CN118984717A - Arnatar化合物和用于增强细胞摄取的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明一般性涉及用于增强细胞摄取的化合物和方法的领域。具体地，本发明涉及N‑乙酰半乳糖胺化合物及其缀合物。还提供了用于制备这些分子的方法及其可能的用途，特别是在医药中的用途。
Description
相关申请的交叉引用
本PCT申请要求于2022年12月19日提交的美国临时申请号63/433,730、于2023年8月17日提交的美国临时申请号63/533,273和于2023年11月22日提交的美国临时申请号63/602,245的优先权，每个所述申请的全部内容通过引用并入本文。
通过引用并入电子提交的材料
本文同时提交的计算机可读核苷酸/氨基酸序列表通过引用以其全文并入本文并标识如下：命名为“GalNac_sequence_listing”的文本文件，创建于2023年12月18日。
本申请全文引用了各种出版物。本说明书中提及的所有出版物、基因转录物标识符、专利和专利申请均通过引用并入本文，其程度与每个单独的出版物、基因转录物标识符、专利或专利申请被具体地且单独地指示通过引用并入本文相同。
技术领域
本发明一般性涉及用于增强细胞摄取的化合物和方法的领域。具体地，本发明涉及N-乙酰半乳糖胺化合物及其缀合物。还提供了制备这些分子的方法及其用途，特别是在医药中的用途。
背景技术
药剂，例如寡聚化合物(例如，寡核苷酸)，需要进入靶细胞才能变得有活性。已经使用多种方式将寡聚化合物运送至靶细胞中，包括病毒递送载体、基于脂质的递送、基于聚合物的递送和基于缀合物的递送(Paunovska et al.,Drug Delivery Systems for RNATherapeutics,2022,Nature Reviews Genetics,23(5):265-280；Chen et al.,2022,Molecular Therapy,Nucleic Acids,29:150-160)。
N-乙酰半乳糖胺(N-acetylgalactosamine，GalNAc)化合物与寡聚化合物的缀合已成为将寡聚化合物递送至细胞(例如肝细胞)的主要递送策略。文献中先前已描述了各种GalNAc化合物缀合物，包括以下内容，所有这些内容均通过引用并入本文：Sharma etal.,2018,Bioconjugate Chem,29:2478-2488；Nair et al.,2014,J.Am.Chem.Soc.136(49):16958-16961；Keam,2022,Drugs,82:1419-1425；美国专利10,087,208；Prakash et al.,2014,Nucleic Acids Res,42(13):8796-807；Debacker et al.,2020,MolecularTherapy,28(8):1759-1771；Huang et al.,2017,Bioconjugate Chem,28:283-295；Nairet al.,2017,Nucleic Acids Res,45(19):10969-10977；US Patent 11,110,174；USPatent 9,796,756；美国专利9,181,549；美国专利10,344,275；美国专利10,570,169；美国专利9,506,030；美国专利7,582,744；US 8,106,022；美国专利11,692,001；WO2022162161；WO 2022162154；WO 2022136466；WO 2021257917；和WO 2021257916。
具有各种类型的GalNAc化合物缀合物的几种寡聚化合物已获得美国食品药品监督管理局(FDA)的批准(Moumnéet al,Oligonucleotide Therapeutics:From Discoveryand Development to Patentability,Pharmaceutics,2022,14(2):260；Friedrich andAigner,Therapeutic siRNA:State-of-the-Art and Future Perspectives,2022,BioDrugs,36(5):549-571；Hu et al.,Therapeutic siRNA:State of the Art,SignalTransduction and Targeted Therapy,2020,5:101)。然而，仍在寻求用于与药剂缀合的改进的GalNAc化合物。
发明内容
本发明一般性涉及用于与药剂缀合的新型GalNAc化合物、GalNAc化合物缀合物及其制备过程和应用。
在一个方面，本发明涉及具有式(0)的结构的化合物：
其中
k是1至5的整数，
m是0至11的整数，
n是0至5的整数，
X是羟基保护基团或H原子，
Y是羟基保护基团、H原子、载荷或固体支持物，其中该载荷或固体支持物任选地通过间隔子连接，并且
R1独立地选自羟基保护基团和H原子。
在一个方面，本发明涉及用于制备具有式(0)的结构的化合物的过程：
其中
k是1至5的整数，
m是0至11的整数，
n是0至5的整数，
X是羟基保护基团或H原子，
Y是羟基保护基团、H原子、载荷或固体支持物，其中该载荷或固体支持物任选地通过间隔子连接，并且
R1独立地选自羟基保护基团和H原子，
该过程包括使具有式(III)的结构的化合物反应的步骤：
其中
k是1至5的整数，优选3，
R2表示氨基保护基团或H原子，
R3表示固体支持物，任选地通过间隔子、羟基保护基团或H原子连接，并且
R6表示羟基保护基团，优选二甲氧基三苯甲基(DMT)或单甲氧基三苯甲基(MMT)，更优选MMT。
在另一个方面，本发明涉及具有式(III)的结构的化合物：
其中
k是1至5的整数，
R2表示氨基保护基团或H原子，
R3表示固体支持物，任选地通过间隔子、羟基保护基团或H原子连接，并且
R6表示羟基保护基团，优选DMT或MMT，更优选MMT。该化合物在本发明的一些实施方案中用于制备式(0)的化合物。
在另一个方面，本发明涉及具有式(0)的结构的化合物用于医药：
其中
k是1至5的整数，
m是0至11的整数，
n是0至5的整数，
X是H原子，
Y是任选地通过间隔子连接的载荷，并且
R1是H原子。
在一个相关方面，本发明涉及该化合物用于用载荷治疗受试者的方法，该受试者包含表达去唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)的细胞。
在一个方面，本发明涉及用于将载荷运输至表达去唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)的细胞中的方法，其包括施用具有式(0)的结构的化合物的步骤：
其中
k是1至5的整数，
m是0至11的整数，
n是0至5的整数，
X是H原子，
Y是任选地通过间隔子连接的载荷，并且
R1是H原子，
其中以足以用该载荷治疗受试者的量将该载荷输送至受试者体内表达去唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)的细胞中。
在另一个方面，本发明涉及药物组合物，其包含具有式(0)的结构的化合物：
其中
k是1至5的整数，
m是0至11的整数，
n是0至5的整数，优选3，
X是H原子，
Y是任选地通过间隔子连接的载荷，并且
R1是H原子，
以及药学上可接受的载体、辅料和/或稀释剂。
此外，还涉及包含本发明的化合物的试剂盒和药物组合物，包括制备和使用方法。
附图说明
图1：显示了人原代肝细胞(hPH)自由摄取不同剂量(μM)的GalNAc缀合的siRNA后51小时的LMNAmRNA水平。
图2：显示了人原代肝细胞(hPH)自由摄取GalNAc缀合的siRNA(5μM)后随时间的LMNAmRNA水平。
图3：显示了小鼠肝细胞(mPH)自由摄取不同剂量(μM)的GalNAc缀合的siRNA后60小时的LMNAmRNA水平。
图4：显示了人原代肝细胞(HPH)自由摄取不同剂量(μM)的GalNAc缀合的siRNA后4天的PCSK9 mRNA水平。
具体实施方式
应当理解，前述一般描述和以下详细描述仅是示例性和解释性的，并不限制所要求保护的本发明。本文中，除非另有明确说明，否则单数的使用包括复数。如本文所用，除非另有说明，否则“或”的使用意指“和/或”。此外，术语“包括(including)”以及其他形式(例如“包括(includes)”和“包括(included)”)的使用不具有限制性。此外，除非另有明确说明，否则术语(例如“元件(element)”或“部件(component)”)既涵盖包含一个单元的多个元件(elements)和部件(components)，也涵盖包含多于一个亚单元的多个元件(elements)和部件(components)。
本文中使用的章节标题仅用于组织目的，不应被视为限制所描述的主题。本申请中引用的所有文件或文件的部分，包括但不限于专利、专利申请、文章、书籍和论文，特此通过引用以本文中讨论的文件的部分及其全文明确并入。
定义
除非提供具体定义，否则与本文描述的分析化学、合成有机化学以及医学和药物化学相关使用的术语以及程序和技术是本领域熟知的且常用的。标准技术可以用于化学合成和化学分析。在允许的情况下，所有专利、申请、已公开的申请和其他出版物、GENBANK登录号和可通过数据库(例如国家生物技术信息中心(NCBI))获得的相关序列信息以及本文公开内容的全文中提及的其他数据均通过引用以本文中讨论的文件的部分及其全文并入。
除非另有说明，否则以下术语具有以下含义：
“2’-O-甲氧基乙基”(也称2’-MOE和2’-O(CH2)2-OCH3)是指呋喃糖环2’位置处的O-甲氧基乙基修饰。2’-O-甲氧基乙基修饰的糖是经修饰的糖。
“2’-MOE核苷”(也称为2’-O-甲氧基乙基核苷)意指包含2’-MOE修饰的糖部分的核苷。“2’-MOE核苷酸”(也称为2’-O-甲氧基乙基核苷酸)意指包含2’-MOE修饰的糖部分的核苷酸。
“2’-O-甲基”(也称2’-OCH3和2’-OMe)是指呋喃糖环2’位置处的O-甲基修饰。2’-O-甲基修饰的糖是经修饰的糖。
“2’-OMe核苷”(也称为2’-O-甲基核苷)意指包含2’-OMe修饰的糖部分的核苷。“2’-OMe核苷酸”(也称为2’-O-甲基核苷酸)意指包含2’-OMe修饰的糖部分的核苷酸。
“2’-取代的核苷”意指在呋喃糖环的2’-位置处包含除了H或OH以外的取代基的核苷。在某些实施方案中，2’取代的核苷包括具有氟(2’-F)、O-甲基(2’-OMe)、O-甲氧基乙基(2’-MOE)或双环糖修饰的核苷。
“5-甲基胞嘧啶”意指用附接至5位置的甲基基团修饰的胞嘧啶。5-甲基胞嘧啶是修饰的核碱基。
“约”意指在数值的±7％以内。例如，如果表述为“化合物对mRNA的抑制作用为至少约70％”，则暗示mRNA水平被抑制的范围在63％至77％内。
“动物”是指人或非人动物，包括但不限于小鼠、大鼠、兔、犬、猫、猪和非人灵长类动物，包括但不限于猴和黑猩猩。
“抗体”是指特征在于以某种方式与抗原特异性反应的分子，其中抗体和抗原根据彼此进行定义。抗体可以是指完整的抗体分子或其任何抗原结合片段或区域。此类抗原结合片段或区域的实例包括抗体的重链、轻链、Fab区和Fc区。
“反义寡核苷酸”或“ASO”意指具有允许与靶核酸的相应区域或区段杂交的核碱基序列的单链寡核苷酸。在某些实施方案中，反义寡核苷酸包含一个或更多个核糖核苷(RNA核苷)和/或脱氧核糖核苷(DNA核苷)。反义寡核苷酸可以经修饰；此类修饰的实例包括5-甲基胞嘧啶和2’-MOE。
“碱基互补性”是指寡核苷酸的核碱基与靶核酸中相应核碱基的碱基配对(即杂交)的能力，并且由相应核碱基之间的Watson-Crick、Hoogsteen或反Hoogsteen氢键介导。碱基互补性还指经典碱基配对(例如，A:U、A:T或C:G)或非经典碱基配对(例如，A:G、A:U、G:U、I:U、I:A或I:C)。
“双环糖”意指由两个非偕碳原子桥接修饰的呋喃糖环。双环糖是经修饰的糖。
“帽结构”或“末端帽部分”意指已在寡聚化合物的任一末端被掺入的化学修饰。
“化学修饰”意指对天然存在的分子的结构或元素进行修饰。例如，siRNA化合物由连接的核糖核苷(有时在本文中也称为RNA)组成，因此，用脱氧核糖核苷(有时在本文中也称为DNA)取代核糖核苷被认为是siRNA化合物的化学修饰。
“化学上不同的区域”是指寡聚化合物的区域，该区域在某种程度上与同一寡聚化合物的另一个区域在化学上不同。例如，具有2’-OMe核苷酸的区域与具有没有2’-OMe修饰的核苷酸的区域在化学上不同。
“嵌合寡聚化合物”意指具有至少2个化学上不同的区域的寡聚化合物，每个位置具有多个亚基。例如，如本文所公开的，siRNA可以包含外围区域和中心区域。外周区域包含具有各种修饰的或未修饰的核碱基的基序，以赋予增加的稳定性、特异性、安全性和效力，而中心区域包含各种修饰的或未修饰的核碱基以用作RISC介导的降解的底物。
“互补性”意指第一核酸与第二核酸的核碱基之间配对的能力。
“依从”意指个体遵守建议的疗法。
“包含(comprise)”、“包含(comprises)”和“包含(comprising)”应理解为暗示包括所述步骤或要素或者步骤或要素的组，但不排除任何其他步骤或要素或者步骤或要素的组。
“连续核碱基”意指彼此紧邻的核碱基。
“脱氧核糖核苷”意指在核苷的糖部分的2’位置处具有氢的核苷。脱氧核糖核苷有时在本文中称为DNA核苷、“D”或“d”。脱氧核糖核苷可以用各种取代基中的任何一种进行修饰，并且可以通过除了天然存在的磷酸二酯(例如硫代磷酸酯)以外的共价键连接。
“脱氧核糖核苷酸”意指在核苷酸的糖部分的2’位置处具有氢的核苷酸。脱氧核糖核苷酸有时在本文中称为DNA核苷酸、“D”或“d”。脱氧核糖核苷酸可以用各种取代基中的任何一种进行修饰，并且可以通过除了天然存在的磷酸二酯(例如硫代磷酸酯)之外的共价键连接。
“设计(designing)”或“设计(design)”是指设计与靶核酸分子特异性杂交的寡聚化合物的过程。
“功效”意指产生期望效果的能力。
“表达”包括基因编码信息转化为细胞内存在并发挥作用的结构的所有功能。此类结构包括但不限于转录和翻译的产物。
“完全互补”或“100％互补”意指第一核酸的每个核碱基在第二核酸中具有互补核碱基。在某些实施方案中，第一核酸是寡聚化合物，并且靶核酸是第二核酸。
“完全修饰的基序”是指包含连续核苷序列的寡聚化合物，其中基本上每个核苷均具有化学修饰。
“GalNAc”意指“N-乙酰半乳糖胺”。因此，“GalNAc化合物”意指包含一个或更多个N-乙酰半乳糖胺单元的化合物。
“杂交”意指互补核酸分子的退火。在某些实施方案中，互补核酸分子包括但不限于寡聚化合物和核酸靶标。在某些实施方案中，互补核酸分子包括但不限于siRNA和核酸靶标。
“紧邻”意指紧邻的元素之间没有中间元素。
“个体”意指选择进行治疗或疗法的人或非人动物。
“诱导”、“抑制”、“增强”、“提升”、“增加”、“减少”等通常表示两种状态之间的量变差异。
“抑制表达或活性”是指减少、阻断表达或活性，并且不一定表示完全消除表达或活性。
“核苷间键”是指核苷之间的化学键。
“连接的核苷”意指通过核苷间键连接在一起的相邻核苷(例如，A、G、C、T或U)。连接的核苷的实例包括脱氧核糖核苷(有时在本文中称为DNA核苷)或核糖核苷(有时在本文中称为RNA核苷)。
“错配”或“非互补核碱基”是指第一核酸的核碱基不能通过Watson-Crick碱基配对(例如，A:T、A:U或C:G)与第二核酸或靶核酸的相应核碱基配对的情况。
“修饰的核苷间键”是指天然存在的核苷间键(即磷酸二酯核苷间键)的取代或任何改变。
“修饰的碱基”意指除了腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸苷或尿嘧啶以外的任何碱基。“未修饰的碱基”意指嘌呤碱基腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G)，以及嘧啶碱基胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)。
“修饰的核苷”意指独立地具有修饰的糖部分和/或修饰的核碱基的核苷。如本文所用，在寡聚化合物基于RNA的情况下，用脱氧核糖核苷(有时在本文中称为DNA核苷)取代核糖核苷被认为是寡聚化合物的修饰。此外，在寡聚化合物基于DNA的情况下，用核糖核苷(有时在本文中称为RNA核苷)取代脱氧核糖核苷被认为是寡聚化合物的修饰。
“修饰的核苷酸”意指独立地具有修饰的糖部分、修饰的核苷间键、用于核糖核苷(有时在本文中称为RNA核苷)取代的脱氧核糖核苷(有时在本文中称为DNA核苷)、用于脱氧核糖核苷(有时在本文中称为DNA核苷)取代的核糖核苷(有时在本文中称为RNA核苷)和/或修饰的核碱基的核苷酸。
“修饰的寡核苷酸”意指包含至少一个修饰的核苷间键、修饰的糖、用于核糖核苷(有时在本文中称为RNA核苷)取代的脱氧核糖核苷(有时在本文中称为DNA核苷)、用于脱氧核糖核苷(有时在本文中称为DNA核苷)取代的核糖核苷(有时在本文中称为RNA核苷)和/或修饰的核碱基的寡核苷酸。
“修饰的糖”意指天然糖部分的取代和/或任何改变。
“部分”意指某物被分成的部分之一，即某物的一部分或组分。例如，核苷酸的糖部分是核苷酸的糖组分。
“单体”是指寡聚体的单个单元。单体包括但不限于核苷和核苷酸，无论是天然存在的还是修饰的。
“基序”意指寡聚化合物中的修饰模式。例如，如本文所公开，ARNATAR设计了包含具有各种修饰的核碱基和核苷间键的基序的寡聚化合物，以改善化合物的递送、稳定性、特异性、安全性和效力。
“天然糖部分”意指在DNA(2’-H)或RNA(2’-OH)中发现的糖部分。
“天然存在的核苷间键”意指3’至5’磷酸二酯键。
“非互补核碱基”是指彼此不形成氢键或以其他方式支持杂交的一对核碱基。
“核酸”是指由单体核苷酸组成的分子。核酸包括但不限于核糖核酸(RNA)、信使RNA(mRNA)、脱氧核糖核酸(DNA)、单链核酸、双链核酸、小干扰核糖核酸(siRNA)和微小RNA(miRNA)。
“核碱基”意指能够与另一个核酸的碱基配对的杂环部分。
“核碱基互补性”是指能够与另一个核碱基配对(也称为互补)的核碱基。如果寡聚化合物的某位置处的核碱基能够与靶核酸的某位置处的核碱基形成氢键，则认为该寡聚化合物与靶核酸在该核碱基对处形成氢键的位置是互补的。例如，在DNA中，腺嘌呤(A)与胸腺嘧啶(T)互补；在RNA中，腺嘌呤(A)与尿嘧啶(U)互补；并且在DNA和RNA中，鸟嘌呤(G)与胞嘧啶(C)互补。碱基对或互补核碱基通常是经典Watson-Crick碱基对(C:G、A:U或A:T)，但还包括非经典碱基对，例如Hoogsteen碱基对(例如，A:G或A:U)、Wobble碱基对(例如，G:U、I:U、I:A或I:C，其中I是次黄嘌呤)等。核碱基互补性有利于本文所述的寡聚化合物与其靶核酸的杂交。
“核碱基序列”意指不依赖于任何糖、键和/或核碱基修饰的连续核碱基的顺序。
“核苷”意指与糖连接的核碱基。
“核苷模拟物”包括用于替换寡聚化合物的一个或更多个位置处的糖或糖和碱基而不一定是键的那些结构，例如具有吗啉基、环己烯基、环己基、四氢吡喃基、双环或三环糖模拟物的核苷模拟物，例如非呋喃糖糖单元。核苷酸模拟物包括用于替换寡聚化合物(例如肽核酸或吗啉代化合物(-N(H)-C(＝O)-O-或其他非磷酸二酯键连接的吗啉代化合物))的一个或更多个位置处的核苷和键的结构。糖替代物与范围稍广的核苷模拟物重叠，但其仅旨在指示糖单元(呋喃糖环)的替换。本文提供的四氢吡喃环示出了糖替代物的实例，其中呋喃糖基团已被四氢吡喃环体系替换。“模拟物”是指取代糖、核碱基和/或核苷间键的基团。通常，使用模拟物代替糖或糖-核苷间键组合，并保留核碱基以与选定的靶标杂交。
“核苷酸”意指具有与核苷的糖部分共价连接的连接基团(例如，磷酸酯(p)或硫代磷酸酯(PS)基团)的核苷。核苷酸包括核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸。核糖核苷酸是形成RNA的连接的核苷酸单元。脱氧核糖核苷酸是形成DNA的连接的核苷酸单元。
“脱靶效应”是指与调节除了预期靶核酸之外的基因的RNA或蛋白表达有关的非期望的或有害的生物学效应。
“寡聚活性”意指寡聚化合物与其靶核酸杂交产生的任何可检测的或可测量的活性。在某些实施方案中，寡聚活性是靶核酸或由该靶核酸编码的蛋白的量或表达的减少。寡聚活性可以通过寡聚化合物(例如siRNA)进行调节。
“寡聚化合物”意指能够通过氢键合与靶核酸的至少一个区域杂交的连接的单体亚基序列。单体亚基可以是修饰的或未修饰的核苷酸或核苷。寡聚化合物作为RISC的模板，识别互补的信使RNA(mRNA)转录物，以靶向特定mRNA转录物进行切割。靶mRNA的切割阻断靶mRNA的翻译并使靶基因沉默。寡聚化合物的实例包括单链和双链化合物，例如反义寡核苷酸、ssRNA、siRNA、shRNA和miRNA。
“寡聚抑制”意指与不存在寡聚化合物的情况下的靶核酸水平相比，在存在与靶核酸互补的寡聚化合物的情况下靶核酸水平降低。
“寡聚机制”包括RISC或RNase H相关机制，涉及寡聚化合物与靶核酸的杂交，其中杂交的结局或效应是靶标降解和基因表达的抑制。
如本文所用，“寡核苷酸”意指一系列相互连接的核苷，其各自可以彼此独立地进行修饰或未进行修饰。寡核苷酸可以具有除了磷酸酯基团之外的连接基团(例如，硫代磷酸酯＝硫代磷酸基团)，用作核苷之间的连接部分。在某些实施方案中，寡核苷酸包含一个或更多个核糖核苷(RNA核苷)和/或脱氧核糖核苷(DNA核苷)。
如本文所用，“载荷”意指通过溶媒运输至细胞中的任何物质，本发明的溶媒是GalNAc化合物。在本发明的意义上，“载荷”包含药剂，即在细胞中提供生物效应的试剂，例如导致疾病或病症的治疗性治疗，或疾病或病症的诊断。下文进一步描述了载荷的优选代表。
如本文所用，“肽”是包含通常通过肽键连接成链的至少两种氨基酸的化合物。肽可以包含修饰的氨基酸。
如本文所用，“药剂”是具有药物活性的任何化合物，即用于治疗和/或诊断方法的化合物。
“硫代磷酸酯键”或“PS”是指核苷之间的键，其中磷酸二酯键通过用硫原子替换非桥接氧原子中的一个而被修饰。硫代磷酸酯键是修饰的核苷间键。
“部分(portion)”意指核酸中确定数量的连续的(即连接的)核碱基。在某些实施方案中，部分是靶核酸中确定数量的连续的核碱基。在某些实施方案中，部分是寡聚化合物中确定数量的连续的核碱基。
“区域”被定义为靶核酸中具有至少一个可识别的结构、功能或特征的部分。
“RNA”或“核糖核酸”由通过磷酸二酯键连接的核糖核苷酸(ribose nucleotide)或核糖核苷酸(ribonucleotide，附接至核糖的含氮碱基)组成，形成不同长度的链。RNA中的含氮碱基是腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和尿嘧啶。
“核糖核苷酸”意指在核苷酸糖部分的2’位置处具有羟基的核苷酸。核糖核苷酸可以用各种取代基进行修饰，并且可以通过除了天然存在的磷酸二酯(例如硫代磷酸酯)之外的共价键连接。核糖核苷酸有时在本文中称为RNA。
“区段”被定义为靶核酸内的较小区域或子部分。
如本文所用，“位点”被定义为靶核酸内独特的核碱基位置。
“特异性杂交”是指寡聚化合物(例如，siRNA)与靶核酸之间具有足够的互补度以诱导期望的效果，而在期望特异性结合的条件下(即在体内测定和治疗性治疗的情况下的生理状况下)对非靶核酸表现出极小影响或没有影响的寡聚化合物。
“严格杂交条件”或“严格条件”是指寡聚化合物将与其靶序列杂交，但与极少数量的其他序列杂交的条件。
“受试者”意指选择进行治疗、诊断或疗法的人或非人动物。
“靶标”是指期望调节的蛋白或核酸序列(例如，mRNA)。
“靶基因”是指编码靶标的基因。
“靶向”意指设计和选择将与靶核酸特异性杂交并诱导期望效应的寡聚化合物的过程。
“靶核酸”、“靶RNA”、“靶RNA转录物”和“核酸靶标”均意指能够被寡聚化合物靶向的核酸。
“靶区域”意指一种或更多种寡聚化合物所靶向的靶核酸的一部分。
“靶区段”意指寡聚化合物所靶向的靶核酸的核苷酸序列。“5’靶位点”是指靶区段的最5’端的核苷酸。“3’靶位点”是指靶区段的最3’端的核苷酸。在实施方案中，靶区段是寡聚化合物所靶向的靶区域的至少12个核碱基部分(即至少12个连续的核碱基)。
“疗效”是指治疗化合物(例如寡聚化合物)的有效性。疗效可以通过改善治疗化合物的递送、稳定性、特异性、安全性和效力来提高。
“未修饰”的RNA核碱基意指嘌呤碱基腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G)，以及嘧啶碱基胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)。“未修饰”的DNA核碱基意指嘌呤碱基腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G)，以及嘧啶碱基胸腺嘧啶(T)和胞嘧啶(C)。在某些实施方案中，当DNA核碱基取代RNA核碱基时，未修饰的RNA核碱基被视为经修饰。在某些实施方案中，当RNA核碱基取代DNA核碱基时，未修饰的DNA核碱基被视为经修饰。
“未修饰的核苷酸”意指由天然存在的核碱基、糖部分和核苷间键组成的核苷酸。在某些实施方案中，未修饰的核苷酸是RNA核苷酸或DNA核苷酸。
本发明的主题
本发明提供了新型含N-乙酰半乳糖胺的化合物(即GalNAc化合物)，用于增强细胞摄取。有意思且完全出乎意料的是，已发现当与载荷(例如寡核苷酸)缀合时，新型GalNAc化合物与结构非常接近的现有技术GalNAc化合物相比，在细胞中具有增强的活性。
本发明还提供了用于制备新型GalNAc化合物的新方法以及非常适合于新方法的中间体化合物。此外，本发明还提供了新型GalNAc化合物的可能用途和方法，特别是在医药中的用途。
GalNAc化合物
在一个方面，本发明涉及具有式(0)的结构的化合物：
其中
k是1至5的整数，优选2或3，更优选3，
m是0至11的整数，优选7至9，更优选7，和
n是0至5的整数，优选2或3，更优选3，
X是羟基保护基团或H原子，
Y是羟基保护基团、H原子、载荷或固体支持物，其中该载荷或固体支持物任选地通过间隔子连接，并且
R1独立地选自羟基保护基团和H原子。
化合物(0)包含三聚单元，该三聚单元包含N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)单元。在本发明的化合物中，环状糖部分基于D-半乳糖，即(2R,3S,4S,5R)-2,3,4,5,6-五羟基己醛。根据残基X、Y和R1的选择，化合物(0)可以是具有载荷的GalNAc化合物缀合物(例如化合物(I))或用于合成GalNAc化合物缀合物的中间体GalNAc化合物(例如化合物(II))。如本文所用，用语“GalNAc化合物”涵盖具有载荷的GalNAc化合物缀合物和中间体GalNAc化合物。
GalNAc单元通过包含三个可变部分的接头连接，这些可变部分可以包含不同数量的-CH2-基团或-OCH2-基团的重复，分别用整数k、m或n表示。特此，k是1至5的整数，优选2或3，更优选3；m是0至11的整数，优选7至9，更优选7；并且n是0至5的整数，优选2或3，更优选3。在一个实施方案中，k与m之和是8至12的整数，优选10。已发现这种长度的接头在GalNAc化合物中特别有用。在一个优选的实施方案中，k是3，m是7和n是3，并且化合物具有式(0a)的结构：
在化合物(0)和/或化合物(0a)中，残基X、Y和R1可以表示羟基保护基团或H(氢)原子。残基可以独立地选自所有可能的羟基保护基团和H原子。优选的羟基保护基团包含乙酰基、苯甲酰基、苯氧基乙酰基、新戊酰基、单甲氧基三苯甲基(MMT)、二甲氧基三苯甲基(DMT)、异丁酰基、叔丁基二甲基硅基、叔丁基二苯基硅基、三异丙基硅基和异丙基二甲基硅基。优选的羟基保护基团是残基R1的乙酰基和/或残基X的单甲氧基三苯甲基(MMT)或二甲氧基三苯甲基(DMT)。已发现这些基团在本发明的GalNAc化合物的合成以及载荷与中间体GalNAc化合物的偶联中特别有用。特别地，MMT将用于寡核苷酸合成。由于-CH2OX和-CH2OY基团的对称性，因此无论制备过程如何，分子式中均包括这些基团。然而，应当理解，如果固体支持物作为Y残基存在，则寡核苷酸将附接至其他残基，即X残基。
残基X和R1中的每一个均可以表示H原子。在具有载荷的GalNAc化合物缀合物的一个实施方案中，优选X和R1残基各自是H原子。
残基Y还可以是载荷或固体支持物，任选地通过间隔子连接。
在一个实施方案中，残基Y是载荷。在该实施方案中，GalNAc化合物可以是用于引入细胞或用于治疗用途的最终缀合物。如上定义，载荷是通过溶媒运输至细胞中的任何物质，本发明的溶媒是GalNAc化合物。在本发明的意义上，载荷包含药剂，即在细胞中提供生物效应的试剂，例如导致疾病或病症的治疗性治疗，或疾病或病症的诊断。本发明中优选的载荷包含寡聚化合物，包括任何寡核苷酸(即修饰的或未修饰的)、肽、抗体、抗体片段或具有药物活性的化合物。应当理解，这些化合物中的每一种均可以直接或通过适合于各自化合物缀合的间隔子与(中间体)GalNAc化合物缀合。因此，即使没有明确指出，本发明含义内的载荷还可以包括间隔子。
在一些实施方案中，载荷包含寡聚化合物，优选寡核苷酸。寡聚化合物包括但不限于单链寡聚化合物，例如微小RNA(miRNA)、单链RNA(ssRNA)和反义寡核苷酸(ASO)；以及双链寡聚化合物，例如短发夹RNA(shRNA)和小干扰RNA (siRNA)。寡聚化合物可以是“反义的”或包含针对靶核酸的“反义链”，这意味着能够通过氢键合与靶核酸杂交。
在某些实施方案中，寡聚化合物具有核碱基序列，当以5’至3’方向书写时，该序列包含其所靶向的靶核酸的靶区段的反向互补物。例如，在某些此类实施方案中，siRNA包含反义链，该反义链具有核碱基序列，当以5’至3’方向书写时，该序列包含其所靶向的靶核酸的靶区段的反向互补序列。
在某些实施方案中，寡聚化合物的长度为12-30个亚基(例如，核苷酸或核苷)。在某些实施方案中，寡聚化合物的长度为18至30个亚基。在某些实施方案中，寡聚化合物的长度为12至22个亚基。在一些实施方案中，寡聚化合物是siRNA。
可能增加或减少寡聚化合物(例如siRNA)的长度，和/或引入碱基错配而不消除活性(美国专利7,772,203，通过引用并入本文)。例如，可能在不消除活性的情况下将非经典碱基配对(例如，A:G、A:C、G:U、I:U、I:A或I:C)引入寡聚化合物中。在某些实施方案中，设计具有一个或更多个非经典碱基配对(即错配)的寡聚化合物增强寡聚化合物的活性。
寡聚化合物可以包含与靶标的错配、双链体内寡聚链之间的错配或二者的组合。错配可以发生在整个siRNA中，例如在突出端区域或双链体区域。
在若干实施方案中，寡聚化合物是单链的(例如，单链寡核苷酸、单链RNA(ssRNA))或双链的(例如，shRNA和siRNA)，并经修饰。单链寡聚化合物包含正义链或反义链。双链寡聚化合物包含正义链和反义链。反义链可以与靶核酸完全或部分互补。
寡聚化合物，优选寡核苷酸，通常可以是修饰的和/或未修饰的化合物。核苷是碱基-糖组合。核苷的核碱基(也称为碱基)部分通常是杂环碱基部分。核苷酸是进一步包括与核苷的糖部分共价键(例如，磷酸酯基团或如下所述的化学修饰键)的核苷。寡核苷酸通过相邻核苷酸彼此共价连接而形成，以形成线性聚合寡核苷酸。在寡核苷酸结构中，键基团通常被称为形成寡核苷酸的核苷间键。寡聚化合物由一个(例如，ssRNA、反义寡核苷酸或miRNA)或多个寡核苷酸(例如，siRNA或shRNA)组成。
对寡聚化合物的修饰涵盖核碱基、核苷间键或糖部分的取代或改变。修饰的寡聚化合物通常比天然的或未修饰的形式更优选，因为修饰的寡聚化合物具有期望的特性，例如，增强的递送(例如，增加的细胞摄取)、增强的对核酸靶标的特异性或亲和力、在核酸酶存在下增加的稳定性、增强的安全性(例如，将化合物施用于受试者后副作用更少)或增强的效力(例如，抑制活性)。
修饰的寡聚化合物，优选修饰的寡核苷酸，优选包括修饰的核碱基或核苷间键。在一些实施方案中，寡聚化合物，优选寡核苷酸，经修饰以抵抗降解、降低毒性和/或增强活性。
在某些实施方案中，本文公开的寡聚化合物具有排列成基序的化学修饰的亚基，以赋予寡聚化合物有益特性，包括但不限于：增强的抑制活性以提高效力；增加的结合亲和力以增加对靶核酸的特异性，从而限制脱靶效应并提高安全性；或增强对体内核酸酶降解的抗性，从而提高稳定性和持久性。在某些实施方案中，寡聚化合物是嵌合体，其中寡聚化合物的外周核碱基包含具有各种修饰的或未修饰的核碱基的基序，从而赋予增加的稳定性、特异性、安全性和效力，而化合物的中心区域包含各种修饰的或未修饰的核碱基以用作RISC介导的降解的底物。每个不同区域可以包含均匀的糖部分、修饰的或交替的糖部分。每个区域可以包含不同模式的磷酸酯和硫代磷酸酯键。
在某些实施方案中，正义链包含2个核苷之间的一个或更多个硫代磷酸酯核苷酸间(PS)键。在进一步的实施方案中，正义链包含与脱氧核糖核苷(D)或核糖核苷(R)相邻的硫代磷酸酯核苷酸间(PS)键。PS键可以与5’侧、3’侧或两侧的脱氧核糖核苷(D)或核糖核苷(R)相邻。PS键还可以与链的5’端的2个核苷相邻和/或与链的3’端的2个核苷相邻。在一个实施方案中，寡聚化合物是ssRNA或siRNA。
寡聚化合物(优选寡核苷酸)可以通过链的3’或5’端附接至GalNAc化合物。在一些实施方案中，寡聚化合物(优选寡核苷酸)通过正义链的3’端附接至GalNAc化合物。在一些实施方案中，寡聚化合物(优选寡核苷酸)通过正义链的5’端附接至GalNAc化合物。
在几个实施方案中，寡聚化合物是修饰的和/或未修饰的寡核苷酸。在一些实施方案中，寡核苷酸是修饰的寡核苷酸，其经修饰以抵抗降解、降低毒性和/或增强活性。优选地，修饰的和/或未修饰的寡核苷酸与靶核苷酸序列结合并修饰由靶核苷酸序列编码的基因的表达。在一些实施方案中，修饰的和/或未修饰的寡核苷酸抑制由靶核苷酸序列编码的基因的表达，优选地通过抑制靶核苷酸序列的转录或翻译来抑制。在一些实施方案中，修饰的和/或未修饰的寡核苷酸的靶核苷酸序列与肝脏病症(优选代谢性肝脏病症)相关，例如，修饰的和/或未修饰的寡核苷酸的靶核苷酸序列编码与在肝脏中表达的疾病相关的基因，或与肝脏病症(优选代谢性肝脏病症)相关的基因。
在某些实施方案中，本文所述的寡聚化合物(优选寡核苷酸)抑制靶核酸的表达至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％。
若干实施方案涉及通过寡聚化合物抑制来调节基因表达。在若干实施方案中，靶核苷酸序列是信使RNA(mRNA)。
在某些实施方案中，旨在抑制细胞中的层粘连蛋白(LMNA)基因表达，并且包括向细胞施用靶向LMNA的mRNA转录物的寡聚化合物。
在某些实施方案中，旨在抑制细胞中的载脂蛋白C3(ApoC3)基因表达，并且包括向细胞施用靶向ApoC3 mRNA转录物的寡聚化合物。
在某些实施方案中，旨在抑制细胞中的核仁素(NCL)基因表达，并且包括向细胞施用靶向NCL的mRNA转录物的寡聚化合物。
在一些实施方案中，杂交发生在寡聚化合物与mRNA之间。最常见的杂交机制涉及核酸分子互补核碱基之间的氢键合(例如，Watson-Crick、Hoogsteen或反Hoogsteen氢键合)。
根据本发明的GalNAc-载荷缀合物可以专门设计用于与去唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)结合。因此，根据一些实施方案，根据本发明的GalNAc-载荷缀合物对ASGPR具有强亲和力。就本发明而言，“强亲和力”意指以IC50值低于50nM、优选25nM或更低、更优选10nM或更低、更优选5nM或更低为特征的亲和力。IC50是抑制标记配体与ASGPR结合50％的GalNAc-载荷缀合物的浓度。IC50可以通过Rensen et al.2001Journal of Biological ChemistryVol 276pp 37577中描述的方法测定。简言之，在存在不断增加的量的待研究GalNAc-载荷缀合物的情况下，将肝细胞(原代或培养)与配体125I标记的唾液酸化血清类粘蛋白(ASOR)以某一浓度(例如，5nM)在4℃下温育2h。以不断增加的浓度，浓度可以从0.2nM至200nM。在存在待研究的GalNAc-载荷缀合物的情况下，跟踪标记ASOR的结合。在存在100mM GalNAc的情况下，可以确定非特异性结合。可以使用单位点结合模型分析置换结合数据，并计算IC50。
去唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)通常在肝细胞上表达，因此，根据本发明的GalNAc-载荷缀合物特别适合运输至肝细胞。因此，可以通过选择相应的载荷来特别设计GalNAc-载荷缀合物，以用于预防、治疗或诊断肝脏疾病或病症或通过肝脏引发的代谢。具体地，载荷可以被设计用于治疗疾病，例如肝炎(包括病毒性肝炎，例如HBV或HCV)、肝脂肪变性(包括代谢功能障碍)、动脉粥样硬化、高脂血症、高胆固醇血症、家族性高胆固醇血症(例如，载脂蛋白B的功能获得突变)、HDL/LDL胆固醇失衡、血脂异常(例如，家族性高脂血症(例如，家族性混合性高脂血症(FCH)、家族性高胆固醇血症(FH))、获得性高脂血症、他汀类药物耐药性高胆固醇血症、冠状动脉疾病(CAD)和冠心病(CHD)、急性冠状动脉综合征(ACS)、肝纤维化(或与肝纤维化相关的疾病)、肝硬化和癌症。因此，在一些实施方案中，GalNAc-载荷缀合物被设计用于治疗肝脏病症(优选代谢性肝脏病症)和/或用于在治疗肝脏病症(优选代谢性肝脏病症)中使用。
去唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)还在睾丸细胞上表达。因此，在一些实施方案中，GalNAc-有效负载缀合物被设计用于治疗睾丸病症和/或用于在治疗睾丸病症中使用。
唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)还在除了肝脏和睾丸以外的细胞上表达。在一些实施方案中，GalNAc-载荷缀合物被设计用于将GalNAc-载荷缀合物递送至表达ASGPR的细胞中。
在具有载荷的GalNAc化合物缀合物的优选实施方案中，GalNAc化合物具有式(I)的结构：
其中Oligo表示修饰的和/或未修饰的寡核苷酸，如上所述。
在具有载荷的GalNAc化合物缀合物的甚至更优选的实施方案中，GalNAc化合物具有式(Ia)的结构：
具有式(I)或式(Ia)的结构的具有载荷的GalNAc化合物缀合物的实施方案可以用上述任何特征和任何实施方案进行制备。
除了寡聚化合物外，载荷还可以包含肽、抗体、抗体片段或具有药物活性的化合物。由于本文对载荷的一般定义，任何分子将具有药物活性。本领域已知几种基于肽、抗体或抗体片段或其他化合物的药物。通常，可能使用本发明的GalNAc化合物与这些分子缀合，用于运输至细胞中，其中这些分子可以显示出它们的药物活性。
在一个实施方案中，载荷包含肽。优选地，肽包含至少2个氨基酸(例如至少3个或至少4个氨基酸或更多个氨基酸)的序列。氨基酸可以是天然氨基酸和修饰的氨基酸。修饰的氨基酸是本领域已知的。在优选的实施方案中，肽是特定蛋白的氨基酸序列。如本文所用，肽可以涵盖特定蛋白的一部分或特定蛋白的整个氨基酸序列，其中氨基酸可以是修饰的和/或未修饰的。治疗性肽是本领域已知的，并且，例如，在Wang et al.,Therapeuticpeptides:current applications and future directions.Sig Transduct Target Ther7,48(2022)中描述，其通过引用并入本文。用于治疗肝脏疾病的治疗性肽的实例是PGPIPN和FFW，如Qi et al.,Therapeutic hexapeptide(PGPIPN)prevents and cures alcoholicfatty liver disease by affecting the expressions of genes related with lipidmetabolism and oxidative stress.Oncotarget.2017Sep 30；8(50):88079-88093；或National University of Singapore.“Scientists develop novel drug that couldpotentially treat liver cancer more effectively:Peptide drug FFW showspromise in reducing tumour growth and slowing down spread of cancer cells.”ScienceDaily,2August 2018.www.sciencedaily.com/releases/2018/08/180802102347.htm中所公开。具有用于治疗肝纤维化潜力的肽化合物公开于Xun et al.,Peptide mediated therapy in fibrosis:Mechanisms,advances and prospects,Biomedicine&Pharmacotherapy,Volume157,2023,113978。
在一个实施方案中，载荷包含抗体或抗体片段。抗体片段优选是可以从抗体的可变区(例如IgG和/或IgM)生成的F(ab’)2、Fab、Fab’和Fv片段，并且是抗原结合片段。
在一个实施方案中，载荷包含具有药物活性的化学化合物。优选地，该化学化合物不同于被描述为载荷的其他分子，因为它是非肽化合物、非寡核苷酸化合物并且不含有任何抗体或抗体片段。通常，化学化合物是具有生物活性的有机分子，例如用作药物的所谓“小分子”。用于治疗肝脏疾病的合适化合物，例如，描述于Muriel P,Rivera-EspinozaY.Beneficial drugs for liver diseases.J Appl Toxicol.2008Mar；28(2):93-103.doi:10.1002/jat.1310.PMID:17966118。合适的实例是秋水仙碱、皮质类固醇、姜黄素、甘草酸、干扰素、白藜芦醇、磺基腺苷甲硫氨酸和沙利度胺。
在式(0)的化合物的一个实施方案中，残基Y是固体支持物，任选地包含间隔子。在该实施方案中，相应的GalNAc化合物可以用于合成GalNAc化合物缀合物。原则上，可以使用本领域已知的用于附接化合物，特别是附接和固相合成核苷酸序列的任何固体支持物。在某些实施方案中，固体支持物是CPG固体支持物，例如LCAA(对数链烷基胺)间隔子CPG支持物。在某些实施方案中，固体支持物是本领域已知的用于固相合成的聚合物支持物，例如，聚苯乙烯固体支持物，例如氨甲基聚苯乙烯支持物。固相支持物上的合成是本领域熟知的，并且，例如，描述于Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry(2000)3.1.1-3.1.28。
在一个优选的实施方案中，GalNAc化合物通过间隔子与固体支持物连接。间隔子可以包含间隔子(2)和/或间隔子(1)。间隔子(2)通常是对所用特定固体支持物具有特异性的间隔子。通常，固体支持物在购买时就已附接有间隔子(2)。它可以是，例如，LCAA(对数链烷基胺)间隔子(如用于CPG支持物)或对氨基甲基聚苯乙烯支持物具有特异性的间隔子(通常含胺间隔子)。间隔子(1)可以包含或是二羧酸衍生部分。二羧酸衍生部分可以包含两个羧基基团，或者这两个羧基基团中的一个或两个羧基基团可以经修饰成酰胺基团。在特定实施方案中，间隔子(1)包含至少一个羧基基团，并且该羧基基团与间隔子(2)的含胺基团反应得到酰胺基团。优选地，二羧酸衍生部分具有3个至10个碳原子，即，其在羧基和/或酰胺基团之间可以具有1个至8个碳原子。1个至8个碳原子可以是具有1个至8个碳原子的直链或支链亚烷基(其中一个或更多个碳原子任选地被O、S、NH和/或N-(C1-C3烷基)(即N-甲基、N-乙基和/或N-丙基)取代)和/或具有5个至8个碳原子的亚环烷基。优选地，1个至8个碳原子是亚乙基、1,1二甲基亚乙基、亚丙基、亚正丁基或1,2亚环己基；优选地，二羧酸衍生部分衍生自琥珀酸、2,2二甲基琥珀酸、戊二酸、己二酸、1,2环己烷二羧酸、二甲醚、二甲硫醚和/或二甲胺。间隔子(1)可以通过使用各自的二羧酸的酸酐进行制备。
通常，残基Y的间隔子可以是任何适合其预期功能的部分，以在两个或更多个单元之间提供空间。优选地，间隔子包含亚烷基部分，例如，C2-10亚烷基，任选地被杂原子取代，以便在GalNAc化合物与载荷反应后促进间隔子的去除。
残基Y还可以是H原子或羟基保护基团，例如上文所定义的任何基团。在一个实施方案中，残基Y是H原子。在另一个实施方案中，残基Y是羟基保护基团，优选地选自上述定义的任何羟基保护基团。
在一个优选的实施方案中，用于合成GalNAc化合物缀合物的GalNAc化合物具有式(II)的结构：
其中
k、m和n如上定义，
R1独立地选自如上定义的羟基保护基团和H原子，优选是乙酰基基团，
R6表示羟基保护基团，优选DMT或MMT，更优选MMT，并且
R7表示式(VI)的部分：
其中
R表示固体支持物，任选地通过间隔子、氨基保护基团、羟基保护基团或H原子连接，
Z表示NH或O，并且
R8表示具有1个至8个碳原子的直链或支链亚烷基，其中一个或更多个碳原子任选地被O、S、NH和/或N-(C1-C3烷基)(例如，N-甲基、N-乙基和/或N-丙基)中的任一个取代；和/或具有5个至8个碳原子的亚环烷基，优选是亚乙基、1,1二甲基亚乙基、亚丙基、亚正丁基、1,2亚环己基、二亚甲基氧化物、二亚甲基硫化物和/或二亚甲基甲基胺。
在一些优选的实施方案中，R7表示式(VIa1)至(VIa8)中任一个的部分：
在一些优选的实施方案中，R7表示式(VIa3)或式(VIa4)中任一个的部分。
在进一步优选的实施方案中，用于合成GalNAc化合物缀合物的GalNAc化合物具有式(IIa)的结构：
其中R1、R6和R7如上定义。
在式(II)或式(IIa)的化合物的一些实施方案中，其中部分R7中的Z表示NH基团，残基R表示氨基保护基团，并且氨基保护基团优选地包含9-芴基甲基氨基甲酸酯(Fmoc)、叔丁基氨基甲酸酯(Boc)、苄基氨基甲酸酯、乙酰胺、三氟乙酰胺、苄胺、三苯基甲胺(三苯甲胺)、对甲苯磺酰胺和/或甲苯磺酰胺。尽管使用以上用语，但本领域技术人员将理解，残基R与N-单元一起构成如上所述的基团。还可以使用氨基保护基团，通过从N原子消除H原子，形成邻苯二甲酰亚胺和苄亚胺。
在式(II)或式(IIa)的化合物的一些实施方案中，其中部分R7中的Z表示O原子，残基R表示羟基保护基团，并且羟基保护基团优选地选自乙酰基、苯甲酰基、苯氧基乙酰基、新戊酰基、二甲氧基三苯甲基(DMT)、单甲氧基三苯甲基(MMT)、异丁酰基、叔丁基二甲基硅基、叔丁基二苯基硅基、三异丙基硅基和异丙基二甲基硅基。
在特定实施方案中，式(II)和式(IIa)的结构中部分R7中的残基R是固体支持物，任选地通过间隔子连接，特别地，如上定义的固体支持物。各自的(中间体)GalNAc化合物特别适合于核苷酸的附接，因此适合于制备与寡核苷酸缀合的GalNAc化合物，例如分别如式(I)和式(Ia)的结构中所示的那些。
用于制备GalNAc化合物的化合物
在一个方面，本发明涉及用于制备本发明的GalNAc化合物的化合物，即中间体化合物。在一个实施方案中，中间体化合物是具有式(III)的结构的化合物：
其中
k是如上定义的整数，优选3，
R2表示氨基保护基团或H原子，
R3表示固体支持物，任选地通过间隔子、羟基保护基团或H原子连接，并且
R6表示羟基保护基团，优选DMT或MMT，更优选MMT。
在式(III)的化合物的一些实施方案中，残基R2表示氨基保护基团，并且氨基保护基团优选地包含9-芴基甲基氨基甲酸酯(Fmoc)、叔丁基氨基甲酸酯(Boc)、苄基氨基甲酸酯、乙酰胺、三氟乙酰胺、苄胺、三苯基甲胺(三苯甲胺)、对甲苯磺酰胺和/或甲苯磺酰胺。尽管使用以上用语，但本领域技术人员将理解，残基R2与N单元一起构成如上所述的基团。还可以使用氨基保护基团，通过从N原子消除H原子，形成邻苯二甲酰亚胺和苄亚胺。
在式(III)的化合物的一些实施方案中，残基R3表示固体支持物，任选地通过间隔子或羟基保护基团连接。
在式(III)的化合物的一些实施方案中，残基R3表示羟基保护基团，其优选是如上文对X、Y和R1残基所定义的羟基保护基团。
在式(III)的化合物的一些特定实施方案中，残基R2表示氨基保护基团，优选9-芴基甲基氨基甲酸酯(Fmoc)，和/或残基R3表示H原子。在一个特定实施方案中，式(III)的化合物具有式(IIIa)的结构：
在式(III)的化合物的一些特定实施方案中，残基R2表示H原子，和/或残基R3表示固体支持物，任选地通过间隔子连接。在一些进一步的特定实施方案中，式(III)的化合物具有式(IIIb1)至(IIIb5)中任一个的结构：
其中
R表示固体支持物，任选地通过间隔子、氨基保护基团或H原子连接，并且
R6表示羟基保护基团，优选DMT或MMT，更优选MMT。
在一些特定实施方案中，式(III)的化合物具有如上定义的式(IIIb3)或式(IIIb4)中任一个的结构。
在式(IIIb1)至(IIIb5)化合物的特定实施方案中，R残基是固体支持物，任选地通过间隔子连接，如上文对固体支持物所定义(例如，如对Y残基所定义)。
用于制备GalNAc化合物的过程
在一个方面，本发明涉及用于制备具有任何上述实施方案中式(0)的结构的化合物(例如化合物(0a))的过程。在一些实施方案中，该过程是用于制备具有任何上述实施方案中式(I)和/或式(II)的结构的化合物(例如化合物(Ia)和/或化合物(IIa))的过程。
该过程包括使具有如上定义的式(III)的结构的化合物反应的步骤。该化合物非常适合作为制备本发明的GalNAc化合物的中间体化合物。
在该过程的一些实施方案中，该过程包括使具有式(IV)的结构的化合物反应的步骤：
其中
m是如上定义的整数，
R4表示并且
R5表示羟基保护基团，优选苄基基团。
已发现式(IV)的化合物非常适合作为制备本发明的GalNAc化合物的进一步的中间体化合物，并且提供高收率的GalNAc化合物。
在一些实施方案中，该过程包括以下步骤：
a)提供具有式(III)的结构的化合物：
其中
k是如上定义的整数，
R2表示H原子，
R3表示固体支持物，任选地通过间隔子、羟基保护基团或H原子连接，并且
R6表示羟基保护基团，优选DMT或MMT，更优选MMT；
b)提供具有式(V)的结构的化合物：
其中
m和n是如上定义的整数，并且
R1独立地选自羟基保护基团，例如，如上定义，优选是乙酰基基团；以及
c)使步骤a)中提供的式(III)的化合物与步骤b)中提供的式(V)的化合物反应，得到式(0)的化合物，其中Y是H原子、羟基保护基团或固体支持物，任选地通过间隔子连接，并且X是羟基保护基团，优选DMT或MMT，更优选MMT，或得到如上定义的任何实施方案中的式(II)的化合物。
在一些实施方案中，该过程进一步使步骤c)中得到的化合物反应的步骤d)，以得到式(0)的化合物，其中Y是载荷，并且X和R1各自是H原子，或以得到如上定义的任何实施方案中的式(I)的化合物。该步骤可以包括直接添加载荷或载荷前体，和/或步骤c)中得到的化合物的进一步反应以添加任选的接头和固体支持物。载荷前体可以是导致载荷附接至(中间体)GalNAc化合物的任何化合物。由于-CH2OX和-CH2OY基团的对称性，无论其制备过程如何，该式均包括这些基团。然而，应当理解，如果固体支持物作为Y残基存在，则载荷将附接至另一个残基，即X残基。
在这些实施方案中，残基R3优选如上定义，包括上述固体支持物和Y残基的羟基保护基团的定义。优选地，式(0)的化合物中的残基R3与中间体化合物(III)中的残基R3相同或是H原子。更优选地，R3与R7相同，并且表示式(VIa1)至(VIa5)中任一个的部分：
优选地，化合物(V)通过使用化合物(IV)进行制备，并且进一步与该过程的步骤a)中提供的式(III)的化合物反应。
在特定实施方案中，在步骤c)中制备式(II)或式(IIa)的化合物，并且其可以进一步反应得到包含载荷的化合物，例如式(I)或式(Ia)的化合物。
在该过程的一些实施方案中，式(III)的化合物包含固体支持物，即该化合物中的残基R3表示固体支持物，任选地通过间隔子连接。因此，化合物(V)与包含固体支持物的化合物(III)直接反应，并且可以在步骤d)中附接载荷，步骤d)紧接步骤c)的反应。特别地，对于制备具有寡核苷酸的GalNAc化合物缀合物，例如式(I)或式(Ia)的那些，该过程的实施方案非常适合。
在优选的实施方案中，在该过程的步骤d)中，通过使用标准亚磷酰胺化学添加修饰的和/或未修饰的核苷酸并将GalNAc化合物缀合物从固体支持物上切割而形成式(I)的化合物(如本文的实施例章节所述)。通过这种方式，可以轻松提供具有寡核苷酸的GalNAc化合物缀合物。
在一些实施方案中，在该过程的步骤d)中，式(0)的化合物，其中Y是羟基保护基团、H原子或固体支持物，任选地通过间隔子连接，与载荷或载荷前体反应以得到式(0)的化合物，其中Y是载荷并且X是H原子。
GalNAc化合物缀合物的应用
在一个方面，本发明涉及具有如上定义的式(0)的结构的化合物，其中所有残基X和R1各自是H原子并且残基Y是载荷，用于治疗受试者或诊断患有疾病或病症的受试者的方法，该受试者包含表达去唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)的细胞。该载荷可以是上述实施方案中的任何载荷。
在一些实施方案中，使用的化合物具有式(I)的结构。在一些优选的实施方案中，使用的化合物具有式(Ia)的结构。在一个实施方案中，式(I)或式(Ia)中修饰的和/或未修饰的寡核苷酸与肝细胞中的靶核苷酸序列结合，并修饰由该靶核苷酸序列编码的基因的表达。表达修饰在本文中应理解为通过增加或减少表达率来改变表达。在一些优选的实施方案中，修饰的和/或未修饰的寡核苷酸抑制由靶核苷酸序列编码的基因的表达。
在一个方面，本发明涉及用于将载荷运输至表达去唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)的细胞中的方法，其包括施用具有如上定义的式(0)的结构的化合物的步骤，其中残基X和R1全部是H原子，并且残基Y是载荷，其中该载荷以足以用该载荷治疗受试者的量被运输至受试者体内表达去唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)的细胞中。该载荷可以是上述实施方案中的任何载荷。
在该方法的一些实施方案中，该化合物具有式(I)的结构。在该方法的一些优选的实施方案中，该化合物具有式(Ia)的结构。在该方法的一些实施方案中，式(I)或式(Ia)中修饰的和/或未修饰的寡核苷酸与肝细胞中的靶核苷酸序列结合，并修饰由该靶核苷酸序列编码的基因的表达。表达修饰在本文中应理解为通过增加或减少表达率来改变表达。在该方法的一些优选的实施方案中，修饰的和/或未修饰的寡核苷酸抑制由靶核苷酸序列编码的基因的表达。该化合物可以以任何适合于施用于受试者的形式施用。在该方法的一些优选的实施方案中，该化合物皮下或静脉内施用于受试者。
在一个方面，本发明涉及药物组合物，其包含具有如上定义的式(0)的结构的化合物，其中残基X和R1全部是H原子，并且残基Y是载荷，以及药学上可接受的载体、辅料和/或稀释剂。该载荷可以是上述实施方案中的任何载荷。
在药物组合物的一些实施方案中，该化合物具有式(I)的结构。在药物组合物的一些优选的实施方案中，该化合物具有式(Ia)的结构。在药物组合物的一些实施方案中，式(I)或式(Ia)中修饰的和/或未修饰的寡核苷酸与肝细胞中的靶核苷酸序列结合，并修饰由该靶核苷酸序列编码的基因的表达。表达修饰在本文中应理解为通过增加或减少表达率来改变表达。在药物组合物的一些优选的实施方案中，修饰的和/或未修饰的寡核苷酸抑制由靶核苷酸序列编码的基因的表达。该药物组合物可以以任何适合于施用于受试者的形式施用。在药物组合物的一些优选的实施方案中，该药物组合物适合于皮下或静脉内施用于受试者。
试剂盒
在一些实施方案中，本公开的化合物和药物组合物以试剂盒形式提供。在各个方面，试剂盒包含作为单位剂量的化合物。出于本文的目的，“单位剂量”是指分散在合适载体中的离散量。在各个方面，单位剂量是足以为受试者提供期望效应(例如，降低靶基因表达)的量。因此，本文提供了试剂盒，其包含任选地以单位剂量提供的本公开的化合物。在各个方面中，试剂盒包含几个单位剂量，例如，一周或一个月供应量的单位剂量，任选地，其各自单独包装或以其他方式与其他单位剂量分开包装。在一些实施方案中，试剂盒/单位剂量的组分与施用于患者的说明书一起包装。在一些实施方案中，试剂盒包含一个或更多个施用于患者的装置，例如，针头和/或注射器等。在一些方面，本公开的化合物、其药学上可接受的盐被预先包装成即用型形式，例如，注射器和/或静脉内注射袋等。在一些方面，试剂盒进一步包含其他治疗剂或诊断剂或药学上可接受的载体(例如，溶剂、缓冲液和/或稀释剂等)，包括本文所述的任何载体。在特定方面，试剂盒包含本公开的化合物，连同药剂(例如，治疗剂)。
具体实施方案
本发明的实施方案1包含具有式(0)的结构的化合物：
其中
k是1至5的整数，
m是0至11的整数，
n是0至5的整数，
X是羟基保护基团或氢原子，
Y是羟基保护基团、氢原子、载荷或固体支持物，其中该载荷或固体支持物任选地通过间隔子连接，并且
R1独立地选自羟基保护基团和H原子。
本发明的实施方案2包含根据实施方案1的化合物，其中Y是载荷，其中该载荷包含寡聚化合物，例如寡核苷酸、肽、抗体、抗体片段或具有药物活性的化合物。
本发明的实施方案3包含根据实施方案1或2的化合物，其中X和R1各自表示H原子。
本发明的实施方案4包含根据前述实施方案中任一项的化合物，其具有式(I)的结构：
其中
k是1至5的整数，
m是0至11的整数，
n是0至5的整数，并且
Oligo表示修饰的和/或未修饰的寡核苷酸。
本发明的实施方案5包含根据实施方案4的化合物，其中该修饰的和/或未修饰的寡核苷酸是单链或双链修饰的和/或未修饰的寡核苷酸。
本发明的实施方案6包含根据实施方案4的化合物，其中该修饰的和/或未修饰的寡核苷酸是单链寡核苷酸、微小RNA(miRNA)或单链RNA(ssRNA)。
本发明的实施方案7包含根据实施方案4的化合物，其中该修饰的和/或未修饰的寡核苷酸是双链寡核苷酸并且是短发夹RNA(shRNA)或小干扰RNA(siRNA)。
本发明的实施方案8包含根据实施方案4至7中任一项的化合物，其中该修饰的和/或未修饰的寡核苷酸通过正义链的3’端附接。
本发明的实施方案9包含根据实施方案4至8中任一项的化合物，其中该修饰的和/或未修饰的寡核苷酸与靶核苷酸序列结合并且修饰由该靶核苷酸序列编码的基因的表达。
本发明的实施方案10包含根据实施方案9的化合物，其中该修饰的和/或未修饰的寡核苷酸抑制由该靶核苷酸序列编码的基因的表达，优选地通过抑制该靶核苷酸序列的转录或翻译来抑制。
本发明的实施方案11包含根据实施方案10的化合物，其中该修饰的和/或未修饰的寡核苷酸抑制基因的表达至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％。
本发明的实施方案12包含根据实施方案4至11中任一项的化合物，其中该修饰的和/或未修饰的寡核苷酸的靶核苷酸序列是信使RNA(mRNA)。
本发明的实施方案13包含根据实施方案4至12中任一项的化合物，其中该修饰的和/或未修饰的寡核苷酸的靶核苷酸序列编码与在肝脏中表达的疾病相关的基因，或与肝脏病症(优选代谢性肝脏病症)相关的基因。
本发明的实施方案14包含根据实施方案4至13中任一项的化合物，其中该寡核苷酸是修饰的寡核苷酸，其经修饰以抵抗降解、降低毒性和/或增强活性。
本发明的实施方案15包含根据实施方案1的化合物，其具有式(II)的结构：
其中
k是1至5的整数，
m是0至11的整数，
n是0至5的整数，并且
R1独立地选自羟基保护基团和H原子，优选是乙酰基基团，
R6表示羟基保护基团，优选DMT或MMT，更优选MMT，并且
R7表示式(VI)的部分：
其中
R表示固体支持物，任选地通过间隔子、氨基保护基团、羟基保护基团或H原子连接，
Z表示NH或O，并且
R8表示具有1个至8个碳原子的直链或支链亚烷基，任选地其中一个或更多个碳原子被O、S、NH和/或N-(C1-C3烷基)取代；和/或具有5个至8个碳原子的亚环烷基，优选是亚乙基、1,1二甲基亚乙基、亚丙基、亚正丁基或1,2亚环己基。
本发明的实施方案16包含根据前述实施方案中任一项的化合物，
其中
k是2或3，
m是7、8或9，并且
n是2或3。
本发明的实施方案17包含根据前述实施方案中任一项的化合物，其中k和m的总和是8至12的整数，并且优选是10。
本发明的实施方案18包含根据前述实施方案中任一项的化合物，其中该化合物具有式(0a)、式(Ia)或式(IIa)的结构：
其中X、Y、Oligo、R1、R6和R7如前述实施方案中所限定。
本发明的实施方案19包含具有式(III)的结构的化合物：
其中
k是1至5的整数，
R2表示氨基保护基团或H原子，
R3表示固体支持物，任选地通过间隔子、羟基保护基团或H原子连接，并且
R6表示羟基保护基团，优选DMT或MMT，更优选MMT。
本发明的实施方案20包含根据实施方案19的化合物，其中k是2或3，优选3。
本发明的实施方案21包含根据实施方案19或20的化合物，其中R2表示氨基保护基团，优选芴基甲氧羰基(Fmoc)，和/或R3表示H原子。
本发明的实施方案22包含根据实施方案19至21中任一项的化合物，其中该化合物具有式(IIIa)的结构：
其中
R6表示羟基保护基团，优选DMT或MMT，更优选MMT。
本发明的实施方案23包含根据实施方案19或20的化合物，其中R2表示H原子，和/或R3表示固体支持物，任选地通过间隔子连接。
本发明的实施方案24包含根据实施方案19、20和23中任一项的化合物，其中该化合物具有式(IIIb1)至式(IIIb5)中任一个的结构：
其中
R表示固体支持物，任选地通过间隔子、氨基保护基团或H原子连接，并且
R6表示羟基保护基团，优选DMT或MMT，更优选MMT。
本发明的实施方案25包括用于制备具有式(0)的结构的化合物的过程：
其中
k是1至5的整数，
m是0至11的整数，
n是0至5的整数，
X是羟基保护基团或氢原子，
Y是羟基保护基团、氢原子、载荷或固体支持物，其中该载荷或固体支持物任选地通过间隔子连接，并且
R1独立地选自羟基保护基团和H原子，
该过程包括使具有式(III)的结构的化合物与化合物(V)反应的步骤，例如通过标准酰胺偶联：
其中
k是1至5的整数，
R2表示氨基保护基团或H原子，以及
R3表示固体支持物，任选地通过间隔子、羟基保护基团或H原子连接，并且
R6表示羟基保护基团，优选DMT或MMT，更优选MMT。
本发明的实施方案26包括根据实施方案25的过程，其中式(0)的化合物具有式(I)的结构：
其中
k是1至5的整数，
m是0至11的整数，
n是0至5的整数，并且
Oligo表示修饰的和/或未修饰的寡核苷酸。
本发明的实施方案27包括根据实施方案25的过程，其中式(0)的化合物具有式(II)的结构：
其中
k是1至5的整数，
m是0至11的整数，
n是0至5的整数，并且
R1独立地选自羟基保护基团和H原子，优选是乙酰基基团，
R6表示羟基保护基团，优选MMT，并且
R7表示式(VI)的部分：
其中
R表示固体支持物，任选地通过间隔子、氨基保护基团、羟基保护基团或H原子连接，
Z表示NH或O，并且
R8表示具有1个至8个碳原子的直链或支链亚烷基，任选地其中一个或更多个碳原子被O、S、NH和/或N-(C1-C3烷基)取代；和/或具有5个至8个碳原子的亚环烷基，优选是亚乙基、1,1二甲基亚乙基、亚丙基、亚正丁基或1,2亚环己基。
本发明的实施方案28包括根据实施方案25至27中任一项的过程，包括使具有式(IV)的结构的化合物反应的步骤：
其中
m是0至11的整数，优选7，
R4表示并且
R5表示羟基保护基团，优选苄基基团。
本发明的实施方案29包括根据实施方案25至28中任一项的过程，包括以下步骤：
a)提供具有式(III)的结构的化合物：
其中
k是1至5的整数，优选3，
R2表示H原子，
R3表示固体支持物，任选地通过间隔子、羟基保护基团或H原子连接，并且
R6表示羟基保护基团，优选DMT或MMT，更优选MMT；
b)提供具有式(V)的结构的化合物：
其中
m是0至11的整数，优选7，
n是0至5的整数，优选3，
R1独立地选自羟基保护基团，优选是乙酰基基团；以及
c)使步骤a)中提供的式(III)的化合物与步骤b)中提供的式(V)的化合物反应，得到式(0)的化合物，其中Y是H原子、羟基保护基团或固体支持物，任选地通过间隔子连接，并且X是羟基保护基团，优选DMT或MMT，更优选MMT，或得到式(II)的化合物。
本发明的实施方案30包括根据实施方案29的过程，进一步包括以下步骤：
d)使步骤c)中得到的化合物反应，得到式(0)的化合物，其中Y是任选地通过间隔子连接的载荷，并且X和R1各自是H原子，或得到式(I)的化合物。
本发明的实施方案31包括根据实施方案25至30中任一项的过程，其中在该过程的步骤d)中，式(II)的化合物与至少两种修饰的和/或未修饰的核苷酸和/或核苷反应，得到式(I)的化合物。
本发明的实施方案32包括根据实施方案25至30中任一项的过程，其中在该过程的步骤d)中，式(0)的化合物，其中Y是羟基保护基团、H原子或固体支持物，任选地通过间隔子连接，进一步与载荷或载荷前体反应，得到式(0)的化合物，其中Y是任选地通过间隔子连接的载荷。
本发明的实施方案33包括根据实施方案32的过程，其中该载荷包含寡聚化合物，例如寡核苷酸、肽、抗体、抗体片段或具有药物活性的化合物。
本发明的实施方案34包括根据实施方案25至33中任一项的过程，其中该过程的步骤b)包括使具有式(IV)的结构的化合物反应的步骤：
其中
m是0至11的整数，优选7，
R4表示并且
R5表示羟基保护基团，优选苄基基团。
本发明的实施方案35包括用于制备具有式(0)的结构的化合物的方法：
其中
k是1至5的整数，
m是0至11的整数，
n是0至5的整数，
X是羟基保护基团或H原子，
Y是羟基保护基团、氢原子、载荷或固体支持物，其中该载荷或固体支持物任选地通过间隔子连接，并且
R1独立地选自羟基保护基团和H原子，
该方法包括使具有式(III)的结构的化合物与具有式(V)的结构的化合物反应的步骤，例如通过酰胺偶联：
其中
k是1至5的整数，
R2表示氨基保护基团或H原子，并且
R3表示固体支持物，任选地通过间隔子、羟基保护基团或H原子连接，并且
R6表示羟基保护基团，优选DMT或MMT，更优选MMT，
其中具有式(V)的结构的化合物是：
本发明的实施方案36包括根据实施方案35的方法，其中式(0)的化合物具有式(I)的结构：
其中
k是1至5的整数，
m是0至11的整数，
n是0至5的整数，并且
Oligo表示修饰的和/或未修饰的寡核苷酸。
本发明的实施方案37包括根据实施方案35的方法，其中式(0)的化合物具有式(II)的结构：
其中
k是1至5的整数，
m是0至11的整数，
n是0至5的整数，并且
R1独立地选自羟基保护基团和H原子，优选是乙酰基基团，
R6表示羟基保护基团，优选MMT，并且
R7表示式(VI)的部分：
其中
R表示固体支持物，任选地通过间隔子、氨基保护基团、羟基保护基团或H原子连接，
Z表示NH或O，并且
R8表示具有1个至8个碳原子的直链或支链亚烷基，任选地其中一个或更多个碳原子被O、S、NH和/或N-(C1-C3烷基)取代；和/或具有5个至8个碳原子的亚环烷基，优选是亚乙基、1,1二甲基亚乙基、亚丙基、亚正丁基或1,2亚环己基。
本发明的实施方案38包括根据实施方案35至37中任一项的方法，包括使具有式(IV)的结构的化合物反应的步骤：
其中
m是0至11的整数，优选7，
R4表示并且
R5表示羟基保护基团，优选苄基基团。
本发明的实施方案39包括根据实施方案35至38中任一项的方法，包括以下步骤：
a)提供具有式(III)的结构的化合物：
其中
k是1至5的整数，优选3，
R2表示H原子，
R3表示固体支持物，任选地通过间隔子、羟基保护基团或H原子连接，并且
R6表示羟基保护基团，优选DMT或MMT，更优选MMT；
b)提供具有式(V)的结构的化合物：
其中
m是0至11的整数，优选7，
n是0至5的整数，优选3，
R1独立地选自羟基保护基团，优选是乙酰基基团；并且
c)使步骤a)中提供的式(III)的化合物与步骤b)中提供的式(V)的化合物反应，得到式(0)的化合物，其中Y是H原子、羟基保护基团或固体支持物，任选地通过间隔子连接，并且X是羟基保护基团，优选DMT或MMT，更优选MMT，或得到式(II)的化合物。
本发明的实施方案40包括根据实施方案39的方法，进一步包括以下步骤：
d)使步骤c)中得到的化合物反应，得到式(0)的化合物，其中Y是任选地通过间隔子连接的载荷，并且X和R1各自是H原子，或得到式(I)的化合物。
本发明的实施方案41包括根据实施方案35至40中任一项的方法，其中在该过程的步骤d)中，式(II)的化合物与至少两种修饰的和/或未修饰的核苷酸和/或核苷反应，得到式(I)的化合物。
本发明的实施方案42包括根据实施方案35至40中任一项的方法，其中在该过程的步骤d)中，式(0)的化合物，其中Y是羟基保护基团、H原子或固体支持物，任选地通过间隔子连接，进一步与载荷或载荷前体反应以得到的式(0)的化合物，其中Y是任选地通过间隔子连接的载荷。
本发明的实施方案43包括根据实施方案42的方法，其中该载荷包括寡聚化合物，例如寡核苷酸、肽、抗体、抗体片段或具有药物活性的化合物。
本发明的实施方案44包括根据实施方案35至43中任一项的方法，其中该过程的步骤b)包括使具有式(IV)的结构的化合物反应的步骤：
其中
m是0至11的整数，优选7，
R4表示并且
R5表示羟基保护基团，优选苄基基团。
本发明的实施方案45包括具有式(0)的结构的化合物：
其中
k是1至5的整数，优选3，
m是0至11的整数，优选7，
n是0至5的整数，优选3，
X是H原子，
Y是载荷，任选地通过间隔子连接，并且
R1是H原子，用于治疗受试者或诊断患有疾病或病症的受试者的方法，该受试者包含表达去唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)的细胞。
本发明的实施方案46包括根据实施方案45使用的化合物，其中该载荷包含寡聚化合物，例如寡核苷酸、肽、抗体、抗体片段或具有药物活性的化合物。
本发明的实施方案47包括根据实施方案45或46使用的化合物，其中该化合物具有式(I)的结构：
其中
k是1至5的整数，
m是0至11的整数，
n是0至5的整数，并且
Oligo表示修饰的和/或未修饰的寡核苷酸。
本发明的实施方案48包括根据实施方案47使用的化合物，其中该修饰的和/或未修饰的寡核苷酸是单链或双链修饰的和/或未修饰的寡核苷酸。
本发明的实施方案49包括根据实施方案47使用的化合物，其中该修饰的和/或未修饰的寡核苷酸是单链寡核苷酸、微小RNA (miRNA)或单链RNA(ssRNA)。
本发明的实施方案50包括根据实施方案47使用的化合物，其中该修饰的和/或未修饰的寡核苷酸是双链寡核苷酸并且是短发夹RNA(shRNA)或小干扰RNA(siRNA)
本发明的实施方案51包括根据实施方案47至50中任一项使用的化合物，其中该修饰的和/或未修饰的寡核苷酸通过正义链的3’端附接。
本发明的实施方案52包括根据实施方案47至51中的任一项使用的化合物，其中该修饰的和/或未修饰的寡核苷酸与靶核苷酸序列结合并且修饰由该靶核苷酸序列编码的基因的表达。
本发明的实施方案53包括根据实施方案52使用的化合物，其中该修饰的和/或未修饰的寡核苷酸抑制由该靶核苷酸序列编码的基因的表达，优选地通过抑制该靶核苷酸序列的转录或翻译来抑制。
本发明的实施方案54包括根据实施方案53使用的化合物，其中该修饰的和/或未修饰的寡核苷酸抑制基因的表达至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％。
本发明的实施方案55包括根据实施方案47至54中任一项使用的化合物，其中该修饰的和/或未修饰的寡核苷酸的靶核苷酸序列是信使RNA(mRNA)。
本发明的实施方案56包括根据实施方案47至55中任一项使用的化合物，其中该修饰的和/或未修饰的寡核苷酸的靶核苷酸序列编码与在肝脏中表达的疾病相关的基因，或与肝脏病症(优选代谢性肝脏病症)相关的基因。
本发明的实施方案57包括根据实施方案47至56中任一项使用的化合物，其中该寡核苷酸是修饰的寡核苷酸，其经修饰以抵抗降解、降低毒性和/或增强活性。
本发明的实施方案58包括根据实施方案47至57中任一项使用的化合物，其中
k是2或3，
m是7、8或9，并且
n是2或3。
本发明的实施方案59包括根据实施方案47至58中任一项使用的化合物，其中k和m的总和使8至12的整数，并且优选是10。
本发明的实施方案60包括根据实施方案47至59中任一项使用的化合物，其中该化合物具有式(Ia)的结构：
本发明的实施方案61包括用于将载荷运输至表达去唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)的细胞中的方法，其包括施用具有式(0)的结构的化合物的步骤：
其中
k是1至5的整数，
m是0至11的整数，
n是0至5的整数，
X是H原子，
Y是任选地通过间隔子连接的载荷，并且
R1是H原子，
其中以足以用该载荷治疗受试者的量将该载荷输送至受试者体内表达去唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)的细胞中。
本发明的实施方案62包括根据实施方案61的方法，其中该载荷包含寡聚化合物，例如寡核苷酸、肽、抗体、抗体片段或具有药物活性的化合物。
本发明的实施方案63包括根据实施方案61或62的方法，其中该化合物具有式(I)的结构：
其中
k是1至5的整数，
m是0至11的整数，
n是0至5的整数，并且
Oligo表示修饰的和/或未修饰的寡核苷酸。
本发明的实施方案64包括根据实施方案63的方法，其中该修饰的和/或未修饰的寡核苷酸是单链或双链修饰的和/或未修饰的寡核苷酸。
本发明的实施方案65包括根据实施方案63的方法，其中该修饰的和/或未修饰的寡核苷酸是单链寡核苷酸、微小RNA(miRNA)或单链RNA(ssRNA)。
本发明的实施方案66包括根据实施方案63的方法，其中该修饰的和/或未修饰的寡核苷酸是双链寡核苷酸并且是短发夹RNA(shRNA)或小干扰RNA(siRNA)。
本发明的实施方案67包括根据实施方案63至66中任一项的方法，其中该修饰的和/或未修饰的寡核苷酸通过正义链的3’端附接。
本发明的实施方案68包括根据实施方案63至67中任一项的方法，其中该修饰的和/或未修饰的寡核苷酸与靶核苷酸序列结合并且修饰由该靶核苷酸序列编码的基因的表达。
本发明的实施方案69包括根据实施方案68的方法，其中该修饰的和/或未修饰的寡核苷酸抑制由该靶核苷酸序列编码的基因的表达，优选地通过抑制该靶核苷酸序列的转录或翻译来抑制。
本发明的实施方案70包括根据实施方案69的方法，其中该修饰的和/或未修饰的寡核苷酸抑制基因的表达至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％。
本发明的实施方案71包括根据实施方案63至70中任一项的方法，其中该修饰的和/或未修饰的寡核苷酸的靶核苷酸序列是信使RNA (mRNA)。
本发明的实施方案72包括根据实施方案63至71中任一项的方法，其中该修饰的和/或未修饰的寡核苷酸的靶核苷酸序列编码与在肝脏中表达的疾病相关的基因，或与肝脏病症(优选代谢性肝脏病症)相关的基因。
本发明的实施方案73包括根据实施方案63至72中任一项的方法，其中该寡核苷酸是修饰的寡核苷酸，其经修饰以抵抗降解、降低毒性和/或增强活性。
本发明的实施方案74包括根据实施方案63至73中任一项的方法，其中
k是2或3，
m是7、8或9，并且
n是2或3。
本发明的实施方案75包括根据实施方案63至74中任一项的方法，其中k和m之和是8至12的整数，并且优选是10。
本发明的实施方案76包括根据实施方案63至75中任一项的方法，其中该化合物具有式(Ia)的结构：
本发明的实施方案77包括用于根据实施方案45至60中任一项的化合物或根据实施方案61至76中任一项的方法，其中该化合物通过皮下或静脉内施用于受试者。
本发明的实施方案78包含药物组合物，其包含具有式(0)的结构的化合物：
其中
k是1至5的整数，优选3，
m是0至11的整数，优选7，
n是0至5的整数，优选3，
X是H原子，
Y是载荷，任选地通过间隔子连接，并且
R1是H原子，
以及药学上可接受的载体、辅料和/或稀释剂。
本发明的实施方案79包含根据实施方案78的药物组合物，其中该载荷包含寡聚化合物，例如寡核苷酸、肽、抗体、抗体片段或具有药物活性的化学化合物。
本发明的实施方案80包含根据实施方案78或79的药物组合物，其中该化合物具有式(I)的结构：
其中
k是1至5的整数，
m是0至11的整数，
n是0至5的整数，并且
Oligo表示修饰的和/或未修饰的寡核苷酸。
本发明的实施方案81包含根据实施方案80的药物组合物，其中该修饰的和/或未修饰的寡核苷酸是单链或双链修饰的和/或未修饰的寡核苷酸。
本发明的实施方案82包含根据实施方案80的药物组合物，其中该修饰的和/或未修饰的寡核苷酸是单链寡核苷酸、微小RNA(miRNA)或单链RNA(ssRNA)。
本发明的实施方案83包含根据实施方案80的药物组合物，其中该修饰的和/或未修饰的寡核苷酸是双链寡核苷酸并且是短发夹RNA(shRNA)或小干扰RNA(siRNA)。
本发明的实施方案84包含根据实施方案80至83中任一项的药物组合物，其中该修饰的和/或未修饰的寡核苷酸通过正义链的3’端附接。
本发明的实施方案85包含根据实施方案80至84中任一项的药物组合物，其中该修饰的和/或未修饰的寡核苷酸与靶核苷酸序列结合并且修饰由该靶核苷酸序列编码的基因的表达。
本发明的实施方案86包含根据实施方案85的药物组合物，其中该修饰的和/或未修饰的寡核苷酸抑制由该靶核苷酸序列编码的基因的表达，优选地通过抑制该靶核苷酸序列的转录或翻译来抑制。
本发明的实施方案87包含根据实施方案86的药物组合物，其中该修饰的和/或未修饰的寡核苷酸抑制基因的表达至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％。
本发明的实施方案88包含根据实施方案80至87中任一项的药物组合物，其中该修饰的和/或未修饰的寡核苷酸的靶核苷酸序列是信使RNA(mRNA)。
本发明的实施方案89包含根据实施方案80至88中任一项的药物组合物，其中该修饰的和/或未修饰的寡核苷酸的靶核苷酸序列编码与在肝脏中表达的疾病相关的基因，或与肝脏病症(优选代谢性肝脏病症)相关的基因。
本发明的实施方案90包含根据实施方案80至89中任一项的药物组合物，其中该寡核苷酸是修饰的寡核苷酸，其经修饰以抵抗降解、降低毒性和/或增强活性。
本发明的实施方案91包含根据实施方案80至90中任一项的药物组合物，其中
k是2或3，
m是7、8或9，并且
n是2或3。
本发明的实施方案92包含根据实施方案80至91中任一项的药物组合物，其中k和m之和是8至12的整数，并且优选是10。
本发明的实施方案93包含根据实施方案80至92中任一项的药物组合物，其中该化合物具有式(Ia)的结构：
本发明的实施方案94包含根据实施方案80至93中任一项的药物组合物，其中该药物组合物适合于皮下或静脉内施用于受试者。
实施例
非限制性公开和通过引用并入
尽管本文所述的某些化合物、组合物和方法已根据某些实施方案具体描述，但下列实施例仅用于说明本文所述的化合物，并不旨在对其进行限制。本申请中引用的每个参考文献均通过引用以其全文并入本文。
实施例1：具有固体支持物的GalNAc化合物的制备
ARNATAR GalNAc-接头-固体支持物合成程序
用于生产三价GalNAc固体支持物的两种合成程序如下所示：反应方案1和反应方案2。
反应方案1
在存在DIEA(二异丙基乙胺)、HBTU(六氟磷酸苯并三唑四甲基脲)的情况下，于RT下使10-(苄氧基)-10-氧代癸酸(CAS编号：67852-88-4，化合物(2))(4.80g/16.00mmol)与三[[2-(叔丁氧基羰基)乙氧基]甲基]甲胺(CAS编号：175724-30-8，化合物(1))(8.00g/16.00mmol)在DCM(二氯甲烷)中反应16小时，得到化合物(3)，收率为70.4％。
将化合物(3)(9.20g/11.80mmol)在甲酸中于25℃下处理24小时以去除叔丁基保护基团，得到化合物(4)，收率为86.1％。将三羧酸盐化合物(4)(6.90g/11.30mmol)与EDCI(1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺)、DIEA和HOAT(1-羟基-7-氮杂苯并三唑)溶解于二氯甲烷中。将(20.00g/38.30mmol)[5-乙酰氨基-3,4-二乙酰氧基-6-[2-[2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙氧基]乙氧基]氧杂环己烷-2-基]甲基乙酸酯(5)(化合物(5)的制备如下所示——反应方案2中的化合物(9))加入DCM混合物中，并于25℃下搅拌16小时。通过LCMS测得化合物(6)的收率为70％/纯度为97.2％。
在存在Pd/C催化剂的情况下，将化合物(6)在氢气(15psi)下溶解于THF中20小时以除去苄基保护基团，并通过制备型HPLC纯化粗物质(7)，得到化合物(7)。
将化合物(7)(0.5g/0.25mmol)与DIEA和HBTU溶解于DCM中。向混合物中加入化合物(8)(150.0mg/0.30mmol)(Wuxi AppTec,Shanghai,China)(Dunetz et al.,Org.ProcessRes.Dev.2016,20,2,140–177)。将反应混合物于25℃C下搅拌16小时。经制备型HPLC纯化后，得到化合物(9)，纯度为96.3％，收率为41％。
通过以下制备化合物(10)：将化合物(9)(380mg/0.26mmol)溶解于DCM中，加入DMAP和过量的琥珀酸酐，使反应完全。
使用在THF中的HBTU、DMAP和DIEA，将化合物(10)与两个氨基修饰的聚苯乙烯珠粒偶联。反应的第二步骤使用乙酸酐及吡啶封端任何未反应的位置。所得负载量为～150μmol/g。在可选的步骤中，将化合物(10)附接至CPG作为固体支持物。
反应方案1中的可选方案：
上述反应只需稍加修改即可得到类似的结果。
具体地，例如，化合物(8)可以含有MMT(r)代替DMT(r)作为羟基保护基团。可以实现核苷酸与MMT作为羟基保护基团的非常有效的偶联。
此外，还可以采用其他二羧酸酐来制备用于连接固体支持物的间隔子。非常有用的二羧酸酐的实例，例如琥珀酸酐、2,2二甲基琥珀酸酐、戊二酸酐、己二酸酐、1,2环己烷二羧酸酐、乙酸酐醚、乙酸酐硫醚和甲基亚氨基二乙酸酐，以及它们与含MMT的化合物(9)的反应如下所示。得到的化合物10的变体(化合物10a至化合物10h)进一步以与上述类似的方式反应生成修饰的化合物11(未显示)。
反应方案2
步骤1：活性三价酯(5)的合成：
10-苄氧基-10-氧代癸酸(CAS编号：67852-88-4，化合物(1))与三[[2-(叔丁氧羰基)乙氧基]甲基]甲胺(CAS编号：175724-30-8，化合物(2))反应得到化合物(3)。化合物(3)反应得到化合物(4)，然后化合物(4)与五氟苯基三氟乙酸酯(CAS编号：14533-84-7)反应得到活性三价酯(5)。
步骤2：胺GalNAc臂(9)的合成：
1-叠氮基-3,6,9-三氧杂十一烷-11-醇(CAS编号：86770-67-4，化合物(6))与(2S,3R,4R,5R,6R)-3-乙酰氨基-6-(乙酰氧基甲基)四氢-2H-吡喃-2,4,5-三基三乙酸酯(CAS编号：3006-60-8，化合物(7))反应得到化合物(8)，然后得到化合物(9)。
步骤3：将(5)和(9)偶联，然后还原苄基，生成三-GalNAc羧酸部分：
将步骤1和2中得到的化合物按化合物(5)：化合物(9)比例为3:1进行反应得到化合物(10)，然后将其如上所述进行处理得到化合物(11)。
步骤4：用于与(11)缀合的接头支持物的合成：
化合物(12)(Wuxi AppTec,Shanghai,China)与琥珀酸酐反应得到包含琥珀酸间隔子的化合物(13)。然后，将化合物(13)附接至固体支持物，该固体支持物可以是本领域中已知用于偶联反应的任何固体支持物，例如CPG(任选地包括LCAA间隔子)和聚苯乙烯固体支持物。
步骤5：三价GalNAc(11)与接头修饰的支持物(14)的偶联反应
将步骤3和4得到的化合物按化合物(11)：化合物(14)的比例为1:1进行反应，得到化合物(15)。
反应方案2中的可选方案：
上述反应只需稍加修改即可得到类似的结果。
具体地，例如，化合物(12)可以含有MMT(r)代替DMT(r)作为羟基保护基团，可以实现核苷酸与MMT作为羟基保护基团的非常有效的偶联。
此外，还可以采用其他二羧酸酐来制备用于连接固体支持物的间隔子。非常有用的二羧酸酐的实例，例如琥珀酸酐、2,2二甲基琥珀酸酐、戊二酸酐、己二酸酐、1,2环己烷二羧酸酐、乙酸酐醚、乙酸酐硫醚和甲基亚氨基二乙酸酐，以及它们与含MMT的化合物(12)的反应将分别产生包含源自这些酸的间隔子的修饰化合物(15)。
实施例2：GalNAc化合物缀合物的制备
ARNATAR GalNAc支持物上寡聚化合物的合成
将寡核苷酸附接至按照反应方案1所述得到的具有结构(11)的ARNATAR GalNAc化合物——具有CPG-LCAA固体支持物。
作为比较实施例，将Sharma et al.(2018,Bioconjugate Chem,29:2478-2488描述的GalNAc化合物、方案1中的化合物8(获自Gene Link,Elmsford,NY,USA or Primetech,ALC.,Minsk,Belarus，名称为“GalNAc TEG CPG”)与相同的寡核苷酸缀合。
寡核苷酸的固相合成在MerMadeTM48x合成仪(BioAutomation,LGC,BiosearchTechnologies,Hoddesdon,UK)上进行，使用标准亚磷酰胺化学方法每次运行可以制备多达48个1μMole或5μMole规模的寡核苷酸。固体支持物是可控孔径玻璃(Wuxi App Tec,Shanghai,China)，负载有3’-GalNAc缀合物；或通用固体支持物(AM Chemicals,Vista,CA,USA)。辅助合成试剂和标准2’-氰基乙基亚磷酰胺单体(2'-氟、2'-O-甲基、RNA、DNA)获自不同来源(Hongene Biotech,Shanghai,China；Sigma-Aldrich,St.Louis,MO,USA；GlenResearch,Sterling,VA,USA；ThermoFisher Scientific,Waltham,MA,USA；LGC BiosearchTechnologies,Hoddesdon,UK)。
在无水乙腈或30％ DMF：乙腈中制备亚磷酰胺混合物，并使用0.25M 4,5-二氰基咪唑(DCI)(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO,USA)进行偶联，偶联时间为120-360秒。使用四氢呋喃(THF)、吡啶和水中的0.02M碘混合物实现标准磷酸二酯键。
使用0.05M硫化试剂II(3-((二甲基氨基-亚甲基)氨基)-3H-1,2,4-二噻唑-3-硫酮，DDTT)(40:60，吡啶/乙腈)(LGC Biosearch Technologies,Hoddesdon,UK)生成硫代磷酸酯键，氧化时间为6分钟。所有序列均在去除二甲氧基三苯甲基(DMT)保护基团的情况下合成。
固相合成完成后，从固体支持物上切割寡核苷酸，并于55℃C下在氢氧化铵中温育6小时，对碱基不稳定基团进行脱保护。使用离心真空浓缩器去除氢氧化铵，并于室温下干燥。对于含有用叔丁基二甲基硅基(TBDMS)保护的天然核糖核苷酸(2’-OH)的序列，使用三乙胺；三氢氟酸(TEA:3HF)进行第二次脱保护。向每个TBDMS保护的寡核苷酸中加入100μLDMSO和125μL TEA:3HF，并于65℃C下温育2.5小时。温育后，向溶液中加入25μL的3M乙酸钠，然后于-20℃C下在丁醇中沉淀30分钟。将浑浊溶液离心成饼，同时用移液器小心地倒出上清液。然后，使用75％乙醇：水，然后使用100％乙醇作为上清液，完成标准沉淀过程。将寡核苷酸饼放入离心真空浓缩器中干燥30分钟。
使用3M乙酸钠沉淀后进行脱盐，无需使用HPLC纯化，随后使用G25 柱(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO,USA)洗脱。寡核苷酸的纯化采用阴离子交换色谱法，在Gilson GX271制备型HPLC系统(Middleton,WI,USA)上使用BioWorks Q40树脂(Uppsala,Sweden)进行。使用G25柱进行最终脱盐。所有寡核苷酸均采用Agilent 1200分析型HPLC(Santa Clara,CA,USA)通过离子配对反相HPLC进行纯度分析，采用Agilent 6130单四极杆质谱仪(Santa Clara,CA,USA)通过负离子质谱法进行完整质量分析，并采用TecanM Plex酶标仪(Zurich,Switzerland)通过UV/Vis进行A260定量分析。
GalNAc缀合的寡核苷酸可以单独用作单链化合物(例如，反义寡核苷酸(ASO)、ssRNA或miRNA；例如，实施例3)或以双链形式使用以形成双链化合物(例如，siRNA和/或shRNA)。在一些实例中(例如，实施例4和5)，GalNAc与双链化合物的正义链缀合。
双链寡聚化合物双链形成
通常，对于双链寡聚化合物(例如siRNA化合物)，将正义和反义寡核苷酸一起退火以形成双链体。可以通过将样品在1×磷酸盐缓冲盐水中在块加热器中以94℃加热4分钟，然后从块加热器中取出含有样品的加热块并让其在1小时内逐渐冷却至室温来实现50-300mM的双链形成。
实施例3：ARNATAR GalNAc缀合物的稳定性
ARNATAR GalNAc化合物和Sharma GalNAc化合物缀合物按照实施例2所述制备，并且包含表1所示的寡核苷酸。对它们的稳定性和持久性进行评估。
总共合成4个寡核苷酸，规模为1μmol。使用Sharma GalNAc或ARNATAR GalNAc支持物，用标准磷酸二酯合成两个24碱基聚T寡核苷酸。使用Sharma GalNAc或ARNATAR GalNAc支持物，用硫代磷酸酯(PS)核苷间化学(核苷间用*表示)合成两个24碱基聚T寡核苷酸。4个寡核苷酸均采用标准合成方法和离子交换纯化，分析HPLC表明，4个寡核苷酸经纯化和脱盐后纯度均大于90％。
表1：GalNAc缀合的寡核苷酸构建体
将每个GalNAc缀合的寡核苷酸构建体的样品(～500uM)置于水中，并与AMA(氢氧化铵/40％甲胺水溶液1:1v/v)或300mM NaAc(乙酸钠)缓冲液pH 4.5组合。表2显示了两种GalNAc寡核苷酸缀合物的稳定性比较。其中，第2行和第3行描述了相应GalNAc化合物与寡核苷酸之间的连接的稳定性测量结果，而第4行和第5行描述了寡核苷酸内的稳定性测量结果。
表2：GalNAc稳定性
通过质谱分析反应以确定是否存在切割产物。在所有观察到降解的情况中，磷酸二酯和硫代磷酸酯键的断裂是主要的截短产物。分析结果显示存在一些轻度降解的N-1和N-2产物。降解结果分析表明，全长产物大部分还原为单体。在酸性和碱性条件下，寡核苷酸磷酸键在观察到任何GalNAc降解产物之前就开始降解。发现ARNATAR GalNAc在压力条件下是稳定的。
实施例4：ARNATAR GalNAc在人原代肝细胞中的评估
ARNATAR GalNAc化合物和Sharma GalNAc化合物缀合物按照实施例2中所述制备，其中GalNAc化合物与靶向双链体正义链上的层粘连蛋白(LMNA)的相同siRNA化合物(ATsi103)缀合，如表3所示。
表3：LMNA siRNA
(5p)＝5’-磷酸酯
d(或在核苷酸前没有标记)＝已取代核糖核苷酸的脱氧核糖核苷酸
f＝2’-F
m＝2’-OMe
*＝硫代磷酸酯(PS)键
GalNAc-AN＝ARNATAR GalNAc
GalNAc-GL＝Sharma GalNAc
将GalNAc缀合的LMNA siRNA与人原代肝细胞一起温育，以使GalNAc-siRNA化合物自由摄取(即无需转染即可进入细胞)进入细胞中。LMNA表达的敲低被用作标记来评估每种GalNAc类型将靶向LMNA的siRNA运输至肝细胞的能力。
将不同剂量的LMNA siRNA(最终浓度为0μM、0.008μM、0.04μM、0.2μM、1μM或5μM)加入人原代肝细胞(HPH)(Xenotech,Kansas City,KS,USA)中，并于37℃和5％CO2下温育16小时、31小时或51小时。siRNA活性通过使用表4中列出的LMNA引物探针组通过qRT-PCR测量靶mRNA水平来确定。qRT-PCR使用AgPath-IDTM一步法RT-PCR试剂在QS3实时PCR系统(ThermoFisher Scientific,Waltham,MA,USA)中进行。将qRT-PCR检测中的靶RNA水平归一化为用RibogreenTM(ThermoFisher Scientific,Waltham,MA,USA)测量的总RNA水平或使用qRT-PCR在RNA样品等分试样中检测到的GAPDH mRNA水平。
图1显示了HPH自由摄取GalNAc缀合的siRNA后51小时LMNA mRNA的百分比。图2显示了LMNA mRNA水平变化的时间过程。空白PBS处理作为对照。
表4：人LMNA引物-探针组
| 引物名称 | 引物序列(5’to 3’) | SEQ ID NO: |
| hsLMNA-S | CGGGTGGATGCTGAGAAC | 3 |
| hsLMNA-A | TGCTTCCCATTGTCAATCTCC | 4 |
| hsLMNA-P | AGTGAGGAGCTGCGTGAGACCAA | 5 |
表5：人原代肝细胞中靶向LMNA的GalNAc缀合的siRNA活性，
ARNATAR GalNAc化合物是新型GalNAc化合物，其活性比Sharma先前公开的GalNAc化合物更强。这项研究表明，在所有剂量和评估时间下，ARNATAR GalNAc缀合物在人原代肝细胞中的表现均优于Sharma GalNAc。出乎意料的是，尽管结构上存在细微差别，但ARNATARGalNAc缀合物的表现却比Sharma GalNAc缀合物好得多。
实施例5：ARNATAR GalNAc缀合物在小鼠肝细胞中的评估
实施例4中公开的GalNAc缀合的LMNA siRNA靶向人和小鼠LMNA mRNA，因此进行研究以确认ARNATAR GalNAc将siRNA递送至小鼠肝细胞中的能力。
在本研究中，将GalNAc缀合的LMNA siRNA与小鼠肝细胞一起温育，以使GalNAc-siRNA化合物自由摄取(即无需转染即可进入细胞)进入细胞中。如同实施例4，LMNA表达的敲低被用作标记来评估每个GalNAc将靶向LMNA的siRNA运输至肝细胞中的能力。
将不同剂量的LMNA siRNA(最终浓度为0μM、0.008μM、0.04μM、0.2μM、1μM或5μM)加入小鼠肝细胞(mHP)(Xenotech,Kansas City,KS,USA)中，并于37℃和5％CO2下温育60小时。siRNA活性通过使用表6中列出的LMNA引物探针组通过qRT-PCR测量靶mRNA水平来确定。qRT-PCR使用AgPath-IDTM一步法RT-PCR试剂在QS3实时PCR系统(ThermoFisherScientific,Waltham,MA,USA)中进行。将qRT-PCR检测中的靶RNA水平归一化为用RibogreenTM(ThermoFisher Scientific,Waltham,MA,USA)测量的总RNA水平或使用qRT-PCR在RNA样品等分试样中检测到的GAPDH mRNA水平。
图3显示了HPH自由摄取GalNAc缀合的siRNA后60小时LMNA mRNA的百分比。
表6：小鼠LMNA引物-探针组
*56-FAM、ZEN和/3IABkFQ是oligo中使用的染料
实施例6：ARNATAR GalNAc体外评估
ARNATAR GalNAc化合物和Sharma GalNAc化合物缀合物按照实施例2中描述的方法制备，其中GalNAc化合物与靶向原蛋白转化酶枯草溶菌素/kexin类型9(PCSK9)的相同siRNA化合物在双链体的正义链上缀合，如表7所示。
表7：PCSK9 siRNA
(5p)＝5’-磷酸酯
d(或在核苷酸前没有标记)＝已取代核糖核苷酸的脱氧核糖核苷酸
f＝2’-F
m＝2’-OMe
*＝硫代磷酸酯(PS)键
GalNAc-AN＝ARNATAR GalNAc
GalNAc-GL＝Sharma GalNAc
表8：人PCSK9引物-探针组
| 引物名称 | 引物序列(5’至3’) | SEQ ID NO: |
| PCSK9正向引物 | TCACCAAGATCCTGCATGTC | 13 |
| PCSK9反向引物 | GTTCCACGGGATGCTCTG | 14 |
| PCSK9探针 | 56-FAM/CAGGTCGCC/ZEN/ACTCATCTTCACCA/3IABkFQ* | 15 |
*56-FAM、ZEN和/3IABkFQ是oligo中使用的染料
人原代肝细胞的体外评估
将GalNAc缀合的PCSK9 siRNA与人原代肝细胞一起温育，以使GalNAc-siRNA缀合物自由摄取(即无需转染即可进入细胞)。PCSK9表达的敲低被用作标记来评估每种GalNAc类型将靶向PCSK9的siRNA运输至肝细胞的能力。
将不同剂量的PCSK9 siRNA(最终浓度为0μM、0.001μM、0.01μM、0.1μM、1μM或10μM)加入人原代肝细胞(HPH)(Xenotech,Kansas City,KS,USA)中，并于37℃和5％ CO2下温育4天。通过使用表8中列出的PCSK9引物探针组，通过qRT-PCR测量靶mRNA水平来确定siRNA活性。qRT-PCR使用AgPath-IDTM一步法RT-PCR试剂在QS3实时PCR系统(ThermoFisherScientific,Waltham,MA,USA)中进行。将qRT-PCR检测中的靶RNA水平归一化为用RibogreenTM(ThermoFisher Scientific,Waltham,MA,USA)测量的总RNA水平或使用qRT-PCR在RNA样品等分试样中检测到的GAPDH mRNA水平。
图4显示了HPH自由摄取GalNAc缀合的siRNA后4天PCSK9 mRNA的百分比。使用空白PBS处理作为对照。
结论
ARNATAR GalNAc化合物是新型GalNAc化合物，与Sharma等人先前公开的GalNAc化合物相比，其活性更强。本研究表明，在所有剂量和评估时间下，ARNATAR GalNAc缀合物在人原代肝细胞中的表现均优于Sharma GalNAc缀合物。出乎意料的是，尽管结构上存在细微差别，但ARNATAR GalNAc缀合物的表现却比Sharma GalNAc缀合物好得多。
表9：序列表
Claims (23)
1.一种具有式(0)的结构的化合物：
其中
k是1至5的整数，
m是0至11的整数，
n是0至5的整数，
X是羟基保护基团或H原子，
Y是羟基保护基团、H原子、载荷或固体支持物，其中所述载荷或所述固体支持物任选地通过间隔子连接，并且
R1独立地选自羟基保护基团和H原子。
2.根据权利要求1所述的化合物，其中Y是载荷，其中所述载荷包含寡聚化合物，例如寡核苷酸、肽、抗体、抗体片段或具有药物活性的化合物。
3.根据权利要求1或2所述的化合物，其中X和R1各自表示H原子。
4.根据前述权利要求中任一项所述的化合物，其具有式(I)的结构：
其中
k是1至5的整数，
m是0至11的整数，
n是0至5的整数，并且
Oligo表示修饰的和/或未修饰的寡核苷酸。
5.根据权利要求4所述的化合物，其中所述修饰的和/或未修饰的寡核苷酸是单链或双链修饰的和/或未修饰的寡核苷酸。
6.根据权利要求4至5中任一项所述的化合物，其中所述修饰的和/或未修饰的寡核苷酸通过正义链的3’端附接。
7.根据权利要求4至6中任一项所述的化合物，其中所述修饰的和/或未修饰的寡核苷酸与靶核苷酸序列结合并且修饰由所述靶核苷酸序列编码的基因的表达。
8.根据权利要求1所述的化合物，其具有式(II)的结构：
其中
k是1至5的整数，
m是0至11的整数，
n是0至5的整数，和
R1独立地选自羟基保护基团和H原子，优选是乙酰基基团，
R6表示羟基保护基团，优选DMT或MMT，更优选MMT，并且
R7表示式(VI)的部分：
其中
R表示固体支持物，任选地通过间隔子、氨基保护基团、羟基保护基团或H原子连接，
Z表示NH或O，并且
R8表示具有1个至8个碳原子的直链或支链亚烷基，任选地其中一个或更多个碳原子被O、S、NH和/或N-(C1-C3烷基)取代；和/或具有5个至8个碳原子的亚环烷基，优选是亚乙基、1,1二甲基亚乙基、亚丙基、亚正丁基或1,2亚环己基。
9.根据前述权利要求中任一项所述的化合物，
其中
k是2或3，
m是7、8或9，并且
n是2或3。
10.根据前述权利要求中任一项所述的化合物，其中k和m之和是8至12的整数，并且优选是10。
11.根据前述权利要求中任一项所述的化合物，其中所述化合物具有式(0a)、式(Ia)或式(IIa)的结构：
其中X、Y、Oligo、R1、R6和R7如前述权利要求中所限定。
12.一种具有式(III)的结构的化合物：
其中
k是1至5的整数，
R2表示氨基保护基团或H原子，
R3表示固体支持物，任选地通过间隔子、羟基保护基团或H原子连接，并且
R6表示羟基保护基团，优选DMT或MMT，更优选MMT。
13.根据权利要求12所述的化合物，其中k是2或3，优选3。
14.根据权利要求12或13所述的化合物，其中R2表示氨基保护基团，优选芴基甲氧羰基基团(Fmoc)，和/或R3表示H原子。
15.根据权利要求12至14中任一项所述的化合物，其中所述化合物具有式(IIIa)的结构：
其中
R6表示羟基保护基团，优选DMT或MMT，更优选MMT。
16.根据权利要求12或13所述的化合物，其中R2表示H原子，和/或R3表示固体支持物，任选地通过间隔子连接。
17.根据权利要求12、13和16中任一项所述的化合物，其中所述化合物具有式(IIIb1)至式(IIIb5)中任一个的结构：
其中
R表示固体支持物，任选地通过间隔子、氨基保护基团或H原子连接，并且
R6表示羟基保护基团，优选DMT或MMT，更优选MMT。
18.一种用于制备具有式(0)的结构的化合物的方法：
其中
k是1至5的整数，
m是0至11的整数，
n是0至5的整数，
X是羟基保护基团或H原子，
Y是羟基保护基团、H原子、载荷或固体支持物，其中所述载荷或固体支持物任选地通过间隔子连接，并且
R1独立地选自羟基保护基团和H原子，
所述方法包括使具有式(III)的结构的化合物与具有式(V)的结构的化合物反应的步骤：
其中
k是1至5的整数，
R2表示氨基保护基团或H原子，以及
R3表示固体支持物，任选地通过间隔子、羟基保护基团或H原子连接，并且
R6表示羟基保护基团，优选DMT或MMT，更优选MMT，
其中所述具有式(V)的结构的化合物是：
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述式(0)的化合物具有式(I)的结构：
其中
k是1至5的整数，
m是0至11的整数，
n是0至5的整数，并且
Oligo表示修饰的和/或未修饰的寡核苷酸。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述式(0)的化合物具有式(II)的结构：
其中
k是1至5的整数，
m是0至11的整数，
n是0至5的整数，和
R1独立地选自羟基保护基团和H原子，优选是乙酰基基团，
R6表示羟基保护基团，优选MMT，并且
R7表示式(VI)的部分：
其中
R表示固体支持物，任选地通过间隔子、氨基保护基团、羟基保护基团或H原子连接，
Z表示NH或O，并且
R8表示具有1个至8个碳原子的直链或支链亚烷基，任选地其中一个或更多个碳原子被O、S、NH和/或N-(C1-C3烷基)取代；和/或具有5个至8个碳原子的亚环烷基，优选是亚乙基、1,1二甲基亚乙基、亚丙基、亚正丁基或1,2亚环己基。
21.一种药物组合物，其包含具有式(0)的结构的化合物：
其中
k是1至5的整数，优选3，
m是0至11的整数，优选7，
n是0至5的整数，优选3，
X是H原子，
Y是任选地通过间隔子连接的载荷，并且
R1是H原子，
以及药学上可接受的载体、辅料和/或稀释剂。
22.根据权利要求21所述的药物组合物，其中所述载荷包含寡聚化合物，例如寡核苷酸、肽、抗体、抗体片段或具有药物活性的化合物。
23.根据权利要求21或22所述的药物组合物，其中所述化合物具有式(I)的结构：
其中
k是1至5的整数，
m是0至11的整数，n是0至5的整数，并且Oligo表示修饰的和/或未修饰的寡核苷酸。
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