wan和Seth,J.Medical Chemistry 2016,59,9645-9667。
其他非限制性的示例性LNA核苷公开于方案1中。
方案1：
Figure BDA0003228959760000121
特定的LNA核苷是β-D-氧基-LNA、6'-甲基-β-D-氧基LNA诸如(S)-6'-甲基-β-D-氧基-LNA(ScET)及ENA。
特别有利的LNA是β-D-氧基-LNA或甲基-β-D-氧基-LNA(ScET)。
缺口聚物
反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列可以是或可以包含缺口聚物，也称为缺口聚物寡核苷酸。反义缺口聚物一般用于通过核糖核酸酶H介导的降解来抑制靶核酸。缺口聚物寡核苷酸包含至少三个不同的结构区域-“5->3”取向的5'-侧翼、缺口和3'-侧翼，即F-G-F'。“缺口”区域(G)包含一段使寡核苷酸能够募集核糖核酸酶H的连续DNA核苷酸。该缺口区域的侧翼是包含一个或多个糖修饰的核苷(有利地是高亲和力糖修饰的核苷)的5'侧翼区域(F)，以及包含一个或多个糖修饰的核苷(有利地是高亲和力糖修饰的核苷)的3'侧翼区域(F')。区域F和F'中的一个或多个糖修饰的核苷增强寡核苷酸对靶核酸的亲和力(即，亲和力增强的糖修饰的核苷)。在一些实施例中，区域F和F'中的一个或多个糖修饰的核苷是2'糖修饰的核苷，诸如高亲和力的2'糖修饰、诸如独立地选自LNA和2'-MOE。
在缺口聚物设计中，缺口区域的5'和3'最末端核苷是DNA核苷，并且分别位于5'(F)或3'(F')区域的糖修饰的核苷附近。所述侧翼可进一步定义为在距离所述缺口区域最远的端，也就是在5'侧翼的5'端及在3'侧翼的3'端具有至少一个糖修饰的核苷。
区域F-G-F'形成连续核苷酸序列。本发明的反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列可以包含式F-G-F'的缺口聚物区域。
缺口聚物设计F-G-F’的总长度可以为例如12至32个核苷，诸如13至24个核苷，诸如14至22个核苷，诸如14至17个核苷，诸如16至18个核苷。
举例来说，本发明的缺口聚物寡核苷酸可以由下式代表：
F1-8-G5-16-F’1-8，诸如
F1-8-G7-16-F'2-8
前提条件是缺口聚物区域F-G-F’的总长度为至少12个核苷酸，诸如至少14个核苷酸。
在本发明的一方面，该反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列包含或由式5'-F-G-F’-3'的缺口聚物组成，其中区域F和F'独立地包含或由1至8个核苷组成，其中1至4个经2'糖修饰且限定该F和F'区域的5'和3'端，并且G为能够募集核糖核酸酶H的介于6至16个核苷之间的区域。
缺口聚物的区域G(缺口区域)是使得寡核苷酸能够募集核糖核酸酶H、诸如人类核糖核酸酶H1的核苷(通常是DNA核苷)的区域。核糖核酸酶H是这样一种细胞酶，其可识别DNA和RNA之间的双链体，并酶促裂解RNA分子。适当的缺口聚物可以具有长度为至少5个或6个连续DNA核苷，诸如5至16个连续DNA核苷，诸如6至15个连续DNA核苷，诸如7至14个连续DNA核苷，诸如8至12个连续DNA核苷酸，诸如8至12个连续DNA核苷酸的缺口区域(G)。
备选地，有许多关于插入经修饰的核苷的报导，其赋予缺口聚物的缺口区域3'内型构象，同时保留一些核糖核酸酶H活性。此类具有以下缺口区域的缺口聚物称作“缺口破坏者(gap-breaker)”或“妨碍缺口的(gap-disrupted)”缺口聚物，该缺口区包含一个或多个3'内型修饰的核苷，参见例如WO2013/022984。
LNA缺口聚物
LNA缺口聚物是这样的缺口聚物，其中区域F和F'中的一者或两者包含或由LNA核苷组成。β-D-氧基缺口聚物是这样的缺口聚物，其中区域F和F'中的一者或两者包含或由β-D-氧基LNA核苷组成。
在一些实施例中，LNA缺口聚物具有下式：[LNA]1-5-[区域G]-[LNA]1-5，其中区域G具有如缺口聚物区域G定义中的定义。
MOE缺口聚物
MOE缺口聚物是这样的缺口聚物，其中区域F和F'由MOE核苷组成。在一些实施例中，MOE缺口聚物的设计为[MOE]1-8-[区域G]5-16-[MOE]1-8，诸如[MOE]2-7-[区域G]6-14-[MOE]2-7，诸如[MOE]3-6-[区域G]8-12-[MOE]3-6，其中区域G具有如缺口聚物定义中的定义。具有5-10-5设计(MOE-DNA-MOE)的MOE缺口聚物在本领域中已广泛使用。
混合型翼缺口聚物
混合型翼缺口聚物是这样的LNA缺口聚物，其中区域F和F'中的一者或两者包含2'取代的核苷，诸如独立地选自由以下项组成的组的2'取代的核苷：2'-O-烷基-RNA单元、2'-O-甲基-RNA、2'-氨基-DNA单元、2'-氟-DNA单元、2'-烷氧基-RNA、MOE单元、阿糖核酸(ANA)单元和2'-氟-ANA单元诸如MOE核苷。在一些实施例中，其中区域F和F'中的至少一者包含或区域F和F'两者均包含至少一个LNA核苷，区域F和F'的其余核苷独立地选自由MOE和LNA组成的组。在一些实施例中，其中区域F和F'中的至少一者包含或区域F和F'两者均包含至少两个LNA核苷，区域F和F'的其余核苷独立地选自由MOE和LNA组成的组。在一些混合型翼的实施例中，区域F和F'中的一者或两者可以进一步包含一个或多个DNA核苷。
混合型翼缺口聚物设计已公开于WO2008/049085和WO2012/109395中，这两个文献通过引用并入本文。
交替侧翼缺口聚物
侧翼区域可以包含LNA和DNA核苷两者，并且由于其包含LNA-DNA-LNA核苷的交替基序，因此称为“交替侧翼”。包含此类交替侧翼的缺口聚物称为“交替侧翼缺口聚物”。因此，“交替侧翼缺口聚物”是LNA缺口聚物寡核苷酸，其中至少一个侧翼(F或F’)除了包含一个或多个LNA核苷外，还包含DNA核苷。在一些实施例中，区域F或F’中的至少一者包含或区域F和F’两者均包含LNA核苷和DNA核苷两者。在此类实施例中，侧翼区域F或F'包含或F和F'两者均包含至少三个核苷，其中F和/或F'区域的5'和3'最末端核苷为LNA核苷。
寡核苷酸中的区域D'或D”
本发明的寡核苷酸在一些实施例中可以包含以下或由以下组成：与靶核酸互补的寡核苷酸的连续核苷酸序列(诸如缺口聚物F-G-F')以及其他的5'和/或3'核苷。所述其他的5'和/或3'核苷可以与靶核酸完全互补或可以不与靶核酸完全互补。此类其他的5'和/或3'核苷在本文中可以称为区域D'和D”。
出于将连续核苷酸序列(诸如缺口聚物)与缀合物部分或另一个官能团接合的目的，可以添加区域D'或D”。当用于将连续核苷酸序列与缀合物部分接合时，其可用作可生物裂解的连接基。备选地，其可以用于提供核酸外切酶保护或促进合成或制造。
可以将区域D'和D”分别连接至区域F的5'端或区域F'的3'端，以生成下式D'-F-G-F'、F-G-F'-D”或
D'-F-G-F'-D”的设计。在这种情况下，F-G-F'是寡核苷酸的缺口聚物部分，而区域D'或D”构成寡核苷酸的单独部分。
区域D'或D”可以独立地包含1个、2个、3个、4个或5个另外的核苷酸或由其组成，它们可以与靶核酸互补或不互补。与F或F’区域相邻的核苷酸不是糖修饰的核苷酸，诸如DNA或RNA或这些的碱基修饰的形式。D'或D'区域可以用作核酸酶敏感的可生物裂解的连接基(参见连接基的定义)。在一些实施例中，另外的5'和/或3'端核苷酸与磷酸二酯键连结，并且是DNA或RNA。WO2014/076195中公开了适合用作区域D'或D”的基于核苷酸的可生物裂解的连接基，其以举例方式包括磷酸二酯连结的DNA二核苷酸。WO2015/113922中公开了可生物裂解的连接基在多寡核苷酸构建体中的用途，其中它们用于连结单个寡核苷酸内的多个反义构建体(例如缺口聚物区域)。
在一个实施例中，本发明的寡核苷酸除包含构成缺口聚物的连续核苷酸序列之外，还包含区域D'和/或D”。
在一些实施例中，本发明的寡核苷酸可由下式代表：
F-G-F'，特别是F1-8-G5-16-F'2-8
D’-F-G-F’，特别是D’1-3-F1-8-G5-16-F’2-8
F-G-F’-D”，特别是F1-8-G5-16-F’2-8-D”1-3
D’-F-G-F’-D”，特别是D’1-3-F1-8-G5-16-F’2-8-D”1-3
在一些实施例中，位于区域D'与区域F之间的核苷间键是磷酸二酯键。在一些实施例中，位于区域F'与区域D”之间的核苷间键是磷酸二酯键。
全聚物
在一些实施例中，寡聚物或其连续核苷酸序列由核苷类似物(诸如亲和力增强的核苷类似物-在本文中称为“全聚物”)的连续序列组成。
全聚物是单链寡聚物或其连续核苷酸序列，其不包含DNA或RNA核苷，并且因此仅包含核苷类似物核苷。寡聚物或其连续核苷酸序列可以是全聚物-实际上，各种全聚物设计作为治疗性寡聚物都非常有效，特别是在靶向微小RNA(抗miR)或作为剪接转换寡聚物(SSO)时。
在一些实施例中，全聚物包含或由至少一个XYX或YXY序列基序组成，诸如重复序列XYX或YXY，其中X为LNA并且Y为替代(即非LNA)核苷酸类似物，诸如2'-OMe RNA单元和2'-氟DNA单元。在一些实施例中，以上序列基序可以为例如XXY、XYX、YXY或YYX。
在一些实施例中，全聚物可以包含以下或由以下组成：8个至16个之间的核苷酸、诸如9个、10个、11个、12个、13个、14个或15个核苷酸、诸如8个至12个之间的核苷酸的连续核苷酸序列。
在一些实施例中，全聚物的连续核苷酸序列包含至少30％、诸如至少40％、诸如至少50％、诸如至少60％、诸如至少70％、诸如至少80％、诸如至少90％、诸如95％、诸如100％的LNA单元。剩余单元可以选自本文中提及的非LNA核苷酸类似物，诸如选自由以下项组成的组的那些：2'-O-烷基-RNA单元、2'-OMe-RNA单元、2'-氨基-DNA单元、2'-氟-DNA单元、LNA单元、PNA单元、HNA单元、INA单元和2'MOE RNA单元、或2'-OMe RNA单元和2'-氟DNA单元的组。
在一些实施例中，全聚物包含或由仅由LNA单元组成的连续核苷酸序列组成。
混聚物
术语“混聚物”是指包含DNA核苷和糖修饰的核苷两者的寡聚物，其中存在长度不足以募集核糖核酸酶H的连续DNA核苷。合适的混聚物可包含多达3个或多达4个连续DNA核苷。在一些实施例中，混聚物或其连续核苷酸序列包含糖修饰的核苷和DNA核苷的交替的区域。通过交替并入寡核苷酸时与短DNA核苷区域形成RNA样(3'内型)构象的糖修饰的核苷的区域，可以制备非核糖核酸酶H募集寡核苷酸。有利地，糖修饰的核苷是增强亲和力的糖修饰的核苷。
寡核苷酸混聚物通常用于提供对靶基因(诸如剪接调节物或微小RNA抑制物)的基于占据的调节作用。
在一些实施例中，混聚物或其连续核苷酸序列中的糖修饰的核苷包含或全部是LNA核苷，诸如(S)cET或β-D-氧基LNA核苷。
在一些实施例中，混聚物的全部糖修饰的核苷包含相同的糖修饰，例如，它们可以全部是LNA核苷，或可以全部是2'O-MOE核苷。在一些实施例中，混聚物的糖修饰的核苷可以独立地选自LNA核苷和2'取代的核苷，诸如选自由以下项组成的组的2'取代的核苷：2'-O-烷基-RNA、2'-O-甲基-RNA、2'-烷氧基-RNA、2'-O-甲氧基乙基-RNA(MOE)、2'-氨基-DNA、2'-氟-RNA和2'-F-ANA核苷。在一些实施例中，寡核苷酸包含LNA核苷和2'取代的核苷，诸如选自由以下项组成的组的2'取代的核苷：2'-O-烷基-RNA、2'-O-甲基-RNA、2'-烷氧基-RNA、2'-O-甲氧基乙基-RNA(MOE)、2'-氨基-DNA、2'-氟-RNA和2'-F-ANA核苷。在一些实施例中，寡核苷酸包含LNA核苷和2'-O-MOE核苷。在一些实施例中，寡核苷酸包含(S)cET LNA核苷和2'-O-MOE核苷。
在一些实施例中，混聚物或其连续核苷酸序列仅包含LNA和DNA核苷，此类LNA混聚物寡核苷酸的长度可以介于例如8至24个核苷之间(参见例如WO2007112754，其公开了微小RNA的LNA抗miR抑制物)。
缀合物
如本文所用，术语“缀合物”是指与非核苷酸部分(缀合物部分或区域C或第三区域)共价连结的寡核苷酸。
本发明的寡核苷酸与一个或多个非核苷酸部分的缀合可以改善寡核苷酸的药理学，例如，通过影响寡核苷酸的活性、细胞分布、细胞摄取或稳定性实现。在一些实施例中，缀合物部分通过改善寡核苷酸的细胞分布、生物利用度、代谢、排泄、通透性和/或细胞摄取来修饰或增强寡核苷酸的药代动力学特性。特别地，缀合物可以使寡核苷酸靶向特定的器官、组织或细胞类型，并且由此增强寡核苷酸在这种器官、组织或细胞类型中的有效性。同时，缀合物可用于降低寡核苷酸在非靶细胞类型、组织或器官中的活性，例如脱靶活性或在非靶细胞类型、组织或器官中的活性。
在一些实施例中，缀合物基团是或包含极性部分。极性缀合物包括碳水化合物缀合物、蛋白质缀合物、肽缀合物、聚合物缀合物，诸如PEG缀合物。在一些实施例中，缀合物部分是或包含N-乙酰半乳糖胺残基。在一些实施例中，缀合物是或包含报告基团，诸如荧光团。
寡核苷酸缀合物及其合成也已在Manoharan的Antisense Drug Technology,Principles,Strategies,and Applications,S.T.Crooke,ed.,Ch.16,Marcel Dekker,Inc.,2001和Manoharan的Antisense and Nucleic Acid Drug Development,2002,12,103的综合评述中有报告，上述各文献通过引用整体并入本文。
在一实施例中，所述非核苷酸部分(缀合物部分)选自由以下项组成的组：碳水化合物(例如GalNAc)、细胞表面受体配体、药品物质、荷尔蒙、亲脂性物质、聚合物、蛋白质、肽、毒素(例如细菌毒素)、维生素、病毒蛋白质(例如衣壳)或其组合。
在一些实施例中，缀合物部分是那些能够结合脱唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)的缀合物部分。特别地，三价N-乙酰半乳糖胺缀合物部分适用于结合ASGPR(GalNAc)，参见例如WO 2014/076196、WO 2014/207232和WO 2014/179620。此类缀合物用于增强肝脏对寡核苷酸的摄取，同时减少寡核苷酸在肾脏中的存在，从而与相同寡核苷酸的非缀合形式相比，增加缀合寡核苷酸的肝脏/肾脏比率。
连接基
键或连接基是两个原子之间的连接，其通过一个或多个共价键将一个目标化学基团或区段与另一个目标化学基团或区段连结。缀合物部分可直接或通过连结部分(例如连接基或系链)连接至寡核苷酸。连接基用于将第三区域(例如缀合物部分(区域C))共价连接至第一区域(例如与靶核酸互补的寡核苷酸或连续核苷酸序列(区域A))。
在本发明的一些实施例中，本发明的缀合物或寡核苷酸缀合物可以任选地包含位于与靶核酸互补的寡核苷酸或连续核苷酸序列(区域A或第一区域)和缀合物部分(区域C或第三区域)之间的连接基区域(第二区域或区域B和/或区域Y)。
区域B是指包含生理上不稳定的键或由生理上不稳定的键组成的可生物裂解的连接基，该键在哺乳动物体内通常遇到的条件下或与之相似的条件下可裂解。生理上不稳定的连接基经历化学转化(例如裂解)的条件包括化学条件，诸如pH、温度、氧化或还原条件或试剂，以及在哺乳动物细胞中遇到的盐浓度或与之相似的盐浓度。哺乳动物细胞内条件还包括通常存在于哺乳动物细胞中的酶活性的存在，诸如来自蛋白水解酶或水解酶或核酸酶的酶活性。在一个实施例中，可生物裂解的连接基对S1核酸酶裂解敏感。在一优选的实施例中，核酸酶敏感连接基包含1至10个之间的核苷，诸如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个核苷，更优选为2至6个核苷，并且最优选为2至4个连结的核苷，所述连结的核苷包含至少两个连续磷酸二酯键，诸如至少3个或4个或5个连续磷酸二酯键。优选地，核苷是DNA或RNA。WO 2014/076195(通过引用并入本文)中更详细地描述了含有可生物裂解的连接基的磷酸二酯。
区域Y是指这样的连接基，所述连接基不一定是可生物裂解的，但主要用于将缀合物部分(区域C或第三区域)共价连接至寡核苷酸(区域A或第一区域)。区域Y连接基可以包含重复单元(诸如乙二醇单元、氨基酸单元或氨基烷基)的链结构或寡聚物。本发明的寡核苷酸缀合物可以由以下区域性元素A-C、A-B-C、A-B-Y-C、A-Y-B-C或A-Y-C构成。在一些实施例中，连接基(区域Y)为氨基烷基，诸如C2-C36氨基烷基，包括例如C6至C12氨基烷基。在优选的实施例中，连接基(区域Y)为C6氨基烷基。
具体实施方式
寡核苷酸
在一些实施例中，寡核苷酸具有10至50个核苷酸，诸如14至25个核苷酸的长度。在一些实施例中，寡核苷酸具有14、15、16、17、18、19或20个核苷酸的长度。
如实例中所示，本发明的方法特别适用于配制硫代磷酸寡核苷酸，即包含硫代磷酸酯核苷酸间键的寡核苷酸。实际上，实例说明包含硫代磷酸酯核苷间键的化合物具有基于DVS结果的线性相关性，甚至超过了磷酸二酯连结的寡核苷酸。这是出人意料的，因为硫代磷酸酯键中的硫原子与水形成氢键的能力要弱得多(Platts等人,J.Am.Chem.Soc.,1996,118(11),第2726–2733页)。可存在于寡核苷酸中的其他含硫核苷间键包括二硫代磷酸酯和三硫代磷酸酯核苷间键。
实例进一步说明本发明的方法特别适用于包含一种或多种糖修饰的核苷的寡核苷酸，诸如一种或多种包含带负电的2’基团(例如取代基，或在LNA的情况下的4'–2'双基)的糖修饰的核苷。此类糖修饰的核苷常用于反义寡核苷酸、PCR引物和杂交探针，其中它们增强了对互补核苷酸序列的结合亲和力。
在一些实施例中，寡核苷酸是或包含反义寡核苷酸，其中反义寡核苷酸包含一种或多种糖修饰的核苷，诸如独立地选自由以下项组成的组的一种或多种糖修饰的核苷：2'-O-烷基-RNA、2'-O-甲基-RNA、2'-烷氧基-RNA、2'-O-甲氧基乙基-RNA(MOE)、2'-氨基-DNA、2'-氟-RNA、2'-F-ANA核苷以及一个或多个LNA核苷。
在一些实施例中，寡核苷酸是或包含反义寡核苷酸，其中反义寡核苷酸包含一种或多种糖修饰的核苷，诸如独立地选自由2’-O-甲氧基乙基和LNA组成的组的一种或多种糖修饰的核苷。
在一些实施例中，寡核苷酸包含一种或多种糖修饰的核苷，诸如一个或多个LNA核苷和/或一个或多个2'-甲氧基乙基(2-MOE)核苷和硫代磷酸酯核苷间键。
在一些实施例中，寡核苷酸包含一种或多种糖修饰的核苷，诸如一个或多个LNA核苷和/或一个或多个2'-甲氧基乙基(2-MOE)核苷，并且进一步包含硫代磷酸酯和磷酸二酯核苷间键两者。
在一些实施例中，寡核苷酸是或包含缺口聚物寡核苷酸，诸如LNA缺口聚物(其中区域F和F’两者均包含LNA核苷)、MOE缺口聚物(其中区域F和F’两者均包含MOE核苷)。混合翼缺口聚物、交替侧翼缺口聚物和缺口破坏者寡核苷酸。在一些实施例中，缺口聚物的核苷酸内的核苷间键合都是硫代磷酸酯。如实例中所示，硫代磷酸寡核苷酸区域(例如缺口聚物区域)的侧翼可以是一个或多个磷酸二酯连结的核苷(例如在本文中描述为区域D)。缺口聚物或缺口聚物区域的长度通常为至少12个核苷酸，并且可以长达24个或26个核苷酸，但更通常的长度为15至20个核苷酸。在一些实施例中，寡核苷酸是全聚物或混聚物寡核苷酸。
在一些实施例中，寡核苷酸包含荧光标记物(也称为荧光染料)。在一些实施例中，寡核苷酸包含猝灭剂。
在一些实施例中，寡核苷酸包含碳水化合物缀合物基团，诸如GalNAc部分。
气氛
本发明的方法包括这样的时间段，其中将寡核苷酸复合盐暴露于气氛一段时间，以允许寡核苷酸复合盐的水含量(水合程度)与气氛充分平衡(该时间段可以称为适应期)。
在一些实施例中，用于适应期的气氛是具有约10％至约70％之间的预定RH水平或约10％至60％之间的预定RH水平的气氛。
在一些实施例中，在适应期期间测定局部气氛的RH以便确定气氛的RH。在一些实施例中，适应期期间的气氛是室内气氛(局部气氛)。
10％至50％的气氛的RH水平是有利的，因为高于50％则吸收或吸着速率较慢，需要较长的适应期(例如至少约4小时)。
吸收和吸着的时间段(适应期)
如实例中所示，寡核苷酸的水分增加/损失的速率取决于气氛的相对湿度(RH)是高于还是低于已在其中储存寡核苷酸复合盐的气氛的相对湿度，以及RH之间的差。将寡核苷酸复合盐转移到具有较高RH的气氛中会引起吸收，而将寡核苷酸复合盐转移到具有较低RH的气氛中会引起吸着。吸着速率通常比吸收速率慢。
通常，至少约2至4小时的时间段足以使吸收/吸着充分完成以允许确定要通过本发明方法确定的寡核苷酸的干重。
在一些实施例中，在步骤b中，使固体粉末形式的寡核苷酸复合盐暴露于气氛至少约2小时的时间段，其中气氛具有约10％至约70％之间的相对湿度(RH)，诸如约10％至约60％之间的已知相对湿度(RH)，诸如约20％至约50％之间的已知相对湿度(RH)。
在一些实施例中，在步骤b中，使固体粉末形式的寡核苷酸复合盐暴露于气氛至少约3小时的时间段，其中气氛具有约10％至约70％之间的已知相对湿度(RH)，诸如约10％至约60％之间的已知相对湿度(RH)，诸如约20％至约50％之间的已知相对湿度(RH)。
在一些实施例中，在步骤b中，使固体粉末形式的寡核苷酸复合盐暴露于气氛至少约4小时的时间段，其中气氛具有约10％至约70％之间的已知相对湿度(RH)，诸如约10％至约60％之间的已知相对湿度(RH)，诸如约20％至约50％之间的已知相对湿度(RH)。
在一些实施例中，在步骤b中，使固体粉末形式的寡核苷酸复合盐暴露于气氛至少约5小时的时间段，其中气氛具有约10％至约70％之间的已知相对湿度(RH)，诸如约10％至约60％之间的已知相对湿度(RH)，诸如约20％至约50％之间的已知相对湿度(RH)。
在一些实施例中，在步骤b中，使固体粉末形式的寡核苷酸复合盐暴露于气氛至少约6小时的时间段，其中气氛具有约10％至约70％之间的已知相对湿度(RH)，诸如约10％至约60％之间的已知相对湿度(RH)，诸如约20％至约50％之间的已知相对湿度(RH)。
在一些实施例中，在步骤b中，使固体粉末形式的寡核苷酸复合盐暴露于气氛至少约8小时的时间段(诸如过夜)，其中气氛具有约10％至约70％之间的已知相对湿度(RH)，诸如约10％至约60％之间的已知相对湿度(RH)，诸如约20％至约50％之间的已知相对湿度(RH)。
在一些实施例中，在步骤b中，使固体粉末形式的寡核苷酸复合盐暴露于气氛至少约1小时的时间段，其中气氛具有约10％至约70％之间的已知相对湿度(RH)，诸如约10％至约60％之间的已知相对湿度(RH)，诸如约20％至约50％之间的已知相对湿度(RH)。
缀合物基团
如实例中所示，本发明的方法可以用于确定寡核苷酸缀合物的干重或摩尔数。实例说明，与等效的非缀合化合物相比，包含用于形成氢键的多侧(水合位点)的亲水缀合物的并入不会破坏基于DVS结果的线性相关性。碳水化合物缀合物(诸如GalNAc缀合物)保持10％至70％RH之间的出色的线性，等效于未缀合的寡核苷酸等效物。相比之下，使用多酚缀合物(以6-FAM(荧光素)为例)也提供了10％至60％RH之间的出色的线性，等效于未缀合的寡核苷酸等效物。
在一些实施例中，缀合物基团是亲水缀合物基团，其包含两个或更多个可用于氢键合(水合)的氧原子。
碳水化合物缀合物部分
如实例中所示，本发明提供了用于确定包括寡核苷酸缀合物的寡核苷酸的干重或摩尔数的方法。实例说明本发明的方法特别适用于确定包含亲水缀合物部分(诸如碳水化合物缀合物部分(非核苷))的寡核苷酸缀合物的干重/摩尔数。在一些实施例中，缀合物部分包含一个或多个C6糖残基(己糖)。
在一些实施例中，碳水化合物缀合物部分包含选自由以下项组成的组的碳水化合物基团：半乳糖、乳糖、n-乙酰半乳糖胺(galNAc)、甘露糖和甘露糖-6-磷酸酯基团。
碳水化合物缀合物可以用于增强一系列组织(诸如肝脏和/或肌肉)中的递送或活性。参见例如EP1495769,WO99/65925,Yang等人,Bioconjug Chem(2009)20(2):213-21.Zatsepin&Oretskaya Chem Biodivers.(2004)1(10):1401-17。
在一些实施例中，碳水化合物缀合物部分是多价的，诸如，例如2个、3个或4个相同或不同的碳水化合物部分可以共价接合至寡核苷酸，任选地通过一个或多个连接基接合。在一些实施例中，本发明提供了这样的缀合物，其包含本发明的寡核苷酸和碳水化合物缀合物部分。
在一些实施例中，缀合物部分是或可以包含甘露糖或甘露糖-6-磷酸。这对于靶向肌肉细胞特别有用，参见例如US 2012/122801。
能够结合至脱唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)的缀合物部分对于靶向肝脏中的肝细胞特别有用。在一些实施例中，本发明提供了这样的缀合物，其包含本发明的寡核苷酸和脱唾液酸糖蛋白受体靶向缀合物部分。脱唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)缀合物部分包含一个或多个能够以等于或大于半乳糖的亲和力结合至脱唾液酸糖蛋白受体(ASPGR靶向部分)的碳水化合物部分。许多半乳糖衍生物对脱唾液酸糖蛋白受体的亲和力已经进行过研究(参见例如：Jobst,S.T.和Drickamer,K.JB.C.1996,271,6686)或使用本领域典型的方法容易确定。
在一个实施例中，缀合物部分包含至少一个选自由以下项组成的组的脱唾液酸糖蛋白受体靶向部分：半乳糖、半乳糖胺、N-甲酰基-半乳糖胺、N-乙酰半乳糖胺、N-丙酰基-半乳糖胺、N-正丁酰基-半乳糖胺和N-异丁酰基半乳糖胺。优选地，脱唾液酸糖蛋白受体靶向部分是N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)。
为了生成ASGPR缀合物部分，可以将ASPGR靶向部分(优选地GalNAc)连接至缀合物支架上。通常，ASPGR靶向部分可以在支架的相同端。在一个实施例中，缀合物部分由连结至间隔物的二至四个(诸如三个)末端GalNAc部分组成，该间隔物将每个GalNAc部分连结至可与反义寡核苷酸缀合的支链分子。
在另一个实施例中，缀合物部分相对于脱唾液酸糖蛋白受体靶向部分为一价、二价、三价或四价。有利地，脱唾液酸糖蛋白受体靶向部分包含N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)部分。
构成缀合物部分的ASPGR靶向支架可以例如通过将GalNAc部分通过其C-l碳连结至间隔物来生成。优选的间隔物是柔性亲水性间隔物(美国专利5885968；Biessen等人J.Med.Chern.1995第39卷第1538-1546页)。优选的柔性亲水性间隔物是PEG间隔物。优选的PEG间隔物是PEG3间隔物。分支点可以是容许两个至三个GalNAc部分或其他脱唾液酸糖蛋白受体靶向部分连接至寡核苷酸，并进一步容许分支点连接至寡核苷酸的任何小分子，此类构建体称为GalNAc簇或GalNAc缀合物部分。示例性的分支点基团是二赖氨酸。二赖氨酸分子包含三个胺基团和羧基反应性基团，三个GalNAc部分或其他脱唾液酸糖蛋白受体靶向部分可以通过所述三个胺基团连接，而二赖氨酸可以通过所述羧基反应性基团连接至寡聚物。Khorev,等人2008 Bioorg.Med.Chem.第16卷,第5216页也描述了合适的三价支化剂(brancher)的合成。其他可商购获得的支化剂是1,3-双-[5-(4,4'-二甲氧基三苯甲氧基)戊基氨基]丙基-2-[(2-氰基乙基)-(N,N-二异丙基)]亚磷酰胺(Glen Research目录号：10-1920-xx)；三-2,2,2-[3-(4,4'-二甲氧基三苯甲氧基)丙基氧甲基]乙基-[(2-氰基乙基)-(N,N-二异丙基)]-亚磷酰胺(Glen Research目录号：10-1922-xx)；和
三-2,2,2-[3-(4,4'-二甲氧基三苯甲氧基)丙氧基甲基]亚甲氧基丙基-[(2-氰基乙基)-(N,N-二异丙基)]-亚磷酰胺；和1-[5-(4,4'-二甲氧基-三苯甲氧基)戊酰胺基]-3-[5-芴甲氧基-羰基-氧基-戊酰胺基]-丙基-2-[(2-氰基乙基)-(N,N-二异丙基)]-亚磷酰胺(Glen Research目录号：10-1925-xx)；以及连接有GalNAc部分的小肽，诸如Tyr-Glu-Glu-(氨基己基GalNAc)3(YEE(ahGalNAc)3；与肝细胞上的脱唾液酸糖蛋白受体结合的糖三肽，参见，例如，Duff,等人，Methods Enzymol,2000,313,297)；基于赖氨酸的半乳糖簇(例如，L3G4；Biessen,等人，Cardovasc.Med.,1999,214)；和基于胆烷的半乳糖簇(例如，脱唾液酸糖蛋白受体的碳水化合物识别基序)。
可以使用本领域已知的方法将ASGPR缀合物部分，特别是三价GalNAc缀合物部分连接至寡核苷酸的3’端或5’端。在一个实施例中，ASGPR缀合物部分连结至寡核苷酸的5’端。
一个或多个连接基可以插入在缀合物部分(诸如在分支分子处)和寡核苷酸之间。在缀合物部分和反义寡核苷酸之间具有可生物裂解的连接基是有利的，任选地与不可裂解的连接基(诸如C6连接基)组合。一个或多个连接基可以选自在“连接基”下的“定义”部分中描述的连接基，特别是可生物裂解的区域D’或D”连接基是有利的。
在一些实施例中，缀合物部分包含一个或多个N-乙酰半乳糖胺残基(GalNAc)：
Figure BDA0003228959760000261
在一些实施例中，缀合物部分包含多个N-乙酰半乳糖胺残基(GalNAc复合物)。在一些实施例中，一个或多个N-乙酰半乳糖胺残基共价连接至聚合物基团，诸如PEG连接基(PEG包含另外的氢键位点)。多个GalNAc(或例如GalNAc-PEG部分)可以通过连结部分(诸如通过肽连接基，诸如聚赖氨酸连接基)共价接合在一起。
在一些实施例中，galNAc缀合物共价连接至寡核苷酸的5’末端，任选地通过连接基基团诸如C6连接基连接。
在一个实施例中，缀合物部分是或包含三价N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)，诸如选自以下所示那些中的GalNAc部分(波浪线代表与寡核苷酸的5’或3’末端的共价键或与位于缀合物部分和寡核苷酸的5'或3'末端之间的连接基的共价键)：
Figure BDA0003228959760000271
Figure BDA0003228959760000281
Figure BDA0003228959760000291
Figure BDA0003228959760000301
其中T2是寡核苷酸或将GalNAc部分连结到寡核苷酸的连接基，如WO2014/179620中所述，其公开了3’缀合的GalNAc部分在反义寡核苷酸上的用途。
WO2016/055601描述了使用亚磷酰胺方法将GalNAc缀合物部分引入到寡核苷酸上，例如：
Figure BDA0003228959760000311
聚合物缀合物部分
在一些实施例中，缀合物部分是或包含聚合物。聚合物包括但不限于亲水性聚合物，诸如聚环氧烷、聚乙二醇(PEG)和/或聚丙二醇(PPG)-参见WO2008/034123(通过引用并入本文)，聚胺、多肽、聚甲基丙烯酸酯(例如，甲基丙烯酸羟丙酯(HPMA))、聚(L-丙交酯)、聚(DL丙交酯-共-乙交酯(PGLA)、聚丙烯酸、聚乙烯亚胺(PEI)、聚烷基丙烯酸、聚氨酯、聚丙烯酰胺、N-烷基丙烯酰胺、聚精胺(PSP)、聚醚、环糊精、其衍生物及其共聚物。
在一些实施例中，缀合物部分包含PEG基团或PEG间隔物。
报告基团
在一些实施例中，缀合物部分是或包含报告基团，诸如荧光团。示例性荧光团包括6-碳荧光素、6-羧基四甲基罗丹明、Cy3和香豆素：
Figure BDA0003228959760000321
其中X为连接基，并且R为寡核苷酸。
例如，荧光标记的寡核苷酸通常用于qPCR中，通常与猝灭剂分子结合使用。在一些实施例中，寡核苷酸包含猝灭剂部分基团，例如dabcyl、BHQ2、IB FQ和IQ4。
报告基团通常作为亚磷酰胺或在寡核苷酸合成后并入寡核苷酸中，例如通过氨基/酯反应并入。
实例
化合物表
以下化合物用于DVS分析。基于它们在长度、序列、不同缀合物的存在以及不同核苷酸类似物的存在方面的差异来选择化合物。还基于不同组合中磷酸二酯和硫代磷酸酯键的存在来选择化合物。
Figure BDA0003228959760000331
磷酸二酯核苷间键由下标o表示，否则所有核苷间键都是硫代磷酸酯核苷间键；非斜体大写字母代表β-D-氧基LNA核苷，所有β-D-氧基LNA C均为5-甲基胞嘧啶β-D-氧基LNA；斜体大写字母代表2’-O-甲氧基乙基RNA核苷，小写字母代表DNA核苷；5'-GN2-C6代表三价GalNAc缀合物，其C6烷基连接基共价连接至寡核苷酸序列的5’末端核苷的5’位置；6SH代表3’末端硫醇；5'-FAM代表5'FAM荧光团缀合物基团。5’-AM-C6是指氨基C6烷基连接基，它通常在缀合至例如GalNAc部分之前用作中间体。在化合物6中，混合序列缺口聚物寡核苷酸，其中小写n为DNA核苷，并且大写N为β-D-氧基LNA核苷。
实例1：未缀合、FAM标记和硫醇标记的寡核苷酸的合成：
使用亚磷酰胺方法在MerMade 12或OligoPilot 100合成仪上以20μmol或更高的合成规模合成无DMT的寡核苷酸。使用氨水在60℃下裂解和脱保护每个寡核苷酸至少5小时。通过以下方法之一纯化粗制化合物：
1)离子交换HPLC，然后在Crossflow上进行超滤。
2)在Crossflow上的直接超滤
3)使用尺寸排阻色谱法直接脱盐
纯化后，将寡核苷酸冻干。寡核苷酸的纯度和分子量通过UPLC-MS表征。
实例2：GalNAc缀合的寡核苷酸的合成：
使用亚磷酰胺方法在MerMade 12或OligoPilot 100合成仪上以20μmol或更高的合成规模将寡核苷酸合成为5'端的氨基C6。使用氨水在60℃下裂解和脱保护每个寡核苷酸至少5小时。通过以下方法之一处理粗制化合物：
1)在Crossflow上的直接超滤
2)溶解在0,1M NaOH中并蒸发
3)在2％LiClO4丙酮中沉淀，然后蒸发丙酮。
使用WO2014118267中描述的方法将寡核苷酸缀合至三价GalNAc缀合物。通过以下方法之一纯化缀合的化合物：
1)离子交换HPLC，然后在Crossflow上进行超滤。
2)离子交换HPLC，然后使用尺寸排阻色谱法脱盐
纯化后，将寡核苷酸冻干、喷雾干燥或沉淀。寡核苷酸的纯度和分子量通过UPLC-MS表征。
下文示出了如WO2014/118267中描述的galNAc-C6连接基缀合物部分(缀合物4a)：
Figure BDA0003228959760000351
实例3：DVS分析
DVS(动态蒸汽吸着)分析是使用自动重量吸着系统完成的。在湿度发生动态变化之前，允许所有样品在分析仪器内在0％相对湿度(RH)下达到稳态。在范围为0至90或95％RH的增加和减小的RH条件下分析质量的变化。对大多数测试化合物使用两个周期进行分析。对一种化合物仅使用一个周期进行分析。对两种化合物进行了两个周期的分析，但由于在测定过程中仪器出现技术问题，因此只使用了一个周期。
分析是在三个实验室中使用两种不同的仪器完成的：
1)带有DVS数据分析套件的表面测定系统DVS仪器
2)带有SPS软件的proUmid DVS仪器
两种软件类型的结果输出都是随固定温度下相对湿度条件变化的样品质量的动态变化。
相对湿度的变化是在使用过的仪器中使用不同的配置文件完成的：
1)RH以如下区间增加：0-5、5-10、10-20、20-30、30-40、40-50、50-60、60-70、70-80、80-90、(90-95)并再次以相同的区间减小。在将相对湿度改变到下一个水平之前，让样品平衡到每个阶段的条件。根据当前条件下的平衡速率，扫描速率对应于同一化合物内1,5％至9％RH/h。
2)相对湿度在0％至95％RH范围内以固定速率5％RH/h变化。
获得的数据示出于下表1中。如图1所示，分析的化合物在增加和减小RH条件期间显示出质量变化滞后。从数据中没有观察到化合物之间的清晰模式或相关性。
来自所有DVS分析的所有数据点的平均值用于研究寡核苷酸的质量百分比变化与长度之间的联系。
表1：不同RH条件下的平均质量变化。
Figure BDA0003228959760000361
肉眼可见，表1中示出的结果未显示RH条件与质量变化(％)之间的任何明确联系。将质量的百分比变化转换为特定化合物吸收的水的重量。将水的重量进一步转换为水的摩尔数。将化合物的重量转换为化合物的摩尔数，并将摩尔数乘以每个化合物中的核苷酸的数量。计算每个化合物中的摩尔数和核苷酸的摩尔数之间的比率。以下方程式用于计算任何给定寡核苷酸样品中每个核苷酸的水分子数-之后称为比率。该步骤对于标准化所有结果是必要的，否则来自DVS分析的不同化合物的重量增加百分比看起来像是随机的。
实例4-基于DVS分析用于评估寡核苷酸的水含量的数学算法的开发。
来自DVS分析的所有数据都使用4个方程式进行了转换。
方程式1-3示出了使用隔离的数学规则来减少未知量，以便获得尽可能少的未知因数。方程式4是基于方程式1-3的结果，并且是所有3个方程式的组合。
m寡核苷酸＝仅含有寡核苷酸(无水)的样品的质量。
m水＝寡核苷酸在适应后获得的水的质量。
m寡核苷酸+水＝寡核苷酸和水加在一起的质量，其对应于m寡核苷酸+m水。
Δm％＝适应后样品的质量百分比变化(写为例如0.09而不是9％)。这些数据通过DVS分析提供。
n寡核苷酸＝寡核苷酸的摩尔数
n核苷酸＝所有核苷酸的摩尔数＝寡核苷酸的摩尔数*化合物中的核苷酸的数量
n水＝水的摩尔数
方程式1是基于这样的假设：如果给定化合物的DVS分析显示该化合物在适应后增加了20％的重量，则可以计算新的重量：
m寡核苷酸+0,20*m寡核苷酸。
方程式1
·
Figure BDA0003228959760000371
·
Figure BDA0003228959760000372
·
Figure BDA0003228959760000373
方程式2是方程式1的转换，以表明可以使用不同的因数计算m寡核苷酸。为了能够做到这一点，假设m寡核苷酸+水＝m寡核苷酸+m水。
方程式2
·
Figure BDA0003228959760000381
·
Figure BDA0003228959760000382
·
Figure BDA0003228959760000383
·
Figure BDA0003228959760000384
·
Figure BDA0003228959760000385
·m寡核甘酸*Δm％＝m水
方程式3是方程式1和2的组合。m寡核苷酸在方程式1和2中都被分离出来并结合在一起形成方程式3。
方程式3
·
Figure BDA0003228959760000386
·
Figure BDA0003228959760000387
方程式4是使用方程式1、2和3以及公式m＝M*n得出的。通过组合所有公式，可以将未知因数的数量减少到仅一个(Δm％)。
方程式4
·
Figure BDA0003228959760000388
·
Figure BDA0003228959760000389
·
Figure BDA00032289597600003810
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Figure BDA00032289597600003811
·
Figure BDA00032289597600003812
实例5–对DVS原始数据应用定量模型
使用方程式4和每个化合物的平均质量变化，计算所有测试化合物在所有RH数据点的比率。Δm％数据是从表格中获得的，其中概述了每种化合物在不同室内湿度下的质量变化。其他因数诸如M寡核苷酸和核苷酸的数量特定于化合物并且可以计算得出，而M水始终恒定为18,02g/mol。结果汇总在下表2中：
表2：使用方程式4计算水分子的比率
Figure BDA0003228959760000391
重要的是应记住寡核苷酸由一系列核苷酸组成，并且数量因化合物而异。区分质量百分比变化(第1部分中有介绍)和室内湿度百分比变化(第2部分中有介绍)也很重要。
实例6–比率数据的比较分析
当将来自DVS分析的所有平均结果组合在一个图表中时，可以将10％至70％RH区间内的所有化合物之间的行为趋势可视化。在该区间内，所有化合物在相对湿度与化合物中每个核苷酸吸收的水分子数之间显示出线性相关性。这表明所有测试化合物都具有非常相似的行为(图2)，这并非是从原始DVS分析数据(表1)中显而易见的或可预测的。
测试的化合物在设计上非常不同，而仍然表现出非常相似的行为，并且证明所有测试化合物之间每个核苷酸的平均水分子数非常相似。假设所有未经测试的寡核苷酸都在同一范围内表现，可以在已经分析过的化合物上建立模型，以便仅基于对寡核苷酸(部分)的长度(或MW)、它们的重量和气氛的RH的了解来预测其他寡核苷酸的行为-尤其是：
对于LNA和2-MOE修饰的寡核苷酸，以及对于仅包含硫代磷酸酯键或包含硫代磷酸酯键和磷酸二酯键的寡核苷酸，寡核苷酸的水合水平与气氛的相对湿度之间存在显著的密切相关性。此外，添加缀合物基团，诸如GalNAc缀合物(其呈现出大量与水的潜在氢键位点)，并没有显著影响比率模型，出人意料地说明DVS分析和本发明人开发的比率模型的组合使用适用于糖修饰的寡核苷酸、键修饰的寡核苷酸和寡核苷酸缀合物。
通过将下图在10％至70％的相对湿度区间内的结果相结合，可以绘制出一条趋势线，也称为比率模型(图2和7)。
基于比率模型，对于之前未使用DVS分析的新化合物，现在可以在10％至70％之间的任何湿度条件下计算每个核苷酸的水分子数。比率模型的使用示意图如图3所示。
如果将每个核苷酸的水分子比率的有关信息与新化合物的长度和分子量的有关知识相结合，则可以使用方程式4计算任何寡核苷酸粉末的理论水含量百分比。
实例7：比率模型–平均值与最大值或最小值
前面提到的比率模型是基于来自DVS分析的平均结果。每个DVS分析也基于平均结果，因为所有化合物在增加和减少RH条件期间都表现出质量变化的滞后，这意味着所有化合物在水的吸着和解吸过程中表现不同。
为了研究使用基于制剂寡核苷酸的平均吸水率的比率模型的精度，进行了以下计算。使用来自所有获得的DVS分析的最高和最低结果制成了最大值的比率模型和最小值的比率模型。
在10％至60％/70％相对湿度区间内，基于每种化合物的以下数据点绘制了3条趋势线。所有趋势线均显示相关系数接近1。这些趋势线被命名为比率模型最小值、最大值和平均值。
比率模型平均值：显示在10％至70％区间内从DVS分析转换的所有可用数据点的平均值。此处包括吸收和吸着的结果，尽管它们显示出滞后现象。
比率模型最大值：在10％至60％的区间内找到每个RH值的最大数据点。在整个区间内，这些值并非源自同一化合物。由于异常行为，排除了70％RH的数据点。
比率模型最小值：在10％至70％的区间内找到每个RH值的最小数据点。在整个区间内，这些值并非源自同一化合物。
图4：该图示出了基于来自转换后的DVS分析的平均值、最大值和最小值的趋势线。该模型不包括最大值的70％RH。
实例8：基于DVS比率模型的寡核苷酸溶液的配制：
为了评估与平均模型相比最大值和最小值之间的这种近似所涉及的偏差，进行了以下理论实验。
质量的平均变化
可以使用比率模型结合方程式4计算任何未知化合物的质量变化。对于寡核苷酸的高通量制剂，平均比率模型是合适的。
比率＝0,061*RH+0,4218
Figure BDA0003228959760000411
比率＝化合物中每个核苷酸吸收的水分子数(GalNAc不包括在内)。
RH＝化合物适应的当前室内湿度。
Δm％＝适应后化合物的质量变化。
MW(水)＝18,02g/mol，水的分子量。
MW(化合物，Na盐)＝钠盐形式的化合物的分子量。
核苷酸数＝化合物中的核苷酸的数量(如果化合物包含GalNAc，则不应包括在该数量中)。
2mg/ml，需要5ml的化合物A。
该溶液所需的理论质量：2mg/ml*5ml＝10mg
化合物A信息：MW(Na盐)＝4900g/mol，化合物含有14个核苷酸
RH：45％
比率＝0,061*RH+0,4218＝0,061*45+0,4218＝3,17
Figure BDA0003228959760000421
假设可以计算出实际重量：
m化合物+水＝m化合物+Δm％*m化合物＝10mg+0,16*10mg＝11,6mg
因而需要称出11.6mg的化合物A以获得5ml的2mg/ml溶液。
实例9：误差容限计算
为了研究基于平均值的计算与基于最外面的结果的计算相比有何不同，使用上述3比率模型进行以下计算。通过使用最大值、平均值和最小值的比率模型，然后在方程式4中使用这些结果，可以计算质量差异，从而计算偏差百分比。
以下所有计算均基于上述实例中的化合物A的相同溶液。
第一步是使用最大值、平均值和最小值比率模型计算化合物A中每个核苷酸的水分子比率。这三个公式取自上图。
最大值：比率＝0,0711*RH+1,365＝0,0711*45+1,365＝4,56
平均值：比率＝0,061*RH+0,4218＝0,061*45+0,4218＝3,17
最小值：比率＝0,0545*RH-0,6818＝0,0545*45-0,6818＝1,77
在方程式4中使用所述比率来计算化合物A在45％的RH下的理论重量增加，如上所述。
最大预期质量变化：
Figure BDA0003228959760000422
平均预期质量变化：
Figure BDA0003228959760000423
最小预期质量变化：
Figure BDA0003228959760000424
当计算质量的百分比变化时，还可以计算样品的实际重量。
最大模型：
m化合物+水＝m化合物+Δm％*m化合物＝10mg+0,23*10mg＝12,3mg
平均模型：
m化合物+水＝m化合物+Δm％*m化合物＝10mg+0,16*10mg＝11,6mg
最小模型：
m化合物+水＝m化合物+Δm％*m化合物＝10mg+0,09*10mg＝10,9mg
目的是将最外面的结果与平均值进行比较，因此计算了最大模型与平均模型以及最小模型与平均模型之间的差：
Figure BDA0003228959760000431
Figure BDA0003228959760000432
最大模型与平均模型以及最小模型与平均模型之间所需化合物的差为仅6％。
这意味着，尽管所有分析的化合物在增加和减小RH条件期间都表现出质量变化的滞后，但平均模型引入的偏差非常低。即使未知化合物是临界情况并且具有接近最大值或最小值的值，与平均模型的最高预期偏差也为6％。尽管存在这种偏差，但基于平均结果的比率模型优于可能会产生较高偏差的依赖于UV测定的方法和基于理论计算的消光系数的方法。
实例10-与替代配制方法的比较
UV测定通常被认为是确定寡核苷酸溶液中的浓度的标准方法之一。为了表明使用比率模型提供的浓度非常接近UV测定和实验测定的消光系数提供的结果，进行了以下实验。
第一步是通过实验确定一系列寡核苷酸的消光系数。还发现了这些化合物的理论消光系数。第二步是使用比率模型(基于平均结果)为相同的化合物配制溶液。使用Beer-Lambert定律和每种化合物的两个可用消光系数计算溶液中的浓度。
消光系数的实验确定
使用TGA分析对测试化合物中的水含量进行分析，并将结果用于下一步。
称出测试化合物的重量，并根据水含量校正重量。用水将所有样品稀释至0,05mg/ml，然后进一步稀释至0,033mg/ml、0,025mg/ml、0,0042mg/ml。在260nm处测定吸光度，并以浓度为X轴和吸光度为Y轴绘制图表。为每种化合物制成趋势线，并且斜率是消光系数。还针对化合物的纯度校正结果。
配制方法的比较
使具有可用的实验测定的消光系数的化合物在进行称重程序的抽吸柜中适应至少4小时。室内湿度读取器也放置在该抽吸柜中。读取室内湿度并使用基于平均结果的公式计算理论水含量。每种化合物称重两次，将粉末溶解在对应量的水中，得到2mg/ml的溶液。在Eppendorf生物光度仪上测定每种溶液中的吸光度。使用Beer-Lambert定律，使用测试化合物的理论消光系数和测定的消光系数计算浓度。结果汇总在下表3中：
表3：
Figure BDA0003228959760000441
基于比率模型的浓度与基于测定的消光系数的浓度之间有更多的一致性。基于理论消光系数的结果与通常太低的其他两种方法有很大差异。这意味着，如果使用理论消光系数调节测试溶液中的浓度，则相同的化合物会以高浓度给药。为了说明方法之间的差异，将结果收集在一张图中(图5)。
从视觉上看，代表基于比率模型和测定的消光系数的浓度的蓝色和绿色条形之间存在良好的相关性。为了表明这两种方法之间的差异低于10％，将误差条添加到基于比率模型的浓度以表示目标浓度的+/-10％。基于理论计算的消光系数得出的结果大部分时间都在10％之外。
该实验表明，比率模型与最公认和最广泛使用的配制方法之一-使用测定的消光系数测定吸光度-之间存在非常好的相关性。因此，可以取代地通过使用比率模型制备溶液来代替通过吸光度测定来确定浓度。
与可能是误差来源的吸光度测定相比，所提出的方法还具有移液步骤较少的优点。
实例11–详细研究吸收率和吸着率
使用实例3中描述的方法分析样品：DVS分析(第39页)。软件选项1和相对湿度的变化均使用配置文件1进行两种分析。
表4
Figure BDA0003228959760000451
Figure IDA0003228959800000011
Figure IDA0003228959800000021
Figure IDA0003228959800000031

Claims (16)

1.一种用于确定以寡核苷酸盐的水合粉末形式存在的寡核苷酸盐的干重(m复合盐)的方法，所述方法包括：
a.获得已知分子量(MW复合盐)的固体粉末形式的寡核苷酸复合盐；
b.使所述固体粉末形式的寡核苷酸复合盐暴露于气氛至少2小时的时间段，其中所述气氛具有约10％至约70％之间的相对湿度；
c.在所述至少2小时的时间段后测定所述固体粉末形式的寡核苷酸复合盐的重量(W＝m复合盐+H2O)；
d.确定所述寡核苷酸的干重
其中所述干重(m复合盐)由下式确定：
Figure FDA0003228959750000011
其中
W为步骤c中测定的所述固体粉末形式的寡核苷酸盐的重量；
Y为0.06±0.011，诸如Y为0.0545与0.0711之间的值；
MWH2O为水的分子量
Z为所述寡核苷酸中的核苷酸的数量
MW复合盐为所述寡核苷酸盐的分子量。
2.一种用于确定以寡核苷酸盐的水合粉末形式存在的寡核苷酸盐的摩尔数(n复合盐)的方法，所述方法包括执行根据权利要求1所述的方法，其中所述摩尔数由下式确定：
n复合盐＝m复合盐/MW复合盐。
3.一种用于制备具有限定浓度(m复合盐/单位体积)的寡核苷酸盐的溶剂制剂的方法，所述方法包括：执行根据权利要求1所述的方法，以及随后将具有计算出的干重的所述寡核苷酸盐溶解在已知体积的溶剂中以提供所述具有限定浓度(m复合盐/单位体积)的寡核苷酸盐的溶剂制剂。
4.一种用于制备具有限定摩尔浓度(n复合盐/单位体积)的寡核苷酸盐的溶剂制剂的方法，所述方法包括：执行根据权利要求2所述的方法，以及随后将具有计算出的摩尔数的所述寡核苷酸盐溶解在已知体积的溶剂中以提供所述具有限定摩尔浓度(n复合盐/单位体积)的寡核苷酸盐的溶剂制剂。
5.根据权利要求3或4所述的方法，其中所述方法进一步包括将所述溶剂制剂等分到小瓶或注射器中的步骤。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述等分到小瓶或注射器中是等分单位剂量形式的所述寡核苷酸盐。
7.根据权利要求3至6中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括对所述溶剂制剂进行灭菌的步骤(可以在根据权利要求5或6所述的等分之前、期间或之后进行)。
8.根据权利要求5或6中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括将所述溶剂制剂等分到小瓶中的步骤，随后是从溶剂组合物中去除所述溶剂以提供装有已知量的干燥寡核苷酸盐的小瓶的步骤。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述寡核苷酸是寡核苷酸缀合物。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述寡核苷酸缀合物包含：碳水化合物缀合物部分，诸如GalNAc缀合物部分；或报告基团，诸如荧光基团(例如FAM)。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中步骤b)的所述气氛具有约10％至约60％之间的已知相对湿度，或约20％至约50％之间的相对湿度。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其中步骤b.中所指的时间段为至少约2小时或至少约3小时或至少约4小时。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其中所述寡核苷酸包含选自由以下项组成的组的一种或多种核苷：2’-O-烷基-RNA、2’-O-甲基-RNA、2’-烷氧基-RNA、2’-O-甲氧基乙基-RNA(MOE)、2’-氨基-DNA、2’-氟-RNA、2’-F-ANA核苷以及一个或多个LNA核苷。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的方法，其中所述寡核苷酸包含硫代磷酸酯核苷间键。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的方法，其中所述盐的离子阳离子选自金属阳离子，诸如钠或钾阳离子，或铵阳离子。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的方法，其中所述寡核苷酸具有8至25个连续核苷酸，诸如12至20个核苷酸的长度。
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